I. EL SUPLICIO DE TNTALO O LA HEBRA INACCESIBLE

LAS MOLCULAS DE LA VIDAA travs de varios miles de millones de aos de evolucin, la diversidad biolgica nos resulta apabullante y asombrosa. Cada organismo vivo, desde un ser humano hasta una pequea planta, una bacteria o una mosca, parece ser una invencin nica y diferente. Si observamos con cuidado, sin embargo, detectamos muchos elementos en comn. La clasificacin de los seres vivos en reinos, rdenes, gneros, etc., obedece precisamente a esta clara nocin de que los organismos vivos se parecen unos a otros. En el nivel molecular, los seres vivos se parecen increblemente. Es de la combinacin y concierto de interacciones de los mismos tipos de molculas que un ser vivo difiere de otro. Esto es similar al caso de las computadoras (especialmente los programas que corren en ellas), que pueden diferenciarse notablemente unas de otras, a pesar de estar constituidas por circuitos o instrucciones muy similares. Las molculas de la vida surgieron hace quiz 3 4 mil millones de aos. Sus caractersticas y sus interacciones fundamentales han sido alteradas muy poco en todo este tiempo. La evolucin ha ocurrido partiendo de lo que ya hay, con modificaciones paulatinas.cidos nucleicosEl fenmeno de la herencia es discernible por cualquier observador, pero su fundamento qumico-biolgico no fue siquiera sospechado hasta pocas relativamente recientes. Fue sino hasta los aos cuarenta que los investigadores estadunidenses Avery, McLeod y McCarty sugirieron, cautelosamente, que el material hereditario podra estar contenido en la sustancia llamada cido nucleico. Durante los siguientes cinco aos, trabajando con sistemas de separacin y anlisis relativamente primitivos, los investigadores del campo de la gentica bioqumica demostraron, de manera inequvoca, que tal era el caso.El multicitado descubrimiento de la estructura tridimensional del cido desoxirribonucleico (ADN), realizado por Watson y Crick, y cuya culminacin fue en 1953, merece siempre una mencin especial.Este trabajo muestra varios conceptos que son piedra angular en la investigacin biolgica moderna. En primer lugar, los experimentos realizados se basaron en los adelantos de la fsica. Se utilizaron rayos X y conceptualizaciones tericas para inferir, a partir de patrones de manchas, la estructura de la muestra deADNanalizada (vase en el captuloVIuna descripcin ms extensa sobre la tcnica de cristalografa de rayos X). En segundo lugar, se hace notar la conviccin de que, de la forma tridimensional de las molculas biolgicas se pueden obtener importantes ideas respecto a la funcin de las mismas. En tercer lugar, se destaca la confianza de que hay elementos y principios universalmente aplicables a todo ser vivo, cuando se hace el anlisis a nivel molecular.- Estructura y Replicacin delADNEl cido desoxirribonucleico oADN,est formado por dos cadenas. Puede ser descrito como un polmero constituido por cuatro diferentes monmeros. El esqueleto es igual en todos los casos: un azcar (desoxirribosa) y un fosfato. Del esqueleto se desprenden las bases, que pueden ser A (adenina), G (guanina), C (citosina) o T (timina). Cada una de las cadenas integra una molcula, porque est unida por enlaces fuertes (o covalentes), mostrados por medio de lneas continuas como se muestra en la figura RI.la. La disposicin de las bases permite, adems, que una cadena tenga afinidad por otra, siempre y cuando sta corra en el sentido opuesto y su secuencia de bases haga que se mantenga la complementariedad entre las bases (A frente a T y G frente a C). Esta afinidad se debe a la formacin de enlaces dbiles (no covalentes) llamados puentes de hidrgeno, que se muestran con lneas punteadas en la figura antes mencionada. Estos enlaces se pueden hacer y deshacer con relativa facilidad. Como puede apreciarse en la figura RI.1b, esto significa que la informacin codificada en la secuencia est duplicada: cada una de las hebras contiene toda la informacin. As, cuando las cadenas se separan, cada una puede servir para regenerar la cadena opuesta. Este proceso se llamareplicacin, y explica de inmediato cmo la molcula de ADNes capaz de transmitir informacin de padres a hijos.La complementariedad de las bases constituyentes de los cidos nucleicos permite almacenar y transferir informacin. A pesar de lo anterior; por medio de un gran nmero de experimentos, que no consistan en la purificacin de molculas deADNespecficas, ni su caracterizacin o anlisis directo, se pudieron sentar las bases de su funcionamiento fundamental. As pues, sustentndose en pruebas de muchos tipos, se estableci lo que se ha dado en llamar "dogma central de la biologamolecular" - La expresin de la informacin genticaLa informacin contenida en la secuencia delADNrequiere convertirse en forma y funcin. ElADNconstituye las instrucciones, es decir; los planos; son necesarios herramienta y materiales para ejecutar lo que dicen los planos. La maquinaria celular convierte la informacin delADNen protenas especficas, una protena por cada gene. As, un gene no es ms que un segmento determinado dentro de alguna larga molcula de ADN(como una cancin dentro de la cinta de un casete). La informacin fluye delADNhacia la protena, pasando por un intermediario, elARN(cido ribonucleico), muy similar alADN, y con las mismas propiedades de apareamiento que ste en el proceso llamadotranscripcin,en el cual se van agregando una por una las bases delARN, copiando la secuencia delADN. Posteriormente, se ensamblan las molculas de protena, haciendo corresponder un aminocido por cada tres bases. Todo un conjunto de molculas y organelos participa en este proceso de traduccin. Hay una correspondencia inequvoca entre la secuencia del ADNy la de la protena para la que codifica, dada por el cdigo gentico. Este cdigo relaciona el idioma de cuatro letras deADN, tomando grupos de tres en tres, con el idioma de las protenas, constituido por 20 letras o monmeros.

