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Bioquímica clínica Principios y guías para el laboratorio

La Habana, 2016

Bioquímica clínica Principios y guías para el laboratorio

Raúl Fernández Regalado

Doctor en MedicinaDoctor en Ciencias Médicas

Profesor Titular de Bioquímica

Segunda edición

Edición: Profesora Ing. Vilgilia Salcines BatistaDiseño: Ac. Luciano Ortelio Sánchez Núñez Fotografía: Ac. Luciano Ortelio Sánchez NúñezRealización: Lisette Hernández RegaladoEmplane: Amarelis González La O

© Raúl Fernández Regalado, 2016© Sobre la presente edición: Editorial Ciencias Médicas, 2016

ISBN 978-959-313-000-4

Editorial Ciencias MédicasCentro Nacional de Información de Ciencias MédicasCalle 23 No. 654, entre D y E, El Vedado,La Habana, Cuba, CP 10400.Teléfono: 7836 1893http://www.ecimed.sld.cu

Catalogación Editorial Ciencias Médicas

Fernández Regalado, Raúl. Bioquímica clínica. Principios y guías para el laboratorio / Raúl Fernández Regalado. -- 2. ed. -- La Habana: Editorial Ciencias Médicas, 2016. 231 p.: il., gráf., tab.--Bioquímica /métodos, Manuales de Laboratorio

QU 25

Primera edición, 2011

A mis padres y Mario.Para Rosita y Lourdes.

Para Pablito, que lo resume todo y ya es capaz de leer estas líneas

A mis colegas del departamento de bioquímica, y a todos sus trabajadores, por las innumerables enseñanzas que me han brindado en mi vida profesional.

A los profesores Gustavo Sierra González, Agustín Vicedo Tomey y Joel Panal Álvarez, por sus críticas y valiosas sugerencias. En particular, al profesor Vicedo por su inestimable ayuda en esta segunda edición.

A los doctores Rolando A. Valle Rodríguez, Josanne Soto Matos, Licenciada Celia A. Alonso Rodríguez y otros profesionales y técnicos del hospital Hermanos Ameijeiras por su amabilidad y colaboración en esta segunda edición.

A la Editorial Ciencias Médicas y muy en especial a la editora Norma Collazo Silvariño por su trabajo en la primera edición, y a la editora Virgilia Salcines Batista por su dedicación en esta segunda publicación. También el diseñador Luciano Ortelio Sánchez Núñez.

A los residentes de bioquímica clínica y de laboratorio clínico, por sus contribuciones y sugerencias.

A mis colegas y compañeros de La Melba, en especial a Guido y Abraham†.

Prólogo de la primera edición

Con sumo gusto y agradecimiento por el honor conferido al distinguirme con esta oportunidad, he accedido a prologar este libro, el cual representa una obra de obligada consulta para todo aquel interesado en la especialidad de la bioquí-mica clínica, en su enseñanza o en su aprendizaje, por la riqueza que encierra al ser depositaria de una larga y fructífera experiencia docente-metodológica y científica del autor.

El libro contiene diez capítulos y dos anexos, apoyados por referencias biblio-gráficas que se encuentran al final de este, todas de gran valor para el tema. Aquí se ofrece, de manera clara y didáctica, un conjunto de principios y guías muy bien seleccionados, que son, sin dudas, las columnas que sostienen un buen laboratorio de bioquímica clínica y general. Se puede apreciar de mane-ra muy diáfana lo que constituye experiencia y aporte del autor, de lo que es conocimiento precedente y “estado del arte”, siendo un sello de autenticidad y originalidad este estilo.

Considero que está bien organizado, escrito con lenguaje claro y bien funda-mentado científicamente, con el gran valor metodológico de guiar de la mano a todo el que necesite trabajar en este tipo de laboratorio. La mayoría de los capítulos son especialmente relevantes para iniciar a cualquier profesional o técnico y el capítulo 10 es, sin lugar a dudas, una pieza integradora que resulta de interés hasta para los ya iniciados y de experiencia en este campo, al brindar una excelente guía para la interpretación de los resultados de laboratorio. Se obsequian al lector las profundas experiencias del autor como bioquímico y como profesor.

Este texto debe formar parte del arsenal metodológico de la enseñanza de la bioquímica a todos los universitarios y técnicos que lo requieran e incluso para entrenamientos y actualizaciones de personal que demanden un reciclaje; es además un libro de consulta y de utilidad en todo laboratorio de bioquímica clínica y general. Particular importancia reviste esta obra para los residentes que reciben esta asignatura y para los tecnólogos de la salud por igual motivo; no está escrito, hasta donde yo conozco, ningún texto que contenga un mejor ajuste a esas necesidades de aprendizaje y consulta.

En el capítulo 1 se aborda la seguridad y organización en el laboratorio. Con-tiene numerosos cuadros sinópticos y una escritura resumida y abarcadora. Este capítulo describe los principales riesgos que se enfrentan en el trabajo en un laboratorio de bioquímica clínica. Los riesgos biológicos, químicos, físicos y los derivados de errores humanos o ambientales. No es un tratado sobre el tema, sin embargo, aporta los elementos esenciales a tener en cuenta en este importante aspecto de la seguridad y la organización de un laboratorio de este tipo, y explica la necesidad de establecer el reglamento de seguridad de un la-boratorio y su documentación esencial. Insiste didácticamente en la necesidad de educar y preparar a todos los que trabajen en el laboratorio en estos aspectos de seguridad, por lo que resulta muy útil para los que se inicien en el trabajo del laboratorio.

El capítulo 2 enfoca los aspectos esenciales del contenido de los laboratorios de bioquímica, como son los reactivos y los materiales fundamentales, no sin hacer una introducción a las funciones e importancia de la organización y el trabajo con conocimientos y calidad; se incluyen las características de los reactivos que se usan y de los materiales o utensilios más frecuentes, además de fotos muy ilustrativas. Este capítulo resume de manera excelente y muy didáctica las funciones principales de los laboratorios de bioquímica clínica e investigativas, su papel esencial en el diagnóstico de enfermedades o en la prueba de hipótesis científicas y sobre qué principios se basa su buen funcionamiento para asegurar el cumplimiento de estos fines, es decir, los conceptos de calidad, organización y eficiencia, y de la creciente automatización y mecanización de algunos pro-cedimientos y técnicas.

Se adentra en el manejo adecuado de reactivos y materiales, de equipos y utensilios y de cómo esto se debe integrar con un manejo seguro, para lo cual resulta imprescindible un alto nivel de conocimientos, los cuales exigen una adecuada preparación y entrenamiento en todas las técnicas a desarrollar en el laboratorio y sus fundamentos.

Dedica un espacio importante a describir los conceptos esenciales sobre reactivos químicos y sus diferentes calidades y grados de pureza según sus fines de uso y requerimientos regulatorios, los niveles de contaminantes admisibles, por tipo de reactivos, sus especificaciones, etiqueteado, su disponibilidad en el mercado, su estabilidad, las condiciones de almacenamiento según requerimientos, la caducidad y su rotulado, elemento esencial desde todos los puntos de vista. Además, brinda un espacio muy acertado sobre la limpieza y preparación de los materiales.

En el capítulo 3 el autor concentra la atención sobre la obtención, preparación, conservación y manejo en general de las muestras y tiene una dedicación muy especial cuando estas muestras se obtienen de pacientes, aunque los principios y enunciados son válidos para cualquier tipo de muestras.

Con el apoyo de varios cuadros sinópticos y tablas, se logra resumir los diferentes tipos de errores en que se puede incurrir en la fase preanalítica, al ordenar el análisis, desde la claridad de la letra, los datos del análisis y del paciente y las consideraciones especiales a tener en cuenta, hasta los errores en la toma de muestras, ya que en la forma de vaciar el contenido de una jeringuilla pueden afectarse parámetros de la sangre y otros fluidos, errores en la transportación, envase y conservación de las muestras, y todos los procedimientos relacio-nados. Atención especial se le concedió al rotulado y correcto etiquetado de las muestras y todo lo que deben decir esos rótulos para evitar confusiones y errores lamentables.

Por último, el autor dedica un espacio especial a los factores biológicos que explican y determinan las variaciones de los resultados analíticos, es decir, las diferencias entre una persona y otra aparentemente iguales, en primer lugar, las características genéticas, edad, sexo, raza, estado nutricional, régimen de actividad física, factores diversos de estrés físico y mental, biorritmo de cada persona, hábitos tóxicos, régimen de medicamentos y drogas, e incluso algunos factores ambientales que pueden afectar.

Este capítulo gira la atención sobre un tema esencial en el laboratorio y logra dejar claras las cuestiones esenciales, válidas para cualquier escenario y sobre todo para los que se inician en el mundo del laboratorio clínico de bioquímica.

Sobre la base de numerosas fotos de excelente calidad y varias tablas sinópticas, en el capítulo 4 se expone el uso, cuidado y mantenimiento de los equipos. Se describen los elementos esenciales, estructurales, funcionales y de fundamen-tación científica y operacional de los principales equipos del laboratorio. El autor logra de esta forma, una familiarización del lector con los equipos y sus propiedades, sobre todo los principios a tener en cuenta al enfrentar su uso por primera vez.

El capítulo 5 es excelente, pues logra introducir al lector en los principios de la fotometría. Muy buenas fotos ilustran no solo los equipos de manera general, sino que se presentan magníficos esquemas que explican las leyes y principios de la fotometría, se brindan datos y explicaciones sobre la física de luz, las lon-gitudes de ondas de sus componentes, las ecuaciones matemáticas que explican

su comportamiento y aquellas relevantes para fundamentar los principios de cuantificación de anualitos a través de la fotometría, como la Ley de Lambert y Beer, brillantemente explicada y esquematizada.

Se brindan las bases para la confección y uso de las curvas de calibración uti-lizadas en las mediciones y, por último, se detallan los tipos de errores debidos al equipo, al operario y a las muestras, así como el cuidado y conservación de estos equipos, los que constituye una de las columnas de sostén del laboratorio de bioquímica.

El capítulo 6 se dedica a la fotometría de llama y a las dos variantes de foto-metría que se derivan de ella: la fotometría de absorción y la emisión atómica. En ambos casos, la llama permite convertir en átomos aislados en estado de vapor al elemento que se pretende analizar, por ejemplo, en el caso de la emi-sión atómica, los átomos de muchos elementos metálicos, como litio, sodio y potasio, son excitados por efecto del intenso calor de la llama y después pueden emitir esta energía como radiaciones electromagnéticas de longitudes de onda características, la intensidad de la luz emitida a una longitud de onda característica es directamente proporcional a la concentración de la sustancia de interés en la muestra.

En la espectrofotometría de absorción atómica, por su principio físico es en cierto sentido el inverso de la fotometría de llama de emisión. En este caso, el elemento químico no es excitado en la llama, sino que es solamente disociado de sus enlaces químicos y se encuentra en el estado base o no excitado. En este estado el átomo puede absorber energía electromagnética a una longitud de onda muy estrecha y específica para cada elemento y en dependencia del número de átomos en la llama, será mayor o menor la cantidad de energía ab-sorbida y, por lo tanto, la luz que sale de la llama sufre una atenuación más o menos intensa. El proceso es muy parecido a la fotometría convencional, pero la llama sustituye a la cubeta.

Los métodos de espectrofotometría de absorción atómica son 100 veces más sensibles que la fotometría de emisión y se utilizan estas técnicas para cuantifi-car elementos que se encuentran en muy bajas concentraciones en las muestras problemas, como son los microelementos en suero u otros materiales biológicos, en agua y en alimentos.

En el capítulo 7 el autor sintetiza el amplio mundo de las enzimas. Estas son tratadas como reactivos de laboratorio tomando como ejemplo los ensayos tipo ELISA, muy bien explicados sintéticamente. También se explican las enzimas

como analitos para determinar que su posible alteración delate el estado de salud o enfermedad en órganos, tejidos y sistemas vitales.

Se hace gala de una elegante explicación de las bases conceptuales que go-biernan las reacciones enzimáticas, llegando incluso a describir las principales ecuaciones matemáticas.

También se brinda una introducción histórica breve al surgimiento y desarrollo de la enzimología, a la clasificación de los diferentes tipos de enzimas según sus funciones y termina el capítulo con las aplicaciones de las enzimas a la terapéutica, con una breve introducción, pero muy acertada para el principiante.

No soslaya ni evita el autor en el capítulo 8 meterse en el agreste mundo de la calidad en los laboratorios y sin entrar en extenso tratado de validación de técnicas analíticas ni nada parecido, logra dejar claro para el lector que se inicia en estas lides, lo complejo e imprescindible de este tema de la calidad.

Aborda con gran claridad el tema de la calidad de manera integral, como un principio general de organización y dirección, así como los temas de asegura-miento de la calidad, auditorías y todas las técnicas y procedimientos según las normas ISO, las cuales usa como un ejemplo.

También dedica cierto espacio a la documentación de la calidad, brinda numerosos y útiles consejos, y recomienda procedimientos adecuados en el quehacer diario del laboratorio.

El autor introduce al lector en el fascinante mundo de la mecanización y la automatización en el laboratorio de bioquímica clínica, en el capítulo 9. Aquí logra dejar claro el camino para la rápida y creciente aplicación de equipos de alto flujo de análisis hasta la introducción de verdaderos robots. Explica los principios de la automatización y también sus ventajas y desventajas, elementos necesarios al tener que decidir los procedimientos a usar y sus conveniencias, costos y posibles dificultades. Brinda definiciones de los diversos tipos de au-tomatización en el laboratorio y los ejemplos concretos.

El décimo capítulo está dedicado a la interpretación de los resultados analíticos de las pruebas de laboratorio; sin dudas es el elemento que pone una importante diferencia entre este libro y otros, pues a pesar del carácter breve y compacto de todo el texto, resumido y sobrio, aquí el autor se detiene un poco más y brinda un sustancioso análisis integrador que le da gran valor. En este espacio le brinda al lector una gran oportunidad de disponer de una excelente guía de interpretación

de las pruebas de laboratorio, no solo para el principiante, sino también para todo el que trabaje en un laboratorio, con mucha o con poca experiencia, es una guía buena para la gaveta principal de cualquier laboratorio y de cualquier laboratorista, integra el manejo especializado de los datos y su tratamiento estadístico, cómo se evalúan los pesos de esos resultados, las probabilidades y se concluye sobre la base de esos resultados.

El anexo 1 fue muy bien seleccionado y resulta de gran utilidad. Su colocación aquí refuerza la utilidad de este texto.

El anexo 2 también resulta muy bien seleccionado y útil. De tal manera que “de tapa a tapa” el libro es útil y bien balanceado y del amplio mundo de la bioquímica clínica se toma lo necesario para afianzar lo que debe constituir la piedra angular y columna de la especialidad y le es regalada al autor con ameno pero técnicamente exacto lenguaje.

Recomiendo, sinceramente, esta importante obra al lector.

Dr. Victoriano Gustavo Sierra GonzálezDoctor en Ciencias MédicasEspecialista en Bioquímica e InmunologíaBiotecnólogo Superior de Primer NivelInvestigador y Profesor TitularAcadémico de Mérito de la Academia de Ciencias de Cuba

Prólogo

Pasados solo un poco más de tres años de que la primera edición viera la luz en el 2011, por medio de la Editorial Ciencias Médica, de nuevo tengo el gusto de presentar al lector esta segunda edición del libro Principios y guías para el laboratorio de bioquímica clínica del profesor doctor Raúl Fernández Regalado. Título que cambió el orden de las palabra para quedar como Bioquímica clínica, principios y guías para el laboratorio.

Han bastado estos tres años para confirmar lo que predije al prologar la primera edición: el libro resultó muy bien acogido por los lectores de un amplísimo rango de profesiones y especialidades, tanto en los niveles de pregrado, como de pos-grado, teniendo todos en común el interés en el trabajo práctico en laboratorios de bioquímica clínica, en laboratorios científicos en general con empleo de las técnicas descritas en el libro; así como, los principios generales que son aun más amplios. Han sido muy numerosos los testimonios de esa buena acogida, con especial referencia a los de las especialidades en formación en Bioquímica y los docentes implicados en esa formación, ellos han dado un magnífico uso al texto.

La segunda edición contiene todos los materiales de la primera, pero, además, contiene dos nuevos capítulos: uno dedicado a la electroforesis y otro dedi-cado a la cromatografía. Tanto una, como la otra son técnicas fundamentales en la separación, purificación y caracterización de biomoléculas y constituyen herramientas insoslayables para todo el que pretenda o necesite lidiar con esas tareas tan comunes y esenciales en muchos tipos de laboratorios, tanto en bio-química clínica, como laboratorios científicos generales, y de múltiples ramas y aplicaciones científicas.

También el autor ofrece dos nuevos anexos muy útiles y esenciales en estos tipos de laboratorios, uno dedicado a la preparación de disoluciones y otro dedicado a brindarnos un inteligente resumen sobre purificación de proteínas.

El capítulo nuevo sobre electroforesis aparece en la segunda edición con el nú-mero 8 y muy bien escrito, y en lenguaje técnico preciso y ameno. El capítulo abarca desde la definición y los objetivos del conjunto de técnicas comprendidas

bajo el término electroforesis, hasta numerosos ejemplos y explicaciones de una utilidad práctica incuestionable, fruto de la cosecha amplia de experiencias del autor.

Los principios fisicoquímicos de la electroforesis, los elementos fundamentales de las relaciones matemáticas y expresiones mediante fórmulas gradualmente deducidas, brindan al lector y usuario de este libro-guía, las bases, no solo para entender los principios de la técnica, sino para poder emplearla, específicamen-te, en sus tareas de purificación y caracterización de biomoléculas, tales como ácidos nucleicos, proteínas, etcétera.

El capítulo también está dotado de notas de seguridad que permiten al usuario ejecutar las técnicas protegiéndose de accidentes.

Las ilustraciones son de buena calidad y ayudan a la comprensión y enseñanza de los textos.

Los ejemplos permiten al principiante un empleo seguro y exitoso de todas las orientaciones teóricas.

También se tratan, de manera didáctica, los diferentes tipos de electroforesis que hoy están en el arsenal de laboratorio y de los diversos soportes y variante, y cómo éstas se adecuan a los diversos objetivos de trabajo.

Los detalles que se regalan al lector, le permitirá trabajar en una amplísima gama de aplicaciones, guiándose únicamente por este libro, aunque oportunamente se indica cuando es necesario consultar otras fuentes.

Especialmente útil y claro es el acápite para el cálculo del peso molecular de la pro-teína problema, aspecto del trabajo de muy frecuente necesidad en nuestro medio.

Por último, se brindan casos especialmente útiles en el análisis de importantes patologías cuyo diagnóstico confirmativo tiene lugar en este tipo de laboratorio.

El capítulo 9 de la segunda edición se dedica a la aplicación de la cromatogra-fía y muestra numerosas figuras y esquemas. Se inicia con notas históricas del origen de la técnica y su creador, el botánico ruso Mijail Tsvet, el primero en describir las bases de esta técnica en 1906, en este caso original para separar a biomoléculas de plantas con colores propios como la clorofila y los carotenos, de ahí el nombre de la técnica.

También se describen: el alcance, los principios, las principales variantes y tipos de cromatografías y las recomendaciones de cómo escoger la más adecuada según los fines de su aplicación.

El capítulo contiene descripciones bastante detalladas de las cromatografías de adsorción en capa fina, una técnica elemental, pero de muy amplio uso. La cromatografía en papel, la de intercambio iónico y la de afinidad, también reciben una adecuada atención en este capítulo.

Los diferentes tipos de matrices o soportes utilizados en cromatografía y la relación de sus propiedades con el desempeño de las técnicas cromatográficas son cuidadosamente tratados, incluidas relaciones matemáticas para los cálculos correspondientes.

La cromatografía de exclusión molecular, tan ampliamente utilizada para pu-rificar o para caracterizar componentes de mezclas biológicas complejas, se explica en el capítulo de manera que este representa una excelente guía para realizar exitosamente estas técnicas. Las fórmulas y relaciones matemáticas que se aportan permiten el empleo adecuado de los cálculos. También ayuda a estos fines las explicaciones de cómo tratar la construcción y empleo de las curvas de calibración.

Un acápite de gran utilidad es, sin dudas, el dedicado a explorar los diferentes tipos de geles de sephadex que representan toda una gama que cubre empleos muy variables según el tipo de muestra y finalidad de la cromatografía que se ha de realizar.

Se dedica un espacio a las técnicas de HPLC o cromatografía de alta resolución o performance, como también se le conoce, la cual se realiza en un equipamiento de alta tecnología, alto grado de automatización y de validación y representa una tendencia en este tipo de laboratorios que les permite aumentar el desempeño aunque por supuesto, a mayor costo. No se concibe modernamente laboratorios de este tipo sin equipamiento de HPLC. Para esta técnica, como se explica, existen equipos y variantes de uso analítico y preparativo.

La segunda edición añade, como ya mencioné, dos nuevos anexos: el anexo 3. Preparación de disoluciones y el anexo 4. Purificación de proteínas. El primero brinda, prácticamente, todo lo que tiene que saber el usuario de un laboratorio de este tipo en lo que concierne a la preparación de las disoluciones de trabajo. Un porcentaje muy importante del éxito del trabajo de laboratorio, depende de la exactitud y calidad con que se preparan las disoluciones.

Se dedican amplios acápites y muy bien construidos a las definiciones y concep-tos principales que gobiernan el trabajo con las disoluciones con un despliegue de conceptos modernos de la quimicafísica de las disoluciones y las relaciones que gobiernan los cálculos. El anexo es más bien un pequeño y valioso nuevo capítulo que contienen todo lo que hay que saber sobre disoluciones para este tipo de laboratorio.

En el anexo 4. Purificación de proteínas, contiene un valioso y útil resumen reflexivo de aspectos que se han de tener en cuenta cuando se tiene enfrente la tarea de acometer la purificación de proteínas. Se dan las ideas y principios básicos que no pueden dejarse de tener en cuenta y, además, se ilustra el anexo con un cuadro resumen típico de un proceso de purificación a modo de ejemplo, con el cual quedan ilustrados, de manera inequívoca, los conceptos con la ayuda de cifras y medidas concretas.

Con apenas nuevas páginas de texto ilustrado, el autor brinda nuevos contenidos relacionados con aspectos de gran importancia en el laboratorio de bioquímica clínica y en cualquier laboratorio científico general donde se utilicen estas técnicas.

Se logra un innegable valor agregado y el libro en su segunda edición resulta aun más completo y atractivo para todo el que pretenda aprender o enseñar y, sobre todo, trabajar en un laboratorio de bioquímica clínica o general.

Recomiendo, sinceramente y con buena fundamentación, esta segunda edición a todos los lectores interesados en el tema.

Dr. Victoriano Gustavo Sierra GonzálezDoctor en Ciencias MédicasEspecialista en Bioquímica e InmunologíaBiotecnólogo Superior de Primer NivelInvestigador y Profesor TitularAcadémico de Mérito de la Academia de Ciencias de Cuba

ContenidoCapítulo 1Seguridad y organización/1

Reglamento de bioseguridad/2Educación y motivación del personal/3Protección de los trabajadores/4

Procedimientos y recursos/4Protección contra accidentes químicos/5Protección contra accidentes físicos/6Protección contra accidentes biológicos/7

Organización del laboratorio/10 Capítulo 2Reactivos y materiales/13

Reactivos químicos/14Agua como reactivo químico/15

Materiales de laboratorio/16Frasco Erlenmeyer/17Probeta graduada/18Vaso de precipitado/18Matraz aforado/20Tubo de ensayos/20Pipeta/21

Otros materiales de laboratorio/23Limpieza de los materiales de laboratorio/25

Capítulo 3Fase preanalítica/27

Errores al ordenar un análisis/28Obtención de la muestra/29Transporte de las muestras/31Almacenamiento de las muestras/31Causas biológicas de variación de una muestra /32

Variables biológicas no susceptibles de modificar/32Variables biológicas susceptibles de modificar/34

Capítulo 4Equipos de laboratorio/38

Centrífuga/39

Balanza /41Medidor de pH/43Microscopio/46

Tipos de microscopios/50Incubadora/53Estufa /53Refrigeradores y congeladores (freezer)/55Baño de agua/56Contador de células/57Equipo de electroforesis/58Agitador/59Sistemas de purificación del agua/59

Filtración/60Destilación/60Desionización/61Ósmosis reversa/61

Capítulo 5Fotometría/63

Fundamento teórico de la fotometría/63Ley de Lambert-Beer/66

Componentes de un espectrofotómetro/70Fuente de luz/71Monocromador/71Cubetas/72Sistema de detección y registro/73

Errores fotométricos/74Errores relacionados con el instrumento/74Errores relacionados con la muestra/76

Cuidado, mantenimiento y limpieza de los equipos/77

Capítulo 6Fotometría de llama/78

Fundamento teórico/78Fotometría de llama de emisión atómica/78Componentes de un fotómetro de llama/79Aspectos técnicos generales/81

Reactivos/81Dilución de las muestras problemas/81Utilización de patrones o estándares/82Causas de errores/82

Espectrofotometría de absorción atómica/82

Capítulo 7Enzimología clínica/84

Fundamento teórico/85Funciones de las enzimas en el diagnóstico/88

Enzimas como reactivos químicos/88Enzimas como índices de enfermedad/91Renovación celular/92

Funciones de las enzimas en la terapéutica/98

Capítulo 8Electroforesis/99

Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida/103Protocolo de técnica en geles de poliacrilamida/103Equipos, materiales y reactivos/103

Preparación de reactivos y procedimiento/106Cálculo del peso molecular de una proteína/110

Electroforesis de las proteínas plasmáticas/111Protocolo para electroforesis de proteínas del plasma/114

Equipos, materiales y reactivos/116Procedimiento/117

Electroforesis de hemoglobina/118Protocolo para electroforesis de hemoglobina/118

Protocolo 1/118Protocolo 2/119

Electroforesis de ácido desoxirribonucleico/120Protocolo para electroforesis de ADN en geles de agarosa/121

Equipos, materiales y reactivos/122Procedimiento/125

Capítulo 9Cromatografía/127

Cromatografía de adsorción en capa fina/129Cromatografía en capa fina de aminoácidos/134Cromatografía en papel/135Cromatografía de intercambio iónico/136Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad/138

Clasificación de las matrices /143Cromatografía de exclusión molecular/147Cromatografía líquida de alta presión o alta eficacia/155

Capítulo 10Calidad en el laboratorio/158

Evolución del concepto de calidad/159Normas ISO/161Control de variables preanalíticas/162

Identificación del paciente/162Tiempo de procesamiento/163Preparación del paciente/163Obtención de la muestra/163Transporte y almacenamiento/164

Control de la fase analítica/164Precisión/167Exactitud/168Especificidad analítica/168Sensibilidad analítica/169Límite de detección/169Linealidad/169Intervalo de medición o rango analítico/169Interferencias/169Error total/170

Control de la fase posanalítica/171Aseguramiento de la calidad/172Inspecciones/173

Capítulo 11Automatización/175

Reseña histórica/175Micrométodos y ultramicrométodos/177Conceptos básicos en automatización del laboratorio/178

Automatización y técnicas manuales/179Automatización de un proceso analítico/179

Selección del equipo automatizado/181

Capítulo 12Pruebas diagnósticas/183

Evolución del diagnóstico médico y de las pruebas/184Valores de referencia/186

Tratamiento estadístico/188Enfoque multivariado/191Otros elementos en la interpretación de las pruebas/191

Características de la muestra de pacientes/192Criterio diagnóstico de la enfermedad/192Sensibilidad y especificidad /193

Teorema de Bayes y otras interpretaciones/194Curvas ROC y pruebas diagnósticas/201

Coordenadas de la curva ROC/202

Anexo 1Sistema Internacional de Unidades/207

Unidades/208Unidades básicas/208Unidades derivadas/209Unidades suplementarias/209Prefijos en el Sistema Internacional de Unidades/210

Anexo 2Curva de calibración de glucosa/212

Anexo 3Preparación de disoluciones/214

Preparación de disoluciones diluidas/216Preparación de disoluciones de diferentes concentraciones/217

Composición porcentual de masa/217Fracción de volumen de un componente/217Concentración de masa de la sustancia /217Fracción molar/218Molaridad /218Molalidad/220Normalidad/220

Consejos practicos en el trabajo con ácidos y bases/222Ejercicios/222

Anexo 4Purificación de proteínas/223

Bibliografía/226

Seguridad y organización

El trabajo en un laboratorio, ya sea de análisis clínicos o de investigaciones, lleva implícitos riesgos importantes para la salud humana. Desde la fase prea-nalítica, cuando se toma la muestra, surgen riesgos biológicos por la posibilidad de la transmisión de numerosas enfermedades, algunas muy graves, como el sida, la hepatitis B, etc. Posteriormente, en la fase analítica, al procesar las muestras obtenidas se requieren diferentes reactivos químicos (los hay muy tóxicos; otros corrosivos, carcinogénicos, inflamables, explosivos, etc.) por lo que surgen elevados riesgos de accidentes químicos. También en esta fase se utilizan variados equipos y materiales de laboratorio: algunos son de vidrio, otros tienen conexiones eléctricas y altos voltajes, o producen calor; si no se toman precauciones adecuadas, en un laboratorio se pueden producir heridas, choques eléctricos, quemaduras, etc., en otras palabras, existen riesgos de accidentes físicos.

Como bien han señalado Suardiaz y otros (2004), en el laboratorio también se pueden identificar riesgos humanos y ambientales. Los humanos dependen del propio laboratorista o de su compañero de trabajo, por factores psicológicos que pueden influir en determinado momento o regularmente en el raciocinio, la capacidad de concentración, la percepción de los riesgos, en la conducta y en las relaciones interpersonales. Los factores del ambiente que pueden constituir riesgos y que no fueron mencionados dentro de los otros tipos de riesgos, se refieren a las condiciones de trabajo en el laboratorio. Así, es evidente que la iluminación, la ventilación de las áreas, la temperatura ambiental, el estado fí-sico de las instalaciones, el área o espacio de trabajo y el nivel de ruido pueden influir, considerablemente, en que ocurran o no accidentes en el laboratorio.

Aunque lo expuesto pueda causarle temor al que comienza a trabajar en un laboratorio, resulta conveniente que esa persona sepa que todos esos riesgos se pueden reducir a un mínimo, si se identifican de forma adecuada y se toman

Capítulo 1

2 Bioquímica clínica...

un conjunto de medidas preventivas de seguridad y bioseguridad. Este último término se ha utilizado, preferentemente, en relación con los riesgos biológicos en particular, aunque algunos autores cuando se refieren a bioseguridad tratan de abarcar todos los tipos de riesgos y acciones para evitarlos, como se hace en el presente texto.

Cada laboratorio, por pequeño que sea, debe tener sus normas de seguridad para el trabajo. Es importante comprender que la seguridad en el laboratorio no puede interpretarse como algo aislado, sino que esas normas son parte integral de las buenas prácticas del laboratorio y, por supuesto, están relacionadas con la productividad, la calidad del trabajo y la eficiencia económica.

Cumplir con las normas de seguridad en el laboratorio debe ser una responsabilidad individual de cada trabajador, aunque no cabe dudas que el jefe o director del laboratorio tiene una gran responsabilidad; en primer lugar, este debe conocer bien cuáles son esas normas, dárselas a conocer a todos sus trabajadores y, por último, hacerlas cumplir. Es una buena práctica, en opinión de muchos, que el jefe del laboratorio, teniendo en cuenta sus múltiples tareas, delegue esta función (no la responsabilidad) en algún trabajador, el cual actuará como “encargado de la seguridad del laboratorio”. Esta persona, que puede ser un profesional o un técnico con suficiente experiencia, será el encargado de llevar adelante todos los as-pectos del programa, bajo la supervisión del jefe.

Las normas de seguridad son parte indisoluble de las buenas prácticas del laboratorio clínico y así, aspectos tales como la organización general del labo-ratorio o el establecimiento de los procedimientos normalizados de operación (PNO), constituyen elementos claves para que se pueda llevar adelante o no este programa.

