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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA ESCUELA DE BIOLOGÍA ACCIÓN DE LA nociceptina/orfanina FQ SOBRE LAS NEURONAS DEL COMPLEJO PERIESOFÁGICO DEL CARACOL TERRESTRE Helix aspersa TESIS PROFESIONAL Autor: Ricardo Cruz Cruz Tutor: Enrique Soto Eguibar Puebla, Pue. Junio del 2001
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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
ESCUELA DE BIOLOGÍA
ACCIÓN DE LA nociceptina/orfanina FQ SOBRE LASNEURONAS DEL COMPLEJO PERIESOFÁGICO DEL
CARACOL TERRESTRE Helix aspersa
TESIS PROFESIONAL
Autor:Ricardo Cruz Cruz
Tutor:Enrique Soto Eguibar
Puebla, Pue. Junio del 2001
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LISTA DE ABREVIATURAS
Ach Acetilcolina
α, β y γ-MSH Hormona estimulante de los melanocitos α, β y γ5-HT SerotoninaAC Adenilato ciclasaACTH Hormona adrenocorticotrópicaAmpPA Amplitud del potencial de acciónAmpPHP Amplitud de la posthiperpolarizaciónBSA Albúmina sérica bovinaA/D Conversor analógico/digitalCGRP Péptido relacionado con el gene de la calcitoninaCHO Células ováricas de Hamsterd+ Pendiente de despolarizaciónd- Pendiente de repolarizaciónDinA, B y 1-8 Dinorfina A, B y 1-8DPDPE [D-pen, D-pen] encefalinaDSLET [D-Ser, D-Leu] encefalina treoninaDura50 Duración del potencial de acción al 50%DuraPA Duración del potencial de acciónDV Discriminador de ventanaEPSPs Potenciales Postsinápticos ExcitatoriosGIRK Canal de K+ rectificante de entradaHA HistaminaHPLC Cromatografía líquida de alta afinidadi.c.v. intracerebroventriculari.t. intratecalIP3 Fosfatidil inositol trifosfatoIPSPs Potenciales Posinápticos InhibitoriosLeu-enc Leucina encefalinaMet-enc Metionina encefalinanoc/oFQ nociceptina/orfanina FQoFQ orfanina FQORC Osciloscopio de rayos catódicosORL-1 Receptor similar al opioide 1PDYN ProdinorfinaPENK ProencefalinaPKA Proteína cinasa APKC Proteína cinasa CPLD Fosfolipasa DPNOC PronociceptinaPOMC ProopiomelanocortinaPPDYN PreprodinorfinaPPENK PreproencefalinapPHP Pendiente de posthiperpolarizaciónPPNOC PrepronociceptinaPPOMC PreproopiomelanocortinaSIA Analgesia inducida por estresSP Sustancia PVIP Péptido intestinal vasoactivoVmem Voltaje de membrana
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ÍNDICERESUMEN 1INTRODUCCIÓN 2
Características generales de moluscos 2Particularidades de Helix aspersa 3Actividad eléctrica de las neuronas del caracol 4Péptidos opioides 7Receptores a opioides 9Mecanismos de acción de péptidos opioides 10Nociceptina/orfanina FQ y su receptor 11Efectos centrales y periféricos de noc/oFQ 13Mecanismos de acción de nociceptina/orfanina FQ 16Péptidos opioides en invertebrados 18
JUSTIFICACIÓN 22HIPÓTESIS 22OBJETIVOS 22MATERIAL Y MÉTODO 23
Preparación de las drogas 23Modelo biológico 23Disección 23Registro intracelular 24Microperfusión con Noc/oFQ 25Análisis de resultados 25Obtención de la nociceptina/orfanina FQ 26
RESULTADOS 27Controles 27Efectos de la noc/oFQ 29
DISCUSIÓN 40CONCLUSIONES 45BIBLIOGRAFÍA 46APÉNDICE 57
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RESUMEN
El heptadecapéptido nociceptina/orfanina FQ (noc/oFQ) fue identificado como un
ligando endógeno de alta afinidad para el receptor opioide ORL-1. La presencia de este
péptido en el complejo periesofágico de Helix aspersa y su influencia sobre la conducta
térmica aversiva en el caracol Cepaea nemoralis indican que la noc/oFQ desempeña un
papel fundamental en el sistema nervioso de los moluscos. Por esta razón decidimos
estudiar su efecto sobre la actividad eléctrica de las neuronas de los ganglios
subesofágicos y cerebrales del caracol Helix aspersa con el fin de dilucidar el papel
funcional y el mecanismo de acción de la noc/oFQ en estas neuronas.
Se realizaron registros intracelulares en neuronas del complejo periesofágico con
electrodos de vidrio que fueron llenados con KCl 3 M, con resistencia de entre 30 y 60
MΩ. Se seleccionaron las células cuyo potencial de membrana era mayor a -40 mV y
cuyos potenciales de acción tenían un sobretiro. Los experimentos se grabaron en
videocassettes y se procesaron fuera de línea. Se estudió la frecuencia de descarga y
la forma de los potenciales de acción antes y después de la aplicación del péptido. Para
la aplicación de la noc/oFQ se acercó a la célula en registro una micropipeta de
aproximadamente 300 µm de diámetro en la punta y la droga se aplicó por eyección de
presión. Se aplicaron 100 µl en un período de 15 a 20 segundos en concentraciones de
1 µM (n=6), 10 µM (n=8), 50 µM (n=4) y 100 µM (n=6).
La microperfusión de noc/oFQ 1 µM no produjo cambios ni en la frecuencia de
descarga ni en la morfología de los potenciales de acción después de la aplicación del
péptido. Mientras que a concentración 10, 50 y 100 µM se observaron grupos de
neuronas en que se produjo un efecto excitatorio, en tanto en otras células el efecto fue
de tipo inhibitorio. La morfología del potencial de acción no se modificó en la mayoría de
los casos, aunque en algunas ocasiones la fase de posthiperpolarización se hizo más
rápida.
Estos resultados coinciden con los hallazgos inmunohistoquímicos, en los que se
demostró la presencia de inmunorreactividad a noc/oFQ en neuronas del complejo
periesofágico de esta especie.
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NTRODUCCIÓN
1.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES DE MOLUSCOSDespués de los artrópodos, los moluscos constituyen el phylum más grande del reino
animal, en el cual se incluyen caracoles, pulpos, calamares, ostras y almejas. Los
miembros de este phylum poseen simetría bilateral y se caracterizan por presentar una
cubierta protectora de la masa visceral llamada manto que envuelve tanto a la cabeza
como al pie (un sistema muscular complejo que sirve para la locomoción) y que es el
encargado de secretar la concha. Entre el manto y la masa visceral existe un espacio
denominado cavidad del manto que contiene los órganos respiratorios, los órganos de
los sentidos (osfradio), las branquias (ctenidio) y que a su vez, se abre al sistema
reproductivo, al sistema renal y al recto. Por su parte, la masa visceral alberga al
hígado, al corazón, a la glándula digestiva y a los órganos reproductivos (Kandel, 1979)
(Figura 1). Su sistema nervioso es una serie de aproximadamente seis pares de
ganglios bien definidos: bucal, cerebral, pleural, pedal, parietal y visceral. Todos los
ganglios se comunican por varios tipos de conexiones y comisuras que componen un
anillo nervioso alrededor del esófago (Barnes, 1989; Bullock, 1977).
Gónada
Hígado
Estómago
Glánduladigestiva
Músculo columelar
OpérculoPieEsófagoEstatocistoAparato radular
Boca
Probóscide
Ojo
Tentáculo cefálico
OsfradioAno
Cavidad del mantoSifón
CtenidioGlándula hipobranquial
CorazónOviducto
Receptáculo seminal
Aorta posterior
Figura 1. Anatomía general de los gasterópodos, indicando la posición de sus órganos internos(modificado de Brusca y Brusca, 1990).
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1.1.1 PARTICULARIDADES DE Helix aspersaSe caracteriza por tener una concha de forma espiral. Posee un grueso pie y pulmones
rudimentarios, en lugar de branquias (ctenidio) (Russell-Hunter, 1979). En la cabeza
posee 4 tentáculos: dos corresponden a los ojos y dos a otros órganos sensoriales
incluyendo el olfato y el tacto. El sentido del tacto está distribuido por toda la superficie
del cuerpo, pero se localiza principalmente en los dos pares de tentáculos que se
encuentran en la cabeza.
El sistema nervioso está compuesto por un par de ganglios bucales y nueve
ganglios ordenados en un complejo ganglionar periesofágico (dos cerebrales, dos
pleurales, dos pedales, dos parietales y uno visceral) (Figura 2). Cada ganglio está
formado por grupos de neuronas motoras unipolares e interneuronas. En el interior del
ganglio se encuentra el neuropilo el cual presenta apéndices entrelazados que permiten
múltiples conexiones y que contribuyen a la complejidad del circuito (Ratté y Chase,
Figura 2. Diagrama del complejo periesofágico del caracol terrestre Helix aspersa, mostrando losganglios cerebrales (A,B), pleurales (C,G), pedales (H,I), parietales (D,F) y viscerales (E).Modificado de Kerkut y cols., 1975.
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1997). Las neuronas desarrollan conexiones con neuropilos de varios ganglios y, por lo
tanto, reciben y distribuyen impulsos eléctricos en numerosas uniones sinápticas.
Los ganglios cerebrales se encuentran situados en la parte anterior del pie, por
debajo del esófago y de ellos parten dos pares de cordones nerviosos que se prolongan
hacia la región posterior del complejo periesofágico hasta conectarse con los ganglios
pedales y pleurales, los cuales, están unidos entre sí por otro par de nervios. Del
ganglio pedal emergen dos cordones nerviosos que se comunican con los ganglios
parietales y que desembocan en el ganglio visceral. Los ganglios pedal, pleural, parietal
y visceral están localizados en la línea media del pie, por encima del esófago formando
la masa ganglionar subesofágica (Barnes, 1989; Brusca y Brusca, 1990).
Los ganglios bucales inervan el aparato radular y el esófago. Los ganglios
cerebrales se subdividen en protocerebro, mesocerebro y postcerebro, y están
encargados de inervar los ojos, los estatocistos, la boca, los tentáculos, el pie y la
superficie de la cabeza. Los ganglios pleurales inervan el manto y el músculo columelar.
Los ganglios pedales inervan los músculos del pie, la piel y los pliegues epidodiales
(quimiorreceptores). Los ganglios parietales inervan al osfradio. El ganglio visceral
inerva el corazón, el hígado, el riñón, el sistema digestivo, el ano y la musculatura del
cuerpo (Barnes, 1989; Brusca y Brusca, 1990).
1.2. ACTIVIDAD ELÉCTRICA DE LAS NEURONAS DEL CARACOLLos primeros intentos por identificar neuronas mediante criterios morfológicos, en los
gasterópodos, se enriquecieron notablemente con el uso de técnicas electrofisiológicas
que permitieron, más adelante, caracterizar a las neuronas en cuanto a sus patrones de
descarga y de respuesta a estímulos antidrómicos sobre las terminaciones nerviosas
(Kerkut y cols., 1975).
