I. INTRODUCCION

El tamaño y formas de las células es muy variable y por lo cual su observación es un

poco dificultosa y debido a ello se usan los diferentes tipos de colorantes para su mejor

observación. Para su observación microscópica de las células se emplean dos métodos:

Preparado en fresco: este método se usa para observar células vivas y que no necesitan

el uso de colorantes ya que estas células se encuentran en su propio medio.

Preparado en seco: este método se usa para observar células muertas, las cuales son

teñidas con los colorantes para su mejor observación morfológica y este comprende tres

pasos: extensión, fijación y tinción.

Dichos métodos nos proporcionan mejores resultados en el estudio de la morfología de

la célula.

II. OBJETIVOS

- Reconocimiento de preparados en seco y en fresco.

- Conocer los métodos y técnicas de las coloraciones más comunes.

III. REVISION DE LITERATURA

3.1 .COLORACIONES

Son compuestos, orgánicos que contienen radicales cromóforos esto es que

producen color y grupo de anxocromos que forman sales los grupos nitrito (-NO2)

y azo (-N = N) son cromóforos. Los radicales hidroxilo (-OH) y amino (-NH2) son

grupos anxocromos. Los cromóforos imparten la propiedad cromógena al

colorante y los anxocromos permiten que el colorante se una con la fibra o tejido.

(Ville, 1988).

3.1.1. Coloración Bacteriana

Entes de la tinción las bacterias suelen encontrarse en agua o en otro

líquido en un porta objeto limpio y son extendido en una película uniforme y

delgada. Se deja que la película seque en el aire y los microorganismos son fijados

por sustancias químicas o por el calor moderado. (Ville, 1988).

Tinciones: Es un método utilizado para estudiar microorganismos. (no vivos); en

estas tinciones se observa morfología, estructura y agrupamientos de

microorganismos. (Ville, 1988).

3.2 .TIPOS DE COLORANTES

3.2.1 Colorantes básicos

Verde de metilo (verde)

Azul de metileno (azul)

Pironina G (rojo)

Azul de toluidina (azul)

- Reaccionan con los grupos de aniónicos de los componentes texturales

que son los grupos fosfato de los ácidos nucleicos (DNA, RNA) los

grupos sulfato de los glucosaminoglucanos y los grupos carboxilo de

las proteínas. (Sherman, 1994)

- Los tres grupos se ionizan y quedan disponibles para la reacción con el

colorante básico por medio de uniones electrostáticas; a un pH

ligeramente ácido o neutro. (Sherman, 1994)

- Hematoxilina no es colorante básico en sentido estricto. (Sherman,

1994)

- Hematoxilina se presta para aquellos procedimientos tintoriales no los

que a ella le sigue la eosina u otro colorante ácidos. (Sherman, 1994)

- Los colorantes básicos verdaderos no suelen usarse en secuencias en

donde el colorante básico es seguido por un ácido por que la anilina

básica tiene a disociarse del tejido durante los lavados posteriores en

soluciones acuosas. (Sherman, 1994)

3.2.2 Colorantes Ácidos

Fucsina ácida (rojo)

Azul de anilina (azul)

Eosina (rojo)

Naranja G (naranja)

- Se unen primariamente a los componentes texturales por medio de

enlaces electrostáticos de manera similar pero opuesta a la de los

colorantes básicos. (Otto, 1993).

- Las anilinas ácidas reaccionan con grupos cationicos, como son los

grupos Aminos ionizados de las proteínas. Aunque el enlace

electrostático constituye el principal factor en la unión primaria del

colorante con el tejido. (Otto, 1993).

- En la técnica de MALLORY se usan tres colorantes ácidos, azul de

anilina, fucsina ácida, y naranja G. Estos tiñen con selectividad el

colágeno, el citoplasma en general y los eritrocitos, respectivamente.

(Otto, 1993).

- La fucsina ácida también tiñe los núcleos. (Otto, 1993).

- En otras técnicas con anilinas ácidas múltiples se emplea la

hematoxilina para teñir los núcleos primero y luego se aplican los

colorantes ácidos con el fin de teñir selectivamente el citoplasma y las

fibras extracelulares. (Otto, 1993).

- Los colorantes básicos también pueden emplearse combinados, pero

estas combinaciones no son de uso tan extendido como las de los

colorantes ácidos.