Los aspectos organizativos más importantes y generales que debe contener el programa de seguridad son: establecer un reglamento de bioseguridad; educar y motivar a los empleados en relación con este programa; y contar con procedimientos y recursos para garantizar la protección de los trabajadores. A continuación se analizan cada uno de estos aspectos.

Reglamento de bioseguridadExisten diferentes sugerencias para elaborar este documento; como es lógico,

puede tener algunas variaciones de un laboratorio a otro, de acuerdo con las características particulares. Se recomienda realizar a partir de una evaluación de los riesgos existentes. Lo importante es que este documento recoja un conjunto de normas que permitan prevenir accidentes y enfermedades, y en caso de que ocurran, indicar las acciones que se han de seguir.

Capítulo 1. Seguridad y organización 3

Entre los aspectos que se deben registrar en el documento se encuentran: 1. Definir el nivel de bioseguridad con el que se debe trabajar (en la escala

de 1 a 4). 2. Chequeo médico y vacunación (hepatitis B, por ejemplo) de los traba-

jadores. 3. Medios de protección disponibles y cómo usarlos correctamente. 4. Características de la transportación de las muestras dentro y fuera del la-

boratorio. 5. Mantenimiento del inventario de productos químicos con especificaciones

de peligrosidad. 6. Identificación correcta de cada reactivo o disolución de trabajo. 7. Forma de almacenar los reactivos. 8. Medidas de higiene en el laboratorio (no fumar, no ingerir alimentos,

no guardar alimentos en el área del laboratorio, uso de bata sanitaria y de guantes, no usar cosméticos, lavado de las manos, uso de desin-fectantes, etc.).

9. Manipulación correcta de los equipos y otros materiales del laboratorio.10. Protocolos para el trabajo con sustancias particularmente peligrosas.11. Protocolos para la eliminación de desechos del laboratorio.12. Conducta que se ha de seguir en caso de accidentes físicos, químicos

o biológicos.13. Todos los accidentes ocurridos y los riesgos muy peligrosos.14. Definición de los accesos a las diferentes áreas.15. Establecimiento de las responsabilidades del trabajador, el supervisor y el

jefe del laboratorio.16. Medidas de control para garantizar el cumplimiento de las normas.

Educación y motivación del personalEs muy importante que cada nuevo trabajador que ingrese al laboratorio

conozca el reglamento de seguridad, pero es imprescindible que no lo acepte como algo impuesto, sino como un conjunto de normas que tienen por obje-tivo garantizar su propia salud y la de sus compañeros de trabajo. Hay que realizar, por lo tanto, un buen trabajo educativo y motivar al nuevo trabaja-dor para que cumpla con todas estas normas. La educación tiene que ser un proceso continuo, sistemático; puede y debe realizarse de manera individual y mediante reuniones colectivas para analizar aspectos de la bioseguridad, con ejemplos concretos y medidas para mejorarla. Pueden utilizarse medios audiovisuales sobre este tema.


Protección de los trabajadoresLo primero que debe tener un laboratorio de bioquímica clínica es una buena

protección para los trabajadores, la cual ha de incluir: 1. Procedimientos y recursos.2. Protección contra accidentes químicos.3. Protección contra accidentes físicos.4. Protección contra accidentes biológicos.

Procedimientos y recursos

Para garantizar la seguridad de todos los trabajadores, el laboratorio debe contar con instalaciones adecuadas, con espacio suficiente en los locales, buena iluminación y ventilación, de tal manera que el ambiente sea confortable. Las mesetas de trabajo, el piso y las paredes deben estar en buen estado y ser fáciles de limpiar. También es necesario tener cuidado con el nivel de ruido, el cual puede molestar o distraer a los trabajadores.

En el laboratorio es importante que se disponga de desinfectantes, detergente, jabón, guantes y de otros medios que garanticen la adecuada limpieza de las áreas y la higiene personal de cada trabajador. Los guantes son muy importantes para todo el trabajo, principalmente al manipular muestras biológicas. También se debe contar con los medios adecuados para la descontaminación y eliminación del material desechable y de los residuales sólidos y líquidos.

Debe existir un área para almacenar reactivos y otros materiales de laboratorio, así como otra área para el fregado y la preparación de los materiales.

Para muchos trabajos, en el laboratorio se necesita una campana para elimi-nar los gases tóxicos de algunos reactivos y para otros trabajos con peligrosas muestras biológicas se requiere de equipos de flujo laminar.

Pipetear con la boca está prohibido y, por lo tanto, se deben utilizar pipetas automáticas o dispositivos para succionar adaptables a las pipetas. Es necesario aprender a trabajar con las pipetas correctamente. No mezclar disoluciones con el empleo de pipetas. Las contaminadas deben ser colocadas en una disolución desinfectante (de hipoclorito, por ejemplo). Resulta conveniente que todos los frascos y tubos estén tapados y que sean abiertos únicamente cuando van a ser utilizados. Las jeringuillas, agujas y lancetas deben ser colocadas en contene-dores especiales para su eliminación (si son desechables).

Se recomienda mantener en buen estado todas las instalaciones eléctricas del laboratorio, trabajar correctamente con la centrífuga y otros equipos, y mantenerlos limpios, transportar las muestras biológicas debidamente tapadas y en recipientes apropiados. Si el nivel de bioseguridad debe ser


alto (niveles 3 o 4), se requieren recursos adicionales, y los procedimientos de trabajo deben estar muy bien especificados y controlados.

Protección contra accidentes químicos

La protección contra accidentes químicos es muy importante y, por eso, la adecuada identificación de los reactivos, así como el almacenamiento apropiado, contribuye a evitar:

1. Quemaduras.2. Explosiones.3. Incendios. 4. Vapores tóxicos.

Es necesario conocer las propiedades de los reactivos con los que se trabaja. Los frascos que los contienen deben ser cuidadosamente manipulados al tras-ladarlos de un lugar a otro (si los recipientes son plásticos mejor). Todos los frascos deben identificarse de forma apropiada, con una etiqueta que muestre el nombre y la concentración del reactivo, la fecha de preparación y de venci-miento (si procede), el nombre de la persona que lo preparó, y las condiciones de almacenamiento.

El derramamiento de ácidos, materiales cáusticos o fuertes oxidantes repre-senta un riesgo importante para el que trabaja en un laboratorio. Los ácidos deben ser diluidos vertiéndolos lentamente en el agua; nunca se debe añadir agua a un ácido concentrado.

Ninguna disolución de ácidos fuertes, álcalis, agentes oxidantes o tóxicos debe pipetearse con la boca. En particular, hay que tener cuidado con algunos reactivos, como el ácido perclórico que es potencialmente explosivo en contacto con sustancias orgánicas. Se debe tener cuidado al eliminar estas sustancias y solo muy pequeñas cantidades pueden ser eliminadas a través del sistema de residuales líquidos del laboratorio.

Es necesario manipular con cuidado los cilindros que contengan gases com-primidos.

Los reactivos inflamables deben mantenerse alejados de las fuentes eléctricas y no almacenarlos en el refrigerador.

Si se derrama alguno de estos reactivos químicos en la meseta o en el piso, debe limpiarse inmediatamente con una sustancia neutralizante o agua abun-dante. Conviene almacenar los reactivos más peligrosos cerca del suelo, para evitar caídas y roturas de los frascos que los contienen.

Los ojos deben protegerse de salpicaduras de reactivos químicos usando espejuelos de protección.


En el caso de ocurrir accidentes químicos, es aconsejable cumplir las recomendaciones que se relacionan a continuación, para:

1. Derramamiento de líquidos:a) Verter grandes cantidades de agua sobre la zona implicada.b) Quitar la ropa de la parte afectada.c) Continuar vertiendo agua.d) Remitir a emergencia médica.

2. Derramamiento de reactivos sólidos:a) Sacudir el agente químico de la ropa.b) Quitar la ropa y eliminar de la piel el reactivo.c) Verter grandes cantidades de agua sobre la parte corporal afectada.d) Remitir a emergencia médica.

3. Ingestión de reactivo químico:a) Tratar de vomitar y eliminar reactivo de la boca.b) Si está inconsciente, poner a la víctima de lado.c) Remitir a emergencia médica.

4. Derramamiento de reactivos en los ojos:a) No frotarse; si usa lentes quitarlos.b) Lavar con abundante agua corriente (abrir y cerrar los ojos continua-

mente).c) Continuar el lavado e identificar el reactivo.d) Remitir a emergencia médica.

Protección contra accidentes físicos

Entre los accidentes producidos por causas físicas se encuentran los incendios, las explosiones y el choque eléctrico.

En el caso de los incendios, los laboratorios deben tener bien establecidas las acciones generales y específicas para el caso de que estos ocurran (medidas para la evacuación, área de extintores, etc.).

Si por causa de la explosión o del incendio algún miembro del laboratorio sufre quemaduras, se procede de la manera siguiente:

1. Evitar que la víctima se continúe quemando. Si es preciso acostarla en el piso y rodarla (darle vuelta) hasta apagarla.

2. Verter agua fría en la parte quemada.3. No eliminar ampollas.4. Remitir a emergencia médica.

Si alguien sufre un choque eléctrico por una incorrecta manipulación de algún equipo eléctrico, por tocar una fuente eléctrica con las manos mojadas,


o el equipo mojado, por el empleo incorrecto de extensiones eléctricas u otra causa, se realiza lo siguiente:

1. Desconectar el circuito.2. Si el circuito no puede ser desconectado, separe a la víctima utilizando

algún material no conductor, como una escoba.3. Medidas de reanimación, si hay paro cardiorrespiratorio.4. Remitir a emergencia médica.

En caso de ocurrir algún accidente físico con heridas o desgarramientos de piel se recomienda:

1. Lavar bien en agua corriente.2. Aplicar algún desinfectante.3. Cubrir con vendaje apropiado.4. Si la herida es grande y el sangrado importante, comprimir con los

dedos o usar torniquete, si es necesario, y remitir a emergencia médica.

Protección contra accidentes biológicos

Lo más importante, en cuanto a los accidentes biológicos, es evitarlos. El uso de diversos medios de protección biológica (guantes, espejuelos de protección, guantes de protección para el calor, etc.) resulta muy importante. Es esencial prevenir a los trabajadores del laboratorio de los agentes infecciosos, como el virus de la hepatitis B y el del VIH.

La exposición a los agentes infecciosos es consecuencia, generalmente, de: 1. Pinchazos accidentales con agujas.2. Esparcir en el aire el agente infeccioso contenido en una jeringuilla.3. Derramar o salpicar líquidos en el piso o la meseta.4. Accidentes con centrífugas.5. Cortaduras con cristalería contaminada.

Para impedir que ocurran accidentes biológicos se ha elaborado una rela-ción de precauciones universales que deben ser incluidas en el reglamento de bioseguridad:

1. Nunca pipetee con la boca ni sople pipetas que contengan materiales con agentes infecciosos.

2. No mezcle material potencialmente infeccioso provocando burbujas de aire a través de un líquido.

3. Use barreras de protección, tales como: guantes, espejuelos, máscaras, etc., al extraer sangre de los pacientes y cuando manipule cualquier muestra de estos (Fig. 1.1).


4. Lavarse las manos cada vez que cambie de guantes y acostumbre a lavárselas con frecuencia.

5. Evite el empleo de jeringuillas cuando sea posible y elimine las agujas en recipientes rígidos apropiados.

6. Elimine, de forma adecuada, todos los materiales cortantes.7. Use la bata protectora. Cuando abandone el laboratorio, quítesela.8. Hágase el hábito de mantener sus manos lejos de las membranas mucosas:

boca, nariz, ojos, etc.9. Trate de minimizar los derramamientos de líquidos y las salpicaduras.

10. Descontamine todas las superficies de trabajo con desinfectantes apropiados.11. Antes de centrifugar, revise los tubos. Inspeccione, si el interior de

la centrífuga está limpio.12. Nunca deje un tubo contaminado sin marcar o sin eliminar apropiadamente.13. De forma periódica limpie el congelador (freezer) y refrigeradores para

eliminar tubos rotos y desechos de material biológico. Use guantes y protección para las vías respiratorias en esta limpieza.

14. Analice si debe emplear normas de bioseguridad más estrictas.

Fig. 1.1. Protección contra accidentes biológicos.


Con relación a este último aspecto, se han clasificado los riesgos biológicos en cuatro grupos y en dependencia de sus niveles de riesgo se recomienda tomar las acciones o medidas preventivas. Por lo tanto, estos cuatro grupos de riesgo se corresponden con cuatro niveles de bioseguridad.

Grupo 1

En el laboratorio se trabaja con agentes no asociados a enfermedades en hu-manos adultos saludables, ni en animales (riesgo nulo o bajo para el individuo y el ambiente). Ejemplos: Bacillus subtilis; ciertas cepas de Escherichia coli. Asociado a este grupo de riesgo está el nivel de bioseguridad 1, para el cual no es necesario un equipamiento especial de protección; son suficientes el equipo básico y las precauciones universales.

Grupo 2

Este grupo de riesgo corresponde a microorganismos asociados con enfer-medades humanas raramente serias y para las cuales siempre hay medidas pre-ventivas y terapéuticas disponibles. El riesgo de diseminación de la infección es limitado (riesgo individual moderado y bajo riesgo al ambiente). Aquí se pueden citar, como ejemplos, las infecciones por: Toxoplasma gondii, Adeno-virus, Papovirus y Neisseria gonorrhoeae. En el nivel de bioseguridad 2 se recomienda prestar especial atención a:

1. Acceso limitado a determinadas áreas.2. Señalamientos de bioseguridad.3. Manipulación de desechos.4. Chequeo médico de los trabajadores.5. Precauciones con los objetos punzantes.6. Uso de guantes y espejuelos en casos necesarios.7. Utilización de campanas de protección para cuando se produzcan aerosoles

y salpicaduras.8. Disposición de autoclave en el laboratorio.

Grupo 3

Infecciones provocadas por agentes relacionados con enfermedades serias o letales para el ser humano, para las cuales pudieran estar disponibles medidas preventivas y terapéuticas. El contagio entre individuos infectados es poco co-mún (alto riesgo individual y bajo riesgo ambiental). Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis y el VIH.


Entre las medidas preventivas de bioseguridad para este grupo 3 se consideran:1. Descontaminación de desechos.2. Control de acceso a determinadas áreas.3. Descontaminación de la ropa de trabajo antes de lavarla.4. Uso de equipos de protección personal: batas, guantes, gorros, botas

desechables y espejuelos. 5. Empleo de campanas de bioseguridad para cualquier manipulación de los

agentes en barreras primarias y entre las barreras secundarias.6. Utilización de autoclaves.7. Separación física de corredores.8. Acceso con doble puerta que cierre sola.9. Flujo de aire saliente que no recircule al laboratorio y presión de aire negativa.

Grupo 4

Agentes causales de enfermedades humanas serias o letales, para las cuales no existen medidas preventivas ni terapéuticas disponibles. El contagio entre individuos infectados es elevado (alto riego individual y para el ambiente). Ejemplo: virus del Ébola.

Las medidas preventivas que se recomiendan para este nivel de bioseguridad comprenden todas las del nivel 3 y otras más estrictas y específicas, que pueden ser consultadas en los manuales de bioseguridad.

Organización del laboratorioSe exponen algunas recomendaciones para la organización del laboratorio.

Es imprescindible tener en cuenta estos aspectos organizativos para garantizar las condiciones de seguridad y bioseguridad en el trabajo diario de técnicos y profesionales.

Los laboratorios ubicados en centros de salud de los niveles de atención secundario y terciario tienen una mayor complejidad estructural y organizativa que los de la atención primaria, pero aun así, en estos últimos también se debe prestar atención a una organización por áreas bien identificada.

El laboratorio contará, como mínimo, con áreas o locales adecuados para:1. Espera de los pacientes.2. Recepción y registro de muestras y pacientes, y entrega de informes de ensayo.3. Obtención, identificación y manipulación de las muestras.4. Procesamiento y conservación de las muestras.5. Ejecución de los procedimientos analíticos.6. Aseo, higiene y vestuario del personal.7. Almacenamiento de reactivos, kits diagnósticos, materiales de laboratorio

y misceláneas.


8. Aseguramiento de la calidad y sistema de documentación.9. Dirección del laboratorio.

10. Fregado y preparación de materiales. 11. Esterilización y almacenamiento de material estéril. 12. Almacenamiento de útiles de limpieza.

Se recomienda que:1. instalaciones del laboratorio,2. recursos energéticos,3. iluminación,4. climatización,5. nivel de ruido,6. sistemas auxiliares,7. drenaje, 8. ventilación,

deben ser tales, que faciliten la adecuada realización de los ensayos, y en ningún caso afecten o interfieran negativamente en los resultados. Es conveniente que exista una separación efectiva entre las áreas contiguas cuando las actividades que se realicen así lo requieran.

El acceso a cada una de las áreas y su utilización estarán definidos, docu-mentados y controlados.

Todas las áreas y locales del laboratorio deben estar identificados, y las con-diciones de las áreas para la espera de los usuarios y la obtención de muestras reunirán los requisitos necesarios para proporcionar un ambiente confortable a los pacientes.

El laboratorio debe tener un sistema que establece los procedimientos para la elaboración, revisión, modificación, reproducción, conservación, distribu-ción y retiro de la documentación. Debe utilizarse el Sistema Internacional de Unidades (SIU o SI), siempre que sea procedente. Además, se dispondrá de los documentos siguientes:

1. Manual de la calidad o de la organización. 2. Organigrama completo del laboratorio y de la organización donde este se

inserta. 3. Reglamento del laboratorio.4. Reglamento de bioseguridad.5. Descripción de los contenidos de trabajo y los requisitos de calificación de

cada cargo.6. Especificaciones del servicio y de la prestación del servicio. 7. Procedimientos normalizados de operación. 8. Registros.9. Informes de ensayo.


10. Horario de servicios de rutina y urgencias.11. Relación de ensayos disponibles en el laboratorio, preparación reque-

rida del usuario y tiempo de retorno de los resultados.

Se elaboran los procedimientos normalizados de operación (PNO) de todas las actividades que lo requieran. Estos documentos, en forma escrita, deben contener:

1. Título.2. Objetivos.3. Alcance.4. Definiciones (si procede).5. Responsabilidades.6. Condiciones de seguridad o bioseguridad (si procede).7. Equipos, materiales y reactivos (si procede).8. Operaciones preliminares (si procede).9. Procedimiento.

10. Cálculo e interpretación de los resultados (si procede).11. Controles.12. Observaciones (si procede).13. Requisitos de documentación (si procede).14. Referencias.15. Anexos (si procede).16. Datos acerca de la elaboración, revisión y aprobación de los procedimientos

normalizados de operación.

Reactivos y materiales

La función principal de un laboratorio de análisis clínicos es realizar pruebas diagnósticas, cualitativas o cuantitativas, en diferentes muestras biológicas (sangre, suero, orina, etc.), de tal manera que se obtenga un resultado final, en un tiempo relativamente breve, que le sea útil al médico en el diagnóstico, pronóstico o seguimiento de determinada enfermedad.

Estas pruebas, generalmente, son indicadas por el médico, en correspondencia con determinadas hipótesis que él elabora para un paciente en particular, de acuerdo con sus antecedentes personales y familiares, síntomas, signos y los resultados del examen físico.

En un laboratorio de investigación de bioquímica se realizan determinacio-nes analíticas para obtener datos con la finalidad de confirmar o rechazar una hipótesis científica.

Fácilmente se comprende que un primer principio para el trabajo de labora-torio es lograr el máximo de calidad. Si los datos primarios no tienen calidad, los resultados y su interpretación no pueden ser confiables.

También es muy importante una buena organización y eficiencia en el trabajo del laboratorio. Actualmente, para lograr una alta eficiencia, muchos procesos y determinaciones analíticas se llevan a cabo con un alto grado de mecanización y automatización.

Todas estas técnicas implican la utilización de reactivos químicos, así como de equipos y materiales que deben manipularse cuidadosamente; es evidente que es primordial cumplir estrictamente todas las normas de seguridad para el trabajo, en las condiciones particulares del laboratorio.

El personal que labora en un laboratorio que realiza pruebas de bioquímica clínica o experimental debe tener un nivel elevado de conocimientos acerca de las reacciones químicas y de los materiales y equipos que se utilizan, para poder trabajar con calidad, organización y eficiencia.

Capítulo 2


En este capítulo se analizan, en particular, los reactivos y materiales que se emplean en el laboratorio, y más adelante se exponen los equipos de empleo común.

Como resulta difícil abarcar la gran diversidad de técnicas de análisis y ma-teriales en general que puede tener un laboratorio actual, solo son tratados los aspectos esenciales y el lector se puede remitir a otros textos más especializados, si es de su interés aplicar alguna técnica en particular.

Reactivos químicosLos reactivos químicos inorgánicos que se utilizan en el trabajo de laboratorio

están disponibles en el mercado con varias categorías de pureza. En general, es importante trabajar con reactivos de gran pureza, como los clasificados interna-cionalmente reactivo analítico (AR: Analytical Reagent), los cuales se pueden presentar en dos formas en el mercado:

1. Cada lote individual es analizado y se reporta con precisión su nivel de impureza, por ejemplo, una impureza de arsénico de 0,0005 %.

2. En otros casos, lo que se reporta es el máximo de impurezas en el reactivo que interesa; por ejemplo, máximo de arsénico 0,001 %, aunque el conte-nido real sea de 0,0004 %.

En el mercado internacional también existen reactivos ultrapuros para:1. Cromatografía de gases.2. Cromatografía líquida de alta presión o alta eficacia (HPLC: del ingles,

High pressure liquid chromatography/high performance liquid chromato-graphy).

3. Fluorimetría.4. Espectrofotometría de absorción atómica.5. Otras técnicas analíticas.

Naturalmente, no es necesario trabajar con estos reactivos ultrapuros, si lo que se va a realizar es una técnica fotométrica común para determinar glucosa en suero.

Hay otras designaciones de pureza para los reactivos químicos, como CP (del inglés, Chemical Pure), pero en esta categoría no se especifican en la etiqueta los límites de impurezas.

En general, la pureza de los reactivos orgánicos es inferior a la de los inorgá-nicos en el mercado internacional y la mayoría de las impurezas son introducidas en el proceso de síntesis y, además, son muy difíciles de eliminar.

La estabilidad de los reactivos orgánicos se incrementa cuando son envasados en frascos ámbar y se mantienen en refrigeración.

Capítulo 2. Reactivos y materiales 15

Muchos reactivos orgánicos son inflamables y dañinos para la salud humana (hepatotóxicos, cancerígenos, etc.), por lo que es de suma importancia evitar la inhalación de sus vapores.

A partir de los reactivos químicos se pueden preparar materiales de referen-cia primarios y secundarios. Según la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC, siglas del inglés) un material de referencia primario se prepara midiendo un reactivo de forma directa, para producir una disolución cuya concentración es exactamente conocida (la IUPAC ha propuesto 99,98 % de pureza para este tipo de material, lo cual es difícil de alcanzar). Un material de referencia secundario es una disolución cuya concentración se determina midiendo una alícuota por un método aceptado, utilizando un material primario para calibrar el método de determinación.

Cada disolución reactiva que se prepare en el laboratorio debe tener un rótulo que permita identificarla e informe sobre su composición y empleo. El rótulo o etiqueta debe incluir las precisiones siguientes:

1. Nombre del reactivo, conciso.2. Fecha de preparación.3. Fecha de caducidad.4. Almacenamiento.5. Frase sobre riesgo (y símbolo de peligro, sobre todo, si es etiqueta

comercial).6. Frase de seguridad.

Las precauciones generales de almacenamiento incluyen un ambiente limpio, seco y con luz baja; lejos de fuentes eléctricas y, si hay alguna debe estar en buen estado técnico. Las temperaturas de almacenamiento pueden ser:

1. Temperatura ambiente: de 20 a 25 °C.2. Refrigeración: de 0 a 4 °C.3. Congelación: generalmente, alrededor de -20 °C o temperaturas infe-

riores.

Agua como reactivo químico

El agua también se considera un importante reactivo químico y su empleo es muy común en cualquier laboratorio. La mayoría de las disoluciones utilizadas, tanto en un laboratorio de diagnóstico bioquímico clínico, como de investigación en bioquímica se preparan utilizando agua pura.

Durante muchos años, cuando se hablaba de agua pura se pensaba inmedia-tamente en el agua destilada, porque la destilación era el principal método para obtenerla. En la actualidad existen otros métodos, como: la desionización, la filtración y la ósmosis reversa para obtener agua pura.


Una clasificación utilizada en laboratorios de Estados Unidos considera tres categorías para la pureza del agua (Tabla 2.1).

En algunos textos, en lugar de resistividad del agua, se hace referencia a su conductividad, la cual es el inverso de la resistividad. Así, el agua destilada con una conductividad de 5 µohm-1 ·cm-1, tendría una resistividad de 0,2 Mohm ∙ cm.

Tabla 2.1. Categorías para la pureza del agua

Pureza del agua Grado I Grado II Grado III

Resistividad (Mohm ∙ cm) 10 2 0,1Silicatos, mg/SiO

2 /L 0,05 0,1 1,0

Partículas Agua a través de filtro de 0,2 µm - - - - - -Contenido microbiológico(colonias/mL después de incubar 16 h a 36 0C) 10 103 - - -pH - - - - - - 5,0-8,0Sustancias orgánicas Eliminadas por - - - - - - carbón activado

Materiales de laboratorioEn un laboratorio son muy comunes frascos volumétricos convencionales

de diversos tamaños: 1. Matraces volumétricos.2. Probetas.3. Buretas.4. Pipetas.5. Vaso o copa de boca ancha (beakers).

También existen otros materiales, como: 1. Tubos para centrífugas.2. Tubos de ensayos.3. Frascos.4. Varillas agitadoras.5. Embudos, etc.

La mayoría de estos utensilios están hechos con materiales de vidrio o plástico.


El vidrio está compuesto por silicatos y sus propiedades dependen del tipo de anión silicato, así como del contenido de cationes. La adición de cationes de elementos metálicos, como Fe3+ o Ni2+, a la estructura básica del vidrio puede darle un color particular.

Las propiedades térmicas del vidrio pueden cambiarse significativamente añadiéndole óxido de boro (B2O3); este tipo de vidrio se conoce como boro-silicato y se utiliza bastante en los laboratorios; si tiene un bajo contenido de sustancias alcalinas y está libre de zinc y metales pesados alcanza una alta re-sistencia térmica y a la corrosión. Debido a que sus dimensiones cambian muy poco con la temperatura (bajo coeficiente de dilatación) este tipo de vidrio se utiliza para la cristalería que debe ser calentada o esterilizada. Alguna cristalería de borosilicato puede soportar temperaturas hasta de 600 0C por un período corto de tiempo. Beakers, tubos de ensayos, frascos y pipetas de la marca Pyrex (de la firma Corning) han sido utilizados en muchos laboratorios durante los últimos años. La marca Corex (también de la Corning) se fabrica con vidrio de alúmina-silicato y es casi como seis veces más resistente que la Pyrex. Este último vidrio se emplea para termómetros de alta temperatura (> 250 0C). Los cristales libres de boro tienen una alta resistencia a las disoluciones alcalinas y existen otros tipos de vidrio con propiedades de protección a la luz, resistencia a radiaciones, etcétera.

La sustitución del vidrio por materiales plásticos ha beneficiado grande-mente el trabajo en el laboratorio. Al conjunto de materiales de plástico de un laboratorio, algunos le denominan plastiquería, aunque esta palabra no existe oficialmente en español.

Los materiales de plástico tienen algunas ventajas sobre los de vidrio: alta resistencia a la corrosión por ácidos, álcalis y otras sustancias, a los impactos mecánicos y a las fuerzas de tensión. Otra ventaja del plástico es que no libera iones hacia la disolución, como lo hace el vidrio; una desventaja es que el plástico tiene tendencia a unir, por adsorción, solutos de la disolución. Algunos materiales plásticos pueden, incluso, esterilizarse en autoclave.

Los frascos volumétricos son muy importantes en un laboratorio para contener y medir volúmenes de una disolución y transferirlos de un recipiente a otro.

A continuación se describen algunos tipos de frascos frecuentemente utilizados, así como sus funciones.

Frasco Erlenmeyer

El matraz o frasco Erlenmeyer (nombrado así en honor al químico Emil Erlenmeyer, quien lo diseñó) tiene una forma cónica y es un recipiente que se utiliza en el laboratorio para preparar disoluciones, en especial para mezclar bien el soluto con un volumen de disolvente, por agitación (Fig. 2.1).


La agitación puede ser manual o mediante algún tipo de agitador mecánico, hasta obtener la disolución, la que se puede transferir a un matraz aforado y completar con disolvente hasta un volumen fijo y determinado. El Erlenmeyer también se puede emplear en titulaciones de una disolución con un ácido o una base para observar el cambio de coloración de un indicador. No se deben realizar mediciones de volumen con estos frascos, pues las medidas son imprecisas.

Probeta graduada

Este es un material volumétrico que permite medir, con alguna aproximación, determinados volúmenes de disolución. No debe ser utilizado para mediciones muy exactas de volúmenes. En el mercado existen probetas graduadas de diferentes volúmenes, que facilitan el trabajo para la preparación de disoluciones de distinto tipo (Fig. 2.2).

Vaso de precipitado

Los vasos de precipitados o beakers son recipientes cilíndricos, de fondo plano, usualmente utilizados en el laboratorio para contener líquidos o disol-ver algún soluto; pueden ser fabricados de vidrio o plástico. Aunque suelen ser graduados, las mediciones con estos recipientes son inexactas (Fig. 2.3).

Fig. 2.1. Frasco Erlenmeyer.

Fig. 2.2. Probetas para diferentes volúmenes.

Fig. 2.3. Vasos de precipitados (beakers).


Matraz aforado

Se utiliza en el laboratorio para medir un volumen exacto de líquido. Una marca de graduación rodea el cuello de este recipiente, por lo que resulta fácil determinar con precisión el momento en que el líquido llega hasta esa marca. El hecho de que el cuello sea estrecho es para aumentar la exactitud (Fig. 2.4).

Con el matraz aforado se preparan, principalmente, disoluciones de con-centración conocida y exacta. Para realizar esta operación se pesa el soluto y se disuelve en un beaker con una pequeña cantidad de disolvente; después se vierte la disolución, utilizando un embudo adecuado, en el matraz aforado; a continuación se añade más disolvente en el matraz hasta la marca, lo que se conoce como enrase. Estos recipientes se presentan en volúmenes desde 10 mL hasta 2 L.

Fig. 2.4. Matraz aforado.

Tubo de ensayos

El tubo de ensayos, ya sea de vidrio o plástico, forma parte del material de un laboratorio de bioquímica.

Consiste en pequeño tubo con la parte superior abierta y la inferior cerrada y redondeada.

Este utensilio se utiliza para contener pequeñas muestras líquidas y existe en el mercado en muy diferentes tamaños. Algunos tienen una graduación que permite realizar mediciones no precisas (Fig. 2.5).


Pipeta

La pipeta es un instrumento volumétrico de laboratorio que permite medir alícuotas de un líquido con elevada precisión. Está formada por un tubo trans-parente, que una de sus puntas termina de forma cónica, y tiene una graduación (una serie de marcas grabadas) que indica distintos volúmenes (Fig. 2.6).

Algunas pipetas son de simple aforo, es decir, que se enrasan una vez en 0 mL, y luego se dejan vaciar hasta el volumen que se necesite; otras, denomi-nadas de doble enrase o doble aforo, se enrasan en la marca o aforo superior, y el líquido se deja escurrir con precaución hasta enrasar en el aforo inferior. Si bien poseen la desventaja de medir un volumen fijo de líquido, las pipetas de doble aforo superan en gran medida a las graduadas, en que su precisión es mucho mayor, ya que no se modifica el volumen medido, si se les rompe o deforma la punta cónica.

Fig. 2.5. Tubos de ensayos en la gradilla.

Fig. 2.6. Pipetas graduadas de simple enrase o aforo.

