Artculo originalIdentificacin de 4-(4-nitro-2-phenethoxyphenyl) piridina como un prometedor nuevo conductor para descubrir inhibidores de ambos humano y rata de 11b-hidroxilasa. AbstractoLa inhibicin de la 11b-hidroxilasa es una estrategia prometedora para el tratamiento del sndrome de Cushing, en particular para los casos recurrentes y subclnicos. Para lograr la prueba de concepto en ratas, los esfuerzos fueron pagados para identificar nuevos compuestos que inhiben a ambos humanos y rata CYP11B1. Modificaciones en un potente inhibidor promiscuo de hCYP11B1, hCYP11B2 y hCYP19 (compuesto IV) que exhiben una inhibicin moderada rCYP11B1 conducida a el compuesto 8 como un nuevo y prometedor compuesto. Se lograron mejoras significativas en comparacin con el punto de inicio IV inhibitoria contra ambos humanos y rata CYP11B1 (IC50 valores de 2 y 163 nM, respectivamente) as como de selectividad sobre hCYP19 (IC50 1900 nM). En consecuencia, el compuesto 8 fue alrededor de 7 y 28 veces ms potente que la metirapona con respecto a la inhibicin de humanos y ratas CYP11B1 y exhibi una selectividad similar sobre hCYP11B2 (SF de 3,5 vs 4,9). Con ms optimizaciones sobre este nuevo plomo compuesto 8, se espera que los candidatos con perfiles que satisface descubrir drogas.

1. Introduccin Aunque el sndrome de Cushing endgeno es una enfermedad rara con una incidencia anual como de 2 a 3 casos por milln de la poblacin [1], conduce a una alta mortalidad por comorbilidades incluyendo cardio - y enfermedades cerebrovasculares [1,2]. En cuanto a la mayora de este sndrome que son causados por adenomas pituitarios y llamado enfermedad de Cushing, la supervivencia de los 5 aos es slo un 50% sin tratamientos eficaces [3]. A pesar del hecho de que la extirpacin quirrgica de tumores conduce a la curacin o remisin en 65 a 85% de los pacientes, las repeticiones se observan en hasta un 20% de los casos [1]. Adems, las investigaciones indican una alta prevalencia de subclnico sin diagnosticar el sndrome de Cushing en particular en pacientes con diabetes tipo II y la osteoporosis [4,5]. Aunque no hay sntomas evidentes distintos niveles altos de cortisol en plasma se observan en estos pacientes, este sndrome se considera exacerbar enfermedades concomitantes. Ms grave es que el que sndrome de Cushing subclnico se considera ser asociado con demencia metablica y promover la progresin de la enfermedad de Alzheimer [6]. Al parecer, para estos casos recurrentes y subclnicos, farmacoterapia a travs de la inhibicin de la 11b-hidroxilasa (hCYP11B1), que cataliza la hidroxilacin de 11-deoxycortisol al cortisol, para reducir los niveles circulantes de cortisol es superior. Metirapona (IC50 15 nM, tabla 1) como un inhibidor de la esteroidognesis suprarrenal se ha empleado para aliviar los sntomas de los pacientes antes de la ciruga [7]; y sus aplicaciones a largo plazo tambin se presentaron para controlar con xito los niveles de cortisol y manifestaciones psiquitricas [8,9]. En la fase clnica 1 estudio, un inhibidor de la hCYP11B1 experimental LCI699 (IC50 2.9 nM, tabla 1) normaliz los niveles de cortisol libre urinario o reduccin de sus concentraciones en ms de la mitad de lnea de base en pacientes con moderada a severa enfermedad de Cushing [10]. Sin embargo, al mismo tiempo, los niveles de aldosterona plasmticos fueron disminuidos perceptiblemente por BW alrededor de 4.2 a 1.3 ng/dL debido a la potente inhibicin de la aldosterona sintasa (hCYP11B2) por LCI699 (IC50 0.2 nM). Aunque esta inhibicin contribuy a la reduccin de la presin sangunea sistlica y diastlica (6.0 y 10.0 mmHg, respectivamente), junto con la hormona dual adrenocorticotrpica en plasma, es la respuesta a la cada de los niveles de cortisol, aument la concentracin de su precursor 11-deoxycorticosterone por 42-dual de 3,5 a 147.5 ng/dL. El atascamiento de estos exceso producido 11-deoxycorticosterone a receptores de mineralocorticoide inducida alrededor de 8% de reduccin de los niveles de potasio en plasma y por consiguiente hipopotasemia en un tercio (4 de 12) de los pacientes. Segn lo evidenciado por los niveles de renina de plasma disminuida (13e8 ng/L), que segua habiendo suprimidos dos semanas despus de la discontinuacin del tratamiento, el sistema renin-angiotensin-aldosterone fue deteriorado. Por lo tanto, la selectividad sobre hCYP11B2 se considera un criterio crucial para la seguridad en el tratamiento del sndrome de Cushing mediante inhibicin de la hCYP11B1. Adems de esta indicacin, aplicacin tpica de los inhibidores de la hCYP11B1 tambin se ha propuesto como una nueva estrategia para promover la cicatrizacin de las heridas crnicas [11] basadas en la observacin que el cortisol cutaneal sobreexpresado deteriora la proliferacin de fibroblastos y la sntesis de colgeno y as induce a las heridas crnicas y lceras [12]. Cortisol tambin estimula la proliferacin de clulas de cncer de prstata a travs de ciertos receptores de andrgenos mutado [13], por lo tanto, la combinatoria aplicacin de inhibidores de la hCYP11B1 [14] o inhibidores duales de la 17a-hidroxilasa-17.20-liasa (hCYP17) y hCYP11B1 [15] podran ser superiores enfoques para mejorar la supervivencia de los pacientes de cncer de prstata. Desde varias otras esteroidognicas citocromo P450 (CYP) las enzimas incluyendo hCYP11B2, hCYP17 y aromatasa (hCYP19) catalizan la biosntesis de hormonas esteroides importantes (mineralocorticoides, andrgenos y estrgenos, respectivamente), los candidatos de la droga inhibidora hCYP11B1 debera mostrar selectividad adecuada sobre estas enzimas, en particular hCYP11B2 (segn lo indicado por los resultados del ensayo clnico de LCI699). La selectividad entre hCYP11B1 y hCYP11B2 es especialmente difcil de alcanzar debido a la alta homologa (> 93%) entre estas dos enzimas. A pesar de esta dificultad, potentes y selectivos inhibidores de la hCYP11B2 [16e21] fueron descubiertos recientemente. Con la ayuda de nuestra amplia experiencia en el desarrollo de inhibidores selectivos de la enzimas esteroidogenica de CYP, incluyendo hCYP11B2 [22e26], hCYP17 [27e33] y hCYP19 [34e38], varias clases de hCYP11B1 potentes inhibidores fueron identificados [39e41]. Ejemplos como compuestos (IC50 107 nM) [45] y II (IC50 2 nM) [41] exhibi tanto inhibicin potente de la hCYP11B1 (tabla 1 & tabla 1) y prometiendo selectividad sobre otras enzimas CYP (para hCYP11B2, factores de selectividad (SF IC50 hCYP11B1 hCYP11B2/IC50) fueron observados alrededor de 15). Sin embargo, estos compuestos no (yo, IC50 > 10.000 nM) a bajos (II, IC50 2440 nM) mostraron inhibicin hacia rata CYP11B1 (tabla 1), lo que es difcil probar el concepto en ratas. Por lo tanto, el descubrimiento de compuestos con estructuras innovadoras inhibiendo a ambos humanos y rata CYP11B1 es necesario y urgente. En este estudio, describimos nuestros esfuerzos para identificar nuevos compuestos de plomo para explotar conocimientos previamente adquiridos en el desarrollo de inhibidores selectivos de la enzimas esteroidogenicas de CYP. 2.Resultados 2.1. Concepto de diseo En nuestra anterior investigacin de piridil sustituy 3,4-dihydroquinolin-2(1H)- como potentes inhibidores de la hCYP11B2, un interesante SAR observ que al aumentar de volumen del sustituto alkoxy en la posicin 7 aument en gran parte la inhibicin de la hCYP11B1 [42]. El IV compuesto benzyloxy exhibieron una 56-doblez inhibicin de hCYP11B1 ms fuerte que el metoxi correspondiente anlogo III (IC50 2487 nM) con un valor de IC50 de 44 nM (tabla 1). Aunque la inhibicin de la hCYP11B2 por consiguiente mejor a 22 nM slo mostrando as un factor de selectividad inadecuada de 0.5 para el hCYP11B1, una tendencia de preferencia inversa entre hCYP11B1 y hCYP11B2 la inhibicin se anticip al comparar a la del compuesto III (SF 0.1). Ms importante es que el compuesto IV demostr una inhibicin moderada de la rCYP11B1 (IC50 1500 nM), que es al parecer superior a la clnica usado droga metirapona (IC50 4607 nM) y previamente identificado inhibidores potentes hCYP11B1 I (IC50 > 10.000 nM) y II (IC50 2440 nM) (tabla 1 & tabla 1). Debido a la dificultad de identificar inhibidores de ambos humanos y rata CYP11B1 para facilitar la prueba de concepto en ratas, IV compuesto era considerado como un prometedor punto de partida para otras modificaciones. Sin embargo, como compuesto IV realmente se origin de una serie de dos inhibidores de la hCYP11B2 y hCYP19 [42,43], mostraron inhibicin significativa de la hCYP19 as (IC50 35 nM). Por lo tanto, adems de elevar las potencias contra humanos y rata CYP11B1, mejora de la selectividad sobre hCYP11B2 y hCYP19 es otro desafo encontrado. Para resolver estos problemas, se realizaron modificaciones como se muestra en el grfico 1. Puesto que la base 3, 4-dihydroquinolin-2(1H)-uno fue considerada como una estructura privilegiada para la inhibicin de hCYP11B2 [44], el anillo de lactama fue abierto y simplificado en un fenilo sustituido por diversos grupos. Como la insercin de un tomo de nitrgeno en el ncleo fue demostrado para ser beneficioso para la selectividad sobre hCYP11B2 [45], una piridil tambin trataba de reemplazar el ncleo de benceno. Basado en la comparacin entre los compuestos de III y IV, alcoxilo moiety fue especulado para ser la clave para la potencia y selectividad. Por lo tanto, se investigaron las influencias de la longitud de la cadena y la posicin de sustituir el grupo alcoxilo. Desde este tipo de inhibidores competitivos inhiben enzimas CYP a travs de la coordinacin entre sus hbridos sp2 N y el hierro heme, la conveniencia de formar estas interacciones, que dependen en gran medida de la posicin relativa del N en relacin con el ncleo hidrofbico, exhibira impactos significativos en la potencia y selectividad. Este factor por lo tanto, se examin mediante la introduccin de cualquiera de los dos moieties de 3 o 4 piridil como los heterociclos heme-coordinados, as como mediante la insercin de un grupo metileno entre el anillo piridil y el ncleo, que se han encontrado para alterar el patrn inhibitorio entre enzimas esteroidogenicas de CYP [11,39,43]. Estos esfuerzos condujeron a 1-25 compuestos que posteriormente fueron evaluados por su inhibicin de ambos humanos y rata CYP11B1 as como la selectividad sobre CYP11B2, hCYP17 y hCYP19.