Mediante la técnica de registro intracelular, las neuronas del sistema nervioso
central de los caracoles han sido diferenciadas y, atendiendo su actividad eléctrica,
éstas pueden dividirse en: 1) silentes o 2) con descarga espontánea (marcapaso o
sináptica).
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Las neuronas silentes mantienen su potencial de membrana en reposo sin presentar
variaciones endógenas, por lo que no generan potenciales de acción, excepto cuando
se les estimula.
Por su parte, las células que presentan descarga espontánea pueden dividirse en
dos grupos: 1) aquellas que son excitadas a través de múltiples conexiones sinápticas
con otras neuronas activas y que, por lo tanto, desarrollan patrones de descarga
irregulares con una gran cantidad de EPSPs e IPSPs (Figura 3a) y 2) las que presentan
actividad marcapaso. Estas últimas se agrupan en dos categorías; la más común
corresponde a células con descarga regular rítmica, las cuales poseen menor número
de entradas sinápticas (en comparación con las células con descarga irregular) y que
por lo tanto, poseen una frecuencia de descarga estable durante largos periodos de
tiempo (Figura 3b). El grupo de neuronas menos frecuente comprende células con ritmo
marcapaso bimodal o bifásico en el cual se observan periodos de descarga en trenes o
ráfagas seguidos por una fase inhibitoria de larga duración en donde la célula se
hiperpolariza impidiendo el disparo de potenciales de acción (Kerkut y cols., 1969
Salánki y Vehovszky, 1981) (Figura 3c). Este tipo de actividad puede tener varios
orígenes: en primera instancia, un nervio contiene fibras nerviosa excitatorias e
inhibitorias que pueden hacer sinapsis con una neurona dentro del sistema nervioso, si
estas fibras poseen umbrales de activación distintos, la fibra con el umbral más bajo
estimularía primero y la fibra con el umbral alto lo haría después, provocando una
descarga bifásica en la neurona blanco. Otra alternativa podría ser que ambas
respuestas (excitatoria e inhibitoria) puedan ser mediadas por vías polisinápticas en las
cuales intervengan interneuronas. Finalmente, es posible que exista la presencia de
más de un tipo de receptor postsináptico para un solo transmisor, en este caso la
respuesta en la neurona blanco dependería de los patrones de actividad de la fibra
presináptica (Kerkut y cols., 1975). Otra posibilidad es que las propiedades de las
corrientes iónicas presentes en la membrana de la célula tengan relaciones de
amplitudes y cinéticas tales que el potencial de membrana oscile de forma rítmica
produciendo la descarga en ráfagas.
Como se mencionó anteriormente, la actividad eléctrica de las células del
sistema nervioso se ve influenciada en gran medida por conexiones sinápticas. En el
9
complejo periesofágico del caracol terrestre Helix aspersa se han identificado un gran
número de moléculas que pueden modular el patrón global de descarga de las
neuronas; entre los más estudiados se encuentran acetilcolina (Ach), aminoácidos
como el glutamato y aminas biogénicas como la serotonina (5-HT), la dopamina y la
histamina (HA). En el caso de Ach, 5-HT, glutamato y dopamina la aplicación
independiente de cada uno de ellos produce efectos excitadores, inhibidores y bifásicos
(Kerkut y cols., 1975) mientras que la perfusión de HA ejerce sólo efecto excitador
(Kerkut y cols., 1970). El mismo tipo de efectos fue reportado por Ikumi y su grupo en
1982 para serotonina y dopamina en Achatina fulica (Ikumi y cols., 1982).
Por otra parte, se han identificado diversos péptidos bioactivos como encefalinas,
dinorfinas, FMRF-amida, substancia P (SP), péptido relacionado con el gene de la
10 seg
20 mV
8998-9
A
20 mV
51699-1
5 seg
C
Figura 3. Actividad eléctrica de las neuronas del complejo periesofágico del caracol Helixaspersa. (A) Descarga irregular, la cual presenta mayor cantidad de EPSP. (B) Descargatipo marcapaso. (C) Marcapaso bimodal. Registros obtenidos en el Laboratorio deNeurofisiología Sensorial en el Instituto de Fisiología de la BUAP por el autor.
28699-28
B
20 mV
1 seg
10
calcitonina (CGRP), péptido intestinal vasoactivo (VIP), gastrina y colecistoquinina en el
sistema nervioso del caracol Helix aspersa, y aunque no se ha descrito su efecto sobre
la actividad eléctrica de las neuronas del complejo periesofágico, es muy probable que
estos péptidos puedan modular dicha actividad.
1.3 PÉPTIDOS OPIOIDESEn el año de 1803, Derosne obtuvo una sal de opio que, por su poder narcotizante,
denominó narcotina. Posteriormente, Sertürner purificó de la planta de opio un
componente al que llamó morphinum (en referencia a Morfeo dios del sueño) el cual
tenía cualidades analgésicas y narcóticas.
Diversos intentos para determinar los mecanismos de acción de la morfina
guiaron al descubrimiento de los péptidos opioides endógenos: las encefalinas (Hughes
y cols., 1975), las endorfinas (Goldstein y cols., 1971; Bradbury y cols., 1976) y las
dinorfinas (Kakidani y cols., 1982).
Los péptidos opioides endógenos están ampliamente distribuidos en el cerebro y
en el sistema nervioso periférico (Boom y cols., 1999) y juegan un papel fundamental en
la nocicepción, las funciones endocrinas, cardiovascular, gastrointestinal e
inmunológica, actuando como neurotransmisores o como neuromoduladores.
Técnicas en biología molecular han demostrado que existen tres proteínas
precursoras de péptidos opioides (Uhl, Childens y Pasternak, 1994). Cada una de ellas
es una larga prohormona peptídica: la proopiomelanocortina (POMC) (Nakanishi y cols.,
1979), la proencefalina A (PENK) (Comb y cols., 1982) y la proencefalina B o
prodinorfina (PDYN) (Kakidani y cols., 1982). Todas ellas se caracterizan por poseer un
péptido señal necesario para su procesamiento postraduccional en el retículo
endoplásmico y en el aparato de Golgi. Cada prohormona es cortado por enzimas
proteolíticas las cuales son empaquetadas junto con los precursores opioides en las
vesículas de secreción. El procesamiento postraduccional varía dependiendo del tipo
celular, inclusive dentro de una misma célula la expresión de estos péptidos puede
variar gracias a diversos procesos regulatorios.
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El gene de la POMC es traducido dentro de una prohormona de 267 aminoácidos. El
procesamiento postraduccional produce varios péptidos opioides pequeños entre los
que se encuentran la Met-encefalina, la β-endorfina y la β-lipotropina (Figura 4a). Esta
prohormona contiene pequeños fragmentos biológicamente activos que no están
relacionados con los péptidos opioides y que son: hormona adrenocorticotrópica
(ACTH) y hormona estimulante de los melanocitos αβγ (α-MSH, β-MSH y γ-MSH), las
cuales se sintetizan en la adenohipófisis.
El gene que codifica para la PENK es un precursor proteico con 267
aminoácidos. En esta proteína (Figura 4b) existen cuatro copias de Met-encefalina y
una de Leu-encefalina, Met-encefalina-Arg6-Phe7 y Met-encefalina-Arg6-Gly7-Leu8.
Alternativamente, el precursor PENK puede ser procesado en un péptido que contiene
encefalinas largas, entre las que se incluyen: la BAM-18P, la metorfamida, la
amidorfina, el péptido E y el péptido F.
COOHNH2
Señal PPNOC
Nocistatina
Nociceptina!
PPNOC154-181
COOHNH2
Señal PPDYN DinA DinB
Din 1-8
ββββ-Neoendorfina
αααα-Neoendorfina
COOHNH2
Señal
PPENK
Péptido F Péptido E
COOHNH2
Señal PPOMC
αααα-MSH ββββ-LPH
ββββ-MSHββββ-Endorfina
ACTHγγγγ-MSH
Leu-enc
Met-enc Arg-Gly-LeuMet-enc Met-enc
Arg-Phe
A
B
C
D
Figuras 4. Precursores de péptidos opioides y sus posibles productos. En A se observa lapreproopiomelanocortina (PPOMC) y sus fragmentos β-endorfina, hormona estimulante de losmelanocitos α, β y γ (α, β y γ-MSH), hormona adrenocorticotrópica (ACTH) y hormona lipotrópica β(β-LPH). En B la preproencefalina (PPENK) y sus fragmentos metionina-encefalina (Met-enc),leucina-encefalina (Leu-enc), péptido E y F. En C la preprodinorfina (PPDYN) y sus fragmentos α yβ neoendorfina, dinorfina A,B y 1-8 (DinA, DinB y Din1-8). Y en D la prepronociceptina (PPNOC) ysus fragmentos nocistatina, nociceptina y prepronociceptina154-181, (PPNOC154-181) (modificado deFeldman y cols., 1997).
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El gene de la PDYN es una prohormona de 254 aminoácidos (Figura 4c) la cual, al ser
segmentada, puede producir tres copias de leu-encefalinas, o bien una copia de
dinofina A, dinorfina B, α neoendorfina y β neoendorfina.
1.3.1 RECEPTORES A OPIOIDESEstudios farmacológicos han definido al menos tres clases de receptores a opioides
denominados µ, δ y κ, que difieren en su afinidad por varios ligandos y en su
distribución en el sistema nervioso. Estos receptores se encuentran acoplados a
proteínas Gi/0 y presentan una misma estructura general con una región extracelular
amino terminal, siete dominios transmembranales y una estructura carboxilo terminal
intracelular (Figura 5).
El receptor µ se define operacionalmente como el sitio de alta afinidad en que los
opioides producen analgesia, aumento del tono muscular, constipación, oliguria, fuerte
depresión respiratoria e intensa dependencia física. La morfina, las endorfinas, y las
endomorfinas se unen a este receptor y su efecto es antagonizado por naloxona
(Chang y Cuatrecasas, 1979; Zadina y cols., 1997).
Extracelular
Membranaplasmática
Intracelular
Figura 5. Estructura del receptor δ. Cada circulo representa un aminoácido. Los siete dominiostransmembranales son típicos de receptores acoplados a proteínas G. Los círculos obscurosrepresentan sitios de fosforilación para proteínas cinasas A y C (PKA y PKC) (modificado deFeldman y cols., 1997).
13
Se han identificado dos tipos de receptores µ: el µ1, de alta afinidad a la morfina y a los
opioides, y que se encuentra principalmente en el sistema nervioso central; y el µ2,
presente en el sistema nervioso periférico y con baja afinidad a la morfina (Pasternark y
Wood, 1986).
Por su parte, el receptor δ, juega un papel importante en la depresión respiratoria
y no parece mediar la analgesia (Pasternak, 1982; Lord y cols., 1977). Tiene gran
afinidad por todos los péptidos derivados de la proencefalina, pero también puede unir
endorfinas y dinorfina 1-8 (Akil y cols., 1984). El principal antagonista selectivo de este
receptor es el naltrindol.
En 1991, Jiang y su grupo sugirieron la existencia de dos subtipos de receptor δ
con base en la potencia de los agonistas: el receptor δ1, al que se une con alta afinidad
la [D-pen, D-pen]encefalina (DPDPE), y el δ2, que tiene como agonista preferencial a la
[D-Ser, D-Leu]encefalina-treonina (DSLET) (Portoghese y cols., 1992).