Existen algunas reglas que se deben aplicar en el trabajo con las pipetas:1. Se introduce la pipeta (con la punta cónica para abajo) en el recipiente del

cual se desea extraer un volumen determinado de muestra.


2. Se coloca una perita de goma en la punta libre y se hace ascender el líquido por encima del aforo superior (no pipetear con la boca).

3. Se saca la perita colocando el dedo índice en la punta para obturarla, con la finalidad de evitar que descienda el líquido. Se disminuye levemente y con lentitud la presión ejercida por el dedo, hasta que el líquido comience a descender. Se vuelve a presionar cuando el menisco del líquido llegue a cero. La parte inferior del menisco debe estar a nivel con la línea de medición.

4. La punta de la pipeta tiene que ser secada con papel de filtro, sobre todo en el caso de pipetas de pequeño volumen.

5. Las pipetas deben sostenerse en posición vertical al ajustar el nivel de líquido y durante su liberación.

6. Se traslada la pipeta al recipiente de destino.7. De nuevo se disminuye la presión del dedo hasta llegar a la cantidad de

mililitros necesarios. Para vaciar por completo las pipetas de simple enrase, se saca el dedo y se deja fluir el líquido libremente. No se debe forzar la caída de las últimas gotas, sino que estas deben quedar en la punta cónica de la pipeta.

8. La punta de la pipeta debe tocar la superficie inclinada del recipiente hasta 2 s después que el líquido ha cesado de fluir.

9. La calibración de estas pipetas se refiere a volumen de agua y no vale para líquidos con viscosidad diferente. Existen métodos gravimétricos y fotométricos para calibrar pipetas.

Además de las pipetas de cristal o de plástico, en un laboratorio es muy común el empleo de pipetas mecánicas, semiautomáticas, de volumen fijo o variable, muy utilizadas para dispensar pequeños volúmenes, aunque se fabrican común-mente para un rango entre 1 μL y 1 mL o más. Estas pipetas son, generalmente, calibradas para contener un volumen fijo (Fig. 2.7).

El empleo apropiado implica enjuagar la pipeta con la disolución final, después de aplicar el contenido de la pipeta en el disolvente. Las puntas plásti-cas desechables son muy cómodas y evitan la contaminación cruzada entre las muestras y mejoran la precisión de las determinaciones. Es necesario ajustar bien la punta a la pipeta para evitar errores importantes. Es posible pipetear la misma disolución varias veces con la misma punta, pero esta se debe cambiar, si se trata de muestras diferentes. Existen modelos de estas pipetas con escala digital.


Otros materiales de laboratorioCon frecuencia, en un laboratorio se utilizan:

1. Espátulas para extraer de algún frasco un reactivo sólido (Fig. 2.8).2. Frascos de vidrio o de plástico para contener líquidos.3. Balones no graduados también para contener líquidos y en procesos de

extracción con disolventes orgánicos.4. Varillas de vidrio para agitar disoluciones.5. Frasco plástico lavador (Fig. 2.9).6. Embudos para trasladar disoluciones o disolventes de un recipiente a otro,

etc. (Fig. 2.10).

Fig. 2.7. Pipetas semiautomáticas.

Fig. 2.8. Espátulas.

Fig. 2.9. Frasco plástico lavador.


Limpieza de los materiales de laboratorioLos materiales del laboratorio se pueden clasificar en tres categorías:

1. Graduación volumétrica para mediciones precisas.2. Graduación volumétrica para mediciones aproximadas.3. No graduados.

Para un buen trabajo analítico es fundamental que todos los materiales estén muy limpios. Los análisis enzimáticos y las microtécnicas resultan muy afec-tados cuando esto no se cumple. Son importantes tres aspectos para una buena limpieza:

1. Calidad del agua.2. Agente adecuado para limpiar.3. Procedimiento normalizado de operación para la limpieza.

Se recomienda el procedimiento general siguiente:1. Los materiales del laboratorio deben ser enjuagados con agua corriente

inmediatamente después de utilizarse.2. Retirar etiquetas y rótulos.3. Colocar los materiales en un recipiente con una disolución de deter-

gente no muy concentrada, hasta que se proceda con el lavado.4. Utilizar detergentes no muy alcalinos, no iónicos y libres de metales.

Fig. 2.10. Embudos.


5. En algunos casos se puede emplear mezcla sulfocrómica por 30 min, como mínimo.

6. La cristalería se enjuaga con agua corriente abundante.7. Después se enjuaga con seis cambios de agua destilada.8. A continuación, se enjuaga con seis cambios de agua bidestilada.9. Secar a temperatura ambiente o en la estufa (recordar que esta última no

es recomendable para materiales volumétricos, ni plásticos).

La mezcla sulfocrómica se prepara bajo una campana de extracción de vapo-res, utilizando espejuelos protectores y guantes; se añaden 100 g de dicromato de potasio bien pulverizado a 1 L de H2SO4 concentrado. Es necesario mantener la mezcla en un recipiente bien tapado y tan pronto cambie de color carmelita a verde debe ser desechada. Se recomienda no emplear la mezcla en cubetas de fotometría o, si los materiales son utilizados en análisis enzimático.

En algunos laboratorios existen máquinas para lavar los materiales. Si estos muestran gotas de agua, eso indica que el recipiente no está suficientemente limpio.

Fase preanalítica

A la etapa del trabajo de laboratorio en que la muestra biológica es obtenida, transportada y procesada se le denomina fase preanalítica.

Para que un producto elaborado por una industria cualquiera tenga calidad, lo primero que se debe garantizar es una materia prima con calidad. Lo mismo ocurre en el laboratorio: ningún resultado puede ser confiable, si la muestra biológica no tiene la calidad requerida (Fig. 3.1).

Fig. 3.1. Manipulación de muestra biológica en la fase preanalítica.

Capítulo 3


Se han descrito errores en la fase preanalítica desde el mismo momento en que se confecciona la orden de análisis, como son:

1. Letra no legible.2. Identificación errónea del paciente.3. Orden de análisis deficiente, por ejemplo, se indica solo la determinación

de la fracción de lipoproteína de baja densidad (LDL) en un estudio de lípidos.

4. Preparación del paciente no indicada correctamente, etcétera.

Durante la obtención de las muestras pueden existir errores, tales como: 1. Identificación equivocada del tubo de ensayo. 2. Identificación incorrecta del paciente.3. Volumen insuficiente de la muestra.4. Colección incorrecta.5. Muestra hemolizada, etcétera.

Si hay que trasladar la muestra son muy importantes las condiciones de transportación y, si no se va a procesar inmediatamente, es necesario tener en cuenta las condiciones de almacenamiento.

Lo primero que debe conocer el especialista en bioquímica clínica acerca de una muestra biológica es su procedencia, a qué paciente pertenece y cuáles pueden ser las variaciones biológicas individuales capaces de influir de manera significativa en el resultado final.

A continuación se revisan cada uno de los factores mencionados, para cuyo control es necesario el esfuerzo de varias personas, e incluso, de varios depar-tamentos de un hospital u otros servicios asistenciales.

Errores al ordenar un análisisUna gran frecuencia de errores ocurre con el empleo de letra manuscrita en

las órdenes de análisis, frecuentemente ilegibles. Una recomendación es com-parar identificadores del paciente, digamos su nombre y su historia clínica. La identificación en el rótulo de la muestra se debe corresponder con el número de la orden. La introducción de la tecnología del código de barras ha evitado muchos errores.

También puede ocurrir extravío de órdenes, sobre todo, si el jefe del labora-torio no establece medidas organizativas adecuadas y el personal encargado de esta tarea no presta suficiente atención.

Por otro lado, la preparación del paciente es muy importante, por ejemplo, en el caso de recoger una muestra de orina en una mujer. Aunque la responsa-bilidad de la preparación del paciente recae en otras personas que no laboran en el laboratorio, es conveniente que se establezcan, de manera clara, los

Capítulo 3. Fase preanalítica 29

procedimientos adecuados para esto, lo cual debe ser transmitido a los pacientes, o sus familiares, de manera verbal y escrita.

Obtención de la muestraUna muestra biológica muy frecuente para la realización de análisis en seres

humanos, es la muestra de sangre. La sangre para análisis puede ser obtenida de venas, arterias y capilares.

Si se requiere un pequeño volumen de sangre, la muestra puede ser de sangre capilar por punción de la piel, previa asepsia.

La obtención de sangre venosa es lo más común en adultos, preferentemente a partir de la vena media cubital, en la parte interna de la flexura del codo. Si se trata de un análisis no urgente se prefiere obtener la sangre en horas tempranas de la mañana, después de un periodo de ayuno durante la noche.

Antes de colectar la sangre se deben tomar las precauciones generales de bioseguridad correspondientes, estimar la cantidad de sangre que se necesita obtener y definir bien para cuáles análisis se utilizará. Para algunos análisis se requiere suero, pero para otros pueden ser necesarios sangre total o el plasma. En estos dos últimos casos es necesario agregar anticoagulantes al tubo de ensayo donde se vierte la sangre, si este ya no lo contiene. Son ejemplos:

1. El anticoagulante que menos afecta los resultados analíticos es la heparina, un heteropolisacárido del que se utilizan 20 unidades, aproximadamente 0,2 mg/mL de sangre.

2. Otro anticoagulante es el citrato de sodio, para ello se prepara una disolución con una concentración de 3,4 a 3,8 g/dL y se añade una proporción de una parte de la disolución de citrato por nueve partes de sangre.

3. Otro anticoagulante utilizado es el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) efectivo a una concentración final de 1 a 2 mg/mL de sangre.

4. Los oxalatos de sodio y potasio también son utilizados como anticoagulan-tes, más el de potasio a una concentración final de 1 a 2 mg/mL de sangre.

La extracción de la sangre se hace con el paciente sentado o en posición de decúbito supino, la vena que se va a puncionar en la flexura del codo, se localiza por palpación y la zona debe ser limpiada con un algodón o gasa impregnado en alcohol isopropanol a 60 % o etanol a 70 %; a continuación se aplica un torniquete unos 10 a 15 cm por encima del sitio donde se va a puncionar, aflo-jándolo después de obtener la sangre, proceso que no debe durar más de 1 min.

La punción venosa se realiza con una jeringuilla o tubo colector al vacío (vacuotainer) y con una aguja de calibres 19 a 22 (1,06 a 0,76 mm de diámetro exterior). La aguja debe penetrar la piel con el bisel hacia arriba y en un ángulo de 45 grados. En el caso de obtener suero es necesario dejar reposar la sangre


obtenida durante 20 a 30 min para que se complete el proceso de coagulación antes de llevar a cabo la centrifugación.

Después de obtenida la sangre necesaria se retira la aguja suavemente, y se coloca en el sitio de la punción una gasa seca durante unos 15 min, y el paciente debe, además, levantar el brazo para evitar derramamiento de sangre.

Se separa la aguja de la jeringuilla y la sangre se vierte en tubos de ensayo para los distintos análisis. Los materiales utilizados, la aguja, la jeringuilla etc., son desechados cumpliendo las normas establecidas de bioseguridad para la eliminación de estos materiales.

La técnica para obtener una muestra de sangre venosa puede afectar su resultado. Así:

1. La aplicación prolongada de un torniquete causa anoxia local y aumento de la presión venosa; la anoxia determina que pequeñas moléculas e iones salgan de las células, en particular de las sanguíneas.

2. La presión venosa incrementada provoca que se produzca un aumento en la concentración de proteínas y de las sustancias (como el calcio) que se unen a estas.

3. Por el contrario, la extracción de sangre del brazo de un paciente que tiene una venoclisis puede causar dilución de la muestra de sangre.

4. La utilización de una aguja muy fina, una punción traumática, la utilización incorrecta de anticoagulantes, distracción del personal técnico que realiza la extracción o confusión al rotular los tubos de ensayo también son frecuentes causas de error.

La hemólisis durante y después de la colección de sangre, causa una altera-ción importante de los analitos que tienen una concentración diferencial célula/ /plasma elevada principalmente, además de producir interferencias en algunas pruebas diagnósticas.

Entre las causas artificiales de hemólisis se han citado las siguientes:1. Canalización del vaso sanguíneo muy traumática.2. Obtención de la muestra de sangre con una aguja muy fina.3. Succión forzada con la jeringuilla.4. Agitación brusca de la sangre en la jeringuilla o el tubo de ensayo.5. Forzar la expulsión de la sangre de la jeringuilla, principalmente a través

de la aguja.6. No permitir que el coágulo se retraiga y separarlo de manera inadecuada

de las paredes del tubo.7. Centrifugación a altas revoluciones sin haberse completado el proceso de

coagulación.8. Tubos sucios con restos de detergente.9. Agua o disoluciones hipotónicas en la jeringuilla.


Entre las pruebas de química clínica que se afectan por la hemólisis se destacan la determinación de:

1. Bilirrubina. 2. Fosfato.3. Hierro sérico.4. Colesterol.5. Ion potasio (K+).6. Fosfatasa alcalina.7. Láctico deshidrogenasa.8. Electroforesis de proteínas.

También el empleo de tubos de ensayos u otros recipientes con preservativos o anticoagulantes inapropiados puede afectar los resultados.

Se ha señalado que la mejor manera de evitar estos errores consiste en disponer de un grupo de técnicos, especialmente entrenados en la obtención de la muestra y, que tengan a su disposición, por escrito, los procedimientos normalizados de operación para esta tarea.

Transporte de las muestrasEs muy importante garantizar la estabilidad de las muestras durante el trans-

porte hacia el laboratorio. El personal que recibe las muestras debe inspeccionar cómo arriban estas al laboratorio y rechazar las que no cumplan las condiciones satisfactorias; por ejemplo, si se establece que las muestras deben llegar al laboratorio congeladas, hay que rechazar las que no lo están.

Si la transportación es prolongada téngase en cuenta que se puede producir, en el caso de una muestra de sangre, captura de glucosa por las células sanguí-neas, liberación de enzimas de las células y disminución rápida de la actividad enzimática.

Durante la transportación también puede ocurrir contaminación micro-biana o química.

Almacenamiento de las muestrasUna regla principal en un laboratorio de bioquímica clínica es que las muestras

no se deben almacenar y, siempre que sea posible, realizar las determinaciones analíticas inmediatamente. Por ejemplo, se conoce que las células rojas de la sangre metabolizan la glucosa de manera importante y esto determina que la glucosa en sangre disminuya. Además, la sangre, la orina y otros líquidos biológicos son un excelente medio de cultivo de diversos microorganismos, lo que altera, evidentemente, la composición de la muestra.


Si la muestra de sangre, plasma o suero no puede ser procesada de inme-diato, debe mantenerse en la oscuridad a 4 0C en viales tapados (para prevenir evaporación) y protegidos de la luz.

En la tabla 3.1 se puede apreciar cómo varían diferentes analitos en depen-dencia de las condiciones de almacenamiento.

Cuando las muestras necesitan ser procesadas dentro de 1 mes, aproximada-mente, deben conservarse a -20 0C (si es permisible para el analito en cuestión) y a -40 0C si hay que almacenarlas por períodos más largos.

Tabla 3.1. Variación de analitos según las condiciones de almacenamiento

Analito 4 0C 20 a 25 0CBilirrubina Solo medir en muestra frescaCloruros 10 días 10 díasHierro 7 días - - -Ion potasio 14 días 14 díasFosfato 7 días 2 díasTriglicéridos 2 días No recomendadosUrea 3 días 24 hLácticos deshidrogenados 7 días 7 días

Causas biológicas de variación de una muestra Además de los aspectos técnicos mencionados, que pueden afectar una mues-

tra biológica, hay que considerar que cambios fisiológicos, tanto en personas sanas, como en enfermas, pueden ser causa importante de mala interpretación de los resultados del laboratorio. En muchas ocasiones se pueden originar fuertes discusiones entre los clínicos y los laboratoristas por esta causa y se ordenan nuevos e innecesarios análisis.

Para cada analito existen los denominados valores de referencia, los cuales se obtienen a partir de muestras, relativamente, grandes de personas, ya sean enfermos o sano.

Los valores de referencia pueden ser afectados por varios factores, los que se clasifican en dos categorías:

1. Variables biológicas no susceptibles de modificar. 2. Variables biológicas susceptibles de modificar o controlar.

Variables biológicas no susceptibles de modificar

Entre estas variables se encuentran:1. Variación genética.2. Edad.


3. Sexo. 4. Raza.5. Biorritmo.

Variación genética

Existen enfermedades genéticas que pueden afectar los resultados del labo-ratorio; incluso, hay algunas endémicas de ciertas regiones del planeta, como la anemia por hematíes falciformes (sicklemia) en poblaciones africanas y la talasemia en poblaciones del Mediterráneo, pero otras se pueden encontrar en poblaciones muy diferentes, como la hipercolesterolemia familiar, la fenilce-tonuria y la fibrosis quística del páncreas.

Edad

Los cambios en algunas variables hematológicas en diferentes edades del ser humano son una buena prueba de la influencia de este factor, pero también existen otros ejemplos, como se muestra en la tabla 3.2.

El niño recién nacido tiene muchas particularidades bioquímicas y fisioló-gicas, por ejemplo:

1. Nivel elevado de bilirrubina.2. Concentración de glucosa baja debido a sus escasas reservas de glucógeno. 3. Valores altos de hemoglobina. 4. Hipertiroidismo fisiológico, entre otras.

Lo que constituye un ejemplo de variación biológica con la edad.

Tabla 3.2. Cambios en variables hematológicas en diferentes edades del ser humano

Analito Recién nacido 1 a 14 años Adultos

Conteo de leucocitos (∙ 109/L) 9-30 5-14,5 4,3-10,8Hemoglobina (g/L) 145-245 - - - 120-180Creatinina (μmol/L) - - - 35-60 50-120Gammaglutamiltransferasa (U/L) < 210 < 20 < 50

Sexo

Hasta la pubertad se encuentran pocas diferencias en el laboratorio al com-parar niños y niñas. Después de la pubertad, las actividades séricas de fosfatasa


alcalina, transaminasas y creatinaquinasa son más elevadas en adolescentes va-rones que en hembras. Las concentraciones de calcio, magnesio y albúmina son más altas en los hombres, así como las cifras de colesterol total y hierro sérico.

Los valores de hemoglobina y de algunas hormonas, también son diferentes entre hombres y mujeres. En particular, en la mujer durante el embarazo se modifican algunos analitos en suero.

Raza

Muchos autores de prestigio internacional consideran que es muy difícil distinguir si algunas diferencias observadas en individuos de distinta raza son debidas realmente a este factor o a diferencias en las condiciones sociales. De todas maneras se han descrito valores más altos de láctico deshidrogenasa y creatina quinasa en individuos de raza negra, presumiblemente asociados a una mayor masa muscular.

Biorritmo

Muchos constituyentes de los fluidos biológicos exhiben variaciones cíclicas. Estas variaciones pueden ser grandes y, por lo tanto, es importante controlar es-trictamente cuando se toma la muestra de sangre. Un cambio dramático ocurre, por ejemplo, con la concentración de hierro sérico, que desde las 8:00 a.m. hasta las 2:00 p.m. sus valores se pueden elevar en 50 %. También la urea, la creatini-na, el colesterol y los lípidos totales pueden tener variaciones importantes entre estos horarios.

En ocasiones, los ciclos de variación son más largos, como por ejemplo, lo que ocurre con el colesterol sérico (más elevado durante la ovulación) y el fosfato sérico, proteínas totales y hierro sérico (más bajos durante la menstruación); en la fase de menstruación la creatinina es, por el contrario, más elevada.

Variables biológicas susceptibles de modificar

Entre estas variables se encuentran:1. Actividad física.2. Postura del paciente al tomar la muestra. 3. Hábito de fumar y alcoholismo.4. Factores ambientales.5. Estado nutricional.6. Ingestión de medicamentos y drogas.


Actividad física

El ejercicio físico moderado o intenso influye, de manera importante, sobre las transaminasas y la creatina quinasa; también la concentración de urea, creatinina, fosfato sérico y uratos puede ser más elevada; y el hierro sérico puede ser más bajo. Es recomendable, por lo tanto, que antes de realizarse una extracción de sangre para análisis los pacientes se encuentren en reposo o no realicen ejercicios importantes.

Postura del paciente al tomar la muestra

El volumen de sangre aproximado de un adulto que se encuentra en posición erecta es de 600 a 700 mL menor que si está acostado. El cambio de la posición de decúbito a de pie, que ocurre en un tiempo breve de unos 10 min da lugar a una reducción, principalmente, de plasma con un incremento en la concentración de proteínas séricas.

A continuación se aprecian algunos analitos modificados por la postura del paciente al tomar la muestra:

Analito Incremento promedio (%)

Albúmina 9 Colesterol total 7 Tiroxina 11 Creatinina 5 Hematócrito 10

En los casos que permanecen en cama durante un tiempo prolongado debe tenerse en cuenta que puede ocurrir retención de líquido, y la albúmina sérica y las proteínas totales pueden ser más bajas. También puede aumentarse la excreción urinaria de calcio, sodio y potasio, así como de urea.

Hábito de fumar y alcoholismo

El hábito de fumar, por medio de la acción de la nicotina, puede afectar varias pruebas de laboratorio. El efecto depende del nivel de nicotina asimilado y se debe a que esta sustancia incrementa la secreción de adrenalina por la médula suprarrenal. Pueden afectarse, por ejemplo:

1. La glucemia (puede elevarse 0,56 mmol/L a los 10 min de fumar un cigarro).2. La hormona del crecimiento.3. El colesterol.4. Los triglicéridos, que estarán más elevados.


También la nicotina afecta la secreción de hormonas de la corteza suprarrenal y el conteo de eritrocitos se puede encontrar más elevado.

La ingestión de alcohol moderada puede elevar la glucemia e incrementar los triglicéridos en el suero.

Con una intoxicación alcohólica se incrementa la liberación de cortisol y de hormonas de la médula suprarrenal; la ingestión crónica puede modificar enzi-mas como la gammaglutamiltransferasa y otras. Es conveniente, por lo tanto, advertir de manera general a los pacientes sobre los efectos indeseables al fumar o ingerir bebidas alcohólicas antes de realizarse algún análisis de laboratorio.

Factores ambientales

El mejor reconocido de estos factores es la altura, que por compensación fisiológica da lugar a un incremento de las células rojas de la sangre (por lo tanto, del hematocrito) y de incremento de uratos. La concentración de hormona de crecimiento es menor en personas que viven en grandes alturas.

También se ha señalado que la creatinina sérica es más elevada en el verano que en los meses de invierno, así como el ácido úrico.

Estado nutricional

El estado nutricional y la dieta de un paciente pueden influenciar de manera notable en los resultados del laboratorio. A continuación se muestran algunos ejemplos.

Analito Cambio observado

Triglicéridos séricos Se elevan después de una comida abundante en grasaUrea sérica Se eleva después de abundante ingestión de carneGammaglutamil- Se eleva después de ingestión de alcoholtransferasa Calcio sérico Elevado después de ingestión de leche

En los estados de malnutrición, como la obesidad, se producen variaciones importantes en muchos analitos. Naturalmente, para modificar algunos estados nutricionales se requiere de cambios en los hábitos alimentarios y en los estilos de vida.

Se ha señalado que la cafeína contenida en muchas bebidas habituales, como el café, té y refrescos de cola, tiene un considerable efecto sobre la médula adrenal y sobre la secreción de glucocorticoides, todo lo cual puede afectar la cantidad de glucosa en sangre. También puede modificar variables


del metabolismo lipídico. Lo anterior hace evidente la necesidad de realizar las pruebas de laboratorio después de un período de ayuno de 12 h y evitar excesos alimentarios el día anterior.

Ingestión de medicamentos y drogas

Existen varios ejemplos: 1. Los contraceptivos orales afectan varios analitos. 2. Los diuréticos pueden reducir la concentración de sodio. 3. Las tiazidas en particular pueden producir hiperglucemia y afectar la prueba

de tolerancia a la glucosa. 4. Cuando se administran por vía intramuscular, muchas drogas también cau-

san suficiente irritación local para producir elevación de enzimas, como la creatina quinasa y láctico deshidrogenasa.

Equipos de laboratorio

Los instrumentos analíticos que se utilizan en los laboratorios clínicos cada vez son más complejos. Muchos de estos equipos constituyen sistemas cerrados en cuanto a sus partes y reactivos que requieren, mientras que otros conservan flexibilidad en el tipo de reactivos que pueden aplicar.

Existen equipos para determinaciones muy específicas, como hemoglobinó-metros, y otros más versátiles, como espectrofotómetros. Al igual que existen otros conjuntos de equipos que son tradicionales en los laboratorios.

La selección de equipos para un laboratorio depende mucho de la misión y objetivos de este, de la carga de trabajo, del personal y, desde luego, de fac-tores económicos. Para adquirir un equipo se recomienda tener en cuenta los aspectos siguientes:

1. Valoración inicial basada en las características técnicas que informa el fabricante (evaluar también las facilidades de instalación, mantenimiento y suministros de reactivos).

2. Selección del equipo apropiado.3. Instalación.4. Evaluación en la práctica diaria, incluyendo programa de control interno

de la calidad y de evaluación externa.5. Elaborar procedimiento normalizado de operación (PNO).6. Calibración periódica.7. Establecer programa de mantenimiento.

A continuación se describen los principios básicos de funcionamiento y algunos requerimientos importantes para el mantenimiento y la operación de algunos equipos de empleo común en el laboratorio.

Capítulo 4

Capítulo 4. Equipos de laboratorio 39

CentrífugaLa centrífuga es un equipo muy utilizado en el laboratorio, ya sea de análisis

clínicos o de investigación (Fig. 4.1). Realiza la separación de las partículas que difieren en sus masas y que son sometidas a grandes aceleraciones.

Fig. 4.1. Centrífugas de: ángulo fijo. (A) y cabezal oscilante (B).

En el laboratorio clínico la centrifugación se utiliza para:1. Separar partículas de una disolución en la cual están suspendidas (células,

organelos celulares, precipitar agregados supramoleculares, complejos antígeno-anticuepo, etc.).

2. Separar dos fases líquidas de diferente densidad.

La centrífuga es un instrumento que acelera de manera diferencial a partí-culas o componentes de una suspensión o disolución que difieren en su masa o densidad.

Se debe recordar que por la ley de Newton:

a = F/mDonde: F: fuerza centrífuga; m: masa; a: aceleración de la partícula.Y que:

Densidad = Masa/Volumen

La fuerza centrífuga es proporcional al radio de rotación y a la velocidad de rotación. Las partículas más densas sedimentan primero y las más ligeras

A B


después. Las partículas con densidad menor que la del agua (como es el caso de los quilomicrones, una clase de lipoproteínas del suero) se quedan flotando.

La fuerza centrífuga relativa (FCR) en la centrífuga se relaciona con las revoluciones del rotor por minuto, según la fórmula:

FCR = 1,118 ∙ 10-5 ∙ r ∙ n2 Donde:

FCR: fuerza centrífuga relativa y representa el número de veces la acele ración de la gravedad (g); 1,118 · 10-5: factor empírico; r: radio del rotor desde el eje central hasta el fondo del tubo de la centrífuga (en cm); n: revoluciones por minuto (r.p.m.).

De la ecuación 4.1 se infiere que mientras menor es el radio del rotor de una centrífuga, esta debe girar a mayor velocidad para alcanzar el mismo valor de g. Existen nomogramas que relacionan g con r y con n.

De acuerdo con las características del cabezal donde se colocan los tubos, las centrífugas se pueden clasificar en dos tipos:

1. De cabezal horizontal u oscilante, ya que al girar la centrífuga los tubos alcanzan la posición horizontal y cuando la centrífuga está en reposo, el estado de los tubos es vertical. El sedimento se distribuye uniformemente en el fondo.

2. De ángulo fijo entre 25 y 40 grados; el sedimento va hacia las paredes y el fondo. Permite mayores velocidades que la anterior.

Es importante conocer que existen centrífugas comunes y ultracentrífugas; estas últimas son de muy alta velocidad, usualmente emplean rotores de ángu-los fijos y cuentan siempre con un sistema de refrigeración. Con el empleo de ultracentrífugas se pueden separar incluso macromoléculas, como las proteínas. Se fabrican modelos preparativos y analíticos. También existen en el mercado centrífugas comunes refrigeradas.

Todas las centrífugas tienen entre sus principales componentes una estructura central, un rotor y un motor eléctrico. El rotor se encuentra en una cámara con un cerrojo, que en el caso de las ultracentrífugas siempre es refrigerada. La mayoría de las centrífugas tienen un interruptor para el encendido, un control de velocidad, de tiempo y del número de revoluciones del motor. Las modernas tienen un microprocesador que controla la aceleración y desaceleración del rotor y sistema de alarmas.

Los aspectos más importantes del mantenimiento de las centrífugas de un laboratorio de bioquímica clínica son:

1. La centrífuga debe estar colocada en una superficie horizontal y firme.2. Solo utilizar los tubos recomendados por el fabricante.


3. Es de importancia crítica que los tubos opuestos en el rotor estén balancea-dos al tener igual peso (no tan importante para el caso de las centrífugas de microhematocritos).

4. Mover el control de velocidad lentamente.5. Detener la centrífuga, si hace un ruido anormal.6. Después de centrifugar, limpiar bien el interior de la centrífuga, particular-

mente, si se ha derramado alguna muestra, y desinfectar, si es necesario.

Balanza La masa es una propiedad invariante de la materia. El peso de una sustancia

es una función de la masa bajo la influencia de la gravedad, lo que se puede expresar en la relación:

Peso = Masa · Gravedad

Dos sustancias de la misma masa y sujetas a la misma fuerza gravitacional, tienen el mismo peso. Sin embargo, no pesa lo mismo un hombre sobre la Tierra, que si está en la Luna.

La determinación de la masa se realiza con una balanza, cuyo principio se basa en comparar la masa de una sustancia desconocida con la masa de otra conocida. Como se supone que en cualquier lugar del planeta la fuerza gravi-tacional es la misma, se utilizan como sinónimos masa y peso.

Una balanza clásica está formada por una viga equilibrada que descansa en un punto de apoyo, con dos platos colgando de los extremos de dicha viga. Habitualmente se coloca la sustancia que se va a pesar en uno de los platos y en el otro, pesas que equilibran al anterior. Por lo tanto, el peso requerido para alcanzar el equilibrio es igual al peso de la sustancia que queremos conocer.

Existen varios tipos de balanzas, pero pueden ser de dos categorías princi-pales: mecánicas y electrónicas.

En las balanzas electrónicas (Fig. 4.2), una fuerza electromagnética ocupa el lugar de las pesas en la clásica balanza mecánica de dos platillos.

Hay balanzas de dos platos y otras monoplato, que son las que más común-mente se utilizan en el laboratorio.

En general, se requiere más de una balanza en un laboratorio, porque hay necesidad de pesar desde 3 kg hasta microgramos de algunas sustancias.

Las balanzas de gran capacidad (hasta 5 kg) tienen un límite de detección de 0,1 g. Las balanzas analíticas típicas tienen una capacidad hasta de 200 g y un límite de detección de 10 μg. Las microbalanzas pueden tener una capacidad máxima de 5,0 g y un límite de detección de 0,1 μg.


Algunas recomendaciones para el trabajo con las balanzas y su mantenimiento son las siguientes:

1. Colocar las balanzas en locales libres de vibración (por ejemplo, lejos de una centrífuga), con temperatura del local próxima a 25 °C, sin alta humedad ni electricidad estática y sin corrientes de aire.

2. Las sustancias químicas nunca se deben pesar directamente sobre los pla-tillos.

3. Utilice pinzas forceps para manipular las pesas, evitando el contacto directo de las manos.

4. Utilice recipientes apropiados (no plásticos) de acuerdo con el peso que vaya a medir.

5. La balanza se debe encender y primero ajustar a cero.6. Coloque la sustancia que va a pesar en el centro del platillo.7. Es necesario mantener las balanzas limpias de restos de reactivos. Si se

trata de sustancias biológicas es posible utilizar alcohol a 70 %.8. Después de terminar de pesar coloque la balanza en cero.9. Mantener el lugar de trabajo limpio.