3.3. TINCION GRAM

Es un extendido bacteriano fijado al calor sobre un portaobjetos se trata con el

colorante básico, violeta de cristal. Todos los organismos toman este colorante, luego se

cubre el extendido con la solución yodada de gram. Después de un enjuague con agua y

una decoloración con acetona, se lava el preparado minuciosamente en agua y se

contratiñe con un colorante rojo, generalmente saframina. El el preparado teñido se

enjuaga entonces con agua, se seca y se examina bajo el microscopio .

Las bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos grupos , según lo

implementara a comienzo del siglo XVIII el bacteriólogo danés Christian Gram.

a). Microorganismos Gram-positivos

Estos microorganismos se tiñen de color azul o violeta intensa

b). Microorganismos Gram-negativos

Estos microorganismos pierden el cristal violeta y se vuelven a teñir con la

saframina, apareciendo el color rojo.

3.4. NUEVO COLORANTE DE CÉLULAS

La técnica de tinción celular o coloración de las células facilita el estudio de la

composición y estructura microscópica de tejidos orgánicos. El proceso consiste

en teñir una muestra del tejido a observar y cuando éste tiene contacto con el

colorante o pigmento, los núcleos y el citoplasma de las células resaltan, con lo

que se simplifica la localización de cualquier tipo de daño. (Sanboh, 1996).

En la estructura celular de los seres vivos es posible observar y detectar la

existencia de anomalías o patologías, que generalmente se relacionan con

enfermedades. Este método ha permitido a los científicos localizar padecimientos

múltiples, que van desde procesos degenerativos celulares hasta de tipo maligno

como el cáncer. (Sanboh, 1996).

Las primeras sustancias empleadas por los microscopistas como colorantes celulares fueron de origen natural, como el carmín

(extraído de la cochinilla), la crocianina (del azafrán) y la hematoxilina (del árbol haematoxylon campechianum o palo de Campeche). Actualmente, se usa este último para la coloración de tejidos, pero su producción tiene un costo elevado. Por tanto, dos investigadores de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, la maestra María Teresa Valenzuela Vargas y el doctor Filiberto Vázquez Dávila, probaron la eficacia de un colorante celular sintético, el cual reúne las características de pigmentación requeridas, es de bajo costo y el procedimiento para producirlo es sencillo. (Sanboh, 1996).

IV. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Materiales

- Mucosa labial- Laminas de porta y cubre objetos- Eosina- Fucsina- Cristal violeta- Aceite de cedro- Asa de kolle- Sarro dental- Alcohol - Lugol- Mechero- Agua destilada

Azul de metileno- Microscopio compuesto

4.2. Metod

ología

La práctica fue visual-experimental, se empezó poniendo las muestras en los

portaobjetos, luego se tiñeron dichas muestras para ser observadas en el

microscopio.

II. RESULTADOS.

5.1. Preparado en fresco

- En este proceso se uso agua estancada o de charco para ello se siguió los

siguientes pasos:

- Se saco con un gotero una gota y se puso la muestra, en una lamina de porta

objeto.

- Luego se cubrió la muestra con una lamina de cubre objeto.

- Luego se llevo al microscopio para observar, de manera directa, se observo a

10X y a 40X,

5.2. Preparado en seco

Aquí se usan colorantes

a). Coloración simple.-

Se usa un solo colorante puede ser acido o base (azul de metileno)

- En este tipo de preparado se uso como muestra la mucosa labial, para observar

en el microscopio su morfología, y para ello se siguió los siguientes pasos.

- Se coloco la mucosa labial en una lámina porta objeto, luego con otra lámina

se hizo un frotis, para extenderla sobre la primera lamina.

- Una vez extendida se hizo una fijación, flameándole sobre el fuego de manera

vaivén, para que la fijación sea uniforme y rápida para matar a las células.

- Después de la fijación pasamos a la coloración de la muestra, en nuestra mesa

usamos el colorante azul de metileno; también se puede usar otros colorantes

como son: Eosina, Fucsina, Cristal violeta, Verde de metileno, etc.

- Después de una pequeña tinción se paso al lavado para quitar el exceso de

colorante y para que se visualice, mejor en el microscopio.

- Luego se observo al microscopio en 10X y 40X, dependiendo de la muestra,

para una mejor visualización de la mucosa labial..

b) Coloración Doble

Se usa dos clases de colorantes (Coloración Gram).