El receptor κ se ha postulado para drogas del tipo de la ketazocina, y su acción
analgésica es pobre (Martin y cols., 1976). Participa en funciones como la diuresis, la
nocicepción, la alimentación y las secreciones endocrinas (Hansen y Morgan, 1984).
Las dinorfinas y las neoendorfinas son agonistas de este receptor, que es antagonizado
por nor-binaltorfimina y naloxona.
Se han descrito tres tipos de receptores κ: el κ1, al que se une el U50488 y los κ2
y κ3, que ligan preferencialmente el benzomorfán.
1.3.2 MECANISMOS DE ACCIÓN DE PÉPTIDOS OPIOIDESLos sistemas efectores a los que están acopladas los péptidos opioides incluyen la
inhibición de la adenilatociclasa (AC), la activación del ciclo de los fosfoinosítidos y la
regulación de canales de potasio y calcio.
La unión de agonistas opioides a sus receptores activa proteínas Gi/o, que inhiben
a la adenilatociclasa (AC) en un proceso dependiente de GTP, lo que conlleva a una
disminución en la producción de AMPc, esencial en diversas cascadas de señalización
intracelular. Este proceso es sensible a naloxona (antagonista de los receptores µ, κ y
δ) y a toxina pertusis (inhibidor de proteínas Gi/o).
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El efecto de los agonistas del receptor µ, tales como la morfina y la morficeptina,
es el incremento de la actividad de la proteina cinasa C (PKC) en el citosol. Este
proceso es mediado por la fosfolipasa D (PLD), la cual promueve la formación de
fosfatidilinositol y diacilglicerol (Mangoura y Dawson, 1993; Narita y cols., 1994),
involucrados es una gran variedad de procesos celulares.
Por otra parte, el efecto de péptidos opioides sobre canales iónicos es
igualmente mediado por proteínas G (Brown y Birnbaumer, 1990). La activación de
estas proteínas, por medio de los receptores δ y µ, incrementa las conductancias de K+
provocando una hiperpolarización de las células. En algunos tejidos, el aumento en las
corrientes de K+ acelera la fase de repolarización e incrementa la magnitud de la
posthiperpolarización del potencial de acción. Aunque se carece de evidencias que
involucren a los receptores κ en la regulación de las conductancias de K+, se piensa,
que en algunos tejidos, estos receptores pueden alterar la función de los canales de
potasio (Carpenter y cols., 1996).
Por su parte, agonistas de receptores µ, δ y κ disminuyen las conductancias de
Ca2+ al cerrar canales tipo N en varios tejidos (Ottolia y cols., 1998; Adams y
Terquettrini, 1998; Endoh y Suzuki, 1998; King y cols., 1999). A su vez, los receptores δ
modulan canales de calcio tipo L y P/Q en neuronas del ganglio submandibular del
hamster, efecto que es bloqueado por naloxona (Endoh y Suzuki, 1998). Asimismo, la
dinorfina A (agonista del receptor κ) disminuye las corrientes de Ca2+ tipo P en
neuronas del ganglio de la raíz dorsal (Wiley y cols., 1997).
El acoplamiento entre el aumento de las corrientes de K+ y el decremento de las
corrientes de Ca2+ reduce potencialmente la liberación de neurotransmisor y puede ser
el responsables del efecto analgésico de los opioides (DiChiara y North, 1992).
1.4 NOCICEPTINA/ORFANINA FQ Y SU RECEPTORDurante varios años se pensó que existían solamente tres clases de receptores a
péptidos opioides en los organismos. Sorprendentemente, Mollereau y su grupo, en
1994, descubrieron la presencia de un cuarto gene que codifica para este tipo de
receptores. Este último une agonistas y antagonistas opioides con muy baja afinidad
(Mollereau y cols., 1994) y fue llamado receptor huérfano similar al opioide (ORL-1).
15
El receptor ORL-1 (también conocido como: LC132, XOR, ROR-C, KOR3, Hyp 8-1, C3
y NOR) presenta una homología de entre 63 y 65 % en su secuencia de aminoácidos
con respecto de los otros tres receptores, pero su segunda asa extracelular posee una
característica ácida que lo asemeja más al receptor κ (Meunier y cols., 1995;
Hawkinson y cols, 2000).
Basándose en la distribución del transcripto del receptor ORL-1 en el cerebro y
en la médula espinal, y antes de identificar su ligando endógeno, se consideró que
podría desempeñar un papel en procesos nociceptivos. Siguiendo esta línea, Meunier y
su grupo, en 1995, aislaron de cerebro de rata un heptadecapéptido que se une
específicamente a ORL-1 y que, al ser inyectado por vía intracerebroventricular (i.c.v.),
produce hiperalgesia. Este neuropéptido fue llamado nociceptina. En 1995 Reinscheid y
colaboradores demostraron la presencia de un péptido idéntico a nociceptina en el
cerebro porcino; éste posee afinidad nanomolar por el receptor ORL-1 y fue nombrado
orfanina FQ (oFQ).
La nociceptina/orfanina FQ (noc/oFQ) es transcrita a partir del gene denominado
PNOC, el cual es un precursor que codifica para péptidos opioides endógenos, su
procesamiento postraduccional produce una copia de noc/oFQ, una de nocistatina
(prepronociceptina125-132) y una de prepronociceptina154-181 (Figura 4d) (Mollereau y cols.
encefalina
encefalina
Noc/oFQ
Leu-
Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Ala-Asn-Gln-OH
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Gln-OH
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Val-His-Lys-Lys-Gly-Gln-OH
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro-Lys
Dinorfina
Met-
ββββ-endorfina
Neoendofina
Tabla I. Secuencia de aminoácidos de los principales péptidos opioides. En negritas semuestran los residuos de aminoácidos conservados con respecto a nociceptina. Nótese quela secuencia Tyr-Gly-Gly-Phe está presente en todos los péptidos excepto en la noc/oFQ,donde la Tyr es sustituida por Phe. Como puede observarse las dinorfinas presentan unamayor similitud con la noc/oFQ (modificado de Julius, 1995).
16
1996). La similitud entre el gene de la PNOC y los otros tres precursores opioides
sugiere que pueden haber derivado de un ancestro común (Mollereau y cols., 1996;
Darlison y cols.,1999).
Al igual que los otros tres precurosres opioides la PPNOC, presenta un péptido
señal, el cual es escencial para ingresar al retículo endoplasmico. El procesamiento
postraduccional de la PNOC se lleva a cabo en los granulos de secreción después de
haber sido formados en el aparato de Golgi.
La noc/oFQ es homóloga de las endorfinas, encefalinas y dinorfinas (Tabla I),
principalmente de la dinorfina A (Guerrini y cols, 2000), pero a diferencia de esta última,
carece de una tirosina en el extremo amino terminal esencial para la activación de los
receptores µ, κ y δ, de ahí la gran especificidad de noc/oFQ por el receptor ORL-1.
Interesantemente, la nocistatina es un péptido que funciona como antagonista de la
nociceptina, pero se sabe que éste no es un antagonista competitivo debido a que no
actúa directamente sobre el receptor ORL-1 (Okuda–Ashitaka y cols., 1999; Zhao y
cols., 1999). Hasta el momento no existen reportes que describan la actividad biológica
de la prepronociceptina154-181.
1.4.1 EFECTOS CENTRALES Y PERIFÉRICOS DE noc/oFQInicialmente se propuso que la noc/oFQ era un péptido que provocaba nocicepción
(Meunier y cols., 1995; Reinscheid y cols., 1995). Estudios subsecuentes, utilizando
controles adicionales, mostraron que la inyección i.c.v., por sí misma, provoca una
analgesia inducida por stress (SIA) que puede ser revertida por naloxona y noc/oFQ. El
hecho de que la SIA haya sido revertida por naloxona indica que este mecanismo es
mediado por opioides y que la noc/oFQ actúa como un antiopioide (Mogil y cols.,
1996a). La analgesia inducida por agonistas de los receptores µ (DAMGO), δ (DPDPE)
y κ (U50488H) es bloqueada por la inyección i.c.v. de noc/oFQ (Mogil y cols., 1996b),
así como la analgesia inducida por morfina en ratones (Grisel y cols., 1996) y ratas
(Tian y cols., 1997).
Se demostró también que noc/oFQ es completamente inefectiva para revertir la
analgesia inducida por morfina administrada por vía intratecal (i.t.), indicando que
17
funciona como un analgésico supraespinal, pero no como un analgésico espinal (Grisel
y cols., 1996; Tian y cols., 1996).
De acuerdo con lo que se esperaba, en 1997, King y su grupo reportaron una
rápida aparición de analgesia espinal en ratones al administrar dos fragmentos de
noc/oFQ (noc/oFQ(1-11) y noc/oFQ(1-7)) por vía i.t., efecto que fue revertido por naloxona
(King y cols., 1997). En contraste, se detectó analgesia insensible a naloxona en ratas,
al aplicar noc/oFQ por esta misma vía (Xu y cols., 1996). Se demostró además que no
existe tolerancia cruzada entre el efecto antinociceptivo de la inyección i.t. de noc/oFQ y
morfina, indicando que estos dos fármacos activan distintos receptores (Hao y cols.,
1997).
Con algunas excepciones (Rossi y cols., 1996; Hara y cols., 1997), se ha
demostrado que la noc/oFQ ejerce un efecto dicotómico en el cual la administración
supraespinal produce hiperalgesia (antagonizando la analgesia opioide) y la espinal
analgesia (similar a la de los péptidos opioides).
En algunas ocasiones, el efecto de la noc/oFQ es antagonizado por naloxona
Rossi y cols., 1996; King y cols., 1997); ello se debe a la influencia indirecta de distintos
mecanismos opioides, ya que la naloxona no se une al receptor OLR-1.
El efecto de la noc/oFQ en respuestas nociceptivas es más complicado que un
simple descenso en el umbral nociceptivo. Varios estudios han demostrado que este
péptido produce hiperalgesia, bloqueo de la hiperalgesia, analgesia, bloqueo de la
analgesia, bloqueo de la alodinia o bien, ningún efecto (Grisel y cols, 1996; Meunier y
cols, 1995; Reischeid y cols, 1995; Xu y cols, 1996 y Pan y cols, 2000). Los factores
que difieren entre estos estudios son la especie, la vía de administración, el índice de
conductas medidas, la dosis administrada y el estado fisiológico del sujeto. Estas
diferencias pueden contribuir a la variabilidad de resultados (Harrison, 2000). No
obstante, esto no impide proponer que la noc/oFQ media un amplio espectro de
respuestas algésicas y analgésicas en los seres vivos.
Se ha demostrado también que la noc/oFQ tiene un efecto en la locomoción.
Reinscheid y su grupo, en 1995, notaron que la inyección i.c.v. (0.1 a 10 nM) de este
péptido en ratones causó un decremento en la actividad vertical y horizontal, así como
una disminución del tono muscular (Reinsched y cols., 1995). Tales resultados fueron
18
confirmados en ratas a dosis de 10 y 100 nM, observándose fallas en la coordinación,
equilibrio y tono muscular. La tolerancia al péptido se desarrolló a los 2 y 3 días
después de la primera inyección y desapareció a los 7 días después de la última
(Devine y cols., 1996). Sin embargo, otros estudios han demostrado que la aplicación
i.c.v. de noc/oFQ en ratones puede causar un incremento en la locomoción vertical y
horizontal. Este efecto es insensible a naloxona y puede ser revertido por agonistas
dopaminérgicos (Florin y cols., 1996). La influencia sobre la acción motora es
específicamente supraespinal, ya que la administración i.t. de noc/oFQ (0.5 a 10 nM)
no produce signos de deficiencia motora (Xu y cols., 1996; Tian y cols.,1997).