Fig. 4.2. Balanza analítica.


Medidor de pHEn los laboratorios, los medidores de pH se conocen como pH-metros (pea-

chimetro) y su función consiste en medir la concentración de iones hidrógeno [H+] en una disolución acuosa. Se debe recordar que las sustancias ácidas en disolución acuosa se disocian y liberan protones; los ácidos fuertes se disocian totalmente, mientras que los ácidos débiles, como el ácido acético, solo par-cialmente; por lo que la disociación de un ácido débil se puede representar de la manera siguiente:

AH ↔ A- + H+

La concentración de iones hidrógeno o protones se expresa mediante la relación:

pH = -log [H+]

Los componentes esenciales de este instrumento son: un electrodo de vidrio, un electrodo de referencia y un voltímetro calibrado para poder leer directamente en unidades de pH (Fig. 4.3).

Fig. 4.3. pH-metro.

El electrodo de vidrio está constituido por una fina membrana de un vidrio especial, a través de la cual puede establecerse un potencial eléctrico cuando ambos lados de esta se hallan en contacto con disoluciones en las que las con-centraciones de iones hidrógeno son diferentes. Durante su utilización, todo el


electrodo se sumerge en la disolución de pH desconocido y así la membrana se halla en contacto con dos disoluciones: una de pH conocido y otra de pH desconocido.

Como electrodo de referencia se emplea, generalmente, un electrodo de ca-lomelanos saturado que, junto con el electrodo de vidrio, constituye una celda electroquímica representada por:

Ag | AgCl | HCl | (membrana de vidrio) disolución pH desconocido || Hg2Cl2 | Hg

Los iones de hidrógeno pueden atravesar la pared de vidrio; esta pila puede considerarse de concentración.

De la ecuación de Nernst se tiene que:

E = E0 + (RT/nF) ∙ log (a2/a1) Donde:

E: fuerza electromoriz o potencial eléctrico; E0: fuerza electromoriz estándar;

R:constante de los gases; T: temperatura absoluta; n: número de electrones;

F: Faraday; a2: concentración de H+ en el medio; a1: concentración dentro del electrodo de vidrio, cuyo valor es constante.

Ese potencial eléctrico que se establece en el electrodo de vidrio es propor-cional a la concentración de H+ en el medio, según la relación:

V = b + aTpH (4.2)

Donde: a y b: constantes; T: temperatura absoluta.

Por lo tanto, en los pH-metros a partir de la medición de voltaje se obtiene el valor de pH.

En el término b de la ecuación 4.2 se puede producir alguna incertidumbre a causa del denominado potencial de asimetría, probablemente debido a lo que sucede a cada lado de la pared de vidrio del electrodo. Por esa razón, el electrodo de vidrio debe calibrarse con disoluciones tampón (buffer) de pH conocido. Usualmente, los fabricantes de estos instrumentos suministran estas disoluciones.

Los pH-metros se utilizan con frecuencia en el laboratorio para medir la concentración de H+ de disoluciones que se preparan o de muestras biológicas.

Entre las disoluciones que se requiere preparar en un laboratorio se encuentran los amortiguadores o tampón.


Los amortiguadores son sustancias que resisten los cambios de pH de un sistema. Todos los ácidos o bases débiles en presencia de sus sales, forman sistemas tampón. La acción de estos puede ser explicada utilizando la ecuación de Henderson-Hasselbalch, que expresa:

pH = pKa + log (A-/HA)

Donde: pKa : -log Ka (Ka: constante de disociación del ácido).

Esta relación es muy útil para calcular cómo deben mezclarse la sal y el ácido para preparar un tampón con un pH determinado.

El procedimiento que se expone a continuación ejemplifica lo explicado.Se desea preparar un amortiguador 0,1 M de acetato de sodio/ácido acético.

Las disoluciones de las que se parte son ambas 0,1 M, pero ¿en qué propor-ciones deben mezclarse para obtener un amortiguador con pH = 5,0? El pKa del ácido acético es 4,73. Utilizando la ecuación de Henderson-Hasselbalch es posible plantear:

5,0 = 4,73 + log (acetato de sodio/ácido acético) 0,27 = log (acetato de sodio/ácido acético) antilog 0,27 = acetato de sodio/ácido acético 1,86 = acetato de sodio/ácido acético

Este cociente se obtiene, por ejemplo, mezclando 186 mL de acetato de sodio 0,1 M con 100 mL de ácido acético 0,1 M; esta mezcla tendrá un pH de 5,0, el cual se debe comprobar con el pH-metro. Como se aprecia, el pH de un sistema amortiguador es determinado por el pKa del ácido y la relación A-/HA. Los tampones tienen mayor capacidad de amortiguar los cambios de pH cerca del pKa. En el caso de este tampón formado por ácido acético y acetato de sodio, el sistema funcionaría, desde el punto de vista químico, como se expresa a continuación.

Si se añade NaOH:

Se puede apreciar que al añadir una base fuerte, esta se elimina.Por otro lado, si se añade un ácido fuerte, como HCl, ocurre lo siguiente:


En este caso, la adición de HCl disminuye la concentración de acetato de sodio e incrementa la de ácido acético, pero se debe recordar que este último es un ácido débil y el ácido clorhídrico es fuerte. El cambio de pH que se produce en la disolución es pequeño.

Por último, las recomendaciones para el empleo y mantenimiento de pH-metros son:

1. Encienda el equipo y permita unos minutos de calentamiento.2. Lave el electrodo con agua desionizada.3. Transfiera el electrodo a un pequeño vaso de precipitado (beaker) con un

amortiguador estándar con pH 7,0 y calibre el equipo.4. Después de limpiar bien el electrodo con agua desionizada, transfiéralo a

un vaso de precipitado que contenga un tampón de pH 4.0 para calibrar con este pH. La lectura de pH debe estar muy cerca de este valor (utilice tampón estándar fresco cada día).

5. Lave bien el electrodo y proceda a medir el pH de la disolución problema. Espere de 5 a 20 s, ajustando la temperatura. No lea hasta que esté estable la lectura.

6. Lave bien el electrodo con agua desionizada y manténgalo en un recipiente con esta misma agua.

MicroscopioEl microscopio (micro, pequeño y scopio, observar) es un instrumento que

permite observar objetos demasiado pequeños para ser vistos a simple vista.El microscopio óptico, el tipo más común y el primero que se inventó, es

un instrumento básico en muchos laboratorios, sobre todo en los que brindan servicio en la atención primaria, en hematología, en microbiología y parasito-logía (Fig. 4.4).

Todos los microscopios ópticos constan de:1. Base o soporte.2. Sistema para fijar y enfocar las muestras u objetos.3. Sistema de iluminación.4. Sistema óptico de lentes que funciona basado en la refracción de la luz y

permite obtener una imagen amplificada del objeto.


El microscopio óptico también se conoce como microscopio de luz, micros-copio fotónico (que utiliza luz o fotones) o microscopio de campo claro.

En el campo de la medicina, además de utilizarse en el laboratorio clínico o de bioquímica, se le da amplio empleo en el laboratorio de histología y anatomía patológica, donde la microscopia permite determinadas aplicaciones diagnós-ticas, entre estas, el diagnóstico de certeza del cáncer.

A mediados del siglo xvii, un holandés, Anton Van Leeuwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricación propia describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos.

Durante todo el siglo xviii continuó el progreso y desarrollo de este instru-mento, pero las mejorías más notables en el sistema óptico se lograron a fines del siglo xix, cuando Ernst Abbe publicó su teoría del microscopio.

Ya en la década del 30 del siglo xx se había alcanzado el límite teórico para los microscopios ópticos, no consiguiéndose aumentos superiores a 500x, o 1000x.

Sin embargo, un problema práctico y científico emergía, y estaba relacionado con la necesidad de estudiar la estructura, detalles y organización de los compo-nentes celulares, lo cual, en gran medida, impulsó el desarrollo del microscopio electrónico. En este instrumento, un haz de electrones, en lugar de luz, se utiliza para enfocar el objeto, lográndose aumentos muy notables.

En la figura 4.5 se aprecia el esquema de cómo ocurre la difracción de la luz en un microscopio óptico, cuando los rayos luminosos atraviesan las lentes del objetivo y el ocular procedentes de un objeto situado cerca de F (distancia

Fig. 4.4. A y B: microscopio óptico.A B


focal), siendo F1 y F1΄ así como F2 y F2΄ las respectivas distancias focales de esas lentes. Al final, el ojo del observador ve una imagen virtual invertida y aumentada del objeto.

Fig. 4.5. Esquema de la difracción de la luz en un microscopio óptico.

La resolución de los microscopios ópticos está restringida por el fenómeno de difracción de la luz que, en dependencia de la apertura numérica (AN) del sistema óptico y de la longitud de onda de la luz (λ) utilizada, establece un límite definido a la resolución óptica (δ). Suponiendo que las aberraciones ópticas fueran despreciables, la resolución sería:

δ = λ/2AN

Normalmente, se supone una longitud de onda de la luz de 550 nm, corres-

pondiente a la luz verde. Si el medio es el aire, la apertura numérica práctica máxima es de 0,95, y en el caso de aceite, cuando se utiliza objetivo de inmersión en este medio, de hasta 1,5.

Ello implica que, incluso, el mejor microscopio óptico está limitado a una resolución de unos 0,2 µm. Por lo tanto, el aumento obtenido con el microscopio óptico es limitado debido a la longitud de onda de la luz visible que impone restricciones.

En la práctica, la resolución, como la medida del mínimo intervalo entre dos estructuras adyacentes que pueden ser vistas claramente separadas, depende de varios factores, tales como:

1. Contraste inicial del objeto. 2. Contraste de la imagen. 3. Longitud de onda de la iluminación. 4. Aberraciones en el sistema óptico. 5. Vista del observador (o en las fotomicrografías, el contraste y el poder de

resolución del material fotográfico).6. Abertura numérica del sistema (lo más importante).


Además, el poder de amplificación o capacidad de ampliar la imagen primaria de un objeto depende de la lente ocular del microscopio.

Las partes o componentes del microscopio óptico son las siguientes:1. Base: sostiene al microscopio.2. Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador.3. Diafragma: regula la cantidad de luz que entra en el condensador.4. Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.5. Platina: plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se co-

loca la preparación, y que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparación de delante hacia atrás o de izquierda a derecha y viceversa.

6. Objetivo: lente situada cerca del objeto que se examina. Amplía la imagen de este.

7. Revólver: es el sistema en el que se insertan los objetivos, y que rota para utilizar un objetivo u otro.

8. Tubo: es una cámara oscura unida al brazo del microscopio mediante una cremallera.

9. Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y amplía la imagen formada en los objetivos.

10. Tornillos macro- y micrométrico: son tornillos de enfoque, que mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico lo hace de forma rápida y el micrométrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura.

Todos los componentes del microscopio óptico influyen para que el haz luminoso procedente de la lámpara pase directamente a través del diafragma hacia el condensador. Gracias al sistema de lentes que posee el condensador, la luz es concentrada sobre la preparación que se ha de observar colocada en la platina. El haz de luz penetra en el objetivo y sigue por el tubo hasta llegar al ocular, donde es captado por el ojo del observador.

Para limpiar el polvo de las superficies del microscopio óptico debe utilizarse un cepillo muy suave. Los residuos de grasa en los lentes deben limpiarse con papel absorbente fino y con disoluciones de etanol a 40 % o éter a 20 %.

Con el microscopio óptico deben tenerse en cuenta las precauciones siguientes:

1. Mantener el microscopio bajo una bolsa de plástico que contenga sílica para secar el aire.

2. Nunca sumergir los objetivos en xilol, etanol o acetona.3. No utilizar papel ordinario para limpiar lentes.4. No tocar los objetivos con los dedos.


5. No dejar el microscopio en una caja de madera cerrada en climas húmedos.

6. No comprimir el objetivo contra la lámina, pues puede romperlo.

Tipos de microscopios

Existen diversas clases de microscopios, según la naturaleza de los sistemas de luz y otros accesorios utilizados para obtener las imágenes.

Microscopio óptico

Puede ser monocular o binocular; el primero consta de un solo tubo y la observación se hace con un solo ojo; el segundo tiene dos tubos y la obser-vación se hace con los dos ojos, lo que tiene las ventajas siguientes: mejor percepción de la imagen, más cómoda la observación y los detalles se perciben con mayor nitidez.

Microscopio estereoscópico

Hace posible la visión tridimensional de los objetos. Consta de dos tubos con oculares y dos objetivos pares para cada aumento. Este microscopio ofrece ventajas para observaciones que requieren pequeños aumentos. El óptimo de visión estereoscópica se encuentra entre 2 y 40x o aumento total del microscopio.

Microscopio de campo oscuro

Está provisto de un condensador en forma de parábola, que hace que los rayos luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que iluminen de forma oblicua la preparación. Los objetos aparecen como puntos lumino-sos sobre un fondo oscuro. El objeto iluminado dispersa la luz y así se hace visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como las partículas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitación cerrada.

Por ello, las porciones transparentes de la preparación quedan oscuras, mien-tras que las superficies y partículas se ven brillantes por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones.

Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin dañarla.


Microscopio de luz polarizada

A este tipo de microscopio se le ha añadido dos polarizadores: uno entre el condensador y la muestra y el otro entre la muestra y el observador. Se utiliza para poder identificar mejor sustancias cristalinas o fibrosas, como el citoes-queleto en la célula, sustancia amiloide, asbesto, colágeno, cristales de uratos, queratina, sílice, y otras de origen exógeno.

Microscopio de fluorescencia

La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz propia cuando inciden radiaciones energéticas sobre dicha sustancia. El tratamiento del material biológico con fluorocromos facilita la observación al microscopio.

Microscopio de contraste de fases

Se basa en las modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, que hacen que se produzcan contrastes notables en la preparación.

Los objetos ordinarios son visibles mediante luz transmitida porque tienen contrastes de intensidad (o amplitud). La luz pasa a través de ciertas partes del objeto con muy poca absorción y las ondas luminosas que forman estas partes de la imagen tienen alta amplitud o intensidad, mientras que otras partes por efectos de colorantes o absorción natural, son más oscuras.

En muchas preparaciones la amplitud de la luz que las atraviesa no cambia, pero cambia la fase de las ondas de luz con relación a la iluminación general. Como el ojo no es sensible a los cambios de fase, esto no los hace visibles.

El principio del microscopio de contraste de fase es convertir los cambios de fase en cambios de amplitud, que sí son visibles por el ojo humano.

Microscopio confocal

Más recientemente desarrollado; emplea una técnica óptica para incrementar el contraste y reconstruir imágenes tridimensionales, eliminado la luz desenfo-cada o destellos de la lente.

Microscopio electrónico

Muchas estructuras biológicas se han descubierto, o se han revelado detalles inusitados al observarlas con este tipo de microscopio (Fig. 4.6). Utiliza un flujo de electrones en lugar de luz.


Consta, fundamentalmente, de un tubo de rayos catódicos, en el cual debe mantenerse el vacío. El cátodo está constituido por un filamento de tungsteno, que al calentarse eléctricamente emite los electrones, los cuales son atraídos hacia el ánodo por una diferencia de potencial de 50 000 a 100 000 V.

La lente del condensador enfoca este haz y lo dirige hacia el objeto que se observa, cuya preparación exige técnicas especiales. Los electrones chocan contra la preparación, sobre la cual se desvían de manera desigual.

Se acostumbra utilizar el término microfotografías para las fotografías to-madas a través del microscopio óptico y micrografía o electromicrografía, para las que se toman en el microscopio electrónico.

Con el microscopio electrónico se pueden obtener aumentos hasta de 100 000x, e incluso mayores, si se acoplan al microscopio electrónico un amplificador de imagen y una cámara de televisión.

Fig. 4.6. Microscopio electrónico.


El microscopio electrónico consta, esencialmente, de:1. Un filamento de tungsteno (cátodo) que emite electrones. 2. Condensador o lente electromagnética, que concentra el haz de elec-

trones.3. Objetivo o lente electromagnética que amplía el cono de proyección del

haz de luz. 4. Ocular o lente electromagnética que aumenta la imagen. 5. Proyector o lente proyectora que amplía la imagen. 6. Pantalla fluorescente que recoge la imagen para hacerla visible al ojo

humano.

Además de los tipos de microscopios mencionados, en los últimos años se han desarrollado otros, como el microscopio de efecto de túnel y el de positrones, con importantes aplicaciones en estudios físicos de materiales. Por supuesto, algunos microscopios, como el electrónico, solo es posible encontrarlos en laboratorios muy especializados y que llevan a cabo investigaciones de gran alcance o profundidad.

IncubadoraSu empleo es muy común en los laboratorios de microbiología, y para cultivo

de tejidos. Operan con temperaturas desde -10 hasta 75 0C, o ligeramente su-periores. Deben mantener una temperatura constante. Esta debe ser chequeada de manera rutinaria todos los días. Al igual que todos los instrumentos, las incubadoras deben limpiarse cada vez que sean utilizadas.

En algunas es posible inyectar dióxido de carbono (CO2) para crear una atmósfera especial donde el crecimiento de determinados microorganismos o células se favorece (Fig. 4.7).

Estufa La estufa se utiliza para desecar y esterilizar materiales (de vidrio o metal) del

laboratorio; emplea temperaturas relativamente elevadas que pueden alcanzar hasta 350 0C.

Se debe fijar un valor de temperatura de trabajo de la estufa por el tiempo necesario para lo que se va a realizar. Es conveniente esperar que la temperatura descienda a menos de 40 0C para abrirla (Fig. 4.8).

La estufa no se debe utilizar para secar cristalería volumétrica graduada, como pipetas o matraces aforados, ni materiales plásticos.

Fig. 4.7. Incubadora para el trabajo en microbiología.

Fig. 4.8. Estufa.


A continuación se muestra la relación entre la temperatura de esterilización por calor seco y el tiempo.

Temperatura (0C) Tiempo (min)

180 30 170 60 160 120 150 150 140 180

Refrigeradores y congeladores (freezer)Estos equipos se utilizan comúnmente en el laboratorio para guardar

muestras y reactivos a bajas o muy bajas temperaturas; condiciones en que la actividad biológica y química de las muestras es menor, por lo que se preservan mejor (Fig. 4.9).

Para alcanzar el enfriamiento, estos equipos deben lograr que el flujo de calor, que normalmente en la naturaleza es transferido de un cuerpo caliente a uno frío, sea invertido.

Un gas refrigerante se evapora dentro de un sistema de tubos que constituyen el evaporador de la cámara refrigerante, y en esta absorbe energía calorífica para romper las fuerzas de atracción de las moléculas en el estado líquido; después este gas pasa a un motor compresor y sale de este a elevada temperatura y pre-sión; posteriormente, en el condensador que está en la parte exterior y trasera del refrigerador es condensado a líquido por el aire fresco del ambiente; del condensador, el refrigerante pasa de nuevo al evaporador, donde del estado líquido pasa al gaseoso, repitiéndose de nuevo el ciclo.

El calor es transferido así: del interior de la cámara de refrigeración, un cuerpo más frío, al medio circundante, más caliente. Por supuesto, para este proceso se requiere energía.

A continuación se ofrecen algunos consejos para aumentar la eficiencia de estos equipos:

1. Verificar que la instalación eléctrica sea adecuada y si es posible emplear protección contra cortes eléctricos.

2. No ubicar los equipos donde reciban luz solar directa o cerca de fuentes de calor.3. Los refrigeradores deben tener buena circulación de aire en la parte del

condenador (no colocarlos con la parte posterior muy cerca de la pared).4. Las puertas deben cerrar herméticamente.5. Limpie el condensador de polvo.6. Limpie la cámara fría (donde está el evaporador) periódicamente.


Fig. 4.9. Refrigerador.

7. Limpie las partes internas, puertas, gavetas y estantes, con una disolución diluida de detergente y nunca con material o sustancias abrasivas (gasolina, mallas de aluminio, etc.).

Baño de aguaLos baños de agua (Fig. 4.10) se utilizan en los laboratorios en diferentes

técnicas y comúnmente a temperaturas de 25; 30 y 37 0C. Es importante que el baño mantenga una temperatura constante dentro de un rango de ± 0,5 0C, en especial, en las determinaciones cinéticas. Es importante que:

1. El nivel de agua esté por encima del nivel de la disolución que se está incubando.

2. Los tubos u otros recipientes no se deben incubar tapados, pues el vapor de agua puede condensarse y diluir la muestra.


3. Se debe cambiar, regularmente, el agua, para evitar el crecimiento bacteriano y de algas.

Fig. 4.10. Baño de agua.

Contador de célulasUn tipo de equipo que los laboratoristas mucho han agradecido es el contador

de células, pues los alivian del duro trabajo de estar al microscopio durante horas. Aun así, la experiencia del especialista es necesaria cuando se trata del diagnóstico de tipos celulares patológicos.

Los contadores y analizadores de células utilizan diferentes principios, como la medición de la impedancia eléctrica y la difracción de la luz, entre otros.

El conteo celular por impedancia ha sido el más utilizado. El principio es que las células sanguíneas son menos conductivas que el fluido que las rodea; el flujo de electricidad en una disolución es interrumpido cuando las células sanguíneas se interponen o bloquean una pequeña abertura por donde, normalmente, están pasando iones de la disolución y con estos un flujo de corriente eléctrica. Al pasar cada célula por esa abertura se modifica la corriente eléctrica y estos cambios son registrados en forma de pulsos. El número de células es contado por el número de pulsos. Además, el tamaño de cada pulso es proporcional al tamaño de la célula.

Los contadores por impedancia cuentan a los eritrocitos y los leucocitos juntos, pero la contribución de estos últimos al conteo de glóbulos rojos es solo de 0,2 % y es despreciable (10 000 leucocitos/5 millones de eritrocitos/mm3).

Para realizar el conteo de leucocitos, los glóbulos rojos deben ser previamente lisados con disoluciones de detergentes. La lisis incompleta de los eritrocitos puede dar lugar a resultados erróneos.


Equipo de electroforesisLa electroforesis se utiliza con cierta frecuencia en algunos laboratorios y

se refiere a la migración, en un medio líquido, de partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico.

La electroforesis de zona consiste en la migración de macromoléculas cargadas en un soporte poroso, tal como: acetato de celulosa, geles de poliacri-lamida o de agarosa. Cada una de estas variantes tienen innumerables aspectos importantes que deben ser atendidos en cuanto a:

1. Preparación del soporte.2. Preparación de los amortiguadores de corrida.3. Intensidad del campo eléctrico.4. Tiempo de corrida.5. Procedimiento de revelado, etc.

Las especies químicas, en dependencia del grado de ionización en deter-minado medio, migrarán al cátodo (electrodo -) o al ánodo (electrodo +). Las proteínas, por ejemplo, en un medio que tenga un pH por encima de su punto isoeléctrico (pI) se cargan negativamente y migran al ánodo. La velocidad de migración depende de varios factores:

1. Carga eléctrica neta de la partícula.2. Tamaño y forma de la partícula.3. Intensidad del campo eléctrico.4. Propiedades del medio.5. Temperatura.

La ecuación que relaciona estos factores con la movilidad electroforética es la siguiente:

μ = Q/ k r η Donde:

μ: movilidad electroforética, en cm2/V · s; Q: carga neta de la partícula; k = 6π; r: radio de la molécula; η: viscosidad de la disolución en la cual ocurre la migración.

Por lo general los equipos cuentan con dos celdas donde se coloca la diso-lución amortiguadora; cada una de las celdas tiene contacto con un electrodo conectado a la fuente eléctrica.

Las fuentes para el suministro de corriente pueden operar a: corriente, voltaje o potencia constantes.


Un procedimiento general de electroforesis consiste en los pasos siguientes:1. Un soporte material, como papel de acetato de celulosa o un gel de azarosa,

se coloca en la cámara de electroforesis en contacto con la disolución tampón. Después se elimina el exceso de tampón de la superficie del soporte, ase-gurándose de que no se formen burbujas.

2. Se pone en contacto el soporte con el tampón o amortiguador en cada una de las dos celdas.

3. Se aplica la muestra al soporte.4. Se conecta la fuente eléctrica con parámetros eléctricos de acuerdo con el

tipo de electroforesis y para un tiempo determinado.5. Se desconecta la fuente después de ese tiempo. Nunca abrir o tocar las

celdas por peligro de choque eléctrico.6. Se retira el soporte y, rápidamente se seca o coloca en una cámara para

fijación con algún reactivo y teñido después.7. Después de eliminar el exceso de colorante, el soporte se seca.

AgitadorEl agitador es un equipo que se utiliza muy frecuente en los laboratorios

con la finalidad de acelerar el proceso de disolución de determinados solutos, para mezclar bien y calentar muestras contenidas en tubos de ensayos y en otros recipientes, los cuales se colocan sobre una superficie plana de aluminio o cerámica, la que pueda calentarse hasta 300 o 400 0C y rotar desde 60 hasta 12 000 r.p.m. en algunos modelos (Fig. 4.11).

El agitador es sencillo, tienen una resistencia eléctrica, un motor para producir la rotación del plato donde se coloca el recipiente y sus respectivos controles. Algunos diseños generan un campo magnético que hace girar una varilla de metal colocada en el recipiente que contiene la disolución.

Estos aparatos requieren un mínimo de mantenimiento; deben limpiarse con una disolución diluida de detergente en posición vertical, fundamentalmente, para que no se humedezcan las partes internas. Es muy importante verificar que están secos al conectarlos de nuevo a la corriente eléctrica.

Sistemas de purificación del aguaLa preparación de muchos reactivos en un laboratorio requiere agua pura.

Durante muchos años, este término, para casi todo el personal del laboratorio, era sinónimo de agua destilada; actualmente existen otros métodos de purifi-cación del agua para obtener agua con calidad reactiva de diferentes grados (desde I hasta III. Ver tabla 2.1).


Filtración

Existen tres tipos de equipos de filtración, el que: 1. Utiliza filtros de microfibras de vidrio.2. Consiste en soportes con carbón activado a través de los cuales el agua pasa

y se eliminan grandes cantidades de material orgánico.3. Emplea filtros de microporos (usualmente de 0,2 μm) que remueven par-

tículas o microorganismos mayores que ese tamaño.

Destilación

Es el método más antiguo de purificación. La destilación implica un cambio de fase del agua de líquido a vapor, y los materiales no volátiles quedan por detrás, aunque algunas impurezas, como iones de: sodio, potasio, carbonatos, sulfatos y manganeso, pueden pasar a la fracción destilada. La destilación requiere una gran cantidad de energía, y es muy importante que se limpie, regularmente, el equipo de las impurezas que se acumulan.

Fig. 4.11. Agitador electromagnético.


Desionización

El agua desionizada se obtiene cuando las sales iónicas son removidas del agua por medio de resinas insolubles de intercambio iónico. Las resinas, usualmente contenidas en recipientes separados, pueden ser intercambiadoras de cationes o de aniones.

Una resina típica intercambiadora de cationes actúa de la forma siguiente:

(RSO3)H + Na+ → (RSO3)Na + H+

Mientras que una intercambiadora aniónica lo hace como:

(RNRꞌ)OH + Cl- → (RNRꞌ)Cl + OH-

Las resinas catiónicas pueden ser regeneradas con ácido clorhídrico (HCl) y las aniónicas con hidróxido de sodio (NaOH). Los intervalos de tiempo para efectuar esta regeneración dependen de las veces que se haya utilizado la resina.

Ósmosis reversa

Es otra técnica de purificación del agua. Habitualmente, en la ósmosis el agua pasa a través de una membrana semipermeable desde la disolución más diluida o agua pura, hasta una disolución concentrada de terminado soluto.

En el caso de la ósmosis reversa, como su nombre indica, se aplica una alta presión del lado de la disolución más concentrada, con lo que se impide el paso de agua de la más diluida a la concentrada. La presión es tan elevada que se invierte el flujo de agua y entonces esta pasa de la más concentrada a la disolución más diluida, quedando los solutos aislados.

En ocasiones se combinan intercambio iónico y ósmosis reversa para obtener agua pura.

La conductividad del agua purificada, y de ahí su calidad para el trabajo del laboratorio, puede ser medida por un conductímetro. Este es un equipo que mide la conductividad eléctrica, la cual se define como la capacidad que tiene un medio para conducir la corriente eléctrica, por lo general, debido a las sales inorgánicas disueltas. El agua pura no conduce la corriente eléctrica, sin embargo, el agua con sales sí lo hace.

La conductividad eléctrica se expresa en siemens (S) por centímetro, o más frecuentemente, en microsiemens por centímetro; esta unidad es el recíproco de la resistencia específica o resistividad, que se expresa en ohm por centímetro o también en megaohm por centímetro. Para el agua se han definido tres grados


de calidad, sobre la base de la conductividad eléctrica, en microsiemens por centímetro.

En la definición actual de calidad de agua se tiene en cuenta el contenido de silicatos (SiO2), de microorganismos, de compuestos orgánicos y de partículas.

Según la calidad (tipo I, II y III) el agua se utiliza para: 1. El agua de calidad III se emplea en el lavado de la cristalería y para algunas

técnicas analíticas, como por ejemplo, ciertos análisis de orina y determi-nadas técnicas cualitativas.

2. El agua tipo II se utiliza para técnicas analíticas que no requieren agua muy pura. El almacenamiento debe ser por un mínimo de tiempo.

3. El agua de calidad tipo I se utiliza en las técnicas analíticas de mayor precisión y exactitud, que deben estar libres de interferencias. Por ejemplo, determinaciones de microelementos inorgánicos, análisis enzimáticos, preparaciones de calibradores. Se recomienda no almacenarla; debe emplearse inmediatamente después de su producción.

Fotometría

Los fotómetros y espectrofotómetros son equipos muy utilizados en un laboratorio, pues con estos se puede informar la concentración de gran parte de los analitos que con más frecuencia se determinan diariamente en una muestra biológica.

En el desarrollo de este capítulo, además de explicar el fundamento teórico de la fotometría, se profundiza en los principios de funcionamiento de los equipos, se describen sus distintos componentes y sus características más relevantes.

Fundamento teórico de la fotometríaEn la actualidad, la gran mayoría de las determinaciones en un laboratorio de

bioquímica clínica se realizan con la utilización de técnicas basadas en medicio-nes del espectro de las sustancias, ya sea mediante los instrumentos conocidos, como fotómetros de filtro, o con el empleo de espectrofotómetros (Fig. 5.1).

Fig. 5.1. Espectrofotómetro.

Capítulo 5


El fundamento de cualquiera de estas técnicas se basa en las interacciones que se producen entre los átomos y las radiaciones electromagnéticas.

Las radiaciones electromagnéticas son diversas: desde longitudes de ondas muy cortas, como las de los rayos γ y X, hasta grandes longitudes de onda, como las ondas de radio. El término luz visible se emplea para describir las radiaciones con longitudes de onda visibles para el ojo humano y que están comprendidas entre 400 y 750 nm, aproximadamente (recordar que 1 nm = 10-9 m).

La luz solar (o la emitida por un filamento de tungsteno) es una mezcla de las radiaciones electromagnéticas comprendidas entre 400 y 750 nm, y el ojo humano la reconoce como blanca.

En la tabla 5.1 se muestran las relaciones existentes entre las longitudes de onda de las radiaciones y sus colores característicos.

Tabla 5.1. Relación entre la longitud de onda y los colores observados

Longitud de onda (nm) Región Color observado

< 380 Ultravioleta No visible 380-440 Visible Violeta 440-500 Visible Azul 500-580 Visible Verde 580-600 Visible Verde 600-620 Visible Anaranjado 620-750 Visible Rojo 750-3 000 Infrarrojo cercano No visible

Nota: El color observado es una característica subjetiva y, por lo tanto, los rangos de longitud de onda son aproximados.

Las radiaciones electromagnéticas tienen energía (E) dada por la expresión:

E = hυDonde: E: energia; h: constante de Planck, equivalente a 6,62 ∙ 10-34 J ∙ s;

υ: frecuencia de la luz, se calcula por la expresión:

υ = c/λDonde: c: velocidad de la luz, que es igual a 3 ∙ 108 m/s en el vacío;

λ: longitud de onda, expresada en nm.