2.2. Qumica En los esquemas 1-3, se muestran las sntesis de los compuestos diseados. Para la mayora de los compuestos deseados, se emple una sencilla ruta general (esquema 1). Los fenoles a partir de bromo que fueron sustituidos con grupos diversos, tales como NO2, F, OMe, CF3, CN y CONMe2, eran comercialmente disponibles u obtenidos del clivaje de los precursores de metoxi correspondiente. En primer lugar ellos eran alquilados utilizando los bromuros correspondientes a ter intermedios 4-6a, 10a, 12a, 14a, 16a, 18a, 20a y 22a antes los grupos de 3 o 4 piridil fueron introducidos va reaccin de acoplamiento de Suzuki dando por resultado final compuestos 4-23. Esta secuencia de la reaccin fue establecida despus de haber observado rendimientos bajos de alquilacin con piridil fenoles sustituidos. En la mayora de los casos, la ordinaria Suzuki acoplamiento condicin, ebullicin, es decir, los reactivos correspondientes con Pd (PPh3) 4 y Na2CO3 en una mezcla de etanol, tolueno y agua, dieron rendimientos satisfactorios; mientras que, para compuestos 10-13, 18, 19 y 23, PdCl2(dppf) tuvo que emplearse como una alternativa. El grupo nitro en el compuesto 4 se redujo a aminocidos (3) uso de hidrato de hidracina y Pd/C, que era ms acilada con cloruro de acetilo o cloruro de 4-fluorobenzoyl para obtener compuestos finales 1 y 2, respectivamente. Para lograr la introduccin de un grupo metileno entre el piridil y el ncleo del benceno, el grupo de bromo en la 5a fue convertido primero en borato (24a) usando bis diboro (pinacolato) bajo la catlisis de PdCl2 (PPh3) 2, posteriormente junto con 3 - o 4 - piridina (bromometil) para producir compuestos de 24 y 25, respectivamente.

2.3 Resultados y discusiones biolgicos

2.3.1. Inhibicin de hCYP11B1 y hCYP11B2La sntesis de compuestos 1-25 fue probada para la inhibicin de la hCYP11B1 y hCYP11B2 en las clulas V79MZ expresan las enzimas correspondientes, respectivamente, con [3 H] -11-deoxycorticosterone como sustrato [46]. Resultados se presentan en la tabla 1 con metirapona y IeIV compuesto como referencias. La base 3, 4-dihydroquinolin-2(1H)-one en el IV compuesto de plomo fue inaugurada como el primer paso de modificacin ya que esta estructura fue considerada como una estructura privilegiada para la inhibicin de hCYP11B2 [44]. En contraste, 3-piridil fue tocado para comparaciones directas de potencias inhibidoras. El anillo betalactmico se simplific en un grupo acetamido sustituyendo el ncleo de benceno para mantener el potencial hidrgeno, formado por el grupo amida. Como era de esperar, el compuesto 1 resultante, exhibe preferencia por inhibicin de la hCYP11B1 con un SF de 2.3, que es aproximadamente 5 veces mejor que la del compuesto IV de plomo. Sin embargo, la inhibicin de la hCYP11B1 al mismo tiempo se redujo a 279 nM. Un grupo abultado 4-fluorobenzamido (2) disminuy an ms la potencia inhibitoria nM 4-doblez 1207. Esta observacin es probablemente el resultado de enfrentamientos estrico causado por mayor volumen o rotacin de libertad despus de quitar el astriction del anillo betalactmico. La sustitucin de grupos amido por un grupo amino (3) slo condujo a una inhibicin moderada de la hCYP11B1 (IC50 540 nM). Sorprendentemente, el nitro 4 analgicas demostraron inhibicin potente hCYP11B1 con un valor de IC50 de 23 nM, que es dos veces ms potente que el plomo IV (IC50 44 nM). Sin embargo, no exhiben superioridad para plomo IV sobre selectividad sobre el hCYP11B2 compuesto 4 (SF 0,7). Con el grupo nitro sostenido, posteriormente se investig la influencia de la longitud de la cadena de la molcula de alcoxilo. Como el aumento de unidades de metileno, la inhibicin de hCYP11B1 fue elevada de 23 nM (4, n 0, benzoxy) a 13 nM (5, n 1) y a 6 nM (6, n 2 ). A pesar del hecho de que todos los compuestos tambin mostraron inhibicin potente de la hCYP11B2, mejora de la selectividad en comparacin con el plomo compuesto IV (SF 0.5) logr, en particular para el compuesto 5, que exhibi un SF de 4.1. El desplazamiento de 3-piridil por 4 piridil no influy mucho la potencia inhibitoria de la hCYP11B1. El benzoxy correspondiente compuesto 7 era tambin un potente inhibidor con un valor de IC50 de 50 nM. Con la insercin de ms unidades de metileno, se observ un aumento similar de la potencia inhibitoria. Phenethoxy analgica 8 (n 1 , IC50 2 nM) fue 25 veces ms potente que el benzoxy compuesto de 7; mientras que un IC50 de 8 nM se observ para el phenylpropoxy compuesto 9. Siendo el ms potente inhibidor de la hCYP11B1 en este estudio, compuesto 8 fue 22 - y 7 veces ms potente que el plomo compuesto IV y metirapona, respectivamente y tambin exhibi una selectividad similar sobre hCYP11B2 como la metirapona. El hecho de que ambos compuestos de piridil 3 y 4 mostraron potencia similar es indicativa de un relativo gran bolsillo, en la que el ciclo benceno podra derivar un poco para proporcionar el ngulo adecuado para formar la coordinacin NeFe. La alta flexibilidad de la cadena lateral de alcoxilo podra permitir los compuestos para adaptarse al cambio de ngulo. En contraste, la posicin del grupo alcoxilo era obviamente ms decisiva para la inhibicin de la hCYP11B1. El cambio de la ortho-(con respecto a los piridil) a la metaposition result en decesos de potencia por 85 - y 600 veces para los anlogos de 3 y 4 piridil (10, IC50 508 nM; y 11, IC50 1201 nM), respectivamente. Desde phenethoxy anlogos mostraron mejor selectividad (SF de 4.1 para el compuesto 5 y 3.5 de 8 compuestos), la longitud de esta cadena fue sostenida en las modificaciones posteriores. Por el contrario, ambos anlogos de 3 y 4 piridil fueron sintetizados para evitar faltar cualquier inhibidor potencialmente fuerte. Aunque los grupos nitro se presentan en un nmero considerable de frmacos en uso clnico, como la nifedipina, tienen el potencial de ser reducida a nitrosos aromticos, que puede unirse covalentemente al DNA y protenas y por lo tanto son cancergenos [47]. Por lo tanto, cautelosamente fue puesto en los grupos de nitro y se intent la sustitucin de nitro por otros sustituyentes. *Cuando fueron introducidos relativamente pequeos grupos en las molculas (F en 12 y 13; OMe en 15; CF3 en 17; y CN en 18 y 19), la inhibicin potente hCYP11B1 se observ con valores de IC50 menos de 60 nM. CN en combinacin con 4-piridil conducido al compuesto ms potente en este pequeo set con un valor de IC50 de 12 nM. Una excepcin es OMe 3-piridil 14 compuesto, el cual mostr una inhibicin moderada hCYP11B1 (IC50 183 nM); mientras que CF3 en combinacin con 3-piridil sorprendentemente slo dio lugar a una dbil potencia inhibitoria (IC50 812 nM). Por consiguiente, los sustituyentes ms voluminosos del CONMe2 condujeron a una dbil inhibicin con valores de IC50 de 594 y 1150 nM 3-Py (20) y compuestos (21) 4-Py, respectivamente, indicando posibles obstculos estrico. En contraste con volumen, otras propiedades, como el potencial electrosttico y la capacidad de formar enlaces de hidrgeno, parecen jugar slo papeles menores. Cuando el sustituyente es tan pequeo como F, se encontraron diferencias significativas en la potencia entre 3 y 4 piridil compuestos 12 y 13 (IC50 valores de 51 y 60 nM, respectivamente); mientras que para otros grupos con mayor tamao (OMe, CF3 y CN en compuestos 14e19), los anlogos 4-piridil eran significativamente ms potentes que los compuestos 3-piridil correspondiente. Aunque los inhibidores ms potentes de la hCYP11B1 fueron identificados a travs de estos reemplazos, ninguna mejora de selectividad se observ hCYP11B2 (SFs < 2). como el reemplazo de la base del benceno por un grupo de piridil en el metileno computacional sustituye ingredientes farmacuticos activos clase de los inhibidores de la hCYP11B1 aumentado la selectividad hCYP11B2 [45], un tomo de nitrgeno fue insertado en el ncleo de benceno que conduce a compuestos de 22 y 23. Sin embargo, esta modificacin redujo fuertemente la inhibicin de hCYP11B1 (IC50 > 1400 nM). Por otra parte, la introduccin de un grupo metileno entre el grupo 3-piridil (24) y el ncleo de benceno disminuy la potencia por alrededor diez veces en comparacin con el analgico 5 correspondiente; Considerando que la modificacin de la misma en 4-piridil compuesto 25 condujo a un inhibidor de la hCYP11B1 potente con potencia similar (IC50 6 nM) como compuesto 8.