La complementariedad que pueden tener dos hebras de cido nucleico se puede ilustrar si imaginamos una hebra con la siguiente secuencia: 5CAGTGAATTCAATCGAT3 y otra con la secuencia 5ATCGATTGAATTCACTG3 (los nmeros 5 y 3 marcan los extremos de las hebras que corren en sentido anti paralelo, como se ilustra en el recuadro I.1). Estas dos especies moleculares son complementarias, es decir; si las colocamos una frente a otra, en sentido anti paralelo (tal y como se encuentran en las molculas deADN naturales), tenemos:5CAGTGAATTCAATCGAT33GTCACTTAAGTTAGCTA5

y observamos que frente a C (abajo de la C, en la representacin mostrada), hay siempre G y viceversa, y frente a A, hay siempre T, y viceversa.ProtenasLas protenas son, pues, la herramienta de los genes, el brazo ejecutivo de la maquinaria celular; todo lo que existe en la biosfera resulta, en consecuencia, del trabajo concertado y regulado de las protenas, dirigidas e interactuando con los genes y con el entorno.Estas mquinas moleculares son capaces de llevar a cabo las ms diversas funciones.Las enzimas son protenas que merecen mencin especial. Dentro de una clula viva existen miles de sustancias diferentes, que potencialmente pueden sufrir transformaciones qumicas muy diversas. De hecho, slo algunas de estas reacciones podran ocurrir en condiciones suaves y a temperatura ambiente. La clula, sin embargo, sufre una constante transformacin. Esto se debe al trabajo de las enzimas. Su capacidad cataltica consiste en que, al interaccionar con sus "molculas blanco", es decir; aquellas a las que van a modificar (llamadas sustratos), facilitan transformaciones qumicas especficas, sin alterarse ellas mismas en el proceso: una enzima cataliza o induce una transformacin particular en miles de molculas de sustrato sobre las que acta en forma sucesiva. As, de la accin concertada de las enzimas resulta un proceso continuo de transformacin qumica, que es el responsable de la aparicin de forma, funcin y adaptacin al medio.SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE LAS BIOMOLCULAS

Hay diversas tcnicas que se utilizan rutinariamente en el ADNrecombinante. Una de las ms frecuentes es la electroforesis (figura RI.3A). Esta tcnica se aplica para el anlisis deADNy de protenas y nos permite, en una de sus versiones, separar estas molculas de acuerdo con su tamao.

De manera anloga, en la cromatografa de exclusin (figura RI.3B) se puede colocar en una columna una suspensin o pasta de partculas con agujeros microscpicos y hacer fluir una solucin con las molculas a separar por esta columna. Las molculas ms pequeas se irn introduciendo en los orificios, lo cual retarda su movimiento. Las molculas grandes, que no caben en todos los agujeros, se retardarn menos. Si vamos colectando el fluido al final de la columna, irn apareciendo las molculas separadas: primero las ms grandes y al final las ms pequeas.