Se observa que cuanto menor es la longitud de onda, mayor es la energía de estas radiaciones.

Capítulo 5. Fotometría 65

Los espectros atómicos ocurren como consecuencia de la absorción de ener-gía por los átomos y, ya sean de emisión o absorción, son el resultado de los movimientos de los electrones desde un nivel electrónico de una determinada energía, hasta otro dentro del mismo átomo.

En el caso de los espectros de absorción, los electrones se mueven por ab-sorción de cuantos de energía (incremento finito necesario para saltar de un nivel a otro) desde orbitales más cercanos al núcleo, hasta otros más externos.

Para producir saltos electrónicos en los orbitales que están más próximos al núcleo hacia niveles más externos, es indispensable que el átomo reciba grandes cantidades de energía (100 kcal/mol o más) y que las radiaciones electromag-néticas correspondan a las zonas de los rayos γ, X o ultravioletas; los cambios en los orbitales más externos corresponden a la absorción en el ultravioleta visible o en el infrarrojo cercano.

En los espectros de emisión, lo que se mide es la energía emitida por los electrones al regresar desde un nivel más externo, con mayor energía, hacia un orbital más cercano al núcleo y con menor energía. Sin embargo, en la mayor parte de las sustancias, las moléculas activadas pierden su energía en forma de calor debido a colisiones con moléculas vecinas. En algunas sustancias una parte de la energía se emite en forma de calor y la energía restante se emite como radiación electromagnética en forma de fluorescencia. Es comprensible que la radiación emitida como fluorescencia tiene menor energía que la absorbida, pues una parte se pierde en forma de calor.

Hay que considerar que en el caso de las moléculas, la absorción puede incluir estados de transición entre los niveles de vibración y rotación, además de, o en lugar de, las transiciones electrónicas. La energía para producir movimientos de rotación o vibración en una molécula siempre es menor que la necesaria para los saltos electrónicos. Evidentemente, los espectros de absorción o emisión de las moléculas serán mucho más complicados que los de los átomos.

En los espectros de emisión o absorción, la relación entre el cambio de la energía de la molécula y la frecuencia de la luz emitida o absorbida se determina por medio de la ecuación:

δE = E1 - E2 = hυ

Por lo tanto, en el proceso de absorción, un fotón incidente entrega su energía a una molécula llamada absorbente, lo que da lugar a la excitación del absorbente que pasa a un estado energético superior. Este proceso se puede representar así:

A + hυ → A* → A + calor + radiaciones electromagnéticas


Donde: A: absorbente en su estado energético bajo; A*: absorbente en su

estado energético alto; hυ: energía del fotón incidente.

Ya se mencionó que los valores de energía emitida para pasar al estado base, en forma de calor o radiaciones, varían de una sustancia a otra.

La variación de la energía total de las moléculas al pasar de uno a otro estado es igual a la suma de las variaciones de las energías electrónica, vibracional y rotacional de estas:

δE = δEelectrónica + δEvibracional + δErotacional

Ley de Lambert-Beer

El origen de la espectrofotometría de absorción puede referirse al trabajo de Lambert y Bouguer en el siglo xviii, pero no es hasta un siglo después, cuando Beer y Barnard establecen una ley general para la absorción. Es en los años 40 del pasado siglo xx cuando se comienzan a desarrollar instrumentos que adquieren importancia práctica en el análisis químico.

La magnitud de la absorción de radiación electromagnética depende de la probabilidad de que la energía de un fotón (cuanto de radiación electro-magnética) sea absorbida por una molécula. La probabilidad de absorción es directamente proporcional a la concentración de moléculas que pueden efectuar esa absorción y se expresa matemáticamente mediante la expresión:

dI/I = -kc dx (5.1) Donde:

I: intensidad de la luz de la radiación electromagnética de una longitud de onda particular, es decir, número de fotones por centímetro cuadra-do por segundo; dI: variación diferencial en la intensidad ocasionada por la absorción en una capa delgada de espesor dx; k: constante de proporcionalidad; c: concentración de moléculas (como la I disminuye al aumentar dx, aparece un signo negativo). La distancia x se mide a través de la celda o cubeta en la dirección del rayo de luz absorbido.

De acuerdo con la ecuación 5.1, la fracción de luz absorbida es propor-cional al espesor de la disolución que absorbe, tomando en cuenta que el espesor y la fracción absorbida son muy pequeños. La constante de pro-porcionalidad varía con la longitud de onda empleada, con el solvente y la temperatura (Fig. 5.2).


La intensidad del rayo electromagnético (I) después de haber atravesado b centímetros (dx) de la cubeta que contiene una disolución de concentración c, está relacionada con la intensidad del rayo incidente I0 por medio de la ecuación 5.2:

∫(dI/I) = -kc ∫dx ln I/I0 = 2,303 log10 (I/I0) = -kcb

A = log10 (I0/I) = abc Donde:

A: absorbancia o densidad óptica; a: constante de proporcionalidad definida como absorptividad; b: paso de luz o diámetro de la cubeta, o distancia que la luz recorre a través de la disolución; c: concentración.

En la expresión 5.2, fácilmente se puede apreciar que el valor mínimo de absorbancia es igual a cero, lo que ocurre cuando las moléculas de la sustancia que está en la cubeta no absorben radiación y, en ese caso, I0 = I y log10 1 = 0. También se deduce con facilidad que el valor máximo de absorbancia es infinito (es decir, el límite es infinito).

La absorbancia, como se aprecia, no tiene unidades, y la variable absorptividad tiene las unidades recíprocas del paso de luz y la concentración.

Al cociente I/I0 se le denomina transmitancia (T) y se utiliza menos en la ac-tualidad, ya que esta variable expresada como porcentaje de T varía inversamente y de manera logarítmica con la concentración, mientras que la absorbancia varía con respecto a la concentración directamente y mediante una relación lineal.

En los equipos actuales, fotómetros y espectrofotómetros, el porcentaje de transmitancia es convertido, de forma automática, en valores de absorbancia.

Cuando la concentración se mantiene constante y el diámetro de la cubeta se duplica, la absorbancia se duplica. Es decir, la absorbancia es también propor-cional al paso de luz o distancia que la luz recorre a través de la disolución, lo cual es referido, en particular, como ley de Lambert o Bouguer.

Fig. 5.2. Rayo incidente atravesando una cubeta de espesor dx.

(5.2)


La relación con la concentración fue establecida por Beer y Bernard, y por eso la ley en general (expresada en 5.2), se conoce como ley de Lambert-Beer.

Cuando b = 1 cm y la concentración se expresa en moles por litros, la ab-sorptividad molar (ε) sustituye a la absorptividad (a).

La constante ε para un compuesto determinado depende de la longitud de onda, de las características del disolvente, de la temperatura y del pH. Los valores de la absorptividad molar son útiles para caracterizar compuestos (siempre que el ancho de hendidura (slit) del equipo sea suficientemente estrecho). Por ejemplo, cuando la bilirrubina se disuelve en cloroformo a 25 0C debe tener una absorptividad molar de 60 700 ± 1600 a 453 nm. El peso molecular de la bilirrubina es 584. Por lo tanto, una disolución que contenga 5 mg/L (0,005 g/L) debe tener una absorbancia:

A = 60 700 ∙ 1 (0,005/584) = 0,520

Es necesario recordar que, si la sustancia que va a analizarse no absorbe radiaciones electromagnéticas en un intervalo de longitud de onda favorable, puede hacerse reaccionar con otra, de tal manera, que el producto de la reacción tenga las características de absorción convenientes.

La proporcionalidad entre la absorbancia y la concentración debe ser es-tablecida directamente y de forma experimental para un instrumento dado bajo determinadas condiciones. Es frecuente que exista una relación lineal en determinado rango y se dice entonces que la disolución obedece la ley de Lambert-Beer en ese rango. De esta forma se puede conocer la concentración de una sustancia en una disolución o muestra cualquiera (cm: concentración de la muestra), si se cuenta con una disolución patrón de concentración conocida (cp: concentración patrón) de esa misma sustancia.

Según la ecuación 5.2, cuando se mide la disolución del patrón o estándar:

Ap = ap b cp (5.3)

y cuando se mide en el equipo la disolución problema de que se trate:

Am = am b cm Como se utilizan cubetas con idénticas dimensiones, el paso de luz es igual

en ambas mediciones; lo mismo ocurre con ap y am, porque se trata de la misma sustancia. Dividiendo la ecuación 5.4 entre la 5.3 se tiene:

Am/Ap = am b cm/ap b cp

Am/Ap = cm/cp

(5.4)


Por lo que:cm = Am cp/Ap

El cociente cp/Ap también es conocido como factor de calibración (K); de esta manera, conociendo K y Am es posible calcular la variable desconocida o concentración de la muestra, o disolución problema.

Desde luego, ni el patrón ni la disolución problema deben estar fuera del rango lineal de la curva de calibración (es decir, donde estas disoluciones obedecen la ley de Lambert-Beer).

El factor de calibración puede ser calculado a partir de una pareja de valores, pero es mucho más conveniente calcularlo, por lo menos, con un mínimo de cinco parejas de valores, analíticamente, o a partir de la gráfica conocida como curva de calibración, donde se plotea en el eje x, los valores de diferentes concentra-ciones del patrón, y en el eje y, los valores de absorbancia (Fig. 5.3 y anexo 2).

Fig. 5.3. Curva de calibración.

Siempre que sea posible es aconsejable la construcción de una curva de calibración que cubra la zona de concentraciones que se van a encontrar en la práctica y de los valores de concentración por duplicado o triplicado para obtener un valor de absorbancia promedio.

Cada punto de la curva de calibración debe ser preparado independientemen-te; es decir, no preparar un punto con alta concentración del patrón y después otros a partir de este mediante dilución. La construcción de esta curva debe ser la primera fase al montar una nueva técnica fotométrica en el laboratorio. La línea recta puede ser trazada manualmente o utilizando el método estadístico de la regresión lineal.

La curva de calibración se debe realizar para cada serie de muestras problemas, lo cual permite controlar la reproducibilidad de la técnica (control de la calidad).

La concentración del patrón puede expresarse en cualquier unidad, pero es más conveniente expresarla en las mismas unidades en que se expresa el resul-tado final, por lo general en unidades del Sistema Internacional de Unidades.


A cada valor de absorbancia de los tubos patrones se le debe sustraer el valor de absorbancia del blanco de reactivos.

Es necesario hacer el blanco de reactivos, tanto cuando se realiza la curva de calibración, como cuando se miden muestras problemas. Se obtiene susti-tuyendo el volumen del patrón, o de la muestra problema que se utiliza en la técnica analítica, por la misma cantidad de agua, y determinando la absorbancia de esta disolución. La finalidad de este proceso es establecer la absorbancia de la disolución final que deriva, no de la sustancia que se quiere analizar, sino de los reactivos empleados en su determinación.

Es conveniente realizar las lecturas de absorbancia de los blancos de reac-tivos contra agua o del disolvente utilizado en la técnica y después sustraer la absorbancia del blanco de reactivos de las muestras patrones o problemas. Si la absorbancia del blanco de reactivos es muy alta, conviene leer directamente los tubos problemas o el patrón frente al blanco de reactivos.

Las lecturas de absorbancia deben realizarse, preferentemente, en un rango comprendido entre 0,1 y 1,0 unidades.

En general, la ley de Lambert-Beer se cumple si:1. La luz incidente es monocromática.2. La absorción del disolvente es insignificante comparada con la del soluto.3. La concentración del soluto está dentro de ciertos límites.4. No ocurre reacción química entre la molécula de interés y otro soluto, o

molécula del disolvente.

Componentes de un espectrofotómetroLos componentes básicos de un espectrofotómetro se observan en la figura

5.4 para mejor comprensión de los lectores. Este equipo tiene mucha utilidad en un laboratorio de bioquímica.

Fig. 5.4. Esquema de un espectrofotómetro.

Los fotómetros de filtro son instrumentos relativamente más simples, donde el selector de longitud de onda o monocromador es un filtro óptico.

A continuación se describen algunos detalles de los principales componentes de los fotómetros y espectrofotómetros.


Fuente de luz

Varias fuentes de luz se utilizan en los fotómetros y espectrofotómetros, las cuales incluyen lámparas: incandescentes, ultravioleta, catódicas y láser. La fuente de luz para la región visible del espectro es, por lo general, la lámpara de tungsteno. El tiempo de vida de un filamento de tungsteno se puede incrementar de manera significativa por la presencia de vapor de ioduro o bromuro a baja presión. Sin embargo, esta lámpara no suministra suficiente energía radiante para mediciones por debajo de 320 nm.

Un problema que se ha de considerar, el cual se presenta cuando estos equipos están viejos, es la cantidad de calor generada por esta fuente de luz; el calor puede afectar la geometría del sistema óptico o cambiar la sensibilidad de la fotocelda de detección.

Para mediciones en el ultravioleta (UV) se utilizan diferentes tipos de lám-paras en fotómetros y espectrofotómetros.

Las lámparas de hidrógeno, deuterio (deuterium), xenón y de mercurio a alta presión dan un espectro continuo en la región ultravioleta.

Las lámparas catódicas al vacío se emplean con más frecuencia en espectro-fotometría de absorción atómica.

El láser (light amplification by stimulated emission of radiation) es útil como fuente de luz para espectrofotómetros porque produce un rayo de luz intenso y de longitud de onda estrecha.

Monocromador

Se trata de un dispositivo para aislar una longitud de onda característica y excluir las demás. Se utilizan con este propósito, filtros, prismas y redes de difracción.

El tipo más simple de filtro consiste en una capa delgada de vidrio coloreado. Algunos compuestos de metales o sus sales, disueltos o suspendidos en vidrio, producen un color correspondiente a la luz transmitida.

Algunos especialistas consideran que los filtros de vidrio no son verdade-ros monocromadores debido al relativo ancho de banda de la luz transmitida. Comúnmente, los filtros de vidrio tienen un ancho de banda de 50 nm, aunque también existen otros (filtros de interferencia) que dejan pasar radiaciones con longitud de onda de 5 a 15 nm.

Un prisma separa la luz blanca en un espectro continuo por refracción; con accesorios apropiados puede aislarse una porción del espectro de longitud de onda estrecha.

Por otra parte, las redes de difracción se preparan depositando una delgada capa de una aleación de aluminio y cobre en la superficie de una placa de vidrio plana y trazando muchas líneas paralelas en la cubierta de metal. Al iluminar


la red, en cada línea se forma un espectro delgado con frentes de onda en toda la placa; los frentes de onda con longitudes de onda que están en fase se incre-mentan y se cancelan los que no están en fase. Esta es una red de transmisión plana, pero también hay redes de reflexión.

Es muy importante conocer el ancho de banda de una sustancia absorbente. Esto se puede hacer, si se realiza una curva de absorción que relaciona absor-bancia con la longitud de onda (Fig. 5.5).

Fig. 5.5. Espectro de absorción de la oxihemoglobina.

Las sustancias que muestran un espectro de absorción con un ancho de banda estrecho deben medirse con espectrofotómetros que produzcan luz de banda estrecha, porque si no la intensidad de la absorbancia disminuye mucho. La longitud de onda seleccionada para la medición debe ser la correspondiente al valor máximo del pico de absorbancia.

Cubetas

Hay cubetas de diferentes formas y tamaños. La más común de todas tiene un paso de luz de 1 cm. La mayoría están fabricadas de vidrio (borosilicato), lo cual permite trabajar con longitudes de onda entre 340 y 1000 nm. Cuando se requiere realizar mediciones espectrofotométricas por debajo de 340 nm se requiere utilizar cubetas de cuarzo (sílice). También existen cubetas de material plástico.

Para la utilización de las cubetas se deben cumplir las recomendaciones siguientes:

1. Las cubetas rectangulares tienen dos paredes ópticas. Solo deben tocarse por las paredes no ópticas.


2. Cuando el tiempo de reacción en la cubeta es prolongado, para algunas técnicas debe evitarse la evaporación del disolvente sellándolas.

3. La superficie de la disolución debe estar siempre por encima del rayo de luz que pasa a través de la cubeta.

4. Cuando se emplean microcubetas es importante estar seguro que estén correctamente colocadas.

5. Es importante evitar rayar las paredes de las cubetas.6. Evitar suciedades. Las cubetas deben lavarse con agua, detergentes suaves

(no excesivamente alcalinos) o enjuagarlas en una mezcla de ácido clorhí-drico concentrado, agua y etanol (proporción: 1:3:4). Nunca lavarlas con mezcla sulfocrómica y evitar ácidos o álcalis concentrados.

7. Una buena práctica es llenar las cubetas con agua y medir la absorbancia contra blanco de aire (cubeta vacía) en el rango de longitud de onda utili-zado. La absorbancia debe ser cero.

Sistema de detección y registro

El tubo fotomultiplicador es lo más comúnmente empleado para medir la intensidad de la luz en las regiones visibles y ultravioleta del espectro. Sin embargo, los equipos modernos utilizan fotodiodos.

El tubo fotomultiplicador tiene en su cátodo un metal que es sensible a la luz. Al incidir los fotones de luz, emiten electrones en proporción a la intensidad de la energía radiante absorbida. Los electrones producidos en esta primera etapa van a una segunda superficie, donde por cada electrón se producen entre 4 y 6 electrones. Cada uno de estos, en una tercera etapa, genera otros 4 o 6 electrones. Se produce una cascada que tiene una amplificación de un millón.

Los tubos fotomultiplicadores tienen una rápida respuesta y son muy sensiti-vos. Por esta última razón es que la luz parásita puede afectar, en gran medida, las mediciones en la muestra.

La luz parásita es la radiación de otras longitudes de onda, diferentes a la que debe transmitir el monocromador, que pueden llegar al sistema de detección del equipo.

Un mococromador perfecto debe transmitir luz de una longitud de onda bien definida, pero en la práctica se produce dispersión y difracción de la luz en su interior, lo que introduce otras longitudes de onda en el rayo emergente. También puede existir luz no deseada (aunque algunos autores no la consideran dentro del concepto de luz parásita) por la contribución de entrada de luz del exterior al compartimiento de las cubetas y de la misma muestra cuando se presenta un fenómeno de fluorescencia en esta. La luz producida como consecuencia de la fluorescencia puede incrementar la señal en el detector y causar una aparente disminución de la absorbancia.


Finalmente, la energía eléctrica producida por el detector se convierte, mediante algún sistema de registro, en una señal que se observa en una escala graduada o digital.

Errores fotométricosLos errores fotométricos se dividen en dos grandes grupos y en ambos casos

pueden ocurrir desviaciones de la ley de Lambert-Beer: los relacionados con el instrumento y los que lo están con la muestra.

Errores relacionados con el instrumento

Algunos errores instrumentales son intrascendentales en el trabajo habitual porque quedan anulados al utilizar las curvas de calibración. Los errores, además de la ya mencionada luz parásita, pueden incluir:

1. Falta de paralelismo de los rayos de luz incidentes sobre la cubeta.2. No adecuada radiación monocromática o gran ancho de banda.3. Reflexiones de la luz en la superficie de las cubetas o en cualquier punto

del paso óptico.4. Factores que impiden absorción de radiación por la muestra (polvo, marcas

de rayas en las cubetas o lentes, etc.).

En la mayoría de las técnicas espectrofotométricas, como se utilizan diso-luciones problemas que se comparan con patrones, los errores menores en la calibración de la longitud de onda, en el ancho de la banda espectral (se define el ancho de banda como el ancho en nanómetro de una línea imaginaria que se traza a la mitad de la curva espectral de transmitancia), la presencia de luz parásita y los otros factores mencionados no contribuyen a grandes errores.

Sin embargo, cuando los cálculos están basados en el empleo de coeficientes de absorptividad molar, el espectrofotómetro debe chequearse más rigurosa-mente. De todas maneras, el chequeo periódico del espectrofotómetro, aunque sea utilizado para el trabajo de rutina de un laboratorio, ofrece confiabilidad y aseguramiento de la calidad de los resultados.

Para chequear la longitud de onda del instrumento han sido muy utilizados los filtros de didimio (didymium). Si se realiza una curva de porcentaje de ra-diación trasmitida (T) contra longitud de onda, estos filtros muestran un pico bien definido, con un mínimo de porcentaje de radiación trasmitida a 530 nm contra blanco de aire (esta luz transmitida debe ser verde).

Por lo general, el ancho de banda del espectrofotómetro es declarado por el fabricante y ese valor es aceptado sin verificación; existen, como una opción, filtros de interferencia para verificar el ancho de banda.


En cuanto a la luz parásita, el mayor efecto de esta es un error de absor-bancia, particularmente en el rango superior de absorbancia del instrumento. La mayoría de los espectrofotómetros están equipados con filtros para eliminar la luz parásita. Una disolución acuosa de 50 g/L de nitrito de sodio debe dar 0 % de radiación trasmitida cuando se lee contra blanco de agua en el rango de 300 a 385 nm.

Para que un espectrofotómetro ofrezca mediciones exactas de absorbancia, debe responder a los cambios en la intensidad de la luz transmitida de manera lineal. Esto significa que debe existir una relación lineal entre la luz absorbida y la lectura del equipo; para este propósito se han utilizado los filtros de didimio (aproximadamente, tienen una absorbancia de 0,09 a 550 nm) en un procedi-miento que se describe a continuación:

1. Seleccione la longitud de onda de 550 nm, cierre el compartimiento de las cubetas y fije en 0 el valor de la absorbancia (A).

2. Abra el compartimiento de las cubetas, coloque el filtro de didimio, cierre y lea la absorbancia.

3. Retire el filtro y coloque el valor de la absorbancia en 0,25.4. Ponga de nuevo el filtro y lea la absorbancia.5. Retire el filtro y coloque, sucesivamente, los valores de la absorbancia en

0,50; 0,75; 1,00; 1,25; etc., con el compartimiento vacío, y lea la absorbancia como antes, después de colocar el filtro.

6. Calcule el valor de la diferencia de la absorbancia (delta A) que muestra el filtro para cada incremento de la absorbancia; el valor de la diferencia de la absorbancia debe mantenerse constante.

Para evaluar la exactitud de las mediciones fotométricas se recomienda utilizar disoluciones de bicromato de potasio (K2Cr2O7). El empleo de estas disoluciones es de gran utilidad porque brindan información acerca de la calibración de la longitud de onda, de la linealidad, del paso de luz de la cubeta y de la ausencia de luz parásita en el rango ultravioleta.

El bicromato de potasio de calidad Reactivo de Análisis (AR: siglas del in-glés) se seca a 110 0C durante 1 h en una estufa. Se preparan dos disoluciones en 0,005 mol/L de ácido sulfúrico:

Disolución I: 0,0500 g/L para medir absorbancia en el rango de 0,2 a 0,7.Disolución II: 0,1000 g/L para medir absorbancia en el rango de 0,4 a 1,4.

Las mediciones deben ser hechas con cubetas de 1,0 cm de paso de luz y con la temperatura controlada entre 15 y 25 0C, utilizando como blanco una disolución de 0,005 mol/L de ácido sulfúrico.

En la tabla 5.2 se muestran los valores esperados, máximos y mínimos. Los valores de la disolución I son solo para espectrofotómetros con ancho de banda de 6 nm o menos.


Errores relacionados con la muestra

En relación con la muestra, existen cinco causas que pueden conducir a errores:

1. Temperatura.2. Tiempo.3. Enturbiamiento.4. Fluorescencia.5. Químicas.

Efecto de la temperatura

Las variaciones en la temperatura pueden afectar las mediciones fotométricas, ya sea cambiando el volumen del disolvente en 0,1 a 0,2 % por cada grado centígrado, o produciendo alteraciones fisicoquímicas.

Tiempo en realizar las mediciones

Muchas de las disoluciones que se miden espectrofotométricamente en bio-química clínica tienen propiedades colorimétricas inestables. La intensidad del color puede aumentar o disminuir, o también puede variar la zona de absorción máxima con el tiempo.

Enturbiamiento

Es una de las causas de error más frecuente. La presencia de partículas en suspensión, habitualmente de naturaleza coloidal, da lugar a un aumento de absorbancia, a causa de absorción verdadera y dispersión de la radiación elec-tromagnética. En ocasiones es posible eliminar el enturbiamiento mediante centrifugación, o filtrando a través de papeles de filtro con elevada capacidad de retención.

Tabla 5.2. Valores de absorbancia para las disoluciones de bicromato de potasio

Longitud de onda (nm) Disolución I Disolución II

235 (mín) 0,626 ± 0,009 1,251 ± 0,019 257 (máx) 0,727 ± 0,007 1,454 ± 0,015 313 (mín) 0,244 ± 0,004 0,488 ± 0,007 350 (máx) 0,536 ± 0,005 1,071 ± 0,011


Flourescencia

Si en la muestra existe alguna sustancia fluorescente, al incidir la radiación electromagnética de determinada longitud de onda se produce una emisión fluorescente que se suma a la radiación transmitida a través de la muestra. Sin embargo, el error por la fluorescencia es casi siempre pequeño, porque la fluorescencia se transmite con igual intensidad en todas direcciones y solo una parte de la energía fluorescente alcanza al detector.

Causas químicas

Hay que tener en cuenta que pueden ocurrir:1. Interacciones del absorbente consigo mismo.2. Interacción de la sustancia absorbente con el disolvente (por ejemplo, el yoduro

en un disolvente apolar, tal como el tetracloruro de carbono, da lugar a un color púrpura, mientras que disuelto en un disolvente polar, el color es marrón).

3. Cambios en el índice de refracción de la disolución con la concentración.4. Desplazamientos del equilibrio químico que impliquen a los absorbentes

(por ejemplo, un cambio de pH puede modificar a los absorbentes, si estos son ácidos o bases débiles).

Cuidado, mantenimiento y limpieza de los equiposSe recomienda observar una serie de reglas para mantener estos equipos en buen

estado técnico, con la finalidad de que los resultados sean confiables. Estas reglas son:1. En el área de instalación dejar espacio alrededor del equipo para que los

cables no estén torcidos y, además, para que tenga buena ventilación.2. Verificar que no hay equipos cercanos que transmitan vibraciones (por

ejemplo, centrífugas).3. Comprobar que el local está libre de polvo, alta humedad o calor. 4. Evitar radiación solar directa.5. No instalar el equipo donde haya campos magnéticos o radiaciones

electromagnéticas intensas.6. En la zona de instalación evitar presencia de gases y sustancias corrosivas.7. Si se derraman líquidos dentro del equipo, este debe apagarse y desconec-

tarse de la fuente eléctrica. Utilizar una jeringuilla para aspirar el líquido o muestra derramado y secar la zona con algodón medicinal.

8. Limpiar la ventana de la fotocelda con un paño de tela bien suave y limpia.9. Limpiar el exterior del instrumento, la pantalla, los botones del panel de

control, con un paño suave humedecido en agua destilada.10. Las cubetas de cuarzo se deben limpiar con una disolución de NaOH a 0,1 M, o

una disolución de HCl a 0,1 M, y después enjuagar las cubetas varias veces con agua destilada. Algunos fabricantes ofertan detergentes especiales.

Fotometría de llama

La fotometría de llama es una técnica basada en la absorción o emisión de radiaciones electromagnéticas, con la particularidad de que la llama hace de cubeta para el analito que se quiere determinar.

Existen dos variantes de la fotometría de llama: la de emisión y la de absor-ción. No se puede afirmar que sean técnicas que se utilicen a diario en todos los laboratorios, pero en particular, el empleo de la fotometría de emisión para determinar Na+ y Cl- en suero o plasma es aun utilizada en algunos laboratorios clínicos.

Fundamento teóricoLa fotometría de llama puede subdividirse en dos grandes categorías: emi-

sión atómica y absorción atómica. En cualquier caso, el papel de la llama es convertir el elemento químico que se quiere medir en un vapor de átomos libres.

El fundamento físico consiste en la transformación reversible entre un estado base (A) y uno excitado (A*) como consecuencia de la absorción o emisión de energía (h) y saltos de electrones.

A + hυ → A* → A + hυDonde: H: constante de Planck; υ: frecuencia de la luz.

Fotometría de llama de emisión atómicaEn la emisión atómica, los átomos de muchos elementos metálicos (como

el litio, sodio y potasio) son excitados por efecto del intenso calor de la llama

Capítulo 6

Capítulo 6. Fotometría de llama 79

y después pueden emitir esta energía como radiaciones electromagnéticas de longitudes de onda características.

De manera más precisa puede afirmarse que una cantidad específica de energía o cuanto (quantum) de energía (hυ) térmica es absorbida por un orbital electrónico y, como los electrones pasan a un estado inestable con alto contenido energético, liberan el exceso de energía.

Si la energía es disipada como luz, consiste en radiación electromagnética de una longitud de onda característica cuando regresa al estado base.

En ocasiones, como los saltos electrónicos pueden tener lugar en diversos orbitales porque son absorbidos varios cuantos de energía, la luz emitida puede tener varias longitudes de onda y estas líneas espectrales son características de cada elemento. Así, por ejemplo, el sodio emite a 589 nm, pero tiene otras emisiones de luz menos intensas.

La longitud de onda que se utiliza en la medición depende de la selección de una línea espectral de suficiente intensidad para tener buena sensibilidad ana-lítica en el equipo y que no tenga interferencias con otros elementos presentes en la muestra.

En los metales alcalinos, como el sodio, solo de 1 a 5 % de los átomos son excitados por la llama; sin embargo, es suficiente este pequeño porcentaje para la mayoría de las determinaciones analíticas en fluidos biológicos.

En general, los metales alcalinos son fácilmente excitables en la llama de un quemador ordinario de laboratorio; de este modo, el litio produce una llama roja, el sodio amarilla, el potasio violeta, el rubidio roja y el magnesio azul. Estos colores son característicos de los átomos metálicos presentes como cationes en la disolución. Otros elementos, como el calcio, son poco excitados en una llama ordinaria.

Bajo condiciones controladas y constantes, la intensidad de la luz emitida a una longitud de onda característica es directamente proporcional a la concen-tración de la sustancia de interés en la muestra.

Componentes de un fotómetro de llamaEn la figura 6.1 se muestra un diagrama esquemático de las partes básicas

de un fotómetro de llama. Para el funcionamiento del quemador se requiere un cilindro de gas y un regulador de presión; asimismo, un atomizador es nece-sario para esparcir la muestra en la llama. El monocromador y las hendiduras (slit) de entrada y de salida son similares a los de los espectrofotómetros. Aquí la fuente de luz de los espectrofotómetros es sustituida por la combinación atomizador-llama del quemador, pues lo que se mide, como ya se señaló, es la emisión de la luz.


Se han propuesto varias combinaciones de gases y oxidantes para utilizar en fotometría de llama, como se muestra a continuación.

Mezcla de gases Temperatura 0C

Gas natural-aire 1 840 Propano-aire 1 925 Hidrógeno-aire 2 115 Acetileno-aire 2 250 Hidrógeno-oxígeno 2 700 Gas natural-oxígeno 2 800 Propano-oxígeno 2 850 Acetileno-oxígeno 3 110

La elección de la llama y, por lo tanto, la combinación de gases, depende del elemento que se quiera determinar; para sodio y potasio, por ejemplo, la llama originada por la mezcla propano-aire comprimido es adecuada.

El atomizador y la llama son componentes críticos en un fotómetro de llama. El primero posibilita extraer la muestra con el aspirador y convertirla en un fino vapor que entra a la llama; esto se realiza al pasar un gas a alta velocidad por la salida superior de un fino capilar, la parte inferior del cual está sumergido en la muestra.

La variable más importante en la llama es la temperatura. Es muy importante la calibración frecuente de los fotómetros de llama para evitar errores del sis-tema de detección y registro. Siempre hay que tener en cuenta que se necesita un período de calentamiento del equipo para alcanzar un equilibrio térmico de la llama y de la cámara del atomizador; es conveniente aspirar agua y las disoluciones patrones antes de empezar a realizar las determinaciones en las muestras problemas.