2.3.2. Inhibicin de la humana CYP17 y CYP19

Desde que esta serie de compuestos se originaron desde el compuesto IV de plomo, que demostr una potente inhibicin de la hCYP19 (IC50 35 nM), la mejora de la selectividad correspondiente fue una dura tarea a lo largo de las modificaciones. El ms potente hCYP11B1 inhibidores 4-9, 17-9, 24 y 25, por tanto, se evaluaron por su inhibicin de la hCYP19 con microsomas placentarios humanos usando [1b-3 H] androstenediona (500 nM) como sustrato [48]. Al parecer, todos los compuestos 3-piridil (4e6, 18 y 24) exhibieron la inhibicin potente de hCYP19 con valores de IC50 por debajo de 170 nM (tabla 1). En contraste, 4-piridil anlogos (7e9, 17 y 29) se demostraron muy dbiles para alguna inhibicin hacia hCYP19 con valores de IC50 desde 1500 a 5000 nM. La nica excepcin fue el compuesto 25 (IC50 157 nM) probablemente debido a la molcula de metileno entre el piridil-coordinacin de heme y el ncleo de benceno. Con una mejora de ms de 40-veces sobre hCYP19 de selectividad en comparacin con el plomo IV, estos compuestos 4-piridil no suelen reducir la biosntesis de estrgenos bajo las dosis de tratamiento cuando se toma en cuenta su potencia inhibitoria muy fuerte contra la hCYP11B1 de la enzima objetivo. Puesto que hCYP17 es de importancia crucial para la produccin de andrgenos, la selectividad sobre esta enzima esteroidognica fue empleada como otro criterio para la seguridad. Los compuestos antes mencionados fueron investigandos para su inhibicin de la hCYP17 con el 50,sedimento de 2,000 g de un homogenado de coli de Escherichia por va recombinante expresando hCYP17 con progesterona (25 mM) como sustrato [49]. Ninguna inhibicin (IC50 > 10 mM) se observ para todos los compuestos que se probaron indicando seguridad con respecto a este aspecto.

2.3.3. Inhibicin de rata CYP11B1Como una de las tareas principales de este estudio, la inhibicin de rCYP11B1 se determin para los inhibidores ms potentes de la enzima humana (igual como se mencion en la seccin anterior) en las clulas V79MZ expresan rCYP11B2 [50]. Curiosamente, para nitro compuestos, todos 4-piridil anlogos 7e9 (IC50 < 650 nM) fueron mucho ms fuerte que 3-piridil compuestos 4e6 (IC50 desde 1300 a 2000 nM). Compuesto de 8 como el uno ms potente exhibi un valor de IC50 de 163 nM, que era cerca de 10 - y 28 veces ms fuerte que la de plomo IV y metirapona, respectivamente. En cambio, cuando substituye con CN, diferencias significativas en la potencia entre 3 y 4 piridil compuestos 18 y 19 se observaron (IC50 alrededor de 500 nM); mientras que, en el caso de compuestos de metileno, el derivado 4-piridil 25 demostr una inhibicin dbil aproximadamente 4 veces en comparacin con el correspondiente 3-piridil compuesto 24 (IC50 de 2850 vs 706 nM), que est en contraste con la RAE con los compuestos nitro.

2.3.4. Modelando estudios

Para mayor investigacin de las interacciones entre los inhibidores de la sntesis y la enzima targeting, un modelo de la homologa de CYP11B1 humano fue establecido usando la estructura cristalina divulgado de hCYP11B2 como la plantilla. Las secuencias de ambos hCYP11B1 (UniProt cdigo: P15538) y hCYP11B2 (UniProt cdigo: P19099) comprenden 503 aminocidos, entre los cuales 473 son idnticos (figura S1). En el cristal de hCYP11B2 en complejo con deoxycorticosterone (PDB ID: 4DVQ, cadena A), los aminocidos presentes 34-502. Desde aminocidos 1e24 como un pptido de trnsito es menos relevante para las funciones biolgicas y la configuracin, 1-33 de los aminocidos en la secuencia de hCYP11B1 fue omitido similar como en el cristal de la plantilla cuando se establece el modelo.

Una Biblioteca de diez modelos se gener inicialmente y la que mejor se seleccionaron segn la desviacin de energa y raz cuadrada media de solvatacin electrosttica de cada modelo intermedio a la posicin media de todos los modelos. Este modelo preliminar fue posteriormente ms refinado a travs de simulacin dinmica molecular para rendir un final. Se evalu la calidad del modelo resultante de homologa con respecto a las mediciones de cada aminocido incluyendo bonos longitudes, ngulos, diedros y torsiones 4ej estereoqumico. Como se muestra en el diagrama de dispersin de Ramachandran (figura S2), 451 de 470 aminocidos (96%) agrupados en regiones favorables, mientras que slo un aminocido (Ser288) era considerado como un outlier (0,2%). Este modelo de la homologa de hCYP11B1 presenta caracterstica citocromo P450 pliegues y bien superpuestas a la estructura de la plantilla (Fig. 1A). Aunque 30 aminocidos difieren en las secuencias de estas dos enzimas, localizadas fuera de los sitios activos. Por lo tanto no es sorprendente que la configuracin de sus sitios activos son muy similares. Sin embargo, control sobre los sitios activos todava revel diferencias de menor importancia (Fig. 1B), que podran ser la base y llaves para inhibidores que inhiben selectivamente la enzima individual. En el modelo de la homologa de hCYP11B1, la parte media de la-hlice ligeramente extruida hacia el opuesto b2-hoja comparada con en el cristal de hCYP11B2, estrechando as el bolsillo de Unin; mientras que la hlice F y la molcula de heme como el techo y el piso del sitio activo, respectivamente, se desplom por alrededor de 2 sincrnicamente. Aunque derivas tambin fueron observados para la hoja de b2, el bucle BeB0 y el (b4-1)-(b4-2) lazo, se identificaron alteraciones en el bucle de B0 - C que son sutiles, sin embargo de mayor importancia en el cambio del sitio de unin (Fig. 1). La cadena lateral de Leu131 empujaban hacia la lmina b2 as que encoge el bolsillo hidrofbico en el medio. En contraste, el grupo fenilo del Phe130 vuelta hacia abajo a molcula de heme conduce a ms conveniencia para inhibidores entrar y aprovechar este bolsillo. Los compuestos ms prometedores (8) en este estudio fue posteriormente atracado en el modelo de la homologa de hCYP11B1 para investigar las interacciones entre inhibidores y enzimas objetivos. La molcula fue anclada por la coordinacin entre el hbrido sp2 N en piridil y el hierro hemo y se inclin en la hoja de b2 con un ngulo de aproximadamente 60 con respecto al plano del hemo (Fig. 2A). El grupo phenethoxyl estirado hacia el bucle BeB0 y colocado en el bolsillo hidrofbico mencionado anteriormente, que fue remitida por Arg110- Met111-Ser112-Leu113-Leu131-Glu383 (Fig. 2B). Las cadenas laterales de fenilo de Phe130 y Phe381 sirvieron de dos puertas de este bolsillo y forman pep interacciones con el grupo phenethoxyl en formas paralelas y perpendiculares, respectivamente. Tambin se observ una interaccin areneecation entre el phenethoxyl el sustituto y el guanidyl de Arg110. Puesto que las cadenas laterales de Glu383 y Met111 eran accesibles, la introduccin de grupos positivamente cargados o donantes de hidrgeno en la molcula de phenethoxyl para formar sal puente o enlace de hidrgeno elevara la potencia inhibitoria. Como este de bolsillo en hCYP11B1 modelo de la homologa exhibi una entrada ms conveniente (Phe130) pero un volumen reducido (Leu131) comparado con que en la estructura cristalina de hCYP11B2, esta funcin podra ser aprovechada para lograr mayor selectividad. Adems, Phe130 y Phe381 forman interacciones de pep con la molcula de piridil (paralelo) y el ncleo de fenilo (perpendicular) promovieron afinidad y estabilizaron la postura de la Unin. Una interaccin adicional pep entre Phe487 y el ncleo de fenilo (paralelo) as como enlaces de hidrgeno formada por el grupo nitro con Tyr485 y Leu380 tambin contribuyeron significativamente con este sentido. La deriva de la hlice hacia la lmina b2 estrechando el sitio activo posiblemente facilit la formacin de estos enlaces del hidrgeno, pero tambin aumenta los riesgos de enfrentamientos estricos para sustituyentes ms voluminosos, que est de acuerdo con la RAE discutida arriba.

