INTRODUCCIN El almidn es el carbohidrato de reserva ms abundante en las plantas y se encuentra en hojas, diferentes tipos de tallos y races as como en flores, frutos y semillas en los cuales se utiliza como fuente de energa durante periodos de dormancia, estrs o reinicio del crecimiento. Los rganos que almacenan almidn son productos alimenticios de importancia; De manera creciente, el almidn es utilizado como recurso energtico renovable despus de su conversin a etanol y para muchas aplicaciones industriales por su versatilidad, bajo costo y la facilidad con que se alteran las propiedades fsico qumicas, ya sea mediante modificaciones qumicas, enzimticas o tratamientos fsicos (Jobling, 2004). El almidn es la principal forma de reserva carbonada en planta s superiores. El inters de este polmero de reserva no slo se debe a la gran cantidad en que se produce y a la universalidad de su distribucin, sino tambin a su gran importancia comercial. La sntesis de almidn est regulada alostricamente a nivel de la primera enzima de la ruta, la ADP -glucosa pirofosforilasa (AGPasa). Nuestro grupo ha propuesto que, adems del control alostrico de la actividad de la AGPasa, existen mecanismos de control mediados por el reloj circadiano y por azcares que implican l a regulacin de la expresin de los genes de la ruta de sntesis de almidn.

FUNCIONAMIENTO DE LAS ENZIMAS INVOLUCRADAS SNTESIS Y DEGRADACIN DEL ALMIDN

EN

LA

Aparentemente la ruta postulada para la biosntesis de almidn es relativamente simple e involucra tres enzimas: la ADP- glucosa pirofosforilasa (AGPasa), la sintetasa de almidn (SS) y la enzima de ramificacin del almidn (SBE). Sin embargo, se ha demostrado la participacin de varias isoformas de estas enzimas y otras enzimas adicionales que estn de alguna manera involucradas en el proceso. Las isoformas difieren en su expresin tisular y temporal, en las propiedades ci nticas y en los productos (Dennis y Blakeley, 2000; Santacruz et al.,2002). ADP- glucosa pirofosforilasa (AGPasa) En las plantas las AGPasas son codificadas por diferentes genes que muestran una fuerte especificidad en su perfil de expresin, por ejemplo algunas se expresan solo en hojas, otros en races y otros en el endospermo como en trigo y cebada. La AGPasa es una enzima heterotetramrica y el anlisis de mutantes demostr que tanto las dos subunidades grandes como las dos pequeas son necesarias para la actividad; las subunidades grandes actan en la regulacin y las pe queas en la catlisis. Se han clonado tre s cDNAs en yuca que codifican para las subunidades B, S2 y S3 de la AGPasa. El producto de la actividad de AGPasa es la ADP -glucosa que acta como precursor inmediato de la sntesis del almidn ( Zhou y Cheng, 2005). Sintetasas de almidn (SS) Uno de los adelantos importantes en la compren sin de la biosntesis del almidn, es la explicacin de la aparente simultaneidad en la sntesis de los dos polmeros constituyentes del almidn. Las sintetasas del almidn estn asociadas con el alargamiento de las ca denas de glucano y se pueden clasificar en dos grupos de acuerdo con la localizacin; una (GBSSI) se encuentra firmemente ligada a los grnulos de almidn y cataliza la conversin de ADP-glucosa a cadenas lineales de (1-4) -glucosa (amilosa) y la otra (SSS) es una forma soluble localizada en el estroma de los amiloplastos y cloroplastos y actua especficamente en la biosntesis de amilopectina. Sin embargo, GBSSI res ponsable de la sntesis de amilosa tambin contribuye con la sntesis de amilopectina. A n se desconocen los factores que determinan la particin de la actividad de la enzima en los dos procesos (Denyer, et al., 2005; Smith, 2005).