En algunos instrumentos, las mediciones se realizaban pasando disoluciones patrones o estándares de sodio y potasio, por ejemplo, y comparando estos resultados con las lecturas de las muestras problemas. Este método de lectura directa puede acarrear varias dificultades, como son:

1. Pequeñas fluctuaciones en la presión de los gases pueden producir respuestas inestables del instrumento.

Fig. 6.1. Esquema de un fotómetro de llama.


2. Deben realizarse análisis separados para sodio y potasio.3. La señal del potasio se incrementa por la presencia de sodio en la muestra.

Este efecto es debido a la transferencia de energía de un átomo excitado de sodio a uno de potasio, lo que trae como consecuencia que se exciten más átomos de potasio.

Por las razones anteriores se ha ideado un método nombrado estándar inter-no, en el cual se añade litio o cesio a todos los estándares, blancos y muestras problemas en la misma concentración. Como el litio está ausente de los fluidos biológicos y tiene una intensidad de emisión alta, a diferente longitud de onda del sodio y del potasio, el fotómetro de llama realiza una comparación de la emisión de estos con la emisión del litio. Los efectos de pequeñas variaciones en la velocidad de atomización, estabilidad de la llama y viscosidad de la disolución son minimizados, midiendo los cocientes de emisión sodio/litio y sodio/potasio. También el litio tiene el efecto de minimizar la excitación producida por sodio sobre el potasio. Los efectos de viscosidad se pueden disminuir por diluciones de las muestras.

Aspectos técnicos generalesEntre los aspectos técnicos generales se destacan los que se relacionan a

continuación.

Reactivos

Los patrones y las demás disoluciones deben prepararse correctamente en cada determinación y conservar los reactivos en frascos de polietileno. Es muy importante controlar la pureza del agua desionizada utilizada midiendo su conductividad. Resulta necesario mezclar bien las disoluciones antes de cada determinación.

Dilución de las muestras problemas

Debe utilizarse el mismo disolvente que en los patrones. El factor de dilución de las muestras se determina teniendo en cuenta:

1. Cantidad total de sólidos presentes en la muestra.2. Sensibilidad del instrumento.3. Linealidad entre la señal y la concentración.4. Exactitud y precisión obtenidas.5. Cantidad de muestra que se ha de utilizar.


Para detectar interferencias se pueden efectuar varias diluciones (1:2:4, etc.) del problema y del patrón, y registrar las lecturas de ambos para estas diferentes diluciones.

Es necesario determinar el valor del cociente señal del problema/señal del patrón. En ausencia de interferencias, esta proporción debe mantenerse constante para las distintas diluciones.

Utilización de patrones o estándares

Utilizar como mínimo tres patrones (mejor cinco) en el rango de concen-traciones de las muestras problema diluidas. Leer los patrones antes y después de leer las muestras problemas. Es posible calcular el factor de calibración, si existe linealidad.

Causas de errores

Los errores más frecuentes se originan, habitualmente, por:1. No conseguir presiones y flujos adecuados de los gases, y obstrucciones

en el atomizador.2. Diferencias de disolventes, entre el patrón y la disolución problema.3. Interferencias químicas.4. Interferencias espectrales entre distintos elementos.5. Interferencia de ionización. Se producen porque existe un equilibrio en

la llama entre átomos, iones y electrones (M0 → M+ + e). La lectura en el equipo es proporcional al número de átomos libres y, como se aprecia, cualquier incremento de electrones libres aumenta la cantidad de átomos libres.

Espectrofotometría de absorción atómicaLa espectrofotometría de absorción atómica (Fig. 6.2), por su principio físico,

es en cierto sentido el inverso de la fotometría de llama de emisión. En este caso, el elemento químico no es excitado en la llama, sino que es solamente disociado de sus enlaces químicos y se encuentra en el estado base o no excitado. En este estado, el átomo puede absorber energía electromagnética a una longitud de onda muy estrecha y específica para cada elemento y en dependencia del número de átomos en la llama, será mayor o menor la cantidad de energía absorbida y, por lo tanto, la luz que sale de la llama sufrirá una atenuación más o menos intensa.

En la figura 6.3 se muestra un esquema de las partes principales de los equipos de espectrofotometría de absorción atómica. El proceso es muy parecido a la fotometría convencional, pero la llama sustituye a la cubeta.


Fig. 6.2. Espectrofotómetro de absorción atómica.Tomado de: http://celeq.ucr.ac.cr/equipos © Universidad de Costa Rica 2015.

Fig. 6.3. Componentes de un espectrofotómetro de absorción atómica.

Para producir la luz de longitud de onda que puede ser absorbida por el ele-mento en la llama se utiliza una lámpara catódica, hecha del mismo elemento que se quiere medir en la llama; por ejemplo, si el cátodo es hecho de sodio, una luz de longitud de onda de 589 nm es emitida por la lámpara.

En general, los métodos de espectrofotometría de absorción atómica son 100 veces más sensibles que los de la fotometría de emisión; estas técnicas se utilizan para cuantificar elementos que se encuentran en muy bajas concentra-ciones en las muestras problemas, como son los microelementos en suero u otros materiales biológicos, en agua y en alimentos.

Las causas de error y los aspectos técnicos generales son muy similares a los ya referidos para las técnicas de fotometría de llama de emisión.

http://celeq.ucr.ac.cr/equipos

Enzimología clínica

La enzimología, es la parte de la bioquímica que se ocupa del estudio de las enzimas, se explica en los libros de esta especialidad con la finalidad de entender mejor los procesos metabólicos del cuerpo humano y de otros organismos vivos.

Los conocimientos alcanzados en esta disciplina científica han sido muy ventajosos para el desarrollo tecnológico de nuevas técnicas bioquímicas, en el diagnóstico de enfermedades y, en cierta medida, en el tratamiento de pro-blemas clínicos.

El nombre enzima fue acuñado en 1878 por Friedrich Wilhelm Kuhne (del griego en, que significa adentro y zima, levadura) en un esfuerzo por enfatizar que había algo en las levaduras que catalizaba el proceso de fermentación al-cohólica. No podía imaginar Kuhne que las enzimas no solo están “dentro” de las levaduras, sino que también se encuentran en el ser humano y desempeñan el papel de biocatalizadores en el interior de las células; salvo excepciones, como las enzimas digestivas (pepsina, tripsina y quimotripsina) que actúan extracelularmente en este caso en la luz del tubo digestivo.

En la actualidad, alrededor de 2 000 enzimas han sido purificadas y carac-terizadas, al menos en cierto grado; estas se agrupan en seis clases por el tipo de reacción que catalizan:

1. Oxidorreductasas.2. Transferasas.3. Hidrolasas.4. Liasas.5. Isomerasas.6. Ligasas.

Aunque desde hace algunos años se conoce que existen ácidos ribonucleicos (ARN) con actividad catalítica, cuando se piensa en catalizador biológico, la mayoría de los autores se refiere a las proteínas enzimáticas.

Capítulo 7

Capítulo 7. Enzimología clínica 85

Fundamento teóricoPara que se produzcan las reacciones químicas, donde una sustancia A

(reactante) se transforma en otra B (producto), se requieren choques moleculares del reactante con cierta energía y orientación para obtener el producto.

La energía necesaria para que se produzcan choques efectivos se denomina energía de activación, y tiene determinado valor para cada reacción en parti-cular. Cuando en la reacción participa una enzima como catalizador, el valor de energía de activación cambia y se torna menor, pues la enzima, mediante algún mecanismo (por ejemplo, favoreciendo una mayor proximidad entre las moléculas del reactante), determina que la reacción transcurra de manera más rápida. La reacción es acelerada sin variar la constante de equilibrio:

K = [B]/[A]

Donde: K: constante de equilibrio; B: producto; A: reactante.

Al intervenir la enzima (E), al reactante (A) se le denomina sustrato (S), y a B, producto de la reacción (P).

Con la presencia de las enzimas esta reacción transcurre en dos etapas: de unión (1) y de transformación (2):

La etapa 1 se debe a la presencia del eje covalente de la proteína que toma determinada configuración espacial y que permite la adaptación, “como un guante a la mano”, del sustrato; pero esta unión del sustrato con la enzima se realiza por una parte relativamente pequeña de la proteína enzimática, ubicada casi siempre en la superficie, que es conocida por el nombre de centro activo. También intervienen, o facilitan la unión enzima-sustrato, la presencia de grupos apolares en las cadenas laterales de los aminoácidos de la proteína enzimática, los cuales crean un ambiente apolar; así como otros grupos químicos deno-minados de unión, que establecen con el sustrato algunas de las interacciones débiles, como puentes de hidrógeno, interacciones electrostáticas, hidrofóbicas y de van der Waals.

La etapa 2, de transformación o de catálisis, propiamente dicha, la llevan a cabo grupos químicos localizados en algunas cadenas laterales de los aminoáci-dos que conforman el centro activo; como por ejemplo (con mucha frecuencia) el anillo imidazol del aminoácido histidina o el grupo hidroxilo de la serina.


La velocidad en que transcurre la reacción se puede expresar por:

V = -d[S]/dto por:

V = d[P]/dt

La velocidad debe medirse en condiciones iniciales de la reacción (V0), cuando solo ha sido transformado alrededor de 10 % del sustrato.

En las reacciones catalizadas por enzimas, es muy común que también in-tervengan sustancias de naturaleza no proteica, orgánica o inorgánica, denomi-nadas cofactores. Estas actúan estabilizando la proteína enzimática; en algunas ocasiones facilitan las uniones entre enzima y sustrato y, en otras, transfieren grupos químicos.

Es importante recordar que se han estudiado exhaustivamente varios factores cinéticos que pueden afectar la velocidad de estas reacciones, como son:

1. Temperatura. 2. El pH. 3. Presencia de actividades o inhibidores en el medio. 4. Concentración de enzima, de sustrato y de cofactores.

Al evaluar el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la reacción se han descrito dos constantes:

1. Constante de Michaelis (Km) relacionada con la etapa 1 de unión, que es una medida bajo ciertas condiciones de la afinidad de la enzima por el sustrato.

2. Constante denominada velocidad máxima (Vmáx.), que es el valor límite de velocidad que se alcanza cuando la enzima está totalmente saturada por el sustrato.

La velocidad de las reacciones enzimáticas, o actividad enzimática, puede ser determinada considerando el cambio en el tiempo de alguno de estos factores:

1. Desaparición del sustrato.2. Formación del producto.3. Variación de la concentración del cofactor.

Las determinaciones se pueden realizar mediante dos métodos: de punto final o cinético.

En el primer caso, si se tratara de un producto que reacciona con determinado cromógeno, es posible medir la absorción de luz de la sustancia mediante un espectrofotómetro después de transcurrido cierto tiempo. Desde luego, hay que detener la reacción de alguna manera, lo que en muchas ocasiones se realiza con un simple cambio de pH de la disolución donde se está llevando a cabo la reacción.


En el segundo método (cinético) se miden los cambios de concentración del sustrato, producto o cofactor, en el tiempo. Por ejemplo para determinar la actividad de la deshidrogenasa (LDH) es posible basarse en el hecho de que la coenzima reducida (NADH + H+) absorbe luz a 340 nm, lo cual no sucede con la forma oxidada NAD+.

Para medir la actividad se coloca una disolución de lactato y NAD+ en una cubeta y se registra la absorbancia a una longitud de onda constante de 340 nm. La reacción no catalizada transcurre muy lentamente y solo después de agregar la enzima se puede observar un aumento en la formación de la coenzima redu-cida, con lo que se incrementa la absorbancia (A).

Como: A = log (I0/I) = εbcDonde:

ε: coeficiente de absortividad molar; b: longitud del paso de luz a través de la disolución; c: concentración.

También se puede plantear que el cambio de la absorbancia es proporcional al cambio de concentración, es decir:

δA/bε = δc

y dividiendo ambos términos de la igualdad por el tiempo (t) queda:

δA/bεt = δc/t Donde: δc/t: velocidad de la reacción o actividad enzimática.

Solo queda introducir en esa expresión el factor de dilución de la muestra, que se calcula a partir de: Vt: volumen total en la cubeta y Vm: volumen de la muestra en la cubeta.

La expresión final sería:

Actividad enzimática (μmol/min) = δAVt/bεtVm Para que una determinación enzimática sea válida es necesario realizarla en

la fase lineal, donde el único factor limitante es la concentración de la propia enzima; además, es preciso mantener las condiciones de reacción óptimas, en cuanto a:

1. Concentración de sustrato. 2. Presencia de cofactores. 3. El pH. 4. Temperatura. 5. Presencia de activadores.


Es usual que se trabaje con una concentración de sustrato superior al valor de la constante de Michaelis. Así, en un ensayo, el límite de linealidad es la actividad enzimática más alta que se puede medir con exactitud. Por encima de ese valor es necesario diluir el suero y multiplicar el resultado por el valor de esa dilución.

Funciones de las enzimas en el diagnósticoEn el diagnóstico médico, las enzimas pueden tener dos funciones muy im-

portantes: como reactivos químicos y como índices de enfermedad.

Enzimas como reactivos químicos

El desempeño de algunas enzimas como reactivos es trascendental y consiste en poder cuantificar, en alguna muestra biológica, determinado metabolito propio del organismo humano o, en general, cualquier compuesto químico.

La enzima ureasa es útil para determinar urea en plasma, ya que cataliza la reacción:

La reacción anterior puede ser seguida mediante un espectrofotómetro, equipo muy usual en los laboratorios de los hospitales y clínicas modernas de todos los países.

La medición con este equipo se basa en que el (NADH + H+), o sea, la forma reducida de este cofactor, a medida que la reacción transcurre se va consumiendo y transformando en la forma oxidada (NAD+), y esta transformación es regis-trada por una disminución de un pico de absorción de luz ultravioleta a 340 nm, que tiene la forma reducida. De esta manera, si las dos reacciones anteriores (acopladas por un intermediario común, el NH3) ocurren simultáneamente, se puede cuantificar la urea en cualquier muestra biológica.

Para medir el amoníaco liberado se utiliza otra enzima: la glutámico deshi-drogenasa NAD+ dependiente (GDH), la cual cataliza la reacción:


Otro ejemplo se puede ilustrar para la determinación de glucosa sanguínea; esta se lleva a cabo mediante la oxidación del colorante O-dianisidina por el oxígeno liberado al final de las dos reacciones acopladas siguientes:

En algunos casos particulares estas enzimas empleadas como reactivos son fijadas, o inmovilizadas, a un soporte específico, como ocurre con algunos medios diagnósticos, o diagnosticadores, empleados en las consultas médicas para hacer determinaciones rápidas de colesterol con muy pequeños volúmenes de plasma (10 µL).

El H2O2 que se forma en la primera reacción interviene en una segunda reacción, lo que produce un cambio de color en un compuesto químico:

H2O2 + Leuco-colorante → Color-colorante

Otro ejemplo del empleo de las enzimas como reactivos es el caso de los sistemas ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), donde se hace muy evidente lo mucho que se ha beneficiado la bioquímica clínica del enlace entre la enzimología y la inmunología (Fig. 7.1).

Los anticuerpos (Ac) específicos a un antígeno (Ag) se acoplan con una enzima como la peroxidasa para generar un ensayo muy específico y sensitivo; después de la unión antígeno-anticuerpo, la peroxidasa se emplea para generar un producto coloreado que se puede medir y cuya concentración depende de la cantidad de antígeno presente en la muestra.

La amplificación notable de la señal se produce por la naturaleza catalítica de las enzimas; estas se unen covalentemente con las moléculas del anticuerpo; de tal manera tiene lugar una reacción enzimática, cuya formación de producto será proporcional a la reacción antígeno-anticuerpo que se ha producido pre-viamente en el sistema.

Un ejemplo de los métodos ELISA se aprecia en la figura 7.2. El antígeno que se desea cuantificar en determinada muestra biológica (por ejemplo: una proteína del virus de la hepatitis B) se fija al soporte sólido y a continuación se añade un anticuerpo de conejo específico para ese antígeno; después, un anticuerpo de


Fig. 7.1. Realizando la lectura fotométrica de una técnica de ELISA.

Fig. 7.2. Esquema de un método ELISA.

carnero unido a la peroxidasa se une al anticuerpo de conejo ya combinado con las proteínas del virus. Por último, al añadir el sustrato de la enzima se produce una reacción coloreada que será proporcional a la cantidad de antígeno fijada a la placa de polistireno. En la descripción de esta técnica se han omitido algunos detalles y pasos importantes en aras de explicar el principio general.


En otros casos (Fig. 7.3), el tipo ELISA se conoce como sandwich, ya que para cuantificar un antígeno (como por ejemplo, la enzima enolasa neuroespecífica), primero se recubre una placa de polistireno con los anticuerpos específicos para esa enzima, a continuación se añade el suero del paciente que contiene enolasa y por último, como “tapa superior del sandwich”, anticuerpos específicos contra enolasa, pero unidos o conjugados con la enzima peroxidasa (también se utiliza la fosfatasa alcalina). Al añadir el sustrato se produce la reacción de color.

Fig. 7.3. Esquema de un método ELISA tipo sandwich.

Otra aplicación práctica muy novedosa, donde se utilizan las enzimas como reactivos, es la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction). Con esta técnica, a partir de unas pocas moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) y empleando una polimerasa que puede soportar altas temperaturas (hasta 72 0C), es posible obtener muchas copias de ese ADN específico. Una vez que el ADN se ha amplificado y se obtiene un número de copias relativamente alto, se emplean para identificarlo técnicas de electroforesis en geles de agarosa, y otros métodos. Mediante la reacción en cadena de la polimerasa es posible detectar microorganismos difí-ciles de identificar por métodos inmunológicos, por ejemplo, el virus del sida.

La reacción en cadena de la polimerasa también se ha empleado en el diag-nóstico de enfermedades genéticas, como la anemia por hematíes falciforme (sicklemia) y la fibrosis quística. Otras aplicaciones de esta técnica se relacio-nan con el diagnóstico de algunos tipos de cáncer, con casos de trasplantes de órganos y con la medicina forense.

Enzimas como índices de enfermedad

En el plasma, las enzimas pueden ser de dos tipos:1. Las que son secretadas por algunos órganos y tienen altas concentraciones

en ese fluido, como la trombina (secretada en forma de zimógeno por el hígado) y la lipasa de lipoproteína (tejido adiposo).


2. Las que, normalmente tienen muy baja concentración, ya que son enzimas intracelulares distribuidas en diferentes tejidos.

Las fuentes de las enzimas séricas de este último tipo (Fig. 7.4), en condi-ciones fisiológicas son:

1. Renovación celular. 2. Secreción tisular.3. Actividad muscular.

Fig. 7.4. Fuentes de las enzimas en suero.

Renovación celular

En la especie humana es muy importante, si se tiene en cuenta que cerca de 50 ∙ 106 células mueren cada segundo. Al morir estas células, gran parte de sus componentes pasan al espacio extracelular, donde permanecen un mayor o menor tiempo.

Las células que de forma más directa contribuyen a la liberación de enzimas hacia el plasma, son las que más íntimamente están en contacto con este fluido; por supuesto, que en primer lugar están los eritrocitos, las células del endotelio vascular y las de los órganos hígado y bazo, ya que estos, además de estar muy vascularizados, tienen una estructura anatómica que asegura un estrecho contacto entre sus respectivos parénquimas y la sangre circulante.


Secreción tisular

Es la que permite que algunas enzimas, como la trombina (producida en el hígado en forma de zimógeno inactivo), sean secretadas a la sangre en cantidades apreciables, determinando una alta concentración de estas en condiciones normales.

Actividad muscular

Como los músculos representan una parte importante de todo el organismo humano, algunas enzimas, como la creatina quinasa (CK), se encuentran en el plasma derivadas de la actividad metabólica de estos órganos. Ahora bien, en las enfermedades tisulares y de órganos, las enzimas específicas de estos son muy importantes, ya que pueden pasar al plasma en cantidades apreciables.

Al producirse una lesión en un tejido determinado, primero se altera el me-tabolismo energético y después la permeabilidad celular, con lo que se puede llegar, incluso, a una lesión irreversible con muerte celular y salida de las enzimas desde el interior de la célula hacia el espacio extracelular. Cuanto mayor sea el gradiente de concentración de la enzima y menor su masa molecular, más fácil atraviesan la membrana plasmática.

En un momento determinado, la concentración de este tipo de enzimas en el suero depende de su liberación hacia este fluido y de la velocidad de su degradación o aclaramiento. Esto último depende, a su vez, de la estabilidad de la enzima, de su eliminación por el riñón y de la susceptibilidad al sistema retículo endotelial. La vida media de las enzimas en el suero es de 2 a 4 días, tiempo menor que el de otras proteínas.

Por lo tanto, lo que permite que una enzima en particular sea utilizada para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de una enfermedad, es la gran diferencia o gradiente de su actividad, entre el interior celular y el suero, además de su patrón de libración y eliminación.

En la tabla 7.1 se puede apreciar el notable gradiente de actividad que existe para algunas enzimas de diferentes órganos con respecto al suero.

Hay enzimas específicas de determinados órganos, como el alcohol deshidro-genasa del hígado y la fosfatasa ácida de la próstata. Aunque todas las células del organismo tienen la misma dotación de genes y algunos genes son expre-sados en todas las células, otros solo se expresan en un tejido en particular. Sin embargo, lo más común es que las mismas enzimas se encuentren en órganos muy diferentes, aunque la proporción en cada uno de estos puede variar.

En la tabla 7.1 se observa que la transaminasa glutámico pirúvica o alanina ami-notransferasa tiene mayor actividad en el tejido hepático que en el músculo cardiaco, mientras que con la transaminasa glutámico oxalacética o aspartato aminotransferasa ocurre exactamente lo inverso. Por lo tanto, el cociente entre las dos enzimas refleja cuál de los dos órganos (corazón o hígado) está afectado en mayor grado.


La localización tisular específica de algunas isoenzimas ha elevado el papel diagnóstico de las enzimas en la clínica. No resulta ocioso recordar que las isoenzimas son variantes de una enzima con expresión genética diferente de un tejido a otro. La diferencia entre una isoenzima y otra consiste solo en la diferencia de algunos aminoácidos en su estructura primaria, los cuales pueden influir de manera sutil modificando parcialmente la estructura tridimensional, sus características fisicoquímicas y cinéticas, y la función biológica algo diferente de cada isoenzima. De tal modo, dos isoenzimas distintas catalizan la misma reacción química, pero pueden hacerlo con afinidad diferente por el sustrato y otorgarle particularidades metabólicas a los tejidos donde se expresan.

Por ejemplo, existen cinco isoenzimas de la lacticodeshidrogenasa (LDH) que se originan por la asociación de cuatro cadenas polipeptídicas, que pueden ser de dos tipos: M y H.

Así, la LDH1 está formada por cuatro cadenas polipeptídicas (HHHH) y distribuida, preferentemente, en el miocardio y en el interior de los glóbulos rojos o eritrocitos; la LDH2, con tres cadenas H y una cadena M con la misma distribución tisular; la LDH3, que tiene en su composición dos cadenas M y dos H, está localizada en el cerebro y en el riñón; la LDH4, con una cadena H y tres MMM, menos estudiada; la LDH5 también tiene cuatro cadenas polipep-tídicas, todas MMMM. Esta isoenzima se encuentra localizada en el hígado y en el músculo esquelético.

En caso de existir un daño tisular que afecte de manera específica a algunos de los tejidos u órganos mencionados, es posible detectar en sangre periférica, usualmente mediante técnicas electroforéticas, la isoenzima característica.

Todas las isoenzimas de la lacticodeshidrogenasa catalizan la misma reacción:

Tabla 7.1. Actividad relativa de las enzimas en los tejidos en relación con el suero

Enzima Suero Eritrocitos Hígado Corazón Músculo esquelético

ASAT 1 15 7 000 8 000 5 000 (TGO) ALAT 1 - - 3 000 400 300(TGP) LDH 1 300 1 500 1 000 700CK 1 < 1 <10 10 000 50 000

Nota: ASAT: aspartato aminotransferasa; TGO: transaminasa glutámico oxalacética; ALAT: alanina aminotransferasa; TGP: transaminasa glutámico pirúvica; LDH: deshidrogenasa láctica; CK: creatina quinasa.


La determinación de la actividad enzimática puede llevarse a cabo mediante la medición de la absorbancia en un espectrofotómetro a 340 nm. Al formarse el NAD+ (forma oxidada) disminuye el valor de la absorbancia del NADH, como ya fue mencionado en este mismo capítulo.

Para poder cuantificar cada isoenzima en particular, es necesario realizar antes algún proceso de separación o aprovechar quizás alguna característica fisicoquímica de la isoenzima. En el caso particular de la lacticodeshidrogenasa, la separación mediante electroforesis es la más común, pero en otros casos, la resistencia a altas temperaturas o a determinada inhibición de una isoenzima en particular, puede permitir su fácil identificación con respecto a las demás.

El patrón de liberación de las enzimas de determinado órgano ha servido para conocer la evolución de algunas enfermedades, como por ejemplo, el infarto del miocardio. La enzima creatina quinasa complementa al electrocardiograma en el diagnóstico de la instalación de un infarto del miocardio, mientras que la lacticodeshidrogenasa es más útil en el seguimiento de los pacientes (Fig. 7.5).

Fig. 7.5. Patrón enzimático en el curso del infarto del miocardio.

En la tabla 7.2 se muestran los valores de sensibilidad y especificidad diagnóstica al comparar la creatina quinasa, la isoenzima CK-MB del músculo cardiaco y el electrocardiograma (ECG).

En algunos casos, la localización de las enzimas es importante para diferenciar el tipo de lesión de un órgano o la patogenia de un proceso. Por ejemplo, en caso de daño hepático celular (hepatitis viral), toxicidad a medicamentos, etc., se elevan, fundamentalmente, las enzimas localizadas en el citoplasma, como las aminotrans-ferasas: transaminasa glutámico oxalacética y transaminasa glutámico pirúvica.


Tabla 7.2. Valores de sensibilidad y especificidad de algunas pruebas diagnósticas en el infarto del miocardio

Examen Sensibilidad Especificidad (%) (%)

ECG 73 100CK 98 75CK-MB 98 97(determinada por electroforesis)

Tabla 7.3. Relación entre la enzima fosfatasa ácida y el cáncer de próstata

Enzima Pacientes con carcinoma Pacientes con carcinoma prostático sin metástasis prostático con metástasis (%) (%)

Fosfatasa ácida total 20-25 70-80 elevada Fosfatasa ácida 50-65 85-95 tartrato lábil elevada

Sin embargo, si lo que predomina en el daño es la colestasis, se elevan enzimas asociadas a la membrana plasmática, preferentemente, como la fosfatasa alcalina, la gammaglutamiltransferasa (elevada también en el alcoholismo) y la 5´nucleotidasa.

Para citar otro ejemplo de la utilidad de las enzimas en el diagnóstico médico está el cáncer, en particular el cáncer de próstata. Aunque existen actualmente otros métodos, como el ultrasonido y la determinación del antígeno prostático en suero (PSA, por las siglas en inglés), durante muchos años fue muy útil la determinación de la fosfatasa ácida total y su isoenzima prostática: tartrato lá-bil, casi como única prueba complementaria de la clínica de esta enfermedad. En la tabla 7.3 se aprecia la utilidad de esta prueba, incluso para diferenciar si existe o no metástasis.

Para la determinación de cualquier actividad enzimática es importante conocer bien todos los factores que pueden influir en la velocidad inicial de una reacción catalizada por enzimas. Existe bastante literatura al respecto y prácticamente todos los libros actuales de bioquímica general o de bioquímica humana tienen algún capítulo o sección dedicado a la cinética enzimática. Entre los factores que son necesario tener en cuenta, está la concentración de sustrato, que por lo general debe ser varias veces mayor que la constante de Michaelis de esa enzima. Otros factores, entre los más importantes, que se han de tener en cuenta son:

1. Concentración de enzima de la muestra.


2. Temperatura de la reacción enzimática.3. El pH de la disolución donde se encuentra la enzima.4. Concentración de cofactores.5. Presencia de activadores o inhibidores.

Quien vaya a realizar una determinación enzimática con fines diagnósticos en cualquier muestra biológica, debe ejercer un control de todos estos factores, y es conveniente que revise con profundidad los aspectos relacionados con cinética enzimática.

Las enzimas tisulares no solo se liberan hacia el plasma, sino que también pueden hacerlo hacia otros fluidos. Recientemente, en el líquido amniótico se vienen determinando distintas enzimas con fines diagnósticos. Así, el que se hace prenatal de fibrosis quística (una enfermedad congénita del páncreas que se caracteriza por trastornos digestivos y respiratorios) puede ser confirmado en ese fluido por la determinación de la enzima gammaglutamiltranspeptidasa en las semanas 17 a 18 de gestación.

Asimismo, existen algunas ocasiones en que las determinaciones enzimá-ticas son realizadas directamente en el tejido. Por ejemplo, la identificación de pacientes portadores de enfermedades lisosomales se realiza determinando actividades lisosomales en leucocitos, los cuales constituyen una muestra de fácil obtención.

Para concluir esta sección se puede afirmar que la medición de las actividades enzimáticas en suero y otros fluidos biológicos sigue siendo muy importante en la medicina para verificar las hipótesis diagnósticas que realiza el médico cuando examina a un paciente. Es muy importante que el laboratorista conozca bien cómo debe trabajar con estas proteínas. En la figura 7.6 se brindan algunas razones de la importancia de estas determinaciones.

Fig. 7.6. Utilidad para el diagnóstico médico al identificar actividades enzimáticas anormales.


Funciones de las enzimas en la terapéuticaAunque este aspecto está más relacionado con la medicina en general; como

ejemplo de enzimas útiles en el tratamiento médico se puede mencionar la es-treptoquinasa (la cual se obtiene del estreptococo hemolítico o por ingeniería genética), capaz de disolver coágulos en el músculo cardiaco a consecuencia de un infarto.

La estreptoquinasa activa el precursor de la plasmina de la manera siguiente:

Aunque existen activadores fisiológicos del plasminógeno, como la uroqui-nasa producida en el riñón (proteasa de serina), la estreptoquinasa muestra una gran actividad funcional.

Otras enzimas (como: α-quimotripsina, tripsina y desoxirribonucleasa) han sido utilizadas en el tratamiento de abcesos, quemaduras, úlceras infectadas de la piel y cervicitis de la mujer.

En deficiencias digestivas de enzimas y de pancreatitis se han utilizado pepsina, lipasa y amilasa.

Otro ejemplo es el de la asparaginasa, utilizada en el tratamiento de la leucemia, ya que en estos pacientes las células tumorales requieren de gran cantidad del ami-noácido asparagina para su crecimiento y esta enzima deprime los niveles en plasma.

También se vislumbra en medicina el empleo de una enzima capaz de remover los radicales superóxido (O2

-), como es la superóxido dismutasa.Las enzimas se utilizan como reactivos en algunas aplicaciones terapéuticas.

Por ejemplo, la enzima β-galactosidasa, fijada a una matriz, es capaz de dismi-nuir la lactosa en la leche; así, este alimento puede ser utilizado en pacientes con intolerancia a este disacárido.

Los pediatras conocen bien el cuadro clínico que se origina en niños pequeños con relativa frecuencia, como consecuencia de una infección gastrointestinal, en el que se produce una deficiencia transitoria de la enzima lactasa. En estas circunstancias, el elemento más importante que se ha de tener en cuenta, en el tratamiento, es la supresión absoluta, o casi absoluta, de la lactosa en la dieta; pero el alimento más rico en lactosa es la leche, un alimento muy completo para la buena nutrición de los niños. La administración de leche sin lactosa o con bajo contenido de este disacárido, permite realizar un tratamiento adecuado sin detrimento de la administración de otros nutrientes importantes para el niño.