Conclusiones Como lo demuestra la aplicacin clnica de metirapona y la fase I estudio clnico de LCI699, la inhibicin de la hCYP11B1 es un enfoque elegante para tratar el sndrome de Cushing, en particular para los casos recurrentes y subclnicos. Para superar los inconvenientes en la realizacin de prueba de concepto en ratas, que es causada por la impotencia de nuestros inhibidores de la hCYP11B1 previamente descubierto contra la correspondiente enzima de rata, pagaron los esfuerzos para identificar nuevos compuestos con diferentes estructuras. Modi-especificaciones de un potente inhibidor promiscuo (IV) de hCYP11B1, hCYP11B2 y hCYP19 (valores de IC50 de 44, 22 y 35 nM, respectivamente) que exhiben inhibicin moderada rCYP11B1 (IC50 1500 nM) conducida a compuesto 8 como un nuevo plomo prometedor compuesto. En comparacin con el punto partida IV compuesto, Este inhibidor mostraron elevaciones no slo 22 - y 9 veces en ambos humanos y rata CYP11B1 inhibicin con valores de IC50 de 2 y 163 nM, respectivamente, pero tambin una mejora significativa de selectividad sobre hCYP19 (54-fold, IC50 1900 nM). Por consiguiente, compuesto 8 fue alrededor de 7 y 28 veces ms potente que la droga metirapona con respecto a la inhibicin de humanos y ratas CYP11B1. Aunque su selectividad sobre hCYP11B2 tambin aument por un factor de 7 (SF de 3,5 vs 0.5) en comparacin con el compuesto IV llegando a un nivel similar como la metirapona (SF 4.9), se consider necesario actual y queda por mejorar. Con ms optimizaciones en el nuevo plomo compuesto 8 que fue identificado con xito en este estudio, frmacos candidatos con perfiles que satisface esperan a ser descubiertas para el desarrollo consecuente de la droga y la investigacin de la fisiopatologa que implican CYP11B1.

4. Seccin experimental

4.1. Qumica 4.1.1. Mtodos analticos y qumicos Puntos de fusin fueron medidos en un aparato de punto de fusin Mettler FP1 y estn sin corregir. 1 H NMR y 13C NMR se registraron en un Espectrmetro Bruker AM500 a 500 MHz y 125 MHz, respectivamente, en 300 K. qumica cambios son registrados en partes por milln (ppm), por referencia a los residuos hidrogenados de los disolventes deuterados como estndar interno. Todas constantes de acoplamiento (J) se dan en Hertz (Hz). Espectros de masas (LC/UV/MS: ESI) se registraron en un instrumento SpectraSystem/MSQ Plus (ThermoFinnigan) con una columna de 5-100-RP18 (MachereyeNagel). Un gradiente agua/acetonitrilo fue utilizado como sistema eluyente. Todos los compuestos son > productos qumicos 95% pura medida por rastro LC/UV a 254 nm. Reactivos fueron utilizados como obtenidos de proveedores comerciales sin una posterior purificacin. Solventes fueron agua destiladas antes del uso. Si es necesario, se secaron solventes por destilacin del adecuado secado reactivos antes de su uso. Se realiz cromatografa flash gel de silicona de 40 (35/40e63/70 mM) con acetato de etlico/ter de petrleo o mezclas de CH2Cl2/metanol como eluyentes. Progreso de la reaccin fue monitoreado por cromatografa en capa fina (TLC) en TLC Silicagel 60 F254 (Merck KGaA). Se logr la visualizacin con luz UV. 4.1.2. general procedimiento A: methoxyl escote con solucin de boro tribromuro A del metoxilo correspondiente a partir de material en DCM (4 mL/mmol) fue enfriado a 20 C antes de tribromuro de boro (3 eq, 1 M en DCM) fue agregado en atmsfera de nitrgeno a la misma temperatura. La solucin agitada fue posteriormente calentada a la temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reaccin resultante se diluy con agua y se separaron las fases. La capa acuosa se extrajo tres veces con acetato de etilo y las capas orgnicas combinadas se secaron sobre Na2SO4. El solvente fue eliminado bajo presin reducida y el crudo producto se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel. 4.1.3. eterizacin de B: procedimiento general a la correspondiente de bromofenol en etanol (5 mL/mmol) se agreg K2CO3 (1,2 eq). La mezcla resultante se agit por 2 h en condiciones de reflujo (90 C) antes de la correspondiente bromuro (1,3 eq) y KI (5 mol %) fueron agregados. El reflujo fue continuado durante la noche. Despus de enfriar, el disolvente se elimin a presin reducida y el residuo se lava con salmuera y extrae tres veces con acetato de etilo. Las capas orgnicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, el disolvente se elimin a presin reducida y el producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel.

4.1.4.Procedimiento general C: Suzuki El acoplamiento catalizadas por Pd (PPh3) 4 que el correspondiente bromuro (1,0 eq) y el cido pyridylboronic (1,5 eq) fueron disueltos en una mezcla de etanol (10 mL/100 mg), tolueno (10 mL/100 mg) y una solucin acuosa de Na2CO3 de 2.0 M (2.5 mL/100 mg). La mezcla fue desoxigenada y lavada con nitrgeno tres veces antes de Pd (PPh3) 4 (5 mol %) fue agregado. La suspensin resultante se calent bajo reflujo durante h 3e5. Despus de refrescar abajo, agregaron agua y acetato de etilo y se separaron las fases. La fase de agua se extrajo tres veces con acetato de etilo y las capas orgnicas combinadas se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se elimin a presin reducida y el producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel.

4.1.5. Procedimiento general D: Suzuki acoplamiento haba catalizada por PdCl2(dppf) El correspondiente bromuro (1,0 eq) y cido pyridylboronic (1,5 eq) fueron disueltos en una mezcla de DME (10 mL/100 mg) y una acuosa 2,0 M solucin de Na2CO3 (2.5 mL/100 mg). La mezcla fue desoxigenada y lavada con nitrgeno tres veces antes de PdCl2(dppf) (5 mol %) fue agregado. La suspensin resultante se calent bajo reflujo durante 3-5 h o durante la noche. Despus de refrescar abajo, agregaron agua y acetato de etilo y se separaron las fases. La fase de agua se extrajo tres veces con acetato de etilo y las capas orgnicas combinadas se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se elimin a presin reducida y el producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel.