La noc/oFQ ejerce varios efectos sobre la conducta alimenticia. La aplicación
i.c.v. de 1, 3 y 10 nM del péptido produce la ingesta de alimento durante las primeras 4
horas luego de la inyección a ratas saciadas (Pomonis y cols., 1996; Stratford, 1997).
Este efecto fue sensible a naloxona y puede involucrar un sinergismo con receptores
opioides.
Los altos niveles de RNAm (Mollereau y cols., 1994) y proteína (Anton y cols.,
1996) de ORL-1 en el hipocampo, sugiere la participación de la noc/oFQ en procesos
cognitivos. Adicionalmente, microinyecciones en esta región deterioran el aprendizaje
espacial en ratas (Sandin y cols., 1997). Registros electrofisiológicos apoyan esta teoría
ya que se ha demostrado que agonistas de receptores µ y δ facilitan la inducción de la
potenciación a largo plazo (LTP) en neuronas del hipocampo; mientras que las
dinorfinas (que actuan sobre el receptor κ) y la noc/oFQ ejercen un efecto opuesto
reduciendo la pendiente de los EPSPs y la amplitud de los potenciales de acción. Estos
resultados sugieren que tanto la noc/oFQ como las dinorfinas modulan la plasticidad
sináptica envuelta en la memoria y el aprendizage y que el contrabalance entre los
receptor ORL1 y los receptores µ y δ pueden jugar un rol importante en la regulación de
la eficacia sináptica y la plasticidad funcional (Yu y cols., 1997).
Aunque no ha sido ampliamente estudiado, se sabe que la noc/oFQ regula
procesos involucrados con la motivación (Murphy y cols., 1996), la ansiedad (Jenck y
cols., 1997), la diferenciación neuronal (Saito y cols., 1996), la secreción
neuroendocrina (Bluet-Pajot y cols., 1997), la liberación de neurotransmisor (Faber y
19
cols., 1996) y las percepciones sensoriales como el olfato, el gusto, la audición
(Darland, 1998) y la vista (Neal y cols., 1997).
Por otra parte, varios estudios han demostrado la actividad de noc/oFQ en tejidos
periféricos, principalmente en el músculo liso, donde inhibe la respuesta a estímulos
eléctricos en pelvis aislada de cobayo (Giuliani y Maggi, 1996) y la contracción de los
conductos deferentes de ratón (Berzetei-Gurske y cols., 1996). Funciona como un
potente vasodilatador de la arteria femoral y de la carótida (Gumusel y cols., 1997),
produciendo hipotensión en ratas (Champion y Kadowits, 1997; Giuliani y cols., 1997).
En músculo esquelético disminuye en un 50% la contracción del íleo del cobayo (Zhang
y cols., 1997).
La noc/oFQ actúa también sobre las funciones renales, debido a que la inyección
intravenosa del péptido produce diuresis y suprime la excreción de sodio en el flujo
urinario de la rata. Efectos similares se observan después de la administración i.c.v. del
péptido (Kapusta y cols., 1997). Por esta razón se piensa que la noc/oFQ desempeña
funciones homeostáticas (Darland, 1998).
Aunque su presencia no ha sido demostrada directamente, se piensa que
noc/oFQ tiene un papel en la función inmunológica, ya que el RNAm transcrito de ORL-
1 está presente en linfocitos humanos (Wick y cols., 1995) y de ratón (Halford y cols.,
1995).
1.4.2 MECANISMO DE ACCIÓN DE NOC/OFQDebido a que las asas intracelulares del receptor ORL-1 y de los receptores opioides
poseen un gran número de secuencias idénticas, es factible anticipar que ORL-1 está
acoplado a los mismos efectores celulares regulados por proteínas G(i/o) (Hawes y cols,
2000).
Anteriormente se había reportado que altas dosis de etorfina y dinorfina(1-13 y 1-17)
(agonistas del receptor κ) inhibían la acumulación de AMPc estimulada por forscolina en
células ováricas de hamster (CHO) (Mollereau y cols., 1994). En 1995 se demostró que
la noc/oFQ producía el mismo efecto, pero en un proceso insensible a naloxona
(Reinscheid y cols., 1995; Meunier y cols., 1995). Dos años después, Ma y
colaboradores reportaron la presencia del receptor ORL-1 (Ma y cols., 1997) en la línea
20
celular de neuroblastoma-glioma 108-115 y encontraron que la noc/oFQ es capaz de
inhibir a la adenilato ciclasa (AC) (esencial para la producción de AMPc y para la
subsecuente activación de PKA), en un proceso sensible a toxina pertusis, pero no a
naltrindole, demostrando que el receptor OLR-1 se acopla a una proteína G(i/o).
Por otra parte, la unión de noc/oFQ al receptor OLR-1 estimula a las
subunidades β y γ de la proteína Gi en CHO, promoviendo la producción de fosfatidil
inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol, los cuales subsecuentemente activan a la PKC.
Este efecto no fue revertido ni por naloxona (antagonista de los receptores µ, κ y δ) ni
por naltrindole (antagonista del receptor δ). Sin embargo, el pretratamiento de estas
células con toxina pertusis eliminó completamente la activación de PKC (Lou y cols.,
1997). Siguiendo esta línea, Pei y su grupo, en 1997, encontraron que la exposición
crónica de CHO a este péptido produce una desensibilización del receptor ORL-1,
efecto que es revertido por inhibidores de PKC, pero no de PKA. Esto indica que PKC
es la responsable de los procesos involucrados en la tolerancia y la dependencia a
noc/oFQ.
Registros de fijación de voltaje con la modalidad parche perforado han
demostrado que el receptor ORL-1 está acoplado al canal de potasio rectificante de
entrada (GIRK), debido a que dosis nanomolares de noc/oFQ activan este canal e
incrementan la conductancia al K+ en oocitos de Xenopus (Matthes y cols., 1996) y en
neuronas del rafé dorsal de la rata, mediante un proceso insensible a naloxona
(Vaughan y Chistie, 1996). La activación de estos canales por noc/oFQ induce una
corriente saliente de K+ en neuronas del locus coeruleus (Connor y cols., 1996). y en
células de la amigdala (Meis y Pape, 1998). Esto canales también son blanco de la
noc/oFQ en neuronas de la sustancia gris periacueductal (Vaughan y cols., 1997) y del
hipotálamo ventromedial (Lee y cols., 1997), además en células de los núcleos
supraquiasmático, supraóptico y arcuato de la rata (Allen y cols., 1999; Slugg y cols.,
1999; Wagner y cols., 1998), así como en neuronas piramidales del hipocampo de rata
(Amano y cols., 2000) y de ratón (Ikeda y cols., 1997). Las corrientes activadas en la
amígdala, en la sustancia gris periacueductal, en el hipotálamo ventromedial y en los
núcleos supraquiasmático, supraóptico y arcuato no fueron revertidas por naloxona; sin
embargo, las corrientes evocadas en el locus coeruleus fueron levemente
21
antagonizadas por este fármaco. Por su parte, las corrientes salientes de K+ en las
neuronas del hipocampo de rata fueron insensibles a nocistatina (ver pagina 11).
Además de estos resultados, se ha reportado una influencia de noc/oFQ sobre
los canales de calcio dependientes de voltaje. Por ejemplo, en células de
neuroblastoma humano SH-SY5Y que expresan naturalmente el receptor ORL-1, el
péptido inhibe en un 40 % la conductancia del canal de calcio tipo N, efecto que es
abolido por toxina pertusis pero no por antagonistas opioides (Connor y cols., 1996). A
su vez, Knoflach y su grupo, en 1996, registrando neuronas de hipocampo de rata,
demostraron que los canales de calcio tipo L, N y P/Q son parcialmente inhibidos al
aplicar noc/oFQ en la perfusión, en un proceso sensible a toxina pertusis e insensible a
naloxona. Estos datos sugieren que la acción de la noc/oFQ reduce la excitabilidad
neuronal o la secreción de neurotransmisor al activar los canales GIRK y al reducir las
corrientes de Ca2+ que fluyen a través los canales tipo N, los cuales están involucrados
en el control de la exocitosis de los neurotransmisores.
1.5 PÉPTIDOS OPIOIDES EN INVERTEBRADOSEstudios multidisciplinarios, farmacológicos, fisiológicos e inmunohistoquímicos han
sido de gran utilidad en la investigación de la biología comparada de los péptidos
opioides y de las posibles funciones en las que participan a lo largo de la escala
filogenética. Actualmente podemos afirmar que los péptidos opioides tuvieron su origen
en organismos menos evolucionados, como los protozoarios, y que son proteínas
ancestrales con analogía entre los sistemas neurosecretores de los invertebrados y de
los vertebrados superiores.
En los moluscos, el sistema opioide está involucrado en la locomoción (Burrowes
y cols., 1983), en la termorregulación (Kavaliers y Hirst, 1984), en la conducta
alimenticia (Kavaliers y Hirst, 1987), en la nocicepción (Kavaliers y Perrot -Sinal, 1997) y
en el sistema inmunológico (Sonetti y cols., 1997).
Estudios inmunohistoquímicos han demostrado una amplia distribución de
péptidos opioides en el sistema nervioso de invertebrados. Mediante técnicas de
inmunofluorescencia y e inmunohistoquímica con anticuerpos policlonales contra estos
péptidos, se ha identificado la presencia de Leu-encefalina en los ganglios cerebrales y
22
parietales de Helix aspersa, así como de Met-encefalina distribuida homogéneamente
en todo el sistema nervioso de este molusco (León-Olea M., 1987 y 1993). Estos
resultados fueron corroborados por trabajos en que se indujo la liberación de Met y Leu
encefalinas en la masa ganglionar de Helix aspersa mediante pulsos despolarizantes de
potasio (Pellicer y cols., 1993).
El efecto de los péptidos opioides sobre las neuronas del sistema nervioso de los
invertebrados no es claro, debido a que la mayoría de los reportes indican que los
opioides tienen un efecto dicotómico sobre la descarga de las células; por ejemplo:
mediante la técnica de registro intracelular, se ha reportado que la morfina produce
respuestas despolarizantes e hiperpolarizantes en las neuronas del caracol Helix
locuorum (Bezrukova y Solntseva, 1981). La naloxona inhibe la acción de los opioides
endógenos y es capaz de producir despolarización e hiperpolarización de la membrana
plasmática cuando es aplicada sobre neuronas del ganglio visceral y parietal derecho
del caracol Helix aspersa, afectando la frecuencia de descarga de las células (Gutiérrez,
1992). Asimismo, se ha demostrado que la naloxona produce efectos tanto excitadores
como inhibidores sobre neuronas del complejo periesofágicos de Helix locuorum
(Romanenko, 1987).
En el caracol Helix aspersa la Met-encefalina reduce la amplitud de los
potenciales postsinápticos excitatorios (EPSPs), acortando su duración y alargando su
fase de posthiperpolarización; sugiriendo que ejerce una modulación presináptica
(Gutiérrez, 1994).