Otro principio de gran importancia en los procesos de separacin es explotar la diferente afinidad de unas molculas por otras. El procedimiento consiste en fijar un material que se une fuertemente a una protena a un soporte slido (por ejemplo, algo que se parezca a su sustrato). Estas molculas que se unen a protenas, especficamente, se denominanligandos.Al hacer pasar una solucin con una mezcla de protenas por una columna que contenga este soporte, la protena que es de nuestro inters se quedar adherida, mientras que las otras pasan de largo. S despus agregamos una solucin con abundanteligando libre, la protena se despega de la columna, pues ahora el sitio de unin lo ocupa el ligando que no est sujeto, y ya pura, se puede recuperar. Este proceso se denominacromatografa de afinidad(figura RI.3c).

II. LAS LLAVES DE LA BIBLIOTECA DE LA VIDA: LA NUEVA HERRAMIENTA DE LA INGENIERA GENTICA

ENZIMAS DE RESTRICCINMuchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o rompen elADN. Estos sistemas, llamados demodificacin-restriccin,son anlogos a un sistema inmune, los cuales probablemente evolucionaron como un mecanismo de proteccin de los microorganismos contra infecciones virales. En efecto, las bacterias, por ejemplo, son infectadas por virus, llamadosbacterifagos, que inyectan su propioADNen la clula bacteriana para despus controlar su maquinaria celular y redirigirla hacia la sntesis de sus propios componentes, dando como resultado final la ruptura de la clula y la liberacin de cientos o miles de nuevos virus. En algunas bacterias elADNpropio est modificado en ciertas secuencias. Una enzima de modificacin se desliza sobre la hebra deADN, y cada vez que se topa con su secuencia blanco, por ejemplo GAATTC, introduce un pequeo grupo qumico en la adenina (A) central. Otra enzima, la enzima de restriccin, tambin se desliza en la hebra deADN, y si encuentra la secuencia GAATTC, corta elADNen esa posicin. La enzima, sin embargo, no corta elADNmodificado, por lo que efectivamente es capaz de degradar elADNextrao que puede entrar a la clula, sin alterar elADNpropio.Otra interesante propiedad de las enzimas de restriccin es que, en general, reconocen secuencias palindrmicas, es decir; secuencias que son iguales si se leen en una direccin, o en la direccin contraria. Por ejemplo: 5GAATTC3 3CTTAAG5

es una secuencia palindrmica. Cuando acta la enzima que reconoce y corta esta secuencia, llamadaEcoRI, genera segmentos deADNcon extremos que se proyectan fuera de la doble cadena: 5G AATTC3 3CTTAA G5

Estos extremos se denominancohesivosopegajosos, porque tienden a aparearse o hibridarse nuevamente. En realidad, cualquier extremo deADNgenerado por un corte con EcoRIpuede hibridarse o aparearse con otro extremo generado por la misma enzima.

La separacin de los cidos nucleicosCuando se utiliza la electroforesis, es posible visualizar la accin de las enzimas de restriccin. Si se colocan muestras que contienenADNde diversos tamaos en los pozos de un gel en forma de placa, y se aplica corriente elctrica, la diferencia de velocidad de migracin de estas molculas las distribuir, por separado, al cabo de un tiempo, dentro del gel. Si despus se agrega una sustancia que se hace luminosa al interaccionar con elADNy baarse con luz ultravioleta, directamente se puede observar el patrn de distribucin de las bandas constituidas por las molculas de diversos tamaos, por medio del cual es factible deducir sus respectivas dimensiones.Al usar diferentes enzimas de restriccin, se generan diferentes segmentos. Por ejemplo, si la secuencia reconocida por la enzima Sall aparece en la molcula del ejemplo una vez, cortara el segmento en dos partes. Si la secuencia reconocida porEcoRI,aparece dos veces, generara tres pedazos. Al usar las dos enzimas simultneamente, se produciran cuatro segmentos.

Los procedimientos bsicos delADNrecombinanteEl producto de la digestin delADNcon endonucleasas de restriccin est constituido por muchos fragmentos especficos, cuyos extremos son compatibles o cohesivos unos con otros. Estos fragmentos se ligan despus a un segmento especial deADN,el vehculo de donacin (usualmente un plsmido), que fue cortado con la misma enzima. Las molculas recombinantes resultantes contienen unADNvehculo o vector y unADNpasajero, constituyendo una nueva molcula circular continua.Estas molculas se introducen a clulas bacterianas y se seleccionan por medio de "genes marcadores" presentes en el vehculo de donacin. Dentro de su secuencia deADNlos vehculos de donacin contienen seales que inducen la replicacin delADN, y otras que producen, tpicamente, resistencia a algn antibitico. As, las clulas que reciben una molcula recombinante la perpetan en su interior, y se pueden detectar porque sta confiere a la clula la capacidad de sobrevivir en presencia del antibitico.