4.1.6. N-(3-(Benzyloxy)-4-(Pyridin-3-yl)phenyl)Acetamide (1) A la solucin de 3 3-(benzyloxy)-4-(pyridin-3-yl)aniline (100 mg, 0,36 mmol), trietilamina (0,10 mL, 0.72 mmol) y N, Ndimethylpyridin-4-amina (2 mg) en dicholoromathane (20 mL) fue cado en cloruro de acetilo (29,8 mg, 0.38 mmol) en un bao de hielo. La mezcla de reaccin resultante posteriormente se agit a temperatura ambiente durante la noche antes de que se aada agua (20 mL) y se separaron las fases. La fase de agua se extrajo tres veces con diclorometano (10 mL) y las capas orgnicas combinadas se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se elimin a presin reducida y el producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de dicholromethane/metanol (50: 1) como eluyente. Rendimiento: 109 mg (95%); amarillo slido: MP 157e159 C; RF 0,29 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C20H18N2O2 (C, H, N, O). 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8,78 (d, J 1,7 Hz, 1H), 8,54 (dd, J 1.7, 4,8 Hz, 1H), 7.87e7.89 (m, 1H), 7,47 (d, J 1,7 Hz, 1H), 7.37 (s, br, 1H), 7.31e7.34 (m, 1H), 7.24e7.27 (m, 3H), 7.15e7.18 (m, 1H), 7.10e7.12 (m, 2H), 6.97 (dd, J 1.9, 8,2 Hz, 1H), 4.79 (s, 2H), 2.20 (s 3 H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 156.4 150.1 147,7, 141.3, 139.3, 136.8, 136,7, 133.9, 130.6, 128.4, 125.9, 123,0, 122.8, 111.7, 104.3, 70.4, 20,5; MS (ESI): de m/z 319.14 [M+H] +. 4.1.7. N-(3-(Benzyloxy)-4-(Pyridin-3-yl)phenyl)-4-fluorobenzamide (2) A la solucin de 3 3-(benzyloxy)-4-(pyridin-3-yl)aniline (100 mg, 0,36 mmol), trietilamina (0,10 mL, 0.72 mmol) y N, Ndimethylpyridin-4-amina (2 mg) en dicholoromathane (20 mL) fue cado en cloruro de 4-fluorobenzoyl (60,0 mg, 0.38 mmol) en un bao de hielo. La mezcla de reaccin resultante posteriormente se agit a temperatura ambiente durante la noche antes de que se aade agua (20 mL) y se separaron las fases. La fase de agua se extrajo tres veces con dicholoromathane (10 mL) y las capas orgnicas combinadas se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se elimin a presin reducida y el producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel usando una mezcla de dicholromethane / metanol (50: 1) como eluyente. Rendimiento: 130 mg (91%); amarillo slido: mp 166e167 C; RF 0,35 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C25H19FN2O2 (C, H, N, O). 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.82 (d, J 1,7 Hz, 1H), 8.63 (dd, J 1.7, 4,8 Hz, 1H), 8.10 (dd, J 1.9, 8,2 Hz, 2H), 7.92e7.94 (m, 1H), 7.65 (d, J 1,7 Hz, 1H), 7,59 (s, br, 1H), 7.24e7.35 (m, 6H), 7.17e7.22 (m, 3H), 6.95 (m, 1H), 4.76 (s, 2H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): dC 159.7 (d, JCF 245,7 Hz) 154.7, 147.3, 138.8, 137.9, 134.7, 126,9, 123,4, 119.8 (d, JCF Hz 10,1), 119.7 (d, JCF 10,6 Hz), 119.2, 118.9, 118.7, 117,2, 117.1, 114.0, 111,1, 105.8 (d, JCF Hz 26,6), 105,6 (d, JCF Hz 26,1), 103.7, 102,0, 71,5; MS (ESI): m/z 399.14 [M+H] +.

4.1.8. 3-(Benzyloxy)-4-(Pyridin-3-yl)aniline (3) A la suspensin de 3-(2-(benzyloxy) -4-nitrophenyl) piridina 4 (25 mg, 0.08 mmol) y Pd/C (2,2 mg, 10% mmol) en etanol (5 mL) fue aadido hidrato de hidracina (11,2 mg, 0.25 mmol) lentamente en un bao de hielo. La mezcla de reaccin resultante fue posteriormente calentada a reflujo durante 1 hora. Despus de enfriar a temperatura ambiente, se agregaron agua (10 mL) y acetato de etilo (10 mL) y se separaron las fases. La fase de agua se extrajo tres veces con acetato de etilo (10 mL) y las capas orgnicas combinadas se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se elimin a presin reducida y el producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de dicholromethane/metanol (50: 1) como eluyente. Rendimiento: 19 mg (86%); amarillo slido: mp 172e174 C; RF 0.21 (n-Hex / EtOAc 1:2); Anal. C18H16N2O (C, H, N, O). 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.67 (d, J 2,6 Hz, 1H), 8.47 (dd, J 1.7, 4,8 Hz, 1H), 7.65e7.67 (m, 1H), 7.26e7.29 (m, 2H), 7.15e7.17 (m, 2H), 7.09 (d, J 8,1 Hz, 1H), la 6,35 (dd, J 2.1, 8,1 Hz, 1H), 6.30 (d, J 2,1 Hz, 1H), 4.79 (s, 2H), 3,85 (s, br, H 2 NH2); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 156.9, 150.0, 147.9, 146,9, 136,7, 134.4, 129.0, 128.4, 126.5, 122.6, 117,5, 107.6, 99.4, 70.4; MS (ESI): m/z 277.13 [M+H] +.

4.1.9. 3-(2-(Benzyloxy) -4-nitrophenyl) piridina (4)

El ttulo compuesto fue sintetizado de 2-(benzyloxy) -1-bromo-4-nitrobenceno 4a (108 mg, 0.35 mmol) segn mtodo C cido 3-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etlico/ter de petrleo (2:1) como eluyente. Rendimiento: 80 mg (75%); slidos de color amarillo limn: mp 121e123 C; RF 0.37 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C18H14N2O3 (C, H, N, O). 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.71 (d, J 1,9 Hz, 1H), 8.53 (dd, J 1.4, 4,8 Hz, 1H), 7.85e7.88 (m, 2H), 7.79e7.81 (m, 1H), 7,40 (d, J 8,2 Hz, 1H), 7.23e7.28 (m, 6H), 5.12 (s, 2H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 156.0, 150.0, 149.3, 148.6, 136.8, 135.3, 134.2, 132.2, 131.0, 128.8, 128.4, 127.1, 123,0, 116.5, 107.9, 71,1; MS (ESI): m/z 307.10 [M+H] +.

4.1.10. 3-(4-Nitro-2-phenethoxyphenyl) piridina (5)El ttulo compuesto fue sintetizado de 5a 1-bromo-4-nitro-2-phenethoxybenzene (175 mg, 0.54 mmol) segn mtodo C cido 3-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etlico/ter de petrleo (2:1) como eluyente. Rendimiento: 137 mg (78%); amarillo slido: mp 125e126 C; RF 0.39 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C19H16N2O3 (C, H, N, O). 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8,77 (s, 1H), 8.72 (d, J 4,8 Hz, 1H), 8.00 (d, J 8,3 Hz, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.75 (d, J 7,9 Hz, 1H), 7.52 (d, J 8,3 Hz, 1H), 7.31e7.41 (m, 4H), 7.23 (d, J 7,4 Hz, 2H), 4.40 (t, J 6,5 Hz, 2H), 3.15 (t J 6,5 Hz, 2 H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 156.3 149.9 149.2, 148.5, 137.6, 136.9, 133.8, 132.2, 130.9, 129.0, 128.5, 126.7, 122.9, 116.1, 107.0, 69.9, 35.4; MS (ESI): m/z 321.12 [M+H] +.

4.1.11. 3-(4-nitro-2-(3-phenylpropoxy)phenyl)pyridine (6) El ttulo compuesto fue sintetizado del 1-bromo-4-nitro-2-phenethoxybenzene 6a (125 mg, 0.37 mmol) segn mtodo C cido 3-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel usando una mezcla de petrleo acetato de ter/etilo (2:1) como eluyente. Rendimiento: 89 mg (72%); amarillo slido: mp 117e119 C; RF 0.37 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C20H18N2O3 (C, H, N, O). 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.79 (d, J 41,5 Hz, 1H), 8.62 (dd, J 1,5 4,8 Hz, 1H), 7.92 (dd, J 2.1, 8,4 Hz, 1H), 7.87 (dt, J 1.8, 7,9 Hz, 1H), 7.77 (d, J 2,1 Hz, 1H), 7.45 (d, J 8,3 Hz, 1H), 7.36e7.39 (m, 1H), 7.23e7.25 (m, 2H), 7.15e7.18 (m H 2), 7.08 (d, J 7,0 Hz, 2 H), 4.07 (t, J 6,2 Hz, 2 H), 2,68 (t, J 7,3 Hz, 2 H), 2.06e2.09 (m, 2 H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 156.6, 150.3, 149.5, 148.9, 141,0, 137.0, 134.1, 132.6, 131.1, 128.8, 128.6, 126.4, 123.2, 116.4, 107.4, 68.4, 32.3, 30.7; MS (ESI): m/z 335.13 [M+H] +. 4.1.12. 4-(2-(Benzyloxy) -4-nitrophenyl) piridina (7) El ttulo compuesto fue sintetizado de 2-(benzyloxy) -1-bromo-4-nitrobenceno 4a (150 mg, 0.49 mmol) segn mtodo C cido 4-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etlico/ter de petrleo (2:1) como eluyente. Rendimiento: 107 mg (72%); amarillo slido: mp 129e121 C; RF 0.33 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C18H14N2O3 (C, H, N, O). 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.69 (s, 2H), 7.94e7.96 (m, 2H), 7.47e7.51 (m, 2H), 7.33e7.37 (m, 5H), 5.12 (s, 2H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 156.2 150.1 149.1, 144,3, 135.5, 134.9, 131.2, 129.0, 128.7, 127.4, 124.3, 115.7, 108.2, 71,4; MS (ESI): m/z 307.10 [M+H] +.

4.1.13. 4-(4-Nitro-2-phenethoxyphenyl) piridina (8) El ttulo compuesto fue sintetizado de 5a 1-bromo-4-nitro-2-phenethoxybenzene (150 mg, 0.47 mmol) segn mtodo C cido 4-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etlico/ter de petrleo (2:1) como eluyente. Rendimiento: 104 mg (70%); amarillo slido: mp 112e114 C; RF 0.32 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C19H16N2O3 (C, H, N, O). 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.60 (dd, J 1.6, 4,5 Hz, 2H), 7.87 (dd, J 2.2, 8,4 Hz, 1H), 7.79 (d, J 2,1 Hz, 1H), 7,40 (d, J 8,4 Hz, 1H), 7.25e7.29 (m, 2H), 7.22e7.24 (m, 3H), 7.12e7.14 (m, 2H), 4.31 (t, J 6,4 Hz, 2H), 3.04 (t, J 6,5 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 156.5, 150.0, 149.1, 144,2, 137,8, 134.5, 131.0, 129.2, 128.8, 127.0, 124.3 116.3 107.3, 70.1, 35.6; MS (ESI): m / z 321.12 [M+H] +.