- Azul de metileno.

- Saframina (color rojo).

- Se usa la misma muestra y procedimiento que el anterior

c). Observación de bacterias

- Aquí se usa sarro dental (estreptococos)

- Se usa el colorante saframina

- En la muestra llevada al microscopio se observa bacterias pequeñas en forma

de cadenas alargadas con el objetivo de 40x.

- Con el objetivo de 100x usamos aceite de cedro y observamos las bacterias

con mayor claridad y de tamaño claramente.

III. DISCUSIÓN

- Según Ville (1988) y Otto (1993), nos mencionan de que para realizar el tipo

de coloración o preparado en fresco cumple con lo que se realizo en la

practica; también menciona que para el preparado en seco, también cumple

con lo realizado a la practica, solo con la inferencia de algunos colorantes.

IV. CONCLUSIONES

- Se pudo realizar los preparados en fresco y en seco, conforme a lo establecido

por la práctica.

- Se conoció las técnicas más comunes de coloración que son coloración simple

y compuesto.

V. REFRENCIAS BIBLIOGRAFICAS

- VILLE, C. 1988. Biología. 7ª edic. Edit. Interamericana. S.A. México. 875p.

- OTTO, J.Y.A. TOWLE. 1993. Biología Moderna. 11ª edic. Edit McGraw – Hill,

S.A. México. 621p.

- SANBOH LEE, H-Y Lee, I-F Lee, C-Y. 1996. Teeng. Ink diffusion in water.

Eur. J. Phys. 25. (2004) pp. 331-336.

- SHERMAN, I. Y V. SHERMAN. 1994. Biología. 3ra edic. Edit. Mc Graw-

Hill, S.A. México. 704p.

- Gerard. J. Tortora. Introducción a la Microbiología. Editorial Acribia S.A.

Zaragoza - España. 792p.

IX .CUESTIONARIO

1. Definir una coloración simple, doble y diferencial.

Coloración diferencial:

Cuando la muestra se emplea secuencialmente dos colorantes, que permiten

distinguir tipos de microorganismos.

Coloración Simple:

Cuando la muestra solo se utiliza un colorante que generalmente tiñe a los

microorganismos.

Coloración doble:

Cuando la muestra se agrega varios colorantes

2. Enumerar tres colorantes ácidos y tres colorantes

básicos.

Colorantes básicos

Verde de metilo (verde)

Azul de metileno (azul)

Pironina G (rojo)

Azul de toluidina (azul)

Colorantes ÁcidosFucsina ácida (rojo)

Azul de anilina (azul)

Eosina (rojo)

Naranja G (naranja)

3. Explique cual es la diferencia entre colorante ácido y

básico.

Colorante básico.- son aquellas que tiene afinidad especial por colorear la

cromatina nuclear, llamadas por esto colorantes nucleares.

Pero según Ross/ Romrell (1992); el colorante básico es una molécula de anilina

que tiene una o más cargas positivas en su porción coloreada y su formula general

es: anilina + Cl-.

Colorante ácido.- son aquellos con afinidad especial por colorear el citoplasma por

lo que se les llama colorante citoplasmático. Pero según Ross/Romrell (1992); los

colorantes ácidos llevan una carga negativa en la porción coloreada de la molécula

y su fórmula general se representa así: Na + anilina.

El color de la anilina no está relacionado con el hecho de que sea ácido o básica.

Ej.: azul de metileno (azul) y es básico con el azul de anilina (azul) y es ácido.

4. Explicar el fundamento de la coloración gram.

Tinción de Gram:

Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado con alcohol, Safranina

30 seg)

Tinción de Gram:

Dividida en Gram. Positivo y Gram. Negativo, en el caso de los Gram. (+) la

muestra fue sarcina, puesto que una tonalidad violeta fijada en su estructura

determina la presencia de la misma puesto que fijó en su estructura el cristal violeta.

Y en el gran (-) utilizamos salmonella identificada por la presencia de muchas

estructura un poco triangulares de color rojo.

En la muestra de la práctica anterior 3 eran gran positivo por su coloración morada.

5. Que función cumple el lugol en la coloración gram.

L a acción del lugol en esta coloración es conseguir la mayor fijación de la violeta

por los gérmenes. Gram.+ por unión de los colorantes con el yodo del lugar.