Por otra parte, se ha planteado que los péptidos opioides juegan un papel
fundamental en procesos analgésicos y nociceptivos en invertebrados, ya que la
aplicación de morfina bajo la cavidad del manto del caracol terrestre Cepaea nemoralis
produce un aumento en la latencia a estímulos térmicos de manera análoga a las
respuestas analgésicas reportadas en vertebrados (Kavaliers y cols., 1983). A su vez, la
aplicación de noc/oFQ por esta misma vía reduce el periodo de latencia a la
estimulación térmica, produciendo un efecto hiperalgésico contrario al de los péptidos
opioides (Kavaliers y Perrot-Sinal, 1997).
Por medio de técnicas inmunohistoquímicas, se demostró la presencia de noc/oFQ en
el sistema nervioso del caracol terrestre Helix aspersa (Sánchez-Álvarez y cols.,
23
manuscrito en preparación), el marcaje para el péptido es fuerte en el ganglio cerebral
(Figura 6A) ya que se observa que existen áreas densamente marcadas en las tres
regiones del ganglio (anterior, media y posterior). Como nos muestra la figura 6, el
marcaje contra noc/oFQ se encuentra presente tanto en neuronas (Figura 6C y D) como
en fibras nerviosas (Figura 6B) las cuales pueden estar proyectando hacia regiones
subcerebrales. Los ganglios pedal, pleural y parietal presentaron también
inmunorreactividad al péptido aunque el marcaje en estas regiones fue moderado. Por
su parte, el ganglio visceral no presento fibras ni neuronas inmunorreacitvas a noc/oFQ.
En el presente trabajo no se pretende obtener una visión global del proceso
nociceptivo producido por la noc/oFQ en el caracol, sino dilucidar su efecto a nivel
celular, empleando como modelo biológico al caracol terrestre Helix aspersa.
24
C
D
81µm
E
B
Figura 6. (A) Vista panorámica de la parte anterior del ganglio cerebral muestra abundantes fibrasinmunorreactivas a nociceptina en los ganglios cerebrales. Neuronas positivas presentes en la parte laterale inferior de ambos ganglios. (B) Fibras que proyectan al nervio cerebropedal izquierdo fuertementepositivas a nociceptina. Neuronas pequeñas positivas (15-26 µm de diámetro), localizadas en la parteposterior del postcerebro. (C) Ampliación de neuronas pequeñas (9-11 µm de diámetro) en la parte lateraldel postcerebro derecho, además fibras que forman una densa red a través del neuropilo. (D) Fibrasinmunorreactivas a nociceptina forman una extensa y densa red en la región medial del postcerebroderecho. (E) Grupo de neuronas pequeñas (10-12 µm de diámetro) positivas a nociceptina, localizadas enel borde lateral del mesocerebro izquierdo. Este grupo no se muestra en la fotografía panorámica.
25
JUSTIFICACIÓNDebido a que se ha demostrado un incremento en la sensibilidad al dolor en el caracol
terrestre Cepaea nemoralis, al administrar noc/oFQ (Kavaliers y Perrot-Sinal, 1996) bajo
la cavidad del manto, y debido a la presencia de este neuropéptido en el sistema
nervioso del caracol Helix aspersa (León-Olea, manuscrito en preparación); se pretende
medir su influencia sobre la actividad eléctrica de las neuronas del complejo
periesofágico, ya que estas células sintetizan noc/oFQ y muy probablemente receptor
ORL-1.
HIPÓTESISLa presencia de noc/oFQ en el caracol terrestre Helix aspersa, es capaz de modular la
actividad eléctrica (frecuencia de descarga) y la morfología del potencial de acción de
las neuronas del complejo periesofágico del caracol terrestre Helix aspersa, ya que
tanto los receptores a opioides como el receptor ORL-1 se encuentran acoplados a
proteínas G(i/o), las cuales, activan canales de potasio rectificantes de entrada (GIRK) y
bloquean canales de calcio tipo L, N y P/Q, entre otros procesos. En conjunto estos
cambios en la conductancia de membrana pueden modificar el disparo de potenciales
de acción y el patrón de descarga de las neuronas, así como sus interacciones
sinápticas.
OBJETIVOSGeneralDeterminar el efecto de la noc/oFQ sobre la actividad eléctrica de las neuronas delcaracol terrestre Helix aspersa
Particulares1) Analizar el efecto de la noc/oFQ sobre la frecuencia de descarga de las neuronas.
2) Analizar el efecto de noc/oFQ en las distintas fases del potencial de acción.
26
MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. PREPARACIÓN DE LAS DROGAS
La noc/oFQ fue disuelta en agua desionizada de donde se obtuvieron alícuotas de 10 µl
a concentración 1 mM, las cuales fueron almacenadas a -20°C. La noc/oFQ fue diluido
en solución Ringer normal para molusco compuesta de la siguiente manera (mM): 75
NaCl, 4 KCl, 0.005 MgCl2, 5 CaCl2, 7 Hepes, ajustando el pH a 7.4 con NaOH. El
volumen final de microperfusión (100 µl) fue complementado con 1% de albúmina sérica
bovina libre de proteasas, con la finalidad de estabilizar a la noc/oFQ, en la solución.
Para que a noc/oFQ no fuese degradada se protegió, añadiendo a la solución Ringer,
bacitracina (3 µM), un potente inhibidor de endopeptidasas (Aleixandre y cols., 1981).
3.2 MODELO BIOLÓGICOSe utilizaron caracoles adultos Helix aspersa, los cuales se mantuvieron bajo
condiciones de laboratorio 10 días antes de la disección. Se colocaron en cajas de
acrílico que contenían una capa de 10 cm de tierra; se alimentaron con avena y lechuga
y fueron hidratados todos los días.
3.3 DISECCIÓNEl caracol se colocó en una cámara de disección con fondo de sylgard, y se le dejó en
reposo hasta que su cuerpo quedara adherido a ella. En seguida se removió la concha
realizando un corte transversal en la base de ésta e inmediatamente después se fijó el
cuerpo con alfileres y se agregó solución Ringer para molusco a temperatura ambiente.
A continuación, bajo un microscopio estereoscópico (Nikon SMZ-10), se realizó un corte
en la piel sobre la región dorsal a lo largo de la cabeza, para exponer la masa visceral,
que posteriormente fue removida con el fin de descubrir los ganglios subesofágicos.
Posteriormente se retiró el esófago, lo que nos permitió apreciar el ganglio cerebral, el
cual está situado por debajo de éste. Una vez removida toda la masa visceral, se
extrajo el complejo periesofágico y se colocó en la cámara de registro (con capacidad
es de 2 ml) con ayuda de alfileres que nos permiten sujetarlo. Consecutivamente
27
empleando pinzas y tijeras finas se retiró la cápsula de tejido conectivo que cubre los
ganglios, exponiendo de esta manera los grupos de neuronas.
3.3.1 REGISTRO INTRACELULARUna vez disecada la masa ganglionar se montó en una cámara de registro donde se fijó
con alfileres para sujetarla. Se perfundió de manera constante (2ml / min) con solución
Ringer extracelular para molusco. Para el registro intracelular, se usaron
ORC
DV
AMPLIFICADOR
GRABADORA
CA/D
0:04:10
• • • • • • • •
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• • • • • • • • • • •
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-49
Figura 7. Montaje de la preparación del sistema nervioso del caracol para el registro intracelular. Laactividad eléctrica es regitrada usando un amplificador de DC y se observa en un osciloscopio de rayoscatódicos (ORC). El registro se grabó usando un sistema de grabación en videocasetes para serprocesada posteriormente en una computadora PC con la ayuda de un discriminador de ventana (DV)y un conversor analógico/digital (CA/D).
28
microelectrodos de vidrio con resistencia de entre 30 y 60 MΩ que fueron llenados con
solución 3 M de cloruro de potasio (KCl). Se empleó un osciloscopio de rayos catódicos
(Tektronix 2214) y un amplificador DC (Axon Instruments) para monitorear el registro y
un micromanipulador hidráulico el cual nos ayudo a introducir el microelectrodo en la
célula. Los datos se guardaron en videocasetes para su posterior procesamiento
(Figura 7).
3.3.1.1 MICROPERFUSIÓN CON noc/oFQEl trabajo consistió fundamentalmente en realizar registros intracelulares en el complejo
del ganglio subesofágico y cerebral para probar la influencia de la noc/oFQ la cual se
perfundió cercana al sitio de registro con una microjeringa Hamilton (100 µl) unida a una
cánula conectada a una micropipeta de vidrio que se encontraba montada en un
manipulador, lo que nos permitió aproximar la droga a la zona de registro. Se
perfundieron en la cámara de registro 100 µl de orfanina 1, 10, 50 y 100 µM lentamente,
para eliminar cualquier artefacto mecánico en el registro.
Cabe destacar la preparación se prefundió continuamente con solución salina
durante el transcurso del experimento y de la aplicación del péptido.
3.4 ANÁLISIS DE RESULTADOSPara el análisis de los resultados, fue necesario modificar el programa de cómputo
Analnew7 (Soto y cols., 1997) el cual, nos permitió estudiar tanto la morfología del
potencial de acción como el intervalo de tiempo entre las espigas de las células
registradas (Apéndice 1).
Mediante un conversor analógico digital (DigiData 1200 de Axon Instruments) y el
sofware analnew7 (Soto y cols., 1997, Soto y cols., 2000) se digitalizó (0.2, 3 y 10 KHz)
la actividad eléctrica de las neuronas de la masa ganglionar durante el registro control y
después de la microperfusión con noc/oFQ, con la finalidad de determinar si las fases
de los potenciales de acción (amplitud y duración del potencial de acción, amplitud de la
posthiperpolarización y pendiente de despolarización, repolarización y
posthiperpolarización) se veían afectadas al aplicar este neuropéptido.
29
Por su parte, el análisis de intervalos interespigas se realizó con la ayuda de un
discriminador de ventana (Samuel Cid, 2000) y el programa de cómputo analnew7, la
captura de los datos tanto para el registro control como para el experimental fue de 1
minutos; durante este periodo, se almacenó el número de espigas producidas por la
célula registrada, lo cual nos permitió cuantificar el número de potenciales de acción
producidos por unidad de tiempo. A la vez, se calculó el tiempo promedio de los
intervalos entre espigas (t), la desviación estándar de los intervalos interespigas (σσσσ) y el
coeficiente de variación de los mismos (σσσσ/t).
3.5 OBTENCIÓN DE LA noc/oFQLa noc/oFQ fue aislada de cerebro de rata de manera manual en fase sólida por el
procedimiento de química de aminoácidos Fmoc (Kowalczyk y O´Shea, 1997),
purificada por dos pasos secuenciales de cromatografía de exclusión en gel y por HPLC
fase reversa, purificado a homogeneidad. Su masa fue verificada por espectrometría de
masas. Todo esto fue realizado en el Instituto Mexicano de Psiquiatría de la ciudad de
México, en el laboratorio del Dr. Benito Antón.