4.1.14. 4-(4-nitro-2-(3-phenylpropoxy)phenyl)pyridine (9) El ttulo compuesto fue sintetizado del 1-bromo-4-nitro-2-phenethoxybenzene 6a (150 mg, 0.45 mmol) segn mtodo C cido 4-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etlico/ter de petrleo (2:1) como eluyente. Rendimiento: 113 mg (76%); amarillo slido: mp 127e199 C; RF 0.32 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C20H18N2O3 (C, H, N, O). 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.71 (s, br, H 2) 7.91 (s, br, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.45e7.47 (m, 3H), 7.23e7.27 (m, 2H), 7.15e7.19 (m, 1H), 7.10e7.12 (m, 2H), 4.09 (t, J 6,2 Hz, 2H), 2.71 (t, J 7,3 Hz, 2H), 2.06e2.10 (m, 2H); 13C NMR (CDCl3, 146 p. Hu et al. / Europeo diario de 96 de Qumica Medicinal (2015) 139e150 125 MHz): C.c. 156.3 149.8 148.9, 144,2, 140.7, 134.3, 130.8, 128.6, 128,3, 126.2, 124.0, 116,0, 107.2, 68,2, 32.1, 30,5; MS (ESI): m / z 335.13 [M+H] +.

4.1.15. 3-(4-Nitro-3-phenethoxyphenyl) piridina (10)El ttulo compuesto fue sintetizado de 10a 4-bromo-1-nitro-2-phenethoxybenzene (108 mg, 0.34 mmol) segn mtodo D cido 3-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etlico/ter de petrleo (2:1) como eluyente. Rendimiento: 106 mg, (97%); naranja slido: mp C 91e92; RF 0.36 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C19H16N2O3 (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3040 (m), 2940 (m), 1586 (s), 1505 (s), 1228 (s), 1022 (s), 734 (vs), 694 (vs); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8,78 (s, 1H), 8.63 (d, J 4,7 Hz, 1H), 7.90 (d, J 8,5 Hz, 1H), 7.88 (d, J 7,3 Hz, 1H), 7.40e7.46 (m, 1H), 7.26e7.30 (m, 4H), 7.18e7.23 (m, 1H), 7.14 (dd, J 1.4, 8,4 Hz, 1H), 7.11 (s, 1H), 4.32 (t, J 6,8 Hz, 2H), 3.14 (t J 6,8 Hz, 2 H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz); C.c. 152.9 148.5 147,0, 143,3, 139,5, 137,4, 135.8, 135,4, 129.2, 128.6, 126.8, 126.5, 124.2, 119.1, 113.2, 70.9, 35.7; MS (ESI): m / z 320.88 [M+H] +.

4.1.16. 4-(4-Nitro-3-phenethoxyphenyl) piridina (11) El ttulo compuesto fue sintetizado de 4-bromo-1-nitro-2-phenethoxybenzene 11a (139 mg, 0.43 mmol) segn mtodo D cido 4-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etlico/ter de petrleo (1:1) como eluyente. Rendimiento: 129 mg (94%); slido ocre: mp 98 ; RF 0.27 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C19H16N2O3 (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3032 (m), 2951 (m), 1586 (s), 1552 (s), 1509 (s), 1225 (s), 808 (vs), 755 (vs), 698 (vs); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.66 (d, J 5,4 Hz, 2H), 7.89 (d, J 8,5 Hz, 1H), 7.44 (d, J 5,0 Hz, 2H), 7.25e7.30 (m, 4H), 7.17e7.22 (m, 2H), 7.15 (d, J 1,6 Hz, 1H), 4.32 (t, J 6,8 Hz, 2H), 3.14 (t, J 6,8 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz); C.c. 152.7 149.7, 147.2, 143.8, 140.0, 137,4, 129.2, 128.6, 126,9, 126.4, 122.0, 119.0, 113.2, 70.9, 35.6; MS (ESI): m/z 320.96 [M+H] +.

4.1.17. 3-(4-Fluoro-2-phenethoxyphenyl) piridina (12)El ttulo compuesto fue sintetizado del 1-bromo-4-fluoro-2-phenethoxybenzene 12a (118 mg, 0.40 mmol) segn mtodo D cido 3-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etilo/hexano (1:5) como eluyente. Rendimiento: 86 mg (73%); aceite de color marrn; RF 0.66 (organizacin/EtOAc 1:2); Anal. C19H16FNO (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3029 (m), 2935 (m), 1599 (s), 1279 (s), 1160 (vs), 699 (vs); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.73 (d, J 1,9 Hz, 2H), 7.69 (d, J 1,4 Hz, 1H), 7.21e7.34 (m, 5H), 7.15 (d, J 7,2 Hz, 2H), 6.70e6.76 (m, 2H) 4.19 (t, J 6,5 Hz), 3.03 (t, J 6,5 Hz); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): dC 162.9 (d, JCF 244,7 Hz) 156.7 149.5, 147.8, 138,2, 136.6, 132.8, 131.4 (d, JCF 10,1 Hz) 136,9 123.0, 117.5, 107.2 (d, JCF Hz 21,1), 100.7 (d, JCF Hz 26,6), 69,1, 34.6; MS (ESI): m / z 293.87 [M+H] +. 4.1.18. 4-(4-Fluoro-2-phenethoxyphenyl) piridina (13)El ttulo compuesto fue sintetizado de 12a 1-bromo-4-fluoro-2-phenethoxybenzene (128 mg, 0.43 mmol) segn mtodo D cido 4-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etilo/hexano (1:5) como eluyente. Rendimiento: 89 mg (71%); aceite de leonado; RF 0,54 (organizacin/EtOAc 1:2); Anal. C19H16FNO (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3029 (m), 2936 (m), 1599 (vs), 1407 (s), 1280 (vs), 1161 (vs), 832 (vs), 699 (vs); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.54 (dd, J 4.7, 1,6 Hz, 2H), 7.21e7.31 (m, 6H), 7.14e7.18 (m, 2H), 6.67e6.75 (m, 2H), 4.20 (t, J 6,5 Hz, 2H), 3.03 (t, J 6,5 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) C.c. 35.4, 69,4, 100.4 (d, JCF 25,7 Hz), 107,7 (d, JCF 22,0 hertzios), 123.6 (d, JCF 3.7 Hz), 124.4, 126.7, 128,5, 129.0, 131.3 (d, JCF 10,1 Hz) 137,8 146.0, 148.8, 157.0 (d, JCF Hz 9,2), 163.9 (d, JCF 248,4 Hz); MS (ESI): m/z 293.91 [M+H] +.

4.1.19. 3-(4-metoxi-2-phenethoxyphenyl) piridina (14)El ttulo compuesto fue sintetizado del 1-bromo-4-metoxi-2-phenethoxybenzene 14a (100 mg, 0,33 mmol) segn mtodo C cido 3-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel usando una mezcla de acetato de etlico/ter de petrleo (2:1) como eluyente. Rendimiento: 78 mg (77%); aceite de color amarillo limn; RF 0.55 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C20H19NO2 (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3028 (m), 2934 (m), 2836 (m), 1608 (w), 1883 (s), 1165 (vs), 699 (vs); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.72 (d, J 1,9 Hz, 1H), 8.55 (dd, J 1.6, 4,7 Hz, 1H), 7.71e7.75 (m, 1H), 7.24e7.35 (m, 5H), 7.19e7.22 (m, 2H), 6,62 (dd, J 2.2, 8,4 Hz, 1H), 6.58 (d, J 2,2 Hz, 1H), 4.23 (t, J 6,6 Hz, 2H), 3,87 (s, 3H), 3.07 (t, J 6,6 Hz 2 H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 161.0, 156.9, 149.5, 146.7, 138.1, 137,4, 134.3, 131.1, 129.0, 128.4, 126.5, 122.8, 119,8, 105.3, 99.8, 69.2, 55.4, 35.6; MS (ESI): m/z 305.85 [M+H] +.