Enzima de ramificacin del almidn (SBE) La enzima ramificadora SBE tambin presenta mltiples isoformas que varan entre especies y su actividad entre genotipos debido a cambios en el extremo N y C terminal de la protena. En yuca, se encontr una isoforma similar en 70-75% a SBEI (foliar) pero con alta expresin en las races. La actividad de SBE es importante en la calidad y cantidad de almidn. La ausencia de esta enzima ocasiona varios efectos como bajas concentraciones de amilopectina y almidn pero elevada cantidad de azcares (Baguma et al., 2003; Baguma, 2004). La deficiencia en la enzima SBEI en el endo spermo de mutantes de arroz (sbe1) altera la estructura fina de la amilopectina (disminuye tanto las cadenas largas como el grado de polimerizacin) sin alterar el nivel normal del almidn (Kim, et al., 2005; Satoh et al., 2005). La funcin de SBEIIb no se supli por otras isoformas, lo cual indica el papel especfico de esta enzima en la transferencia de cadenas cortas en la ami lopectina del endospermo de arroz y en la morfologa de la semilla de arveja ( Nishi, et al., 2005). El estado de desarrollo de la planta regula la expresin de las enzimas ramificadoras del almidn I y II por lo cual se pueden observar granos de almidn de forma diferente con el transcurso del tiempo. Mu tantes defectuosos demuestran que se requieren ambas isoformas para el desarrollo completo de los granos de almidn (Baguma, et al., 2003). Biosntesis de amilosa El aumento en longitud de la cadena de amilosa se realiza mediante GBSSI en los rganos de alma cenamiento y por GBSSII en las hojas y otros tejidos que acumulan almid n transitorio. En yuca la enzima GBSSII presenta 30% de similaridad con la enzima GBSSI (Baguma et al., 2003). La isoforma GBSSI es estimulada por los malto oligosacridos (MOS) cuando sintetiza amilosa. Experimentos in vivo demuestran que a partir de la amilopectina se puede producir amilosa y que la sntesis previa de la cadena lineal de glucano no se requiere para la formacin de grnulos semicris talinos (Tetlow et al., 2004).

Biosntesis de amilopectina y formacin del grnulo de almidn La amilopectina se forma por la accin de SBE y SS. SBE introduce sitios ramificados en la molcula de amilopectina por hidrlisis de cadenas (1, 4) glucano a 15-20 unidades del extremo no reductor. Cuando cataliza la formacin de enlaces (1 -6) une el extremo reductor de cadenas adheridas con otros residuos de glucosa. SS sintetiza cadenas de glucanos de diferente longitud de acuerdo con la isoforma que est actuando. El estudio de mutantes del endospermo de maz y arroz, que acumulan fitoglicgeno, condujo a la descripcin del modelo de proceso simultneo, el cual postula que la sntesis de amilopectina y su incorporacin en el grnulo de almidn resulta de la poda, por la DBE, de los glucanos altamente ramificados sintetizados por la SS y la SBE (Baguma, 20 04). La molcula de amilopectina se auto -organiza en arreglos regulares en la fase soluble de la superficie del grnulo en crecimiento y al cristalizarse constituye la nueva matriz del material. Se ha encontrado que el trabajo de la DBE est asociado con la accin de otro grupo de enzimas ISA1, ISA2 e ISA3 (Mukerjea y Robyt, 2005; Smith, 2005) y que se requiere la accin concertada de otras enzimas como la almidn fosfo rilasa (enzimaP), la lucanotransferasa (enzimaD), la UDPglucosa (amilogenina), la isoami lasa 1, la protena RI y la ADP-glucosapirofosfatasa. Recientemente se ha demostrado que varias enzimas relacionadas con la degradacin del almidn como amilasa, amilasa, enzimas D, glucosidasa (maltosa), a -1,4 glucanotransferasa, glucano H2O dikinasa (GWD) y glucano fosforilasa actan tambin en la sntesis de almidn (Tabla 3) (Baguma et al., 2003; Jobling, 2004; Smith, 2005).

Degradacin del almidn en los plastidios De manera similar al proceso de sntesis del almidn, en la degradacin realizada tanto en los plastidios foliares como en los de los vertederos, se conoce la casi totalidad de las enzimas implicadas pero se desconocen los detalles de la regulacin del funcionamiento de las mismas . Recientemente se ha encontrado que las diferencias en el dominio de ligamiento entre el almidn y las enzimas degradativas influencian su capacidad amiloltica (Tetlow et al., 2004; Rodrguez et al., 2005). La amilasa apoplstica ( - amilasa) presente en las paredes celulare s de los rganos en crecimiento de gramneas cataliza la hidrlisis y remocin de unidades sucesivas de maltosa del extremo no reducido de la cadena de

glucanos. La -amilasa hidroliza los enlaces glucosil -(1-4) del almidn, genera malto oligosacridos lineales y ramificados que a su vez producen glucosa, maltosa y un amplio rango de -dextrinas lmite. La fosforilasa del almidn tambin puede degradar los enlaces glicoslicos. La GWD controla putativamente la tasa general de rompimiento del almidn. A partir del estudio de mutantes de Arabidopsis se sugiere que la protena D es fundamental en la degradacin del almi dn al igual que la protena R1 y su producto (residuos glucosil fosforilados de amilopectina). El anlisis del metabolismo del almidn en el mutante de la enzima fosforilasa del almidn (enzima P) de Arabidopsis indica que se requiere fosforilacin previa para la degradacin del almidn. Recientemente se ha evidenciado la preponderancia de la - amilasa y la GWD en la ruptura del almidn transitorio. (Uno-Okamuraa, et al., 2004; Lloyd et al., 2005). del trigo hexaploide se encontr una isoforma similar a SSIII de maz. Las alteraciones fisicoqumicas observadas en el mutante sugary2 de maz se atribuyeron a la actividad de la sintetasa de l almidn IIa que increment las cadenas de glucanos cortos en la amilopectina (Dian et al., 2005; Zhongy, et al., 2005).