30
RESULTADOS
4.1 ControlesLos criterios empleados para determinar la inclusión de los registros en el estudio
fueron: 1) que las neuronas registradas tuvieran un potencial de membrana mayor a -40
mV, 2) que el potencial de acción tuviera sobretiro y 3) que el registro se mantuviera
estable a lo largo del tiempo sin grandes cambios o tendencias ostensibles en el
potencial de membrana.
Para demostrar que nuestro sistema de microperfusión funcionaba
adecuadamente decidimos estudiar el efecto del ácido glutámico 1 mM (n=1) sobre las
neuronas del complejo periesofágico del caracol. El efecto de este neurotransmisor ha
sido ya descrito en la literatura (Kerkut y cols., 1975). Al aplicarlo, la respuesta se
caracterizó por presentar un lapso inhibitorio de alrededor de 6 minutos, seguido de un
notable aumento en la frecuencia de descarga de la célula (Figura 9). El efecto del
ácido glutámico fue revertido a los 15 minutos después de la aplicación. De esta
manera corroboramos que nuestro sistema de microinyección funcionaba
correctamente.
5 min
Ac. Glutámico 1 mM
10 seg
Figura 9. Registro intracelular de una neurona del ganglio parietal derecho del caracol. La actividadeléctrica de la célula se digitalizó a 200 Hz (exp. 18). Luego de la microaplicación del ácidoglutámico, se observa un efecto inhibidor con una hiperpolarización de cerca de 20 mV, seguidoluego de varios minutos por un aumento en la actividad eléctrica de la célula.
10 mV
0 mV
31
Asimismo, probamos que nuestro sistema de microperfusión no influyera en el registro
produciendo algún artefacto mecánico; para ello, decidimos microperfundir solución
Ringer normal sin agregar ninguna droga (n=1). Los resultados arrojados por este
experimento demuestran que no existe ningún cambio entre el registro control y el
correspondiente a la microperfusión de Ringer (Figura 10).
Por otra parte, al momento de diluir la nociceptina en solución Ringer para
obtener el volumen final de microperfusión, tuvimos que agregar 1% de suero bovino
fetal (BSA), el cual permite la estabilidad del péptido en solución, pero antes de ello
decidimos probar sí el BSA no influía en la actividad eléctrica de las células y en la
morfología del potencial de acción. Para demostrarlo, microinyectamos BSA durante el
registro (n=1). En este caso, no existe ninguna influencia del BSA sobre la descarga de
las células ni sobre las propiedades del potencial de acción (datos no mostrados).
20 seg
Microperfusión con Ringer
Figura 10. Actividad eléctrica de una neurona del ganglio parietal derecho del caracol, digitalizada a200 Hz. Se observa que no existe ningún cambio en la frecuencia de descarga de la célula almicroperfundir Ringer para molusco Las líneas que delimitan la microperfusión son pequeños pulsoshiperpolarizantes los cuales ilustran el inicio y la finalización de la aplicación de Ringer (o denoc/oFQ en el caso de algunas figuras que se presentan posteriormente).
31000.dat
0 mV
10 mV
32
Con la idea de proteger a la nociceptina de peptidasas que pudieran degradarla,
decidimos adicionar bacitracina (un inhibidor de peptidasas) al Ringer de perfusión.
Quisimos comprobar también si esta enzima era capaz de producir un efecto sobre la
actividad eléctrica y la forma del potencial de acción de las neuronas del caracol, ya que
se ha descrito que la bacitracina, al ser coaplicada con encefalinas, potencia el efecto
de éstas en el sistema nervioso (Aleixandre y cols., 1981). La aplicación de la
bacitracina 3 µM (n=1) no produjo ningún cambio en la actividad eléctrica de las células
con respecto a su registro control y tampoco afectó la morfología del potencial de acción
de las neuronas (datos no mostrados).
Se realizó también un experimento en el cual se perfundió Ringer con bacitracina
3 µM y se microperfundió Ringer con 1% de BSA, de la misma forma como se
microinyectó la noc/oFQ; ésto, con la finalidad de demostrar que no existe ninguna
influencia de la bacitracina y del BSA sobre el potencial de acción y sobre la actividad
eléctrica de las neuronas al ser coaplicados ambos fármacos (datos no mostrados).
4.2 Efectos de la noc/oFQSe realizaron un total de 40 experimentos en los cuales se registraron neuronas del
complejo periesofágico del caracol Helix aspersa. Se aplicó noc/oFQ 1 µM (n=6),
10 µM (n=8), 50 µM (n=4) y 100 µM (n=6) (Tabla 2). En todos los experimentos, se
grabó la actividad espontánea como control durante 5 minutos y posteriormente se
registró su actividad durante 15 minutos con la droga.
En un total de 6 experimentos en neuronas de los ganglios parietales y visceral
se aplicó noc/oFQ 1 µM (Tabla 2). Cabe destacar que para esta serie de experimentos
no se protegió al péptido con bacitracina en la perfusión y tampoco se adicionó BSA al
volumen final de microinyección.
En estos experimentos, el porcentaje de cambio de la media de los intervalos
interespigas entre el registro control y el correspondiente a noc/oFQ no presentó
grandes modificaciones, ya que la media de los porcentajes de cambio para esta
concentración (la cual incluye el porcentaje de cambio de todos los experimentos
realizados a dosis 1 µM) fue del 5.1% ± 3.8. Estos resultados, nos indican que existen
cambios
1 micromolar (n=6)Excitador Inhibidor Sin efecto
Exp19 xExp.21 xExp.22 xExp.26 xExp.27 xExp.63 x
10 micromolar (n=8)Excitador Inhibidor Sin efecto
Exp.30 XExp.52 xExp.53 x
Exp.54.1 xExp.55.1 xExp.61.1 XExp.62 xExp.64 x
50 micromolar (n=4)Excitador Inhibidor Sin efecto
Exp.54.2 xExp.55.2 xExp.57 x
Exp.61.2 x100 micromolar (n=6)
Excitador Inhibidor Sin efectoExp.46 XExp.48 X
Exp.49.1 xExp.50 x
Exp.63.2 xExp.65 x
Tabla 2. Muestra un resumen de los experimentos realizados con noc/oFQ a diferentes concentraciones
y el efecto encontrado para cada uno de ellos.
33
cambios muy ligeros en la frecuencia de descarga de las células después de la
microperfusión con la noc/oFQ 1 µM (Figura 11A). Por su parte, no se presentaron
variaciones ni en el potencial de membrana ni en la morfología del potencial de acción
antes y después de la microperfusión con el péptido (Figura 11B).
34
Posteriormente se realizó una serie de 8 experimentos sobre las neuronas del
ganglio parietal derecho y visceral, donde se probó el efecto de noc/oFQ 10 µM (Tabla
2). Esta vez, el péptido fue protegido con bacitracina y estabilizada con BSA. A esta
concentración 2 neuronas del ganglio parietal presentaron un efecto excitador, el cual
produjo una ligera despolarización de alrededor de 5 mV que provocó una disminución
de los intervalos interespigas con respecto al registro control. El porcentaje de cambio
en los intervalos interespigas al aplicar la noc/oFQ aumentó el 42.6% ± 21.9 con
___Exp.64 control (21299-7)Vmem= -61.5 mVAmpPA= 66.6 mVAmpSP= 52.7 mVDuraPA= 6.9 msDura50= 4 msd+= 22.56 mV/msd-= 22.57 mV/msAmpPHP= 6.1 mVpPHP= 0.01 mV/ms
....Exp.64 noc/oFQ 1 µM (21299-8)Vmem= -61 mVAmpPA= 66.6 mVAmpSP= 53 mVDuraPA= 6.9 msDura50= 4 msd+= 22.56 mV/msd-= 21.39 mV/msAmpPHP= 6 mVpPHP= 0.02 mV/ms
20 ms
10 mV
0 mV
noc/oFQ 1 µµµµM 20 seg
3998-4.dat
Figura 11. (A) Registro intacelular de una neurona del ganglio parietal derecho del caracoldigitalizada a 200 Hz, en donde se muestra parte del registro control y la microperfusión denoc/oFQ 1 µM. Se observa que el péptido no produjo cambios en la frecuencia de descarga de laneurona. (B) Valores promedio de los potenciales de acción en condiciones control (línea continua)y después de la aplicación de noc/oFQ 1 µM (línea punteada) se observa que no existe ningúncambio en la morfología de la espiga del control y durante la microperfusión con el neuropéptido(exp. 64).
A
B
15 mV
0mV
35
respecto al registro control, efecto que fue revertido 2 minutos después de la
microperfusión del péptido (Figura 12A). Por su parte, la noc/oFQ no influyó
drásticamente en la morfología del potencial de acción, excepto en la fase de
posthiperpolarización, la cual, se hizo más rápida, variando de 0.04 mV/ms a 0.1 mV/ms
después de la aplicación del neuropéptido (Figura 12B).
A esa misma concentración (10 µM), se encontró que 3 neurona del ganglio
parietal presentaron un efecto inhibitorio el cual consistió en una ligera hiperpolarización
20 seg noc/oFQ 10 µµµµM
16799-8.dat
20 ms
10 mV
___Exp.61.1 control (16799-9)Vmem= -55.1 mVAmpPA= 67.2 mVAmpSP= 59 mVDuraPA= 11.2 msDura50= 5.3 msd+= 19.53 mV/msd-= 19.53 mV/msAmpPHP= 7.2 mVpPHP= 0.04 mV/ms
....Exp.61.1 noc/oFQ 10 µM (16799-10)Vmem= -51 mVAmpPA= 61.4 mV AmpSP= 55.4 msDuraPA= 11 msDura50= 5.5msd+= 18.55 mV/msd-= 17.58 mV/msAmpPHP= 9.2 mVpPHP= 0.1 mV/ms
0 mV
Figura. 12. (A) Registro intracelular de una neurona del ganglio parietal del caracol digitalizada a200 Hz, donde se observa un aumento notable en la frecuencia de descarga de la célula despuésde la microperfusión de noc/oFQ 10 µM. (B) Valor promedio de los potenciales de acción del registrocontrol (línea continua) y después de la aplicación de noc/oFQ 10 µM (línea punteada) en donde seaprecia una despolarización de la neurona y un cambio en la pendiente de posthiperpolarización (de0.04 mV/ms a 0.1 mV/ms) después de la perfusión del neuropéptido (exp.61.1).
A
B
20 mV
0 mV
36
que provocó una disminución de la frecuencia de descarga de las neuronas después de
la microperfusión de la noc/oFQ (Figura 13A). El cambio en los intervalos interespigas
después de aplicar el péptido aumentó el 19.2% ± 8.8%. Por su parte, las distintas fases
del potencial de acción no se modificaron en gran medida al microperfundir la
preparación con este neuropéptido, aunque la amplitud del potencial de acción aumento
alrededor del 8 % (–74.9 a –80.9 mV) (Figura 13B).