ElADNsinttico y sus aplicacionesPara un qumico, la tarea de sintetizar molculas deADN representa varios retos. El objetivo es ensamblar secuencias definidas, a partir de los cuatro nucletidos A, G, C y T. Muchos aos de trabajo, de varios laboratorios, han culminado en los sintetizadores robticos que se usan hoy en da, y con los que se producen miles de oligos para las ms diversas aplicaciones.Una vez resuelto el problema de enmascarar selectivamente los grupos qumicos presentes en los nucletidos, se pueden hacer reaccionar ordenadamente, para ir produciendo la secuencia. En la actualidad se utiliza el mtodo en fase slida, en el que la cadena deADNva creciendo adherida a pequeas partculas de vidrio. En la sntesis automatizada, una mquina, constituida por vlvulas y botellas controladas por una computadora, va inyectando diversas soluciones al reactor que contiene el vidrio. Cclicamente se activa el oligo, se le hace reaccionar con la base siguiente y se lava.Con esta tcnica se puede llegar; prcticamente, a oligos de hasta 50 100 nucletidos de longitud.Entre las aplicaciones ms frecuentes y tiles de oligos sintticos se encuentra la construccin de genes, que se logra hibridizando oligos complementarios los cuales reconstruyen el ADNdplex con la secuencia diseada. Otro enfoque de gran utilidad se denominamutagnesis dirigida.En este caso, el oligo se usa para alterar especficamente una pequea regin dentro de un gene natural clonado.

Procedimiento para obtener la secuencia del ADNEn la figura se ilustra el mtodo enzimtico. A partir de un oligo marcado se inicia una reaccin de replicacinin vitro. Esta reaccin procede hasta encontrar un nucletido terminador, que no permite que la cadena replicada siga creciendo. Se efectan cuatro reacciones, una para cada base deADNque contiene el nucletido terminador correspondiente, y se termina con cuatro colecciones de fragmentos marcados, cada una constituida por fragmentos que terminan en A, G, C o T, respectivamente.El anlisis del tamao de estos fragmentos, mediante electroforesis en gel, revela de inmediato un patrn de bandas, que corresponde directamente a la secuencia que se encuentra enfrente del oligo iniciador.

LA REACCIN EN CADENA DE POLIMERASALa enzimaADNpolimerasa participa en la replicacin delADN(recuadro I.I). Para convertir una molcula deADNde doble cadena en dos molculas idnticas, la enzima requiere que las cadenas de la molcula inicial se separen, para as tener un molde disponible. Adems, la enzima requiere un segmento deADNcon un extremo libre, que sirve para cebar o iniciar la reaccin de replicacin y los nucletidos precursores. Si se colocan estos sustratos en un tubo de ensayo, laADNpolimerasa puede incorporar uno por uno los nucletidos correspondientes, es decir, frente a una A en el molde, adicionar T en la cadena creciente; frente a G, C, etc. En realidad, ste concepto era perfectamente conocido y aplicado desde mucho antes de que se concibiera la tcnica de laPCR. Lo original de la idea de la concepcin de Mullis fue pensar qu sucedera si se aplica este procedimiento en ciclos sucesivos, en una reaccin en cadena. Los oligos sintticos, en virtud de su propiedad de hibridacin de los cidos nucleicos, definen los puntos de partida para el copiado de las cadenas deADN. Si se colocan dos oligos cuya secuencia define los extremos de un segmento determinado deADN, se hacen hibridar con las hebras del molde, previamente separadas, y se someten a una reaccin conADNpolimerasa, de lo que resultarn dos molculas cuyos extremos estn definidos por los oligos y que corren en sentido opuesto. Las cadenas resultantes son complementarias entre si: existen ahora el doble de molculas con la secuencia que demarcan los oligos.