As, la enzima Almidn Sintasa Unida a Grnulo (GBSSI) implicada en la sntesis de amilosa, polmero lineal de glucosa que junto a la amilopectina constituye el grnulo de almidn se encuentra regulada a nivel transcripcional por el reloj circadiano y por azcares. Utilizando como sistemas modelo las plantas Arabidopsis thaliana y Anthirrinum majus, hemos demostrado que el gen que codifica para la GBSSI est regulado transcripcionalmente por el reloj circadiano en un proceso en el que participan los factores de transcripcin CCA1 y LHY, elementos del oscilador central de Arabidopsis, e interaccionan directamente sobre el promotor del gen GBSSI. La oscilacin circadiana del mRNA de la GBSSI no se refleja en los niveles de protena, aunque s en los niveles de actividad GBSSI. Asimismo, la expresin del gen GBSSI se encuentra regulada por azcares como glucosa, sacarosa y trehalosa, azcares que inducen la expresin del gen GBSSI. (Jobling, 2004). Nuestro grupo ha caracterizado el papel de las diferentes isoformas de AGPasa [enzima heterotetramrico compuesto por dos subunidades pequeas (APS) y dos subunidades grandes (APL)] en diferentes tejidos y rganos de Arabidopsis thaliana. Esta planta posee 2 genes que codifican para subunidad pequea ( ApS1 y ApS2) y 4 para subunidad grande ( ApL1-4). Hemos demostrado que la subunidad APS2 no es funciona l, siendo la subunidad APS1 la nica responsable de la actividad cataltica. Por otro lado,

las propiedades cinticas y regulatorias que las subunidades APL confieren al heterotetrmero nos permitieron diferenciar entre subunidades APL de tejidos fuente y de tejidos sumidero. Mediante hibridacin in situ de mRNA, se ha caracterizado el patrn de expresin de los 6 genes que codifican para AGPasa en Arabidopsis thaliana. Los resultados indican que existe un patrn diferencial de expresin de las distintas is oformas, lo que nos ha permitido apoyar con ms fuerza nuestra hiptesis de trabajo referente a la diferenciacin funcional de las cuatro isoformas de APL entre tejidos fuente y tejidos sumidero. Se dispone de mutantes de insercin de T-DNA para las 6 isoformas de AGPasa cuya caracterizacin, junto con la obtencin de mutantes dobles y triples, nos permitr definir con mayor precisin la funcin de cada una de las isoformas de AGPasa. La regulacin por azcares de la expresin gnica es un aspecto de gran inters en la biologa vegetal. Mediante RT -PCR cuantitativa hemos observado que de los 6 genes que codifican para AGPasa en Arabidopsis, slo los genes APL3 y APL4 se inducen por azcares, y que el aumento en los niveles de mensajero de los genes ApL3 y ApL4 es mayor con sacarosa y trehalosa que con glucosa. Asimismo, el control por azcares nicamente tiene lugar en hojas, no ocurriendo en el resto de los tejidos y rganos de la planta. La induccin de la transcripcin de estos genes tiene, adems, efectos a nivel fisiolgico, pues se traduce en un aumento significativo en los niveles de almidn acumulado en la hoja. A fin de profundizar en la regulacin por azcares de stos genes, se han realizado delecciones seriadas del promotor del gen APL4 fusionadas al gen testigo GUS con objeto de identificar elementos reguladores implicados en el control transcripcional por azcares del gen APL4. La sacarosa, entre otros azcares han sido implicados en la va de sealizacin que conduce a la floracin. Adems, mutantes de floracin tarda como gigantea (gi) acumulan niveles muy elevados de almidn. El transporte de sacarosa hacia el meristemo apical podra tener una funcin sealizadora de la floracin, adems de constituir la fuente de carbono y energa para dicho proceso. Parece lgico pensar que parte de la sacarosa que se moviliza para el proceso de floracin proceda del almidn acumulado en las hojas. Hemos obtenido resultados que sugieren una conexin entre niveles de almidn y tiempo de floracin. Estamos estudiando los niveles de expresin de genes implicados en la sntesis de almidn y de sacarosa en diferentes fondos genticos con el fin de establecer la posible relacin entre la sntesis de almidn, la sntesis de sacarosa y la induccin de la floracin. Asimismo, se estn caracterizando mutantes de T-DNA de genes

implicados

en

la

sntesis

de

sacarosa

con

dicho

fin.