___Exp.62 control (19799-12)Vmem= -62.4 mVAmpPA= 74.9 mVDura50= 6.8 msd+= 17.58 mV/msd-= 17.58 mV/msAmpPHP= 4.5 mVpPHP= 0.01 mV/ms
....Exp.62 noc/oFQ 10 µM (19799-13)Vmem= -64.5 mVAmpPA= 80.9 mVDura50= 6.5 msd+= 20.51 mV/msd-= 21.48 mV/msAmpPHP= 4.6 mVpPHP= 0.01 mV/ms
20 ms
10 mV
0 mV
Noc/oFQ 10 µM 20 seg
19799-2.Dat
Figura 13. (A) Neurona del ganglio parietal derecho digitalizada a 200 Hz. Se observa una ligerahiperpolarización al finalizar la perfusión de noc/oFQ 10 µM que trae como resultado un aumentoentre los intervalos interespigas de la célula (B) Valores promedio de los potenciales de accióndel registro control (línea continua) y durante la microperfusión de noc/oFQ (línea punteada). Seobserva que una ligera hiperpolarización después de la aplicación del péptido y un aumento en laamplitud de la espiga, (exp. 62).
A
B
15 mV
0 mV
37
En 3 neuronas en las que se aplicó noc/oFQ 10 µM no se observó efecto sobre la
frecuencia de descarga (Figura 14A) ya que el cambio en los intervalos interespigas
después de aplicar el péptido fue sólo del 3.2% ± 2.4%. Por su parte, la morfología del
potencial de acción tampoco se modificó al microperfundir el neuropéptido a esta
concentración (Figura 14B).
Fig 14. (A) Célula del ganglio parietal derecho del caracol digitalizada a 200 Hz. Se observa que noexisten cambios en la frecuencia de descarga en el registro control y después de la microperfusiónde noc/oFQ 10 µM. Se alcanza a apreciar un ligero aumento entre los intervalos interespigas almomento de la aplicación del fármaco (B) Datos promedio de los potenciales de acción del registrocontrol (línea continua) y durante la aplicación de noc/oFQ (línea punteada). Se muestra que noexisten cambios en la morfología de las espigas antes y después de la perfusión con elneuropéptido (exp. 54.1).
noc/oFQ 10 µM 20 seg
28699-13.dat
A
exp.64n exp.64c
___Exp.54.1 control (28699-23)Vmem= -42.9 mVAmpPA= 91.9 mV AmpSP= 59 msDuraPA= 9.9 msDura50= 8 msd+= 25.39 mV/msd-= 14.65 mV/msAmpPHP= 4.8 mVpPHP= 0.01 mV/ms
....Exp.54.1 noc/oFQ 10 µM (28699-24)Vmem= -42.5 mVAmpPA= 92.3 mV AmpSP= 59.6 msDuraPA= 10.9 msDura50= 8.8 msd+= 23.44 mV/msd-= 13.63 mV/msAmpPHP= 4.6 mVpPHP= 0.01 mV/ms
20 ms10 mV
0 mV
B
15 mV
0 mV
38
Se realizaron 4 experimentos en los que se probó el efecto de noc/oFQ 50 µM sobre las
neuronas del ganglio parietal y visceral (Tabla 2). En estos casos, el neuropéptido fue
protegido con bacitracina y estabilizado con BSA. A esta concentración, dos neuronas
presentaron un efecto inhibitorio que consistió en una hiperpolarización de la célula
(Figura 15A), la cual mostró una disminución del 23.3% ± 13.8% en los intervalos
interespigas después de la microperfusión con la noc/oFQ. Por su parte, las distintas
___Exp.54.2 control (28699-26)Vmem= -44.7 mVAmpPA= 89.9 mV AmpSP= 82.8 msDuraPA= 9 msDura50= 7.9 msd+= 23.44 mV/msd-= 14.65 mV/msAmpPHP= 6.3 mVpPHP= 0.01 mV/ms
....Exp.54.2 noc/oFQ 50 µM (28699-27)Vmem= -48.6 mVAmpPA= 91.5 mV AmpSP= 83.3 msDuraPA= 10.3 msDura50= 7.8 msd+= 24.41 mV/msd-= 15.63 mV/msAmpPHP= 6.7 mVpPHP= 0.01 mV/ms
20 ms10 mV
0 mV
Noc/oFQ 50 µµµµM 20 seg
28699-14.dat
Figura 15. (A) Digitalización (200 Hz) de una neurona del ganglio visceral. Control ymicroperfusión de noc/oFQ 50 µM. Se observa una ligera hiperpolarización, que trae comoresultado una disminución en la frecuencia de descarga de la célula. (B) Valores promedio paralos potenciales de acción del registro control (línea continua) y después de la microperfusión connoc/oFQ 50 µM (línea punteada). Como podemos apreciar existe una hiperpolarización segundosdespués de la aplicación del neuropéptido (exp.54.2).
A
B
10 mV
0 mV
39
fases del potencial de acción no presentaron variaciones al aplicar el neuropéptido,
aunque el potencial de membrana disminuyó alrededor de 4 mV (Figura 15B).
Los demás experimentos realizados a concentración 50 µM, no produjeron
cambios en la frecuencia de descarga, ya que el porcentaje de cambio de los intervalos
interespigas se modificó sólo 2.9% ± 1.1% después de aplicar la noc/oFQ. Asimismo, la
noc/oFQ 50 µM 20 seg
90799-13.dat
___Exp.61.2 control (9799-16)Vmem= -68.8 mVAmpPA= 70.9 mVAmpSP= 59 mVDuraPA= 9 msDura50= 4.7 msd+= 27.34 mV/msd-= 22.46 mV/msAmpPHP= 7.4 mVpPHP= 0.03 mV/ms
....Exp.61.2 noc/oFQ 50 µM (9799-18)Vmem= -68.8 mVAmpPA= 69.9 mVAmpSP= 58.6 mVDuraPA= 8.5 msDura50= 4.7 msd+= 26.37 mV/msd-= 21.48 mV/msAmpPHP= 7.1 mVpPHP= 0.02 mV/ms
20 ms
10 mV
0 mV
Figura 16. (A) Registro intracelular de una neurona del ganglio visceral digitalizada a 200 Hz. Seobserva parte del registro control y la microperfusión con el neuropéptido. En este caso se aprecia quela noc/oFQ no produjo cambios en la frecuencia de descarga de la célula. (B) Valor promedio de lospotenciales de acción de una neurona del ganglio visceral en donde se aprecia que no existen cambiosen su morfología después de la aplicación de noc/oFQ 50 µM, con respecto al control (exp.61.2).
A
B
20 mV
0 mV
40
morfología del potencial de acción no se vio afectada por la microperfusión de noc/oFQ
(Figura 16).
Se hicieron también 6 experimentos a concentración 100 µM (Tabla 2); 4 de
ellos en el ganglio cerebral y 3 en el parietal derecho. En estos casos, la noc/oFQ fue
protegida con bacitracina y estabilizada con BSA. Dos de las neuronas registradas en el
ganglio cerebral presentaron un efecto excitador, el cual consistió en una leve
despolarización (5 mV) que provocó una disminución de los intervalos interespigas del
27.6% ± 11.5% después de la microperfusión con noc/oFQ (Figura 17A). En ambos
Figura 17. (A) Registro intracelular de neurona del ganglio cerebral, digitalizada a 200 Hz,presenta un ligero aumento en la frecuencia de descarga después de la aplicación denoc/oFQ 100 µM. (B) Datos promedio de los potenciales de acción de la misma célula, endonde se observa que no existen cambios notables en la morfología de las espigas entre elregistro control y después de la aplicación de noc/oFQ 100 µM, (exp.48).
___Exp.48 control (12399-11)Vmem= -53 mVAmpPA= 85.8 mVAmpSP= 73 mVDuraPA= msDura50= 6.67 msd+= 26.37 mV/msd-= 16.49 mV/msAmpPHP= 8.9 mVpPHP= 0.04 mV/ms
....Exp.48 noc/oFQ 100 µM (12399-18)Vmem= -53.9 mVAmpPA= 86.4 mVAmpSP= 74.1 mVDuraPA= msDura50= 7 msd+= 26.95 mV/msd-= 15.23 mV/msAmpPHP= 8.6 mVpPHP= 0.04 mV/ms
20 ms10 mV
0 mV
B
Noc/oFQ 100 µµµµM 20 seg
12399-11.dat
A 20 mV
0 mV
41
casos no se produjo ningún cambio en la forma del potencial de acción, aunque el
potencial de membrana disminuyó alrededor de 5 mV (Figura 17B). El patrón global de
descarga se modificó ligeramente después de la aplicación del péptido.
Los demás experimentos realizados a concentración 100 µM, no presentaron
cambios drásticos en la frecuencia de descarga de las células (Figura 18A) ya que los
noc/oFQ 100 µM 20 seg
11299-4.dat
A
Figura 18. (A) Actividad eléctrica de una neurona del ganglio parietal derecho digitalizada a 200 Hz. Seaprecia que no hay cambios en la frecuencia de descarga de la célula después de la aplicación denoc/oFQ (B) Valor promedio de los potenciales de acción de la misma célula. No existen cambios entrela morfología de las espigas del registro control y después de la aplicación del neuropéptido (exp.63.2).
....Exp.63.2 noc/oFQ 100 µM (11299-20)Vmem= -52.4 mVAmpPA= 75.6 mVAmpSP= 69.1 mVDuraPA= 11 msDura50= 5.33 msd+= 25.78 mV/msd-= 17.87 mV/msAmpPHP= 9.2 mVpPHP= 0.06 mV/ms
___Exp.63.2 control (11299-19)Vmem= -52.7 mVAmpPA= 76.1 mVAmpSP= 69 mVDuraPA= 11 msDura50= 5.33 msd+= 26.07 mV/msd-= 18.75 mV/msAmpPHP= 9.3 mVpPHP= 0.07 mV/ms
20 ms
10 mV
0 mV
B
20 mV
0 mV
42
intervalos interespigas se modificaron solo un 3.5% ± 1.5% después de la aplicación de
la noc/oFQ (Figura 18B).
Del total de experimentos realizados, el 37.5% de las neuronas fueron afectadas
por la noc/oFQ. El 20.8 % presentaron efecto inhibitorio y el 16.7 % un excitatorio. A
dosis 1 µM no se observaron cambios, mientras que a 10 µM el 62.5% de las células
fueron afectadas por el péptido, de las cuales, el 25% desarrollaron un efecto excitatorio
y el 37.5% un efecto inhibitorio. Por su parte, a concentración 50 µM el 50 % de las
células desarrollaron un efecto inhibitorio. Mientras que a dosis 100 µM, el 30 % de las
neuronas presentaron un efecto excitatorio.
43
DISCUSIÓN
Los resultados inmunohistoquímicos demuestran claramente la presencia de noc/oFQ
en el sistema nervioso del caracol Helix aspersa, principalmente en fibras y neuronas
localizadas en el cerebro anterior, en el cerebro medio y en el cerebro posterior,
probablemente porque el ganglio cerebral, principalmente el mesacerebro, está
involucrado en la respuesta a estímulos nociceptivos (Ieruzalimsky y col., 1994; Ratté y
Chase, 1997).