III. AISLANDO GENES: CASOS DE LA VIDA REAL

AISLAMIENTO DE GENES POR COMPLEMENTACINLos primeros genes microbianos fueron aislados mediante el principio de la complementacin. Este procedimiento se fundamenta en el trabajo previo de los genetistas que, desde mucho tiempo atrs, haban caracterizado indirectamente a los genes. El trabajo clsico en gentica microbiana implicaba el aislamiento y caracterizacin de bacterias mutantes, es decir, variantes que se generan espontneamente o por un tratamiento qumico o fsico. Por ejemplo, una bacteria mutante puede haber perdido la capacidad de alimentarse con cierta sustancia, digamos el azcar galactosa. Esto significa que algn gene relacionado con el proceso de asimilacin de la galactosa est alterado.Primero se requiere crear un conjunto de clones que contengan segmentos de un tamao adecuado. Lo que se hace es someter una preparacin delADNtotal de la bacteria en cuestin (de la cepa silvestreque contiene el gene normal que nos interesa) a la accin de alguna enzima de restriccin. La reaccin se controla para generar segmentos de unos 5 a 10 mil pares de bases, cada uno capaz de contener unos cuantos genes. Esta coleccin de fragmentos se liga a un vector de clonacin (vase el recuadro II.2) y se introduce a clulas de la cepa mutante (la que era incapaz de crecer en galactosa). Si colocamos algunos miles de clulas as transformadas en una caja con medio nutritivo (claro, donde el nutrimento sea galactosa), es probable que crezca alguna de ellas: la que recibi el segmento que contena el gene funcional; correspondiente al gene mutante. Este gene ya no es ms una entelequia. Se encuentra en un segmento pequeo, insertado en un plsmido del que se pueden preparar grandes cantidades. Este gene ha sido aislado, o purificado.AISLAMIENTO DE GENES USANDO ADN SINTTICOAislamiento de genes usando oligonucletdos sintticosAs como existen procedimientos para secuenciar elADN, tambin los hay para secuenciar protenas.A partir de la secuencia de aminocidos de una protena, podemos deducir la secuencia delADNque la codifica, utilizando el cdigo gentico (en realidad, slo de manera imperfecta, debido a que un mismo aminocido puede ser codificado por ms de untripleteocodn). En todo caso, en ciertas regiones favorables se puede esperar que la secuencia deducida corresponda muy cercanamente a la original.

AISLAMIENTO DE GENES UTILIZANDO ANTICUERPOSLas protenas, en particular; cuando son extraas a un animal, inducen en ste la produccin de anticuerpos. Estas molculas son, a su vez, protenas con caractersticas muy interesantes. Baste decir; por el momento, que los anticuerpos pueden ser usados como reactivos que reconocen, en medio de mezclas complejas, las sustancias especficas que indujeron su produccin. ElADNde todos los organismos es similar, pero la manera como ste se expresa para formar protenas especficas debe ser muy diferente; de hecho, de la diferencia del control de la expresin de los genes deriva en gran parte la diferencia entre unos organismos y otros. AISLAMIENTO DE GENES UTILIZANDO SUS ARN MENSAJEROSForma deARNmensajero. De hecho, si se purificaARNmensajero del oviducto de gallina, la mayor parte de esta preparacin estar constituida por el mensajero que codifica para la ovoalbmina.Es decir, que copie una hebra deARNy la "transcriba", de manera reversa haciaADN. Esto es, en principio, posible: la informacin (codificada en la secuencia) est en la molcula deARN. Lo que se requiere es una enzima que realice la copia, pero que acepte como molde al ARN, y como nucletidos para incorporar a los delADN.Usando una preparacin que contenga esta enzima, latranscriptasa reversa,sobre elARN, se obtiene el llamadoADNc, oADNcomplementario.Obtencin delADNcomplementarioEl procedimiento que permite obtenerADNa partir deARNes de extrema utilidad. La informacin que se encuentra en forma deARNmensajero es de una complejidad mucho menor a la que se encuentra en elADNde los cromosomas. Se emplea por lo tanto una tcnica que utiliza una serie de reacciones enzimticas,in vitro, para convertir elARNmensajero enADNde doble cadena, listo para ser clonado. El principal componente para lograr este procedimiento es la enzima llamadatranscriptasa reversa.Esta enzima es capaz de copiar un molde deARNpara fabricarADN, agregando las bases complementarias una por una, en un proceso similar a lareplicacin.Un tratamiento alcalino o enzimtico permite eliminar elARN que sirvi como molde original y se forma luego una segunda hebra deADN,con lo que se completa la copia clonable.

Al comparar las donas deADNc y deADN genmico se observ que stas no coincidan exactamente. ElADNgenmico contena segmentos adicionales deADN, al interior del gene! Estos segmentos se denominaron intrones Podemos comprender entonces que la complejidad de un genoma del ser humano es mucho mayor que la de una bacteria o de una levadura. Aislar genes humanos se parece mucho ms a buscar una aguja en un pajar. Pgina 14