Electroforesis

Es una de las técnicas de separación de moléculas. La separación, identifi-cación y caracterización de distintas biomoléculas en una mezcla compleja ha sido y es en la actualidad una de las tareas comunes e importantes que deben realizar los bioquímicos en su trabajo cotidiano. Para lograr ese objetivo de separar una mezcla compleja de biomoléculas, se han ideado diversas técnicas, algunas de estas se utilizan preferentemente con fines investigativos, ya sea en la variante analítica o preparativa; otras se utilizan con propósitos para el diagnóstico médico en el laboratorio clínico.

Entre estas técnicas de separación de biomoléculas se encuentran la elec-troforesis y la cromatografía, cuyos principios y principales aplicaciones son revisados en este y el capítulo que sigue.

La electroforesis es una técnica utilizada con bastante frecuencia en los labo-ratorios clínicos y más aun en los que se dedican a investigaciones en el campo de la bioquímica o de la biología molecular. Electro se refiere a electricidad y foresis, del griego phoros, significa traslada.

La electroforesis se basa en la separación de las moléculas de una mezcla o disolución según la movilidad de estas en un campo eléctrico. Las moléculas con carga positiva o negativa se moverán hacia el cátodo o el ánodo, respecti-vamente, es decir, hacia los polos opuestos a su carga eléctrica. La separación puede realizarse sobre una superficie o soporte sólido e hidratado (por ejemplo, electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o a través de una matriz poro-sa (electroforesis en gel) o en disolución (electroforesis libre), aunque las dos primeras se emplean con más frecuencia hoy día.

Independientemente de la técnica que se emplee, la separación obedece a dos factores principales: la carga eléctrica de las moléculas y su masa. En alguna medida la forma también influye, pues con moléculas no esféricas la fricción desempeña un papel importante.

Capítulo 8

http://es.wikipedia.org/wiki/Molécula

http://es.wikipedia.org/wiki/Acetato_de_celulosa

http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en_gel


La variante más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, casi siempre de agarosa o de poliacrila-mida (es común que esta última sea nombrada PAGE, por sus siglas en inglés). También la electroforesis se puede utilizar para separar otras biomoléculas que poseen grupos ionizables como heteropolisacáridos, péptidos y aminoácidos.

La carga eléctrica de macromoléculas como las proteínas y los ácidos nuclei-cos, de algunos polisacáridos, depende de los monómeros constituyentes, así como del medio en que estas macromoléculas se encuentren disueltas.

En el caso de las proteínas, son los grupos laterales o cadenas R de los aminoácidos los que pueden conferirle la carga; el grupo amino y el carboxilo terminal también pueden ser responsables de esa carga, aunque solo son dos grupos por cadena polipeptídica. El estado de ionización de esas cadenas late-rales y por ende la carga eléctrica depende del pH del medio y del pKa de esos grupos químicos.

La carga neta de la proteína es, por tanto, la sumatoria de cargas positivas y negativas a un determinado pH. Asimismo, existe un valor de pH, denominado punto isoeléctrico (pI), donde la proteína tiene una carga neta igual a cero, y en ese caso no migra a ninguno de los dos polos. Por debajo del punto isoeléctrico las proteínas siempre tienen carga eléctrica positiva y, por encima, negativa, lo cual puede ser demostrado de forma teórica. La carga eléctrica de proteínas conjugadas como las glicoproteínas o nucleoproteínas puede depender, además, de los grupos químicos de la parte no proteica.

En un caso particular de electroforesis en geles de poliacrilamida, la carga eléctrica no se debe, en sí misma, a la carga de las proteínas, sino a la unión de estas moléculas con el dodecilsulfato de sodio (SDS), un detergente aniónico que es el que les confiere la carga. Este reactivo incorpora cargas negativas de manera dependiente de la masa molecular de la proteína; en este caso se trata de un tipo de electroforesis desnaturalizante en la que las proteínas pierden su estructura tridimensional por efecto del calor y de la presencia de otros dos agentes desnaturalizantes: el β-mercaptoetanol, que rompe los puentes disulfuro, y el dodecilsulfato de sodio que desnaturaliza y recubre a la proteína.

La unión masiva de moléculas de dodecilsulfato de sodio bloquea la carga propia de la molécula de proteína y le confiere al complejo dodecilsulfato de sodio-proteína una carga neta negativa proporcional a su masa, haciendo que todas las proteínas unidas con el dodecilsulfato de sodio viajen hacia el ánodo.

Por otro lado los ácidos nucleicos deben su carga negativa a los grupos fosfatos del eje covalente o parte constante de esta macromolécula, que a pH neutro están totalmente disociados, ya que el pKa de los grupos fosfatos es mucho menor que 7.

Al someter la mezcla de estas biomoléculas, ya sean proteínas o ácidos nuclei-cos, a un campo eléctrico, estas se mueven y van atravesando la malla de fibras del gel o del papel de acetato de celulosa. Las más pequeñas avanzan más y las más grandes quedan cerca del lugar de partida después de un tiempo determinado.

http://es.wikipedia.org/wiki/Proteína

http://es.wikipedia.org/wiki/�cido_nucleico

http://es.wikipedia.org/wiki/�cido_nucleico

http://es.wikipedia.org/wiki/Gel

http://es.wikipedia.org/wiki/Agarosa

http://es.wikipedia.org/wiki/Poliacrilamida

http://es.wikipedia.org/wiki/Poliacrilamida

http://es.wikipedia.org/wiki/Dodecilsulfato_sódico

Capítulo 8. Electroforesis 101

Por lo general, para caracterizar la molécula se determina la velocidad a la que esta se mueve en un campo eléctrico y su localización final en el soporte. En el caso de las proteínas se puede conocer o determinar la masa molecular o detectar cambios de aminoácidos o separar, cuantitativamente, distintas es-pecies moleculares. En el caso de los ácidos nucleicos se determina el tamaño del fragmento, medido en pares de bases.

De la interacción del campo eléctrico con la molécula cargada surge una fuerza sobre la molécula y esta experimenta una aceleración hasta obtener una velocidad en la que la fricción, por la viscosidad del medio, neutraliza la fuerza impulsora. A partir de ese instante la molécula se desplaza con una velocidad constante.

Si la fuerza del campo eléctrico es:

F = qEDonde: q: carga; E: intensidad del campo eléctrico.

Y si la fuerza de fricción, asumiendo que la partícula es esférica, es igual a:

Fr = 6πRηVDonde:

Fr: fuerza de fricción; R: radio de la esfera; V: velocidad; η: viscosidad del fluido.

Al ser iguales ambas fuerzas después de iniciado el movimiento de las mo-

léculas, cuando es alcanzada una velocidad constante, se obtiene entonces que la velocidad es:

V = qE/6πRη (8.1) Por otra parte, la movilidad molecular (μ) es una magnitud característica de

la partícula o molécula, que se define como la velocidad relativa a la intensidad del campo eléctrico, es decir:

μ = V/E

A partir de la ecuación (8.1), sustituyendo el valor de la velocidad se obtiene que:

μ = q/6πRη (8.2) Donde se puede apreciar que la movilidad es directamente proporcional a la

carga (q) y función inversa del radio (R) de la molécula, es decir de su tamaño.

http://es.wikipedia.org/wiki/Viscosidad


La carga de la molécula, a su vez, depende del pH del medio en el que se encuentre y por esta razón es necesario indicar el electrolito o, más importante aun, el pH utilizado para determinar la movilidad. Téngase en cuenta que en la expresión (8.2) se considera que la molécula es una esfera de radio R, pero eso puede ser diferente con proteínas o moléculas no esféricas, y en ese caso la fricción suele ser mayor.

La corriente que atraviesa la disolución entre los electrodos es conducida, principalmente, por los iones del tampón, si bien una pequeña proporción lo es por los iones de la muestra. La relación entre intensidad (I), tensión (V) y resistencia (R) se expresa según la ley de Ohm:

R = V/I

Esta ecuación muestra que, para una resistencia constante, es posible acele-rar la separación electroforética aumentando la intensidad del campo eléctrico aplicado, lo cual da lugar al correspondiente incremento de la intensidad de la corriente. La distancia recorrida será proporcional a la intensidad y al tiempo. Con todo, el aumento de tensión o voltaje (V) y el incremento correspondiente de intensidad (I) ocasionaría uno de los principales problemas que plantea la mayor parte de las diversas técnicas de electroforesis: la generación de calor.

Este fenómeno queda ilustrado con la ecuación, en la que la potencia (W, medida en joules/s) generada durante la electroforesis equivale al valor de la resistencia multiplicado por el cuadrado de la intensidad:

W = I2R

Dado que la mayor parte de la potencia producida en el proceso electroforé-tico se disipa en forma de calor, pueden producirse los efectos perjudiciales siguientes:

1. Aumento de la tasa de difusión de los iones de la muestra y del tampón, con el consiguiente ensanchamiento de las muestras separadas.

2. Formación de corrientes de convección, con la consiguiente mezcla de las muestras separadas.

3. Inestabilidad térmica de las muestras, que son bastante sensibles al calor; por ejemplo, desnaturalización de las proteínas o del ácido desoxirribonu-cleico (ADN).

4. Disminución de la viscosidad del tampón y, por ende, reducción de la resistencia del medio.

En resumen, varios factores pueden influir en el resultado de una electrofo-resis, como son:

1. Intensidad del campo eléctrico.


2. Carga eléctrica de las moléculas.3. Masa molecular de las moléculas que se han de separar.4. Forma tridimensional de las moléculas.5. Temperatura, ya que el paso de corriente produce calor y este puede afectar

las moléculas desnaturalizándolas, alterando, además, la calidad de la sepa-ración. Esta es la razón por la cual algunos equipamientos de electroforesis poseen un sistema de enfriamiento, muchas veces por recirculación de agua, con la finalidad de evitar altas temperaturas en la cámara de corrida.

6. Fuerza iónica de la disolución donde se encuentran las moléculas cargadas, ya que, si es menor, permite mayor movilidad y menos desprendimiento de calor.

Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamidaLa electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) en la actualidad es muy

utilizada para la separación de distintas biomoléculas, incluyendo proteínas de distintas fuentes biológicas. Es muy importante destacar que la calidad de los reactivos y la pureza del agua son factores muy importantes para la calidad de esta técnica y en general de cualquier técnica de electroforesis. Es conveniente emplear tiempos de corrida adecuados, porque con tiempos muy cortos no se logra una buena separación de las bandas.

Existen variantes de esta metodología, por lo que seria conveniente consultar otros manuales prácticos.

Protocolo de técnica en geles de poliacrilamidaNota de bioseguridad: Para preparar y manipular los geles deben utilizarse

guantes, ya que la acrilamida es una sustancia neurotóxica y cancerígena. Otros reactivos como el 2-mercaptoetanol y metanol son tóxicos y deben evitarse con-tacto físico o inhalar vapores. Tomar precauciones al utilizar la fuente eléctrica.

Equipos, materiales y reactivosAdemás de una fuente eléctrica y la cubeta (Fig. 8.1), que son ofertados por

distintas firmas comerciales especializadas, se requieren otros aditamentos como placas de cristal, soportes y fijadores de las placas de cristal, peines y separadores para preparar los geles, y disoluciones patrones de proteínas de conocido peso molecular (Fig. 8.2).

Al retirar el peine, como se observa en el paso 4 de la figura 8.2, debe hacerse con sumo cuidado para no romper la estructura de los pocillos.


El sistema más utilizado en la preparación de los geles es el discontinuo, el cual está formado por dos geles distintos. En la parte de arriba (electroforesis vertical) se coloca un gel con un tamaño de poro mayor (el gel concentrador o stacking gel) que sirve para concentrar las muestras en una banda antes de que ingresen al gel separador. Cada uno se prepara con un amortiguador distinto, diferente también al tampón de corrida. Este sistema discontinuo otorga una mayor resolución, ya que las proteínas ingresan como una banda estrecha al gel de separación.

La polimerización de los geles se realiza entre dos vidrios verticales, con separadores o espaciadores de distinto espesor por medio, que funcionan como moldes, para dar un gel de alguna de estas medidas de espesor: 0,5;

Fig. 8.1. Fuente eléctrica y cubeta para electroforesis con geles de poliacrilamida.

Fig. 8.2. Materiales para la electroforesis en poliacrilamida.


0,75; 1 o 1,5 mm. Inmediatamente después de preparar la mezcla de acrilamida/bisacrilamida, tampón (buffer), persulfato de amonio (PSA) y tetrametiletilendiamina (TEMED) (tetramethylethylenediamine) y colocarla entre los vidrios para que gelifique, el borde superior del gel se cubre con agua o con butanol para evitar el contacto con el oxígeno que inhibe la polimerización. El reactivo persulfato de amonio aporta radicales libres para la polimerización y el tetrametiletilendiamina es un estabilizador.

En la figura 8.3 se muestra la estructura molecular de la acrilamida y bisa-crilamida, así como de la poliacrilamida después de ocurrida la polimerización.

Fig. 8.3. Estructuras moleculares después de ocurrida la polimerización de los geles.

Para la preparación del porcentaje de acrilamida/bisacrilamida se debe tener en cuenta el peso molecular (PM) de las proteínas que se han de separar. La de-pendencia que existe entre el rango de pesos moleculares de las proteínas que se han de separar y el de acrilamida/bisacrilamida se puede observar a continuación:

Acrilamida/bisacrilamida (%) Rango de PM (kDa)

7 50 a 500 10 20 a 300 12 10 a 200 15 3 a 100

En cuanto al reactivo persulfato de amonio es conveniente prepararlo poco antes de iniciar la electroforesis, ya que es un reactivo muy higroscópico; ade-más, debe sellarse bien el frasco. Algunos autores dan como alternativa preparar alícuotas de persulfato de amonio a 10 % (por ejemplo, de 200 µL) en viales pequeños y congelarlas. Otros prefieren preparar fresco el persulfato de amonio.


Otro reactivo, el 2-mercaptoetanol es tóxico y de olor desagradable (hay que utilizar la campana de extracción).

Con respecto al reactivo de destinción (aclaramiento del fondo) y fijador que contiene una mezcla de metanol, ácido acético y agua, se puede guardar a temperatura ambiente en recipiente hermético, siendo importante evitar el contacto físico y la inhalación de vapores de metanol.

Preparación de reactivos y procedimiento

1. Lo primero que hay que hacer es armar el equipo según las indicaciones de la firma comercial.

2. Gel separador. Se prepara a 7,5 %: para ello preparar 10 mL, agregando los volúmenes indicados de cada componente en el orden dado, excepto el persulfato de amonio y el tetrametiletilendiamina que se agregan, inme-diatamente, antes de colocar entre los vidrios todos los reactivos para que ocurra la gelificación. El persulfato de amonio se debe preparar al momento, es un reactivo muy higroscópico.

Reactivo Volumen (mL)

Agua desionizada 4,8 Tampón Tris-HCL 1,5 M; pH 8,8 2,5 Dodecilsulfato de sodio (SDS) 10 % 0,1 Acrilamida/bisacrilamida 29,2: 0,8 % w/v 2,5 Persulfato de amonio (PSA) 10 % 0,07 Tetrametiletilendiamina (TEMED) 0,01

Donde:Acrilamida: C3H5NO; PM = 71,08.Bisacrilamida o N,N’-metilenbisacrilamida: C7H10N2O2; PM = 154,17.Dodecilsulfato de sodio: C12H25NaO4S; PM = 288,38.Persulfato de amonio: N2H8S2O8; PM = 228,2.Tetrametiletilendiamina o N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina: C6H16N2; PM = 116,21.Relación entre la masa o peso del soluto y el volumen de la disolución: w/v.

3. Gel concentrador. Se prepara a 4 %: para ello preparar 10 mL, agregando los volúmenes indicados de cada componente en el orden dado, excepto el persulfato de amonio y el tetrametiletilendiamina que se agregan, inmedia-tamente, antes de colocar los reactivos entre los vidrios.

http://en.wikipedia.org/wiki/N,N%27-Methylenebisacrylamide


Reactivo Concentración Agua desionizada 6,0 Tampón Tris-HCL 0,5 M; pH 6,8 2,5 Dodecilsulfato de sodio (SDS) 10 % 0,1 Acrilamida/bisacrilamida 29: 0,8 % w/v 1,4 Persulfato de amonio (PSA) 10 % 0,07 Tetrametiletilendiamina (TEMED) 0,01

4. Al gel separador agregarle el persulfato de amonio y el tetrametiletilendia-mina, agitar rápidamente y colocar 3,7 mL entre los vidrios, puede hacerse sobre un borde, pegado a uno de los separadores que hay entre los vidrios.

El volumen necesario de gel separador puede variar en dependencia de la cámara utilizada y del espesor de los separadores.

5. Inmediatamente agregar agua desionizada o bidestilada con una pipeta Pasteur hasta el borde del vidrio más pequeño. Cerrar el tubo en el cual se preparó el gel separador para dejarlo como testigo de la polimerización (es decir, cuando polimerice el tubo indicará que el gel entre los vidrios también ha polimerizado). Se pueden incubar a 37 0C para acelerar la polimerización.

6. Después de que haya gelificado, remover el agua y terminar de secar con trozos de papel de filtro.

7. Al tubo del gel concentrador agregarle el persulfato de amonio y el tetra-metiletilendiamina, y verterlo sobre el gel separador ya gelificado entre las dos placas de vidrio, dejando rebasar apenas el borde del vidrio.

8. Enseguida colocar el peine (que servirá para formar las carrileras por donde se aplicaran y desplazaran las muestras). Cerrar el tubo en el que se preparó el gel concentrador para utilizarlo como testigo. Dejar polimerizar.

9. Después de polimerizado el gel sacar los peines con cuidado y enjuagarlos con agua, eliminando los restos de gel, si quedaran.

10. El amortiguador de corrida o amortiguador de la cámara se prepara con:

Reactivo Concentración Tris-HCl pH 8,3 a 8,4 25 mM Glicina 200 mM Dodecilsulfato de sodio (SDS) 0,1 % w/v

11. El amortiguador muestra 5x se prepara con:

Reactivo Concentración

Dodecilsulfato de sodio (SDS) 10 % w/v β-mercaptoetanol 10 mM (también es posible utilizarar ditiotreitol)


Glicerol 20 % v/v Tris-HCl, pH 6,8 0,2 M Bromofenol azul 0,05 % w/v (colorante para el frente de corrida)

Nota: Debido a la toxicidad y olor desagradable del β-mercaptoetanol, se debe utilizar campana de extracción de gases.

12. Preparación de las muestras. Preparar las muestras para aplicar teniendo en cuenta que el volumen final debe ser 20 μL, y que el amortiguador muestra está a 5x. Además, las muestras deben contener 1 μL del extracto o la mez-cla de proteínas, si la cuantificación fue mayor a 50 mg/mL, y 5 μL, si fue menor. Mezclar bien.

Reactivo Volumen (μL)

Agua 10 a 14 Proteínas 1 a 5 Amortiguador 5x 5 Total 20

Se continúa de la forma siguiente: a) Calentar las muestras a 95 0C durante 4 min para desnaturalización de

proteínas en pequeños viales cerrados para evitar evaporación. b) Colocar los geles en el soporte que porta los electrodos e introducirlo

en la cubeta. c) Agregar amortiguador de corrida en ambos compartimentos de la cámara;

asegurarse que estos no estén en contacto. d) Aplicar 7 μL del marcador o patrón de peso molecular en la primera celda,

y en las otras celdas, el total del volumen de cada una de las muestras. En la última celda es conveniente aplicar el mismo marcador o patrón de peso molecular.

e) Conectar a la fuente. Correr a 80 V hasta que las muestras entren en el gel separador y a continuación a 130 V hasta que el colorante del frente de corrida (bromofenol azul) llegue al borde inferior del gel (aproximadamente 1,5 h).

13. Mientras se realiza la corrida preparar las dos disoluciones siguientes: a) Disolución colorante de azul Coomasie (Coomasie blue): Colorante azul brillante (brilliant blue) (R-250 (C45H44N3NaO7S2;

PM: 825,97) a 0,3 % en metanol, acético y agua (proporción de 3:1:6). Disolver el colorante en el metanol, luego agregar el ácido acético y fi-nalmente el agua. Mezclar durante 15 min, filtrar y guardar a temperatura ambiente. Aunque el colorante puede ser reutilizado varias veces para


ciertos fines, la sensibilidad declina, por lo que se prefiere utilizar una pequeña cantidad y descartarla cada vez. Otro tipo de Coomasie, el G-250, se puede emplear como colorante para geles, aunque su sensibilidad es menor.

b) Disolución de destinción: Metanol, ácido acético y agua, con una proporción de 3:1:6. Una más rápida destinción a temperatura ambiente (1,5 h, aproximada-

mente) se logra con mayor concentración de metanol, como con la mezcla anterior, o con la proporción siguiente:

Disolventes mL

Metanol 200 Etanol 100 Ácido acético 50 Agua 650

Para la destinción o aclaramiento del color de fondo de los geles, se pue-de utilizar durante toda la noche a temperatura ambiente la proporción siguiente:

Disolventes mL

Metanol 5 Ácido acético glacial 10 Agua hasta 100

Se puede utilizar el metanol entre 5 y 50 %, dependiendo de lo rápido que se quiera desteñir los geles.

14. Una vez finalizada la corrida, apagar la fuente y desarmar, cuidadosamente, la cámara de electroforesis, depositando el gel en un recipiente para efectuar la tinción.

15. Agregar la disolución de azul Coomasie y teñir en agitación por 30 min.16. Después enjuagar con disolución de destinción hasta que se distingan las

bandas de proteínas y se vean azules contra un fondo claro. 17. Agregar agua destilada para frenar la destinción.18. Escanear los geles y obtener los valores necesarios para calcular la movilidad

relativa de las fracciones (también denominadas Rf por muchos autores, aunque este termino es más apropiado y fue empleado por primera vez en cromatografía) (Fig. 8.4).


Fig. 8.4. A y B: imágenes de la separación de proteínas por electroforesis en geles de poliacrilamida.

Cálculo del peso molecular de una proteína

A continuación se muestra un ejemplo del cálculo del peso molecular de una proteína desconocida. Junto a la corrida electroforética de las muestras se aplicaron patrones de peso molecular, es decir, diferentes proteínas con valor de peso molecular conocidos.

En la tabla 8.1 se muestran los datos necesarios para el cálculo del peso molecular de la proteína desconocida.

Tabla 8.1. Cálculo del peso molecular de proteína desconocida

Marcador de PM PM (kDa) Log PM Distancia recorrida (mm)

Rf

Albúmina bovina 66 1,82 6,5 0,093Ovoalbúmina 45 1,65 13,0 0,186Gliceraldehido 3P deshidrogenasa

36 1,56 18,0 0,257

Anhidrasa carbónica 29 1,46 25,0 0,357Tripsinógeno 24 1,38 28,5 0,407Inhibidor de tripsina 20,1 1,303 38,0 0,543Α lactoálbumina 14,2 1,152 50,0 0,714Proteína problema ? ? 44,0 0,628

Nota: la Rf o movilidad relativa de las fracciones, es el cociente entre la distancia recorrida por la proteína (desde el origen de aplicación hasta el centro de la mancha) y la distancia desde el origen hasta el frente de corrida, que en este ejemplo fue de 70 mm.

A B


Con estos datos se construye un gráfico en Excel (grafico de dispersión o scatter plot) con el valor del Rf en el eje de las abcisas y el logaritmo del peso molecular de las proteínas patrones en el eje de las ordenadas (Fig. 8.5). A partir de la ecuación de la recta de regresión, y sustituyendo el valor del Rf de la proteína problema se obtiene:

y = -1,0313x + 1,8517 log PM = - 1,0313 (0,628) + 1,8517

log PM = 1,2037 PM = antilog 1,2037 PM = 15,98 kDa

Sustituyendo los valores de Rf de la proteína problema en la ecuación de la recta de regresión y hallando el antilogaritmo se obtiene un PM de 15,98 kDa.

Fig. 8.5. Curva de calibración con las proteínas de peso molecular conocido.

Electroforesis de las proteínas plasmáticasEl plasma humano contiene más de 100 proteínas diferentes, cada una con una

función y sujetas a variaciones individuales en condiciones normales, pero más aun en estados patológicos. Desde la introducción por Tiselius de las primeras técnicas electroforéticas y luego con la aparición de la electroforesis de zona, las proteínas plasmáticas han sido caracterizadas en 5 fracciones: la albumina


y las globulinas alfa (α1 y α2), beta (β) y gamma (γ). Cada una de estas bandas o fracciones contiene varias proteínas.

En las electroforesis de las proteínas del plasma no se hace referencia al fibrinógeno, ya que normalmente es consumida esta proteína en el proceso de coagulación de la sangre para obtener el suero, que es el material biológico utilizado comúnmente en las electroforesis.

En la figura 8.6.A se aprecia un esquema de un densitograma normal de las proteínas plasmáticas y en la figura 8.6.B la imagen de los geles de agarosa correspondientes a un grupo de pacientes. Para la cuantificación, primero se realiza la determinación total de proteínas por un método como el Biuret, y después de acuerdo con los porcentajes de absorbancia relativa de cada fracción se calculan los gramos de cada banda.

Fig. 8.6. A: esquema del electroforetograma; B: resultado de las corridas electroforéticas de varios pacientes.

A

B

Se han logrado identificar los principales componentes de las 5 bandas que se distinguen en el electroforetograma, así como algunas implicaciones médicas asociadas a las alteraciones de esas bandas:

1. Albumina. La albumina es una proteína plasmática que se une con ácidos grasos libres,

con la bilirrubina, y con medicamentos como el ácido acetilsalicílico y la


penicilina. Una disminución de esta fracción se produce en los estados de desnutrición, en enfermedades hepáticas, en el síndrome nefrótico y en enfermedades intestinales asociadas a pérdidas de proteínas.

2. Alfa1-globulina. Esta banda contiene a la α1-antitripsina y la α1-glicoproteína ácida (el

componente principal es el primero). La fracción de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) migra entre la albumina y la banda de las α1, y altos niveles de alfa-feto proteína, como ocurre en el carcinoma hepático, se reflejan en una banda estrecha que aparece entre la albumina y la banda α1. La disminución de esta banda de la α1 se observa en el síndrome nefrótico y su incremento en los procesos infecciosos agudos. La proteína de Ben-ce-Jones, sugestiva de mieloma múltiple, puede aparecer en esta banda α1 y retardar su movilidad.

3. Alfa2-globulina. Esta banda tiene dos componentes principales la α2-macroglobulina y la

haptoglobina. La primera se observa elevada, principalmente en el síndrome nefrótico, y puede incrementarse hasta 10 o más veces. La haptoglobina se eleva en los procesos infecciosos agudos y se halla disminuida en las anemias hemolíticas. En esta clase de anemias se forma un complejo entre la hemoglobina liberada de los eritrocitos y la haptoglobina, el cual es rápidamente degradado por los macrófagos. En esta fracción también se encuentra la ceruloplasmina, proteína transportadora de cobre.

4. Betaglobulina. En esta fracción migran proteínas como la transferrina, y la β-lipoproteína

que lo hacen en la subfracción β1, y el complemento C3 y la hemopexina que lo hacen en la subfracción β2. Un incremento de la fracción de las betaglobulinas ocurre cuando se eleva la fracción de LDL-colesterol en plasma. En la anemia ferripriva la transferrina aumenta, así como esta banda. También se puede observar un incremento en el embarazo, así como en el tratamiento con estrógenos.

En la fracción β también se localiza la transcobalamina, proteína encargada del transporte de la vitamina B12 en plasma. Aquí aparece la fibronectina migrando, la que aumenta en la colestasis hepática, en las neoplasias y en el síndrome nefrótico, y disminuye en quemaduras intensas, politraumatismos y sepsis.

En la fracción β2 migra la proteína fibrinógeno del plasma, pero esta pro-teína se consume en el proceso de coagulación de la sangre y, por lo tanto, ya no esta presente en la electroforesis del suero humano. La proteína C reactiva, que se observa aumentada en procesos infecciosos, aparece entre las bandas beta y gamma provocando una fusión de ambas.


5. Gammaglobulinas (banda gamma). Las inmunoglobulinas (Ig) G, M, A, D y E, son las únicas proteínas que

aparecen en la banda gamma. El incremento de algunas de estas fracciones es útil para el diagnóstico de infecciones crónicas, mieloma múltiple y otras afecciones.

Hay veces que el incremento de esta banda se observa en forma de pico, lo cual sugiere la presencia de un anticuerpo monoclonal. El mieloma, la leucemia linfocítica crónica y el linfosarcoma producen estos picos en la banda gamma. Otras veces están presentes anticuerpos policlonales y se observa un ensanchamiento de la banda como es en el caso de una infección crónica, la enfermedad hepática crónica, el lupus eritematoso, la artritis reumatoide y otras enfermedades del tejido conectivo.

La hipogammaglobulinemia puede observarse en niños y también puede observarse la agammaglubulinemia como un trastorno genético ligado al cro-mosoma X.

Los valores normales para las distintas bandas se muestran a continuación y en la figura 8.7 algunos electroforetogramas, normal o característico de algunas afecciones.

Bandas g/dL

Proteína total 6,4 a 8,3 Albúmina 3,5 a 5,0 Alfa1-globulina 0,1 a 0,3 Alfa2-globulina 0,6 a 1,0 Betaglobulina 0,7 a 1,2 Gammaglobulina 0,7 a 1,6

Protocolo para electroforesis de proteínas del plasma

Los principios de esta técnica son los mismos de cualquier técnica de electro-foresis, las proteínas son separadas al aplicar un campo eléctrico basándose en su carga y su tamaño. El acetato de celulosa o geles de agarosa son habitualmente empleados como soporte sólido y la corrida electroforética se lleva a cabo en un tampón a pH 8.8. A ese pH, la albumina con carga negativa es la proteína que más rápidamente se desplaza hacia el ánodo por ser la más pequeña y la que posee mayor carga eléctrica en relación con su masa.

B

A

C


Después que las proteínas son separadas, el acetato de celulosa se coloca en una disolución con un colorante como el rojo Ponceau, que tiñe las bandas de proteína. Posteriormente, la tira de acetato de celulosa se trata con metanol y con una disolución que hace transparente el fondo, lo que permite identificar claramente a las 5 bandas y cuantificarlas en un densitómetro.

Equipos, materiales y reactivos

Se necesita fuente y cubeta de electroforesis suministrada por firmas comer-ciales. También estufa, cubetas metálicas o plásticas, tijeras, placas de vidrio, aplicador semimicro, papel de filtro, etcétera.

El soporte para llevar a cabo la electroforesis consiste en tiras de acetato de celulosa (2,5 · 17 cm), que se conservan en disolución de metanol a 30 % en agua desionizada.

Reactivos

Los reactivos son:1. Tampón de electroforesis (Tris-hipurato; pH 8.8). Preparación: Tris [2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol] 6,0 g/L Ácido hipúrico 2,5 g/L Hipurato de sodio 8,0 g/L pH 8.8

Fig. 8.7. Electroforetogramas: A: de un adulto normal. B: de un paciente con síndrome nefrótico. C: sugestivo de un daño hepático. D: de un paciente con mieloma múltiple.

D


2. Colorante rojo Ponceau: 0,5 % (w/v). Ponceau S disuelto en ácido sulfosalicílico a 10 % (w/v).3. Decolorante: ácido acético a 10 % y metanol a 45 %.4. Transparentador: ácido acético a 18 % y metanol a 82 %. Preparar en el

momento.

Procedimiento

1. Rellenar una cubeta con 100 mL del tampón de electroforesis.2. Preparar un baño con 100 mL de la disolución colorante (sirve para

10 tiras).3. Preparar 3 cubetas o recipientes con la disolución decolorante.4. Sacar la tira de acetato de celulosa de la disolución de metanol y absorber

el exceso de metanol con un papel de filtro.5. Sumergir la tira en el baño con el tampón de electroforesis durante 10 min.6. Absorber el exceso de tampón con papel de filtro y montar la tira en la

cámara con la cara absorbente hacia arriba (la menos brillosa) y situarla en la cubeta de electroforesis.

7. Aplicar la muestra con el aplicador. Para ello: a) Tomar la muestra de suero b) Aplicarla con cuidado sobre el borde catódico. c) Lavar el aplicador varias veces antes de tomar otra muestra.