4.1.20. 4-(4-metoxi-2-phenethoxyphenyl) piridina (15) El ttulo compuesto fue sintetizado del 1-bromo-4-metoxi-2-phenethoxybenzene 14a (106 mg, 0.35 mmol) segn mtodo C cido 4-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etlico/ter de petrleo (1:1) como eluyente. Rendimiento: 76 mg (71%); slidos de color amarillo limn: mp 63e64 C; RF 0,40 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C20H19NO2 (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3028 (m), 2955 (m), 2835 (m), 1610 (w), 1941 (s), 1207 (vs), 696 (vs), 783 (vs); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.47 (dd, J 1.6, 4,7 Hz, 2H), 7.17e7.28 (m, 6H), 7.13e7.17 (m, 2H), 6.53 (dd, J 2.5, 8,5 Hz, 1H), 6,49 (d, J 2,5 Hz, 1H), 4.17 (t, J 6,5 Hz, 2H), 3,79 (s, 3H), 3.00 (t, J 6,5 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 161.5 157.0 148.8, 146,5, 138.1, 131.1, 129.0, 128.5, 126.6, 124.2, 120.4, 105.4, 99.8, 69.1, 55.4, 35.6; MS (ESI): m/z 305.86 [M+H] +. 4.1.21. 3-(2-Phenethoxy - 4-(trifluorometil) fenil) piridina (16) El ttulo compuesto fue sintetizado del 1-bromo-2 - phenethoxy - 4-(trifluorometil) benceno 16a (106 mg, 0,31 mmol) segn mtodo C cido 3-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etilo/hexano (2:1) como eluyente. Rendimiento: 75 mg (70%); slidos luz amarilla: mp C 43e44; RF 0,68 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C20H16F3NO (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3031 (m), 2949 (m), 1614 (m), 1406 (s), 1328 (vs), 1105 (vs) 698 (vs); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.68 (dd, J 0.8, 2,4 Hz, 1H), 8.60 (dd, J 1.6, 4,7 Hz, 1H), 7.66e7.69 (m, 1H), 7.37e7.40 (m, 1H), 7.20e7.31 (m, 5H), 7.15e7.17 (m, 1H), 7.12e7.15 (m, 2H), 4.24 (t, J 6,6 Hz, 2H), 3.03 (t, J 6,6 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 156.0 149.8 148.4, 137,8, 137.2, 133.0, 131.5 (q, JCF 32,5 Hz) 130.9 130.6, 129.0, 128,5, 126,6, 122,9, 123,8 (q, JCF 272,2 Hz), 117.8 (q, JCF 3.7 Hz), 108.8 (q, JCF 3.7 Hz), 69.5, 35.5; MS (ESI): m/z 343.81 [M+H] +.

4.1.22. 4-(2-Phenethoxy - 4-(trifluorometil) fenil) piridina (17) El ttulo compuesto fue sintetizado del 1-bromo-2 - phenethoxy - 4-(trifluorometil) benceno 16a (100 mg, 0.29) segn mtodo C cido 4-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etlico/ter de petrleo (4:1) como eluyente. Rendimiento: 73 mg (73%); slidos ligero cervatillo: mp C 58e59; RF 0.55 (n-Hex / EtOAc 1:2); Anal. C20H16F3NO (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3033 (m), 2946 (m), 1591 (s), 1329 (vs), 1109 (vs), 817 (vs); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.57 (dd, J 1.6, 4,4 Hz, 2H), 7.37 (dd, J 7.9, 0,6 Hz, 1H), 7.24e7.29 (m, 5H), 7.20e7.24 (m, 1H), 7.12e7.17 (m, 3H), 4,25 (t, J 6,3 Hz, 2H), 3.02 (t, J 6,3 Hz, 2 H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 155.9 149.2, 145.2, 137,8, 132.1 (q, JCF 33,0 Hz), 131.1, 130.8, 129.0, 128,5, 126.7, 124.3, 123,7 (q, JCF 272,2 Hz), 117.8 (q, JCF 3.7 Hz), 108.9 (q, JCF 3.7 Hz), 69.5, 35.5; MS (ESI): m / z 343.82 [MH] . 4.1.23. 3-Phenethoxy-4-(Pyridin-3-yl)benzonitrile (18) el ttulo compuesto fue sintetizado de 4-bromo-3-phenethoxybenzonitrile 18a (105 mg, 0.35 mmol) segn mtodo D cido 3-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etlico/ter de petrleo (1) como eluyente. Rendimiento: 82 mg, (78%); aceite de color marrn; RF 0.56 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C20H16N2O (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3029 (m), 2936 (m), 2228 (s), 1506 (s), 1397 (s), 1277 (vs), 1021 (s), 700 (vs); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.7 (br, s, H 1) 8,6 (br, s, H 1) 7.7 (d, J 7,6 Hz, 1H) 7.3e7.4 (m, 3H) 7.2e7.3 (m, 4H) 7.1e7.2 (m, 2H) 4.3 (t, J 6,5 Hz, 2H) 3.1 (t, J 6,5 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 156.0, 149.2, 148.2, 137.5, 134.4, 132.8, 131.8, 131.2, 128,9, 128.5, 126.7, 125,0, 123,1, 118.4, 115.1, 113.0, 69.6, 35.4; MS (ESI): m/z 300.96 [M+H] +.

4.1.24. 3-Phenethoxy-4-(Pyridin-4-yl)benzonitrile (19) El ttulo compuesto fue sintetizado de 4-bromo-3-phenethoxybenzonitrile 18a (110 mg, 0,36 mmol) segn mtodo D cido 4-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etlico/ter de petrleo (1) como eluyente. Rendimiento: 92 mg, (85%), slido blanco: mp C 112e113; RF 0.44 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C20H16N2O (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3031 (m), 2928 (m), 2228 (s), 1595 (s), 1277 (s), 1024 (s), 808 (vs), 752 (vs), 705 (vs); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.6 (d, J 6,0 Hz, 2H), 7.4 (d, J 7,9 Hz, 1H), 7.3 (dd, J 1.6, 7,6 Hz, 1H), 7.2e7.3 (m, 5H), 7.2 (d, J 1,6 Hz, 1H) 7.1e7.2 (m, 2H), 4.3 (t, J 6,5 Hz, 2H), 3.1 (t, J 6,5 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): dC 155.9 149.4 144.5, 137.6, 132.6, 131.1, 128,9, 128.5, 126.8, 124.9, 124.1, 118.4, 115.2, 113.4, 69.6, 35.4; MS (ESI): m/z 300.96 [M+H] +.

4.1.25. N,N-Dimethyl-3-phenethoxy-4-(Pyridin-3-yl)Benzamide (20) El ttulo compuesto fue sintetizado de 20a 4-bromo-N, Ndimethyl-3-phenethoxybenzamide (100 mg, 0.29 mmol) segn mtodo C cido 3-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando acetato de etilo como eluyente. Rendimiento: 95 mg (95%); fawn slido: mp C 161e162; RF 0.05 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C22H22N2O2 (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3451 (br, m), 2927 (m), 1711 (m), 1609 (s), 1406 (s), 1329 (vs), 703 (s); 1 H NMR (2CO (CD3), 500 MHz): dH 8.69 (dd, J 1.0, 2,2 Hz, 1H), 8,54 (dd, J 1.6, 4,7 Hz, 1H), 7.78 (ddd, J 1.9, 3.5, 7,9 Hz, 1 H), 7,40 (d, J 7,9 Hz, 1 H), 7.36 (ddd, J 0.8, 4.9, 7,9 Hz, 1 H), 7.16 (d, J 1,6 Hz, 1 H), 7.09 (dd, J 1.4, 7,7 Hz, 1 H), 4.33 (t, J 6,5 Hz, 2 H), 3.02e3.07 (m, 8 H); 13C NMR (2CO (CD3), 125 MHz): C.c. 171.1, 156,8, 150.9, 149.1, 139.6, 138.7, 137.7, 134.4, 131.1, 130.1, 129.2, 129.0, 127.2, 123,8, 120.6, 112,4, 70.2, 60.6, 36.3; MS (ESI): m/z 346.81 [M+H] +. 4.1.26. N,N-Dimethyl-3-phenethoxy-4-(Pyridin-4-yl)Benzamide (21) El ttulo compuesto fue sintetizado de 4-bromo-N, Ndimethyl-3-phenethoxybenzamide 20a (96 mg, 0,28 mmol) segn mtodo C cido 4-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando acetato de etilo como eluyente. Rendimiento: 76 mg (78%), slido blanco: mp C 262e263; RF 0.05 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C22H22N2O2 (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3438 (br, m), 2933 (m), 1609 (s), 1414 (s), 1315 (vs), 700 (s); 1 H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): dH 8.53 (dd, J 1.6, 4,5 Hz, 2H), 7.41 (d, J 7,6 Hz, 1H), 7.35 (dd, J 1.6, 4,5 Hz, 2H), 7.25e7.30 (m, 2H), 7.19e7.24 (m, 3H), 7.15 (d, J 1,6 Hz, 1H), 7.05 (dd, J 1.6, 7,6 Hz, 1H), 4.30 (t, J 6,5 Hz, 2H), 2.85e3.05 (m 8 H); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): C.c. 169,4 155.3, 149.3, 144.8, 138.5, 138.4, 130.2, 129.0, 128.2, 127.4, 126.3, 124.0, 119.4, 111.3, 68.9, 34,8; MS (ESI): m/z 346.80 [M+H] +.

4.1.27. 3-Phenethoxy-2,30 - bipyridine (22) El ttulo compuesto fue sintetizado del 2-bromo-3-phenethoxypyridine 22a (95 mg, 0,342 mmol) segn mtodo C cido 3-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando acetato de etilo como eluyente. Rendimiento: 92 mg, (97.5%); slido amarillo claro: mp C 126e127; RF 0.14 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C18H16N2O (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3510 (br, m), 2990 (m), 1579 (m), 1452 (s), 1321 (vs), 696 (s); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 9.2 (dd, J 0.6, 2,2 Hz, 1H), 8,6 (dd, J 1.6, 5,0 Hz, 1H), 8.3 (dd, J 1.4, 4,6 Hz, 1H), 8.2 (dt, J 2.0, 8,0 Hz, 1H), 7.4 (ddd, J 0.8, 4.8, 8,0 Hz, 1H), 7.3e7.3 (m, 3H), 7.2e7.3 (m, 4H), 4.3 (t, J 6,6 Hz 2 H), 3.1 (t, J 6,6 Hz, 2 H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 153.2 149.8, 148.2, 144.7, 141.8, 137.6, 137,4, 133.7, 129.0, 128.6, 126.8, 123,8, 123,0, 119.5, 69,4, 35.6; MS (ESI): m / z 276.95 [M+H] +.