Curiosamente la inmunorreactividad a noc/oFQ fue decreciendo en tanto se
alejaba del ganglio cerebral, por lo tanto, los ganglios pedal y pleural presentaron un
abundante marcaje al neuroéptido, posiblemente porque del ganglio cerebral emergen
un gran número de fibras nerviosas que descienden a lo largo del anillo periesofágico y
que desembocan en el ganglio pedal y pleural. Por su parte el ganglio parietal presentó
una inmunorreactividad débil, tanto en las neuronas como en las fibras nerviosas que
inervan dicho ganglio. Probablemente este grupo de neuronas, junto con las del ganglio
visceral puedan ser un blanco importante en la acción de la noc/oFQ
De acuerdo con estos resultados podemos proponer que la noc/oFQ se sintetiza
principalmente en células de los ganglios cerebral, pedal y pleural, debido a la alta
inmunorreactividad presente en estas regiones del sistema nervioso del caracol. A su
vez, el abundante marcaje que existe en las fibras nerviosas de estos ganglios, puede
ser indicativo de un transporte anterógrado a través de estas fibras hasta las uniones
sinápticas donde se realiza la comunicación neuronal con células de otros ganglios, Por
lo tanto, el efecto electrofisiológico de la noc/oFQ es esperable en las neuronas que
presentan los receptores ORL1 y no en las neuronas que liberan el péptido y que son
las que se marcan en la inmunohistoquímica.
Los resultados obtenidos mediante técnicas inmunohistoquímicas han
demostrado una gran distribución de noc/oFQ en el ganglio cerebral, pedal y pleural,
moderada en el parietal y carente en el visceral. De la misma forma, se ha reportado la
presencia de encefalinas en el sistema nervioso del caracol terrestre Helix aspersa, en
donde leu-encefalina está presente en la porción anterior del ganglio cerebral y en el
ganglio parietal y met-encefalina se encuentra distribuida homogéneamente a lo largo
44
de todo el complejo periesofágico (León-Olea y cols., 1993). Pero aunque la noc/oFQ y
las encefalinas puedan coincidir en una misma región del sistema nervioso, no existen
reportes en la literatura que demuestren la coliberación de distintos péptidos opioides
en una misma célula.
Nuestros resultados indican que la noc/oFQ ejerce un efecto sobre las neuronas
del sistema nervioso del caracol terrestre Helix aspersa, ya que en el 37.5% de los
caso, la microperfusión de noc/oFQ sobre el complejo periesofágico produjo ligeras
variaciones en el potencial de membrana, lo que trajo como consecuencia un cambio en
la frecuencia de descarga de las células. Las variaciones en el potencial de membrana
podrían deberse a cambios en la permeabilidad a iones K+ y Ca+, ya que la noc/oFQ
promueve la activación de los canales GIRK e inhibe la de los canales de calcio tipo L,
N y P/Q.
En el presente estudio se encontró que a dosis bajas (1 µM) la noc/oFQ no
produjo efecto en el potencial de acción ni en la frecuencia de descarga de las
neuronas, ésto tal vez se debió a que en los experimentos realizados a esta
concentración el péptido no fue protegido con bacitracina ni estabilizado con BSA y
probablemente la vida media y el efecto biológico del péptido se vieron afectados en
esas condiciones.
A concentraciones más elevadas (10 µM, 50 µM y 100 µM) la microperfusión de
noc/oFQ produjo cambios en la frecuencia de descarga de las neuronas y en el
potencial de membrana. El análisis de las distintas fases del potencial de acción indica
que la noc/oFQ modifica el potencial de membrana y en algunos casos la pendiente de
la posthiperpolarización. Esto sugiere que el péptido está actuando directamente sobre
las propiedades de membrana de estas neuronas.
Los datos electrofisiológicos descritos en este trabajo concuerda con lo reportado
por Sánchez-Álvarez y su grupo, quienes en 1997 encontraron que existe
inmunorreactividad a noc/oFQ en los ganglios cerebrales y subesofágicos del caracol
Helix aspersa.
La IC50 que se ha reportado para noc/oFQ es de 0.9 nM y 1 nM (Meunier y col.,
1995; Reinscheid y col., 1995), y aunque el efecto de este péptido ha sido probado en
un amplio rango de concentraciones (desde 1 nM hasta 10 µM) la mayoría de los
45
trabajos electrofisiológicos han encontrado un efecto máximo a dosis 10 µM. Nuestros
resultados no concuerdan con estos reportes debido a que el efecto producido por la
noc/oFQ en nuestra preparación no varía al microperfundir el péptido a las diferentes
dosis (10, 50 y 100 µM).
A concentración 10 µM la noc/oFQ ejerce un efecto dicotómico en las neuronas
de los ganglios cerebral, parietal y visceral del caracol, debido a que en algunas
ocasiones se produjo un aumento en la frecuencia de descarga debido a la
despolarización de la células y en otras una disminución de la misma, provocada por
una hiperpolarización de las neuronas. Estos resultados concuerdan con lo reportado
en la literatura debido a que un gran número de neurotransmisores presentes en el
sistema nervioso del caracol Helix aspersa como lo son ACh, glutamato, 5-HT y
dopamina ejercen un efecto dual sobre las neuronas del complejo periesofágico, ya que
Kerkut y su grupo, en 1975 demostraron que la aplicación por separado de cada uno
de estos fármacos produce tanto despolarizaciones como hiperpolarizaciones de las
neuronas de los ganglios visceral y parietal derecho. Más interesante aún es el hecho
de que los mismos opioides, como es el caso de la morfina, y el antagonista de amplio
espectro naloxona, producen igualmente un efecto dicotómico, ya que la aplicación de
cada uno de ellos produce igualmente efectos despolarizantes e hiperpolarizantes
sobre las neuronas del sistema nervioso del caracol (Bezrukova y Solntseva, 1981;
Romanenko, 1987).
Aunque a dosis 50 µM sólo se observaron efectos inhibitorios no se descarta la
posibilidad de que a esta concentración la noc/oFQ pueda ejercer un efecto excitador
indirecto, produciendo un efecto dual sobre las neuronas del complejo periesofágico del
caracol. Lo mismo podría suceder a dosis 100 µM, en donde la microperfusión del
péptido únicamente presentó efectos excitadores.
Los reportes que se tienen hasta el momento indican que la noc/oFQ produce
una corriente saliente de K+ al activar canales GIRK. Dicha activación trae como
consecuencia una hiperpolarización de las células y por lo tanto, una disminución en la
frecuencia de descarga de las mismas, provocada por la pérdida de K+ intracelular.
Nuestros resultados indican que la microperfusión de noc/oFQ produce no sólo efectos
inhibidores, sino también excitadores sobre distintas neuronas del sistema nervioso del
46
caracol (ver tabla 2). La explicación a este acontecimiento se sustenta en el hecho de
que en la preparación del sistema nervioso para el registro, se mantienen intactas las
entradas sinápticas y por lo tanto, no podemos descartar un efecto indirecto de la
noc/oFQ sobre algunas células del complejo periesofágico (aunque en ningún caso se
observaron cambios en los potenciales sinápticos luego de la aplicación del
neuropéptido). Dicho de otra manera, el efecto excitador de la noc/oFQ tal vez pueda
llevarse a cabo al inhibir alguna neurona que se encuentre modulando la descarga de la
célula registrada, la cual, al ser liberada aumenta su frecuencia de descarga de manera
considerable.
Por otra parte, trabajos recientes han reportado que la noc/oFQ ejerce un efecto
bifásico en la actividad eléctrica de las neuronas de hipocampo de rata (Amano y col.,
2000). Aunado a ello, se ha demostrado que la mayoría de los neurotransmisores
presentes en el sistema nervioso del caracol producen también un efecto bifásico en las
células del complejo periesofágico (Kerkut y col., 1975). En contraste con estos
resultados, la noc/oFQ no ejerce un efecto bifásico en la actividad eléctrica de las
neuronas de los ganglios cerebral, visceral y parietal del caracol, aunque no se descarta
la posibilidad de que diversas entradas sinápticas puedan modular este tipo de
descarga en algunas neuronas del sistema nervioso de este molusco.
El intenso marcaje de neuronas en el ganglio cerebral nos hizo pensar en un
principio, que el porcentaje de células sensibles a noc/oFQ en esta región era mayor
que en las neuronas de los ganglios subesofágicos, aunado a ello Ratté y Chase en
1997 reportaron que un gran número de vías nociceptivas se encontraban situadas en
el cerebro del caracol, estos antecedentes nos inclinaron a realizar una serie de
experimentos en esta región.
Desafortunadamente la gran mayoría de células en el ganglio cerebral no
presentan descarga espontánea. Aún así, nos pudimos percatar de que el efecto de la
noc/oFQ es muy similar en las neuronas cerebrales y en las neuronas subesofágicas; lo
que significa, que gran parte de la noc/oFQ que se sintetiza en los ganglios cerebrales
es transportada a los ganglios pedal y pleural a través de los nervios cerebro-pedales y
cerebro-pleurales, y probablemente una gran cantidad de neuronas del ganglio parietal
son blanco de neuronas pedales sensibles a noc/oFQ. Esta teoría se sustenta gracias al
47
trabajo de Kerkut y su grupo en 1970 en donde demuestran que varias neuronas
parietales extienden proyecciones hacia el ganglio pedal y al mismo tiempo, un gran
número de neuronas del ganglio visceral desarrollan conexiones con neuronas
parietales. Por esta razón, es muy probable que en algunas ocasiones la noc/oFQ
regule de manera indirecta la actividad eléctrica de las neuronas parietales. Por su
parte, la carencia de inmunorreactividad en las neuronas del ganglio visceral, nos hace
pensar que la noc/oFQ modula la actividad de estas células de manera indirecta.
Hemos enfatizado que la gran mayoría de las neuronas del ganglio cerebral no
presentaron descarga espontánea al momento de ser registradas, Este hecho, tal vez
podría estar relacionado con cambios estacionales, ya que se ha demostrado que
durante el invierno (periodo en el cual nosotros realizamos estos experimentos) la
concentración intracelular de potasio en un gran número de neuronas, es mucho más
elevado con relación a otros meses (Kerkut, G. y Meech, R., 1967). Este aumento en la
concentración de potasio intracelular produce un incremento en el potencial de
membrana de las células (-55 y -65 mV), el cual en condiciones normales se encuentra
entre –45 y –50 mV. Este paqueña hiperpolarización, podría impedir que se alcance el
voltaje de activación de los canales de sodio, los cuales son esenciales en la
generación de los potenciales de acción.
Como se mencionó en el primer capítulo, el caracol Helix aspersa sintetiza un
gran número de neurotransmisores y neuropéptidos implicados en múltiples funciones
dentro del sistema nervioso, por lo tanto, es probable que la noc/oFQ se encuentre
regulando la liberación de estos transmisores en las terminales presinápticas, de la
misma forma en que lo hacen los péptidos opioides (Gutiérrez, 1994), ya que tanto la
noc/oFQ como los opioides inhiben la acción de los canales de calcio tipo L, los cuales,
son indispensables en la liberación del neurotransmisor. Esto nos permite proponer que
la noc/oFQ actúa como un neuromodulador dentro del sistema nervioso de los
moluscos.
48
CONCLUSIONES
La noc/oFQ modula la actividad eléctrica de las neuronas del complejo
periesofágico del caracol terrestre Helix aspersa. En el 37.5 % de los casos la
microperfusión de noc/oFQ produjo variaciones en el potencial de membrana de las
células y en otras afecto la fase de posthiperpolarización del potencial de acción. Este
efecto podría ser la base de las modificaciones conductuales en la reducción de la
latencia a estímulos térmicos, cuando se inyecta noc/oFQ bajo la cavidad del manto en
el caracol Cepaea nemorales y se realiza la prueba del plato caliente (Kavaliers y cols.,
1997).
49
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