Por otro lado, el grupo realiza trabajos en cereales como trigo y arroz con fines biotecnolgicos. As, se est intentando alterar el proceso de sntesis de almidn en plantas de trigo, y se est estudiando el efecto de la salinidad sobre la sntesis de almidn en arroz.

Inicio y Sntesis del Grnulo de Almidn (ngel Mrida) Qumicamente el almidn se puede separar en dos tipos de polmeros: la amilosa y la -D-glucosa. La amilopectina es el Eamilopectina, ambas formadas por residuos de componente mayoritario del almidn y consiste en un polmero altamente ramificado formado por residuos de glucosa unidas por enlace (1-4) y con enlaces (1-6) en los puntos de ramificacin. Los diferentes usos industriales del almidn vienen condicionados en parte por las propiedades fsico-qumicas del almidn: tamao del grnulo, proporcin amilosa /amilopectina, grado de ramificacin de la amilopectina y tamao de dichas ramificaciones. En plantas existen cinco clases de almidn sintasas (SS): GBSSI, SSI, SSII, SSIII y SSIV. La primera est encargada de la sntesis de amilosa, mientras que las Clases SSI-IV parecen intervenir en la sntesis de amilopectina. Nuestro trabajo actual se centra en la caracterizacin del papel de las Clases I -IV de SS en la sntesis de amilopectina en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Los genes que codifican para las formas SSI-IV se expresan en todos los rganos de la planta y sus niveles de expresin no responden a estmulos externos como luz o disponibilidad de azcares. Hemos obtenidos mutantes simples afectados en cada uno de los ge nes SS y estamos analizando el efecto de dichas mutaciones en la sntesis de almidn y en la estructura del mismo. Estos anlisis nos ha permitido demostrar que la SS Clase IV est implicada en el proceso de iniciacin del grnulo de almidn, un proceso de l que no se conoce nada hasta la fecha. Estamos empleando diversas aproximaciones: co-inmunoprecipitacin, co -purificacin por afinidad en tandem, perfiles protemicos, anlisis de mutantes dobles y triples de las diferentes SS, con objeto de identificar el resto de elementos implicados en el proceso de iniciacin del grnulo de almidn y caracterizar la naturaleza de la interaccin entre dichos elementos.

METODOLOGAS PARA LA CARACTERIZACIN DEL ALMIDN Y SU METABOLISMO La importancia del almidn en la alimentacin y la industria hace necesario el desarrollo de tcnicas nuevas y baratas para la evaluacin cualitativa y cuan titativa de caractersticas determinantes de la utilidad potencial como la afinidad por el yodo (IA), la longitud promedio de la cadena, el grado de polimerizacin, el peso promedio y la distribucin molecular, entre otras. El avance en el estudio del metabolismo y caracteri zacin del almidn requiere la integracin de anlisis genmicos, bioqumicos y fsicos. Por ejemplo, los anlisis basados en espectrometra/purificacin por afinidad en tndem (TAP-MS) facilitan la identificacin in vivo de los componentes de los complejos protenicos de las enzimas implicadas en el

metabolismo del almidn, as mismo las tcnicas basadas en esp ectrometra de masas (MS) permiten la identificacin de modifi caciones post traduccionales de las enzimas como la fosforilacin. Las diferentes tcnicas de microscopa y difraccin de rayos X, se utilizan para la caracteri zacin de la microestructura del grnulo de almidn y la distribucin de las molculas que lo componen. Por otro lado, el anlisis de control de flujo metablico, es una herramienta importante en el estudio de la regula cin de la conversin de sacarosa a almidn (Blennow et al., 2002; Salomn et al., 2003; Bornke, 2005; Kolbe et al., 2005; Geigenberger et al., 2004; Korban, 2005; Demiate et al., 2001). En la se relacionan algunos trabajos desarrollados para la identificacin y caracterizacin de las enzimas, las molculas involucradas en la ruta biosinttica del almidn y su interaccin en la dinmica de la formacin del grnulo.

Bibliografa http://www.labferrer.com/documentacio/aqualab/Actividad%20enzi matica.pdf y http://co.patentesonline.com/metabolismo -de-subtipos-dealmidones-y-lipidos-42908.html y y Nishi Aiko; Yasunori Nakamura, Naoki Tanaka; Hikaru Satoh. 2005. Biochemical and Genetic Analys is of the Effects of AmyloseShuai Chen; M. Hajirezaei; M. Peisker; H. Tschiersch; U. Son newald; F. Brnke. 2005. Decreased sucrose-6-phosphate phosphatase level in transgenic tobacco inhibits photosynthesis, alters carbohydrate partitioning, and reduces growth. Planta (2005) 221: 479492 (Denyer, et al., 2005; Smith, 2005).

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