4.1.28. 3-Phenethoxy-2,40 - bipyridine (23) El ttulo compuesto fue sintetizado de 22a 2-bromo-3-phenethoxypyridine (50 mg, 0.18 mmol) segn mtodo D cido 4-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando acetato de etilo como eluyente. Rendimiento: 35 mg, (70.4%); slido marrn claro: mp C 39e40; RF 0.16 (n-Hex/EtOAc 1:2); Anal. C18H16N2O (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3454 (br, m), 1642 (m), 1437 (s), 1322 (vs), 1272 (s), 814 (s), 744 (s), 699 (s); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.6 (d, J 4,7 Hz, 2H), 8.3 (dd, J 1.6, 4,4 Hz, 1H), 7.7 (d, J 5,4 Hz, 2H), 7.2e7.3 (m, 7H), 4.3 (t, J 6,6 Hz, 2H), 3.1 (t, J 6,6 Hz, 2H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 153.7 149.6, 145.3, 145,1, 141,9, 137,9, 129.2, 128.8, 127.0, 124,6, 124.0, 119.9, 69.5, 35.8; MS (ESI): m/z 276.97 [M+H] +.

4.1.29. 3-(4-Nitro-2-phenethoxybenzyl) piridina (24) El ttulo compuesto fue sintetizado de 4,4,5,5-tetrametil-2-(4-nitro 2-phenethoxyphenyl)-1,3,2-dioxaborolane 24a (97 mg, 0,26 mmol) segn mtodo D cido 3-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etilo/hexano (2:1) como eluyente. Rendimiento: 55 mg (63%); slido marrn claro: mp C 82e83; RF 0.48 (n-Hex / EtOAc 1:2); Anal. C20H18N2O3 (C, H, N, O). IR (ATR): n (cm1) 3061 (m), 2928 (m), 2879 (m), 1585 (m), 1511 (vs), 1337 (vs), 1248 (vs), 1026 (s), 744 (vs), 704 (vs); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.48 (br, s, H 2), 7.78 (dd, J 8.2, 2,2 Hz, 1H), 7,70 (d, J 2,2 Hz, 1H), 7.38 (d, J 7,9 Hz, 1H), 7.30e7.35 (m, 2H), 7.24e7.28 (m, 3H), 7.22 (d, J 8,2 Hz, 1H), 7,18 (dd, J 7.4, 4,9 Hz, 1H), 4.30 (t, J 6,6 Hz 2 H), 3.95 (s, 2 H), 3.13 (t, J 6,6 Hz, 2 H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) C.c. 156.6, 149.8, 147.8, 147.4, 137.6, 136.5, 136.0, 134.9, 130.3, 128.8, 128.6, 126.7, 123.5, 115.9, 106.2, 69.3, 35.5, 33.4; MS (ESI): m / z 335.03 [M+H] +. 4.1.30. 4-(4-Nitro-2-phenethoxybenzyl) piridina (25) El ttulo compuesto fue sintetizado de 4,4,5,5-tetrametil-2-(4-nitro 2-phenethoxyphenyl)-1,3,2-dioxaborolane 24a (80 mg, 0,22 mmol) segn mtodo D cido 4-pyridylboronic. El producto crudo se purific mediante cromatografa flash sobre Silicagel utilizando una mezcla de acetato de etilo/hexano (2:1) como eluyente. Rendimiento: 51 mg (69%); aceite de color marrn; Anal. C20H18N2O3 (C, H, N, O). RF 0,35 (n-Hex/EtOAc 1:2); IR (ATR): n (cm1) 3028 (m), 2923 (m), 2851 (m), 1598 (m), 1517 (vs), 1341 (vs), 1247 (vs), 801 (s), 738 (vs), 700 (vs); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): dH 8.45 (d, J 6,0 Hz, 2H), 7.82 (dd, J 8.2, 2,2 Hz, 1H), 7,74 (d, J 2,2 Hz, 1H), 7.25e7.33 (m, 5H), 7.21 (dd, J 7.7, 1,7 Hz, 2H), 7.10 (d, J 6,3 Hz, 2H) , 4.32 (t, J 6,5 Hz, 2H), 4.02 (s, 2H), 3.10 (t, J 6,5 Hz, 2 H); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz): C.c. 156.7, 152.5, 148.2, 147,0, 140.7, 137.5, 134.1, 130.8, 128.7, 126,9, 124.7, 116.1, 106.4, 69.2, 35.9, 35.4; MS (ESI): m/z 334.99 [M+H] + .

4.2. Biologa

4.2.1. Inhibicin de la hCYP11B1, hCYP11B2 y rCYP11B1 V79MZhCYP11B1, V79MZhCYP11B2 o V79MZrCYP11B1 las clulas fueron previamente incubados con inhibidor de 1 h a 37 C. La reaccin se inici por la adicin de 100 nM (hCYP11B) o 500 nM (rCYP11B1) [3 H] -11-deoxycorticosterone como sustrato. Despus de la incubacin de 25 min (hCYP11B1), 45 min (hCYP11B2) o 7 h (rCYP11B1), las reacciones enzimticas fueron detenidas por extraer el sobrenadante con acetato de etilo. Las muestras se centrifugaron y el acetato de etilo fue separado [46,50]. Los esteroides fueron separados por HPLC y analizados con deteccin del flujo de radio.

4.2.2. Inhibicin de la hCYP19 La inhibicin de la hCYP19 determin en vitro usando microsomas placentarios humanos [1b-3 h] androstenediona como sustrato [48].

4.2.3. Inhibicin de la hCYP17 Humana CYP17 se expres en e. coli (coexpressing humano CYP17 y P450 NADPH reductasa) y el ensayo se realiza como se describi previamente [49]. 4.3. modelado estudios 4.3.1. Establecimiento de la homologa hCYP11B1 modelo de la secuencia primaria de sapiens de Homo CYP11B1 (UniProt cdigo: P15538) fue obtenida del Universal Protein Resource (UniProt, http://www.uniprot.org/), que posteriormente fue sujeto a la bsqueda de la similitud en la base de datos de UniProtKB utilizando la herramienta bsica de bsqueda alineacin Local (BLAST) sever en UniProt. Entre los xitos, hCYP11B2 (UniProt cdigo: P19099) con un cristal en complejo con deoxycorticosterone (PDB ID: 4DVQ, cadena A) que demostr la identidad del 93,2% y una E-value de 0,0 fue seleccionado como la plantilla. Las protenas blanco y plantilla experimentaron posteriormente una secuencia inicial basado en el rbol de alineacin y realineacin luego estructural teniendo en cuenta las coordenadas de los carbonos alfa en el cristal de hCYP11B2 con MOE. Despus de establecer el campo de fuerza Amber99 con el campo R de solvatacin, una biblioteca de modelos iniciales diez fue generada utilizando la Integral de volumen de Born generalizado (GB / VI) anotar la funcin, de que la mejor opcin fue seleccionada segn solvatacin electrosttica energtica y raz cuadrada media desviacin de cada modelo intermedio a la posicin media de todos los modelos.

4.3.2. Simulacin molecular dinmicaEl campo de fuerza de Amber99 en primer lugar se aplic el modelo preliminar, y el modelo fue parcialmente acusado y reduce al mnimo energa RMS gradiente de 0.1 antes de la iniciacin de la simulacin de dinmica molecular con MOE. Conformaciones fueron generados en el conjunto estadstico con variables termodinmicas de volumen, temperatura y nmero de partculas se celebra como constantes. El mtododelasecuacionesdeeAndersondeePoincaredenarizdelmovimientofue empleadoparacrearlatrayectoriadelconjunto.Elsistemasecalentde0Ka300Kde60psy,despusdeuntiempode1ns,seenfrahasta0Ken60PS.

4.3.3. AcoplamientomolecularElmodelode lahomologasepreparagregando hidrgenosycargasparcialesmedianteelmduloProtonate3DenMinisterio deeducacin.Compuestode8comoelligandfueconstruidoyminimizadodeenergaenelcampodefuerzaMMFF94sconMOE.Despusdeimportarelmodelode laprotenayelligandoeneloro,elhierrodelhemefuenombradocomoelorigendelsitio activoconunradiode19,aunquelafuncindedeteccinautomticadesitio activotambinfueactivada.Seestableciunarestriccindedistanciade1.5-4.5entreelhierrodelhemeylacoordinacin.El ligandofueatracadoen50iteracionesdelalgoritmogenticoindependienteparacadaserieconparmetrospor defecto.Lasposesdeenlaceresultantefueronevaluadasutilizandolafuncingoldscoreconlosparmetrosp450_pdbyposteriormenteclasificadosegnaptitud.LosmodosdeatardiversosfueronmsinvestigadoseilustradosconelmduloLigXenMinisterio deeducacin.

AGRADECIMIENTOSAgradecemosaJeannineJungpararealizarlaspruebasinvitroyagradecemosalaProf.J.J.RobHermans,UniversidaddeMaastricht,lospases bajos,paraproporcionarlasclulasV79MZhCYP11B1.