8. Cerrar la cubeta de electroforesis y conectarla a la fuente eléctrica (polo negativo con negativo, positivo con positivo). Encender, y aplicar 210 V durante 50 min. Durante este tiempo es posible realizar la cuantificación de proteínas del suero por el método de Biuret.

9. Desconectar las cubetas de la fuente de alimentación y desenchufar esta.10. Introducir la tira de acetato de celulosa en la disolución colorante por la

cara absorbente y dejarla durante 3 min.11. Decolorar la tira utilizando los 3 baños decolorantes.12. Sumergir la tira durante 3 a 4 min en cada baño, agitando manualmente.13. Introducir la tira en un baño con disolución transparentadora durante 90 s

(nunca más de 2 min).14. Colocar la tira sobre una placa de vidrio y quitar las burbujas que queden

entre ambas.15. Introducir en una estufa con temperatura entre 60 y 90 ºC. Cuando la tira

esté transparente, se esperan 5 min antes de sacarla.16. Sacar de la estufa, dejar enfriar a temperatura ambiente y quitar el papel

con una pinza.17. Leer las tiras en un densitómetro utilizando un filtro verde (530 nm).


Electroforesis de hemoglobinaLa anemia drepanocítica (sicklemia) fue descrita por primera vez en 1910

cuando James B. Herrick demostró la presencia de anemia en un joven de la raza negra de 20 años de edad y utilizando microfotografías ilustro la presencia de hematíes en forma de hoz o media luna.

El examen físico de nuevos pacientes diagnosticados con esta anemia revelaba en algunos la presencia de cardiomegalia, íctero, ulceras en la piel de miembros inferiores y con frecuencia presentaban dolores abdominales. Los casos más severos fallecían cerca de los 30 años de edad como resultado de infecciones, insuficiencia cardiaca o renal, o trombosis.

En la década del 1940, James Neel demostró que se trataba de un defecto genético que obedecía las leyes de Mendel, y que podían existir individuos homo- o heterocigóticos. Con el decursar de los años y nuevas descripciones de casos se pudo constatar que los homocigóticos evolucionaban con un cua-dro clínico más severo, mientras que en los heterocigóticos la enfermedad se manifestaba de forma mucho más benigna.

Mas tarde, en 1949 y en años subsiguientes se pudo demostrar fehacientemente que los individuos afectados con esta anemia tenían una hemoglobina (Hb) anormal, denominada HbS, originada por una mutación que tenía diferencias fisicoquímicas importantes con respecto a la HbA normal del adulto.

Por todo lo anterior, un objetivo importante del diagnóstico bioquímico clínico ha sido durante todos estos años la identificación de pacientes en-fermos o portadores de anemia drepanocítica. En este sentido un sencillo procedimiento de electroforesis de hemoglobina ha sido particularmente útil, tanto para identificar la hemoglobina normal, como la S o incluso otros tipos.

Protocolo para electroforesis de hemoglobinaA continuación se brindan dos protocolos diferentes para la electroforesis

de hemoglobina.

Protocolo 1

1. Centrifugar 5 mL de sangre por 5 min a 3 000 r.p.m. (para remover el plasma).2. Lavar los eritrocitos con disolución salina fisiológica, 3 veces. Para esto

se centrifuga cada vez por 3 min a 3 000 r.p.m. (remover el sobrenadante después de cada centrifugación). Agregar 0,4 mL de cloroformo y agitar vigorosamente por 5 min.


3. Centrifugar por 15 min a 3 000 r.p.m. Separar el hemolizado del sobrena-dante.

4. Colocar una tira de acetato de celulosa (ancha) dentro de una cubeta con disolución tampón (pH de 8.6 a 9.2); dejar allí por 5 min. Sacar la tira de la disolución y eliminar el exceso de tampón.

5. Colocar la tira en la cámara de electroforesis, debe quedar bien extendida. Utilizar un capilar para aplicar las muestras (aproximadamente 4 µL) en la tira de acetato de celulosa. En un extremo o en ambos aplicar los patrones. Añadir suficiente tampón dentro de la cámara hasta que haga contacto con los extremos de la tira. Correr las muestras por unos 30 min con un voltaje de 250 a 300 V.

6. Sacar la tira, una vez que se cumpla el tiempo de corrida.7. Teñir la tira con rojo Ponceau (su modo de preparación está descrito en

protocolo anterior) durante 10 min, sin agitar.8. Decolorar la tira agitándola suavemente en un baño de ácido acético a 5 %

hasta que el fondo rojizo sea removido (se realizan tres baños sucesivos).9. Secar la tira en una incubadora por 10 min a una temperatura entre 60 y 100 ºC.

10. Observar la tira y las diferencias de movilidad de las hemoglobinas.

Protocolo 2

1. La muestra de sangre para el estudio (3 mL) se obtiene por punción venosa y se recolecta en tubos con anticoagulante (heparina o ácido etilendiami-notetracético-sal disódica: Na2EDTA). Algunos protocolos requieren un menor volumen de sangre. Se separa el plasma por centrifugación a 1500 g durante 15 min (o 2 500 r.p.m. durante 10 min).

2. La fracción superior o sobrenadante de un color amarillo pálido es el plasma y se desecha, al igual que la segunda o intermedia que es fina y de color gris blanco y representa la fracción de leucocitos. Se colecta entonces la fracción inferior de glóbulos rojos que se lava 3 veces con disolución de NaCl a 0,9 %. Los glóbulos rojos lavados se pueden conservar a 4 oC por un periodo no mayor de 3 a 5 días.

3. Antes de realizar la electroforesis se prepara un hemolizado con las muestras, tomando 50 µL de glóbulos lavados y 50 µL de agua destilada y dejando reposar a temperatura ambiente por 1 h.

4. Se toman 25 µL de la muestra ya hemolizada y se diluyen en 20 µL tampón Tris-glicina (concentración final 80 mM Tris-hidroximetilaminometano, 160 mM glicina, pH 8.6), más 5 µL de glicerol, más 0,06 mg de bromofenol azul para observar el frente de la corrida electroforética.

5. Los geles se preparan con una disolución de agarosa a 1,2 % en tampón Tris-glicina para pH 8.6.


6. Alícuotas de 10 µL de cada muestra se depositan en los pocillos del gel. Una alícuota también de 10 µL del patrón en uno de los carriles.

7. Se conecta la cubeta, que contiene tampón Tris-glicina para pH 8.6 y el gel de agarosa, a la fuente eléctrica, a 170 V, de 45 a 60 mA durante 45 a 60 min.

8. Se desconecta la fuente eléctrica, se pasan los geles de agarosa a una bandeja con 0,1 % de azul Coomasie (R-250) en una disolución de metanol a 44 % y 8 % de ácido acético glacial por un tiempo mínimo entre 20 y 60 min o mejor resulta mantener en esta disolución toda la noche.

9. Posteriormente, los geles se decoloran durante 24 a 48 h con una disolución de metanol a 10 % en 10 % de ácido acético glacial. Es recomendable utilizar un agitador rotatorio y hacer cambios de esta disolución decolo-radora.

En la figura 8.8 se muestran los resultados experimentales de la electroforesis de hemoglobina.

Fig. 8.8. Electroforesis de hemoglobina. En el carril 1, patrones (A: normal del adulto; F: fetal; S: de la anemia drepanocítica y C: otra hemoglobina anormal). En los carri-les del 2 al 8 se colocaron muestras de diferentes pacientes. La corrida electroforética se inició desde el polo negativo en la parte inferior de la figura hacia el polo positivo en la parte superior.

Electroforesis de ácido desoxirribonucleicoLa electroforesis de ácido desoxirribonucleico (ADN) se utiliza para separar

fragmentos de diferentes tamaños de esta macromolécula en un campo eléctrico.


La molécula de ADN está formada por una doble cadena polinucleotídica enrollada en forma de hélice, con las bases nitrogenadas dirigidas hacia el interior de la hélice y un eje covalente o región constante en cada cadena, donde alternan residuos de desoxirribosa y fosfato, este último con carga negativa.

Esta carga negativa de los fosfatos, es lo que permite que los fragmentos de ADN sean atraídos hacia el polo positivo o ánodo de un campo eléctrico aplicado a un gel de agarosa. Los fragmentos mayores de ADN migran a través de los poros del gel más lentamente que los pequeños, de tal manera que los fragmentos son separados por su tamaño.

La aceleración impuesta por la fuerza eléctrica es igual para cualquier mo-lécula de ácido nucleico. La diferencia en velocidad de migración está dada por diferencias en la fuerza de rozamiento, o sea, por la forma y tamaño de la molécula de ADN.

En el caso del ADN de doble cadena, la forma es la misma para cualquier molécula, entonces las distintas moléculas tendrán una velocidad que solo depende de su tamaño, es decir, de su longitud en pares de bases. Como algunas moléculas de ADN son enormes, se utilizan con frecuencia enzimas de restricción para cortarlas y obtener fragmentos más pequeños antes de iniciar la electroforesis.

También los otros ácidos nucleicos, los ácidos ribonucleicos (ARN), pueden ser separados mediante electroforesis en geles de agarosa.

En la figura 8.9 se muestran imágenes típicas de esta técnica.

Protocolo para electroforesis de ADN en geles de agarosa

La agarosa es la matriz más utilizada para separar los fragmentos de ADN, aunque también los geles de poliacrilamida pueden emplearse, y en un rango de 10 a 3 000 pb (pares de base) pueden brindar una excelente resolución.

La agarosa, a diferencia de la poliacrilamida no es toxica y, además, variando la concentración de esta sustancia se obtienen geles con poros de diferente tamaño. La migración de los ácidos nucleicos es también afectada por el tampón utilizado y el voltaje aplicado.

Para la detección de los fragmentos de ADN se utiliza el bromuro de etidio, que sí es una sustancia toxica, se intercala en el interior de la doble cadena y fluoresce bajo los efectos de la luz ultravioleta.

La determinación del tamaño de cada fragmento se realiza mediante comparación con marcadores o patrones comerciales de ADN de distintos tamaños.


Equipos, materiales y reactivos

Como en otros tipos de electroforesis los equipos consisten básicamente en una fuente eléctrica, una cubeta donde se realiza el procedimiento y otros materiales accesorios, suministrados por firmas comerciales. Desde luego, son necesarios otros materiales de laboratorio como: micropipetas, balanza, espátula, tubo de ensayo, frascos Erlenmeyer, vasos de precipitados (beakers), gradilla y transilu-minador con radiación ultravioleta 312 nm y cámara para fotos de los geles.

Reactivos

A continuación se analizan algunas particularidades de los reactivos necesarios.

Fig. 8.9. A y B: imágenes de la electroforesis de ADN.

A

B


Agarosa

La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con un peso molecular medio de ~120 kDa) formado por la repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternas de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa.

La agarosa es muy frágil y las manipulaciones poco cuidadosas pueden des-truirla con facilidad. Los geles de agarosa poseen grandes poros y se emplean, fundamentalmente, para separar las moléculas grandes con un peso molecular mayor que 200 kDa.

Los geles de agarosa permiten una electroforesis rápida, pero con una re-solución limitada por cuanto las bandas que se forman en estos geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse.

Los geles de agarosa se obtienen por suspensión de agarosa seca en polvo en un tampón acuoso, tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde y se convierte en una disolución transparente. A continuación, se vierte esta disolución en un molde y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta que se forma un gel rígido.

Tampón de electroforesis

La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y la fuerza iónica del tampón de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor lo cual puede desnaturalizar el ADN y fundir el gel.

Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo bicatenario. Contienen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y Tris-acetato (TAE), o Tris-borato (TBE) o Tris-fosfato (TPE) a una concentración de apro-ximadamente 50 mM.

Los tampones de electroforesis suelen prepararse en forma de disoluciones concentradas y se conservan a temperatura ambiente. Inicialmente el Tris-borato se utilizaba a una concentración de trabajo de 1x en el caso de la electroforesis en gel de agarosa. No obstante, una disolución de trabajo de 0,5x del tampón proporciona un poder más que suficiente y, en la actualidad, prácticamente todas las electroforesis en gel de agarosa se realizan utilizando esta concentración.

Concentración de agarosa

Un fragmento de ADN de un tamaño determinado migra a diferentes velo-cidades a través de los geles según la concentración de agarosa.


En función de la concentración de agarosa o tampón, se pueden separar seg-mentos de ADN que contengan de 20 a 50 000 pb (pares de base).

En los geles horizontales, la agarosa se emplea, por lo general, en concen-traciones comprendidas entre 0,7 y 3 %. La concentración recomendada para separar moléculas de ADN lineales es la siguiente:

Agarosa (%)

Rango de tamaño del ADN (kpb: kilopares de base o mil pb)

0,75 10-15 1,0 0,5-10

1,25 0,3-5 1,5 0,2-4 2,0 0,1-2,5 2,5 0,05-1

ADN marcador

Para un voltaje, un gel de agarosa y unas concentraciones de tampón deter-minadas, la distancia de migración depende del peso molecular del material inicial. Así pues, debe cargarse un ADN marcador de tamaño conocido en las ranuras situadas en los extremos derecho e izquierdo del gel.

Generalmente un marcador contiene un número determinado de segmentos de ADN conocidos, lo que facilita la labor de determinar el tamaño de los ADN desconocidos en caso de que se produjese alguna distorsión sistemática del gel durante la electroforesis.

Tampón de carga

Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan, en primer lugar, con un tampón de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y un colorante (por ejemplo: cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de bromocresol, etc.).

La cantidad máxima de ADN que puede cargarse depende del número de fragmentos. La cantidad mínima de ADN que puede detectarse mediante foto-grafía de los geles teñidos con bromuro de etidio es de aproximadamente 2 ng en una banda de 0,5 cm de ancho. Si una banda de este ancho contiene más de 500 ng de ADN, la ranura estará sobrecargada y se producirá emborronamiento.

El tampón de carga se emplea con tres fines:1. Aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan

uniformemente en el pocillo.


2. Añadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga.3. Incorporar un colorante a la muestra que, en un campo eléctrico, se desplace

hacia el ánodo a una velocidad previsible.

Tampón de TBE 10x (1 L) g Tris-hidroximetilaminometano 54, 0 Ácido bórico 27, 5 Na2EDTA 7, 44

Mezclar el reactivo con agua desionizada o bidestilada para obtener una disolución de 1 L y pH 8.3. Conservar a temperatura ambiente.

Tampón de TAE 10x (1 L)

Tris-hidroximetilaminometano 48,4 g Ácido acético glacial 11,4 mL 0,5 M EDTA 20,0 mL

Mezclar los reactivos, ajustar pH a 8.0 y añadir agua desionizada o bides-tilada hasta 1 L.

Tampón de carga 6x (10 mL)

Cianol de xileno FF 0,025 g Sacarosa 4 g Agua 10 mL

Añadir la sacarosa y cianol de xileno FF al agua desionizada para obtener 10 mL de disolución. Mezclar la disolución, pasar por autoclave y conservar a 4 °C.

Otros autores recomiendan el tampón de carga siguiente:

Tampón de carga 6x %

Azul de bromofenol 0,25 Cianol de xileno 0,25 Glicerol en agua 30

Procedimiento

1. Sellar los bordes de un molde de plástico limpio y seco con cinta adhesiva o de otro modo. Colocar el peine adecuado de modo que se formen pocillos completos al añadir la disolución de agarosa.


2. Diluir tampón de TBE 10x y preparar la cantidad adecuada de tampón de TBE 0,5x para llenar la cubeta de electroforesis y preparar el gel.

3. Pesar la agarosa en polvo según lo indicado en el tema de Concentracion de la agarosa y añadirla a una cantidad apropiada de tampón de TBE 0,5x en un matraz de Erlenmeyer con tapa suelta (normalmente 150 mL de disolución de gel para un molde de 15 por 15 cm y 100 mL de gel para un molde de 15 por 10 cm).

4. Calentar la mezcla en un horno microondas o en baño María hasta que se disuelva la agarosa (comprobar el volumen de la disolución tras haberla calentado).

5. Enfriar la mezcla hasta 50 a 60 °C y añadir bromuro de etidio (de una disolución madre de 10 mg/mL) hasta lograr una concentración final de 0,2 μg/mL y mezclar bien.

6. Verter la disolución en el molde y dejar que se forme el gel. La cantidad de gel empleado debe corresponder a un grosor aproximado, de 3 a 5 mm.

7. Una vez formado el gel por completo, retirar con cuidado el peine y la cinta adhesiva y colocar el gel en la cubeta de electroforesis.

8. Añadir tampón de TBE 0,5x a la cubeta de electroforesis de modo que el gel quede cubierto por una capa de 2 a 5 mm, aproximadamente.

9. Preparar muestras y marcador para ADN genómico según la tabla 8.3.

10. Cargar 10 μL de cada muestra en pocillos consecutivos y el ADN marcador adecuado en las calles primera y última.

11. Cerrar la tapa de la cubeta del gel y conectar los cables eléctricos para que el ADN migre hacia el ánodo; aplicar un voltaje de 5 a 10 V/cm (aproxi-madamente 100 V).

12. Hacer la electroforesis hasta que el cianol de xileno haya recorrido la dis-tancia adecuada a través del gel (~ 40 a 60 min).

13. Desconectar la corriente, y retirar los cables y la tapa de la cubeta. Introducir el gel en un transiluminador ultravioleta y fotografiarlo.

14. Eliminar el gel en un recipiente para residuos sólidos destinado al bromuro de etidio y de este modo evitar el posible efecto tóxico de esta sustancia.

Tabla 8.3. Volúmenes de reactivos para la preparar muestras y el marcador ADN

Reactivo Muestra Marcador ADN (µL) EcoR I/Hind III (µL)

Agua 3 6Tampón carga 2 2Muestra 5 2Total 10 10

Cromatografía

Es otra de las técnicas de separación de moléculas. Algunas de esas técnicas también son utilizadas con propósitos del diagnóstico médico en el laboratorio clínico. Entre estas técnicas de separación de biomoléculas se encuentran la electroforesis y la cromatografía, cuyos principios y principales aplicaciones son revisados en este capítulo y en el anterior.

El botánico Mijaíl Tsvet (también transcrito del ruso su apellido como Tswet o Tswett) aunque nacido en Italia, pero trabajando en un laboratorio de la Academia de Ciencias de Rusia, fue el primero que en 1906 logró establecer las ventajas de esta técnica para separar clorofila y carotenoides, adoptó la terminología y definió los procedimientos experimentales básicos. Por esta razón se considera que es el creador de las primeras técnicas cromatográficas.

Solo a los 10 años después de su muerte, ocurrida en 1919, su trabajo fue traducido del ruso, conocido y divulgado a nivel internacional. En la tumba de Tsvet, aparece inscrito en ruso el siguiente epitafio: “Él inventó la cromatografía, separando moléculas, pero uniendo personas”.

En los años 30 y 40 del siglo xx estas técnicas se empezaron a desarrollar y aplicar en diferentes procedimientos de experimentación. La palabra cromatogra-fía significa escritura en colores, porque cuando fue desarrollada por Tsvet los primeros componentes separados eran pigmentos como clorofila y carotenoides.

Se define como una técnica o método físico de separación basado en las diferentes velocidades con que se mueven los solutos disueltos en un disol-vente llamado “eluyente (o eluente)” o fase móvil a través de un medio fijo o fase estacionaria. Los componentes que se han de separar se distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil o fluido que pasa a través o a lo largo de la fase estacionaria. Como los componentes de la mezcla presentan diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las dos fases, la separación se da por el movimiento de la fase móvil en relación con la estacionaria y de la distribu-ción de las sustancias entre las fases. Las moléculas que se disuelven mejor en

Capítulo 9


la fase móvil serán “eluídas” más rápido en comparación con las que son más solubles en la fase estacionaria o establecen interacciones de algún tipo con esta y tienden a quedar retenidas.

El principio fisicoquímico básico de todas las técnicas cromatográficas es el coeficiente de distribución o partición (KD o KP), que describe la manera en la cual una sustancia se distribuye entre dos fases.

KP = [sustancia] fase 1/[sustancia] fase 2

Las dos fases (estacionaria y móvil) no tienen que ser líquidas, necesaria-mente. Pueden ser las fases: líquido-líquido, gas-líquido, gas-sólido etc., se-leccionándose la combinación más adecuada, donde las sustancias que se han de separar tengan diferentes coeficientes de partición.

En la actualidad existen diferentes variantes de cromatografía bien identifi-cadas de acuerdo con el mecanismo de retención-separación de las sustancias, estas son:

1. Cromatografía de partición. Se alcanza un equilibrio entre una fase esta-cionaria líquida (sostenida en un soporte sólido) y una fase líquida móvil.

2. Cromatografía de adsorción. El equilibrio ocurre entre el soporte sólido que adsorbe las moléculas (fase estacionaria) y una fase móvil, líquida o gaseosa.

3. Cromatografía de intercambio iónico. Se alcanza un equilibrio entre un intercambiador sólido (la fase estacionaria) y una fase líquida que contiene electrólitos.

4. Cromatografía de exclusión molecular o de filtración en gel. El equilibrio ocurre entre las fases líquidas contenidas dentro de esferas porosas (fase estacionaria) y la fase líquida en el exterior de las esferas.

5. Cromatografía de afinidad. Se obtiene un equilibrio entre una macromo-lécula disuelta en una fase líquida (fase móvil) y otra molécula ligada al soporte sólido por la que tiene alta afinidad.

6. Cromatografía gaseosa. Es una variante de las técnicas 1 y 2, ocurre cuando la fase móvil es un gas en lugar de un líquido.

La selección de una técnica cromatográfica, en particular, depende de la naturaleza de la biomolécula que se quiere aislar o separar y del medio donde esté contenida. Pueden ser aplicadas diferentes técnicas cromatográfica para conseguir una completa purificación, pero es frecuente combinarlas con otras técnicas de separación de biomoléculas, como la electroforesis.

También existen otras maneras de clasificar e identificar las técnicas croma-tográficas. Por ejemplo, es posible clasificarlas de acuerdo con las caracterís-ticas físicas de la fase móvil. De esta forma existen dos variantes que tienen

Capítulo 9. Cromatografía 129

sus respectivas subclasificaciones al tener en cuenta las características físicas de la fase estacionaria:

1. Cromatografía de gases: a) Gas-líquido. b) Gas-sólido.

2. Cromatografía líquida: a) Líquido-líquido. b) Líquido-sólido.

Otra clasificación se basa en el tipo de dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase móvil y la estacionaria, y así en la literatura se hace referencia a:

1. Cromatografía en columna.2. Cromatografía plana:a) En capa fina.b) En papel.

Algunas de estas variantes de las técnicas cromatográficas, las más empleadas en bioquímica clínica, son objeto de análisis en este capítulo.

Cromatografía de adsorción en capa finaLa cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa unifor-

me de un adsorbente aplicado, previamente, sobre una placa de vidrio u otro soporte sólido.

Los requisitos y materiales esenciales son un adsorbente sobre placas de vidrio y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. También es preciso poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.

La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, etc.), ya que requiere de materiales simples, el tiempo necesario para conseguir las separa-ciones es mucho menor y la separación es por lo general mejor. Además, pueden emplearse reveladores corrosivos sobre soportes como la sílica, porque sobre papel destruirían el cromatograma. Se considera que los resultados son repro-ducibles con facilidad después de un periodo de entrenamiento.

En la cromatografía en capa fina, la fase móvil es líquida y la fase estacio-naria sólida. La fase estacionaria es polar y el “eluyente o eluente” es por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad son los menos polares. Los adsorbentes más utilizados son gel de sílice (sílica gel), óxido de aluminio (alúmina), tierra silícea, celulosa, carbón activo, y poliamidas. Como soportes del adsorbente se


utilizan láminas o placas de vidrio, plásticas o metálicas; algunas placas pueden tener un indicador de fluorescencia.

El gel de sílice es uno de los más utilizados como fase estacionaria, es dé-bilmente ácido, y su pH oscila entre 4 y 5. Los geles de sílice normales suelen contener impurezas de hierro y/o aluminio. El tamaño del grano suele ser de 10 a 40 μm y el tamaño de poro varía de 2 a 15 nm.

Aunque existen placas suministradas por firmas comerciales, es posible pre-parar las placas en el propio laboratorio siguiendo las instrucciones siguientes:

1. El adsorbente se vierte en agua destilada. Para mezclar homogéneamente es preferible agitar de modo mecánico.

2. La proporción de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. Dos partes de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general.

3. Dependiendo del tipo de separación que se desee (analítica o preparativa) se utiliza un tamaño de placa u otro. En general, para realizar una separación preparativa de 1 g de muestra es necesario una placa de vidrio de 20 por 20 cm; 35 g de adsorbente y 80 mL de agua destilada.

4. Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adi-ción de compuestos, tales como disoluciones tamponadoras o buffer para mantener el pH deseado. En la preparación de las placas también se pueden adicionar indicadores fluorescentes. Cabe destacar la adición de nitrato de plata (AgNO3), proceso al que se le denomina argentación; se utiliza para separar componentes insaturados.

5. El espesor de la placa es otro factor que se ha de tener en cuenta al preparar la placa; en general suele ser de 0,1 a 0,2 mm para separaciones analíticas y 0,5 a 2 mm para separaciones preparativas.

6. La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, los que afectarían el desarrollo del proceso cromatográfico. Para evitar eso existen en el mercado extensores que se utilizan para crear de forma mecánica placas homogéneas del espesor deseado. Si no se dispone del extensor, el proceso que se ha de seguir es el siguiente:

a) Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente. b) Agitar enérgicamente. c) Extender la mezcla sobre el soporte de vidrio. d) Hacer oscilar el recubrimiento de un lado a otro. e) Golpear con el dedo la parte inferior del soporte.

7. Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo después de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metálicas.

8. En este momento puede activarse el agente adsorbente calentándolo durante 30 a 60 min entre 105 y 110 °C (las placas de celulosa no deben calentarse más de 10 min a 105 °C) para expulsar así el aire. Es conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire, para evitar los agrietamientos que se producirían por efecto del cambio de temperatura.


La elección de la fase móvil líquida (eluyente) depende, lógicamente, del com-ponente que se va a separar, y también en cierta medida de la fase estacionaria.

Los principales eluyentes o eluentes empleados, en orden creciente de pola-ridad, son (según la serie de Trappe) los siguientes:

Éter de petróleo < ciclohexano < tetracloruro de carbono* < tolueno* < benceno < cloroformo* < dietiléter < acetona < n-propanol < etanol < metanol < agua < piridina

Donde: *: compuestos cancerígenos.

Los productos o muestras que se van a examinar se disolverán, cuando sea posible, en un disolvente apolar que tenga un punto de ebullición lo suficiente-mente bajo para que se evapore después de la aplicación. Sin embargo, a menudo se necesitan disolventes con algún grado de polaridad que se obtiene mediante mezclas de disolventes. La mezcla cloroformo: metanol (1:1), por ejemplo, ha demostrado ser muy efectiva.

Frecuentemente se emplean disoluciones de las muestras a 1 %, de manera que al aplicar 2 µL resulta una cantidad de 20 µg de producto sólido.

La muestra para análisis, entre 2 y 5 μL, se aplica por medio de un tubo capilar o una micropipeta en la superficie de la placa en forma de ban-da, punto o mancha, dejando una distancia de unos 2 cm desde el bor-de inferior. La muestra es adsorbida en la superficie por la acción de fuerzas o interacciones débiles (fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrogeno, etc.). Una vez aplicada la muestra, se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quede la muestra que se va analizar. A continuación, la placa se coloca en la cámara o tanque cromatográfico (Fig. 9.1), ya saturada la atmosfera interior con el eluyente (fase móvil líquida). Generalmente el eluyente se introduce en la cámara 1 h antes, para permitir esa saturación de la atmósfera.

El eluyente asciende o se desplaza por capilaridad en la placa y arrastra los componentes a lo largo de dicha placa produciendo “manchas” que representan los distintos componentes; la separación se da por migración diferencial, es decir, porque la fase móvil arrastra a las substancias apolares y las más polares son retenidas por la fase estacionaria, dando lugar a la separación.

Posteriormente se evapora el eluyente y la placa se analiza por medio de métodos químicos, en el que por inmersión o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes.

Los métodos químicos se basan en la reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados. El yodo se ha utilizado como reactivo revelador general, porque reacciona con compuestos orgánicos con tonos que varían entre el amarillo y el marrón. También se ha empleado como reactivo


Fig. 9.1. Tanque de vidrio para cromatografía en capa fina.

revelador general el ácido sulfúrico, el cual produce manchas negras con las sustancias orgánicas. Además de estos reactivos reveladores generales, existen otros específicos, como:

1. La ninhidrina para los aminoácidos.2. La 2,4-dinitrofenilhidracina para los aldehídos y cetonas. 3. El verde de bromocresol para los ácidos carboxílicos.

Entre los métodos físicos el más utilizado ha sido el añadir un reactivo fluorescente a la fase estacionaria o también por medio de métodos ópticos utilizando radiación ultravioleta o luz visible.

En la figura 9.2 se esquematizan los distintos pasos o etapas de la técnica descrita.

Donde: 1 Aplicación de la muestra. 2 Se sumerge el extremo inferior en la fase móvil. 3 a 5 La fase móvil asciende por capilaridad y se va produciendo

la separación de los componentes. 6 Se marca el frente de avance del disolvente y se deja secar la placa. 7 Revelado de los componentes ya separados y medida de su avance.

El cálculo de la migración relativa de cada componente factor de resolución (RF del inglés ratio of front) con respecto al máximo posible (D) sería así:

RF de la fracción a = a/D RF de la fracción b = b/D RF de la fracción c = c/D


El análisis puede ser de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el de tipo cualitativo se hacen comparaciones visuales de color e inten-

sidad, principalmente. En el semicuantitativo se observa el diámetro y se realiza una comparación

visual de la intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentración conocida.

En la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisión a través de la sustancia y medidas de emisión o medida de luz reflejada desde la sustancia, así como espectrofotometría por fluorescencia. Esta técnica se utilizó mucho en el análisis de mezclas de aminoácidos.

La constante RF es simplemente una manera de expresar la posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal, mide la retención de un componente y se define como:

RF = X/YDonde: X: distancia recorrida desde el origen por el compuesto. Y: distancia recorrida desde el origen por el frente del eluyente.

La distancia recorrida por el compuesto se mide, generalmente, desde el centro de la mancha, y los cálculos se simplifican, si el denominador de esta fracción es 10.

Para que el factor de resolución sea reproducible, deben ser fijadas una serie de condiciones:

1. Espesor de la placa.2. Fase móvil.3. Fase estacionaria.4. Cantidad de muestra.

El máximo valor, que se puede alcanzar, del factor de resolución es, por supuesto, 1.

Fig. 9.2. Pasos de la técnica de cromatografía en capa fina.


Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los factores de resolución y, si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario, si los fac-tores de resolución son iguales, los compuestos pueden ser iguales o no serlo.

Cromatografía en capa fina de aminoácidosEsta técnica es llevada a cabo con placas de vidrio cubiertas por una fina capa

de material adsorbente, como el gel de sílice, que constituye la fase estacionaria. Para esto se necesita:

1. Materiales y reactivos: a) Tanque cromatográfico. b) Estándares de aminoácidos.c) Placas de gel de sílice para cromatografía en capa fina (usualmente sumi-

nistradas por firmas comerciales). d) Butanol. e) Ácido acético. f) Ninhidrina. g) Estufa.

2. Procedimiento:a) Preparación de la muestra biológica.b) Preparación de los estándares (1 mg/mL) en agua.c) Preparación del disolvente o fase móvil: butanol, ácido acético y agua (2:2:1).d) Verter el disolvente en el tanque cromatográfico y cerrarlo con su tapa

para saturar la atmosfera interior con vapores.e) Activar las placas de gel de sílice calentándolas en la estufa a 100 °C

por 10 min.f) Extraer las placas de la estufa, dejarlas enfriar, y hacer una marca (línea

con una regla y lápiz) a 2 cm de uno de los extremos de la placa.g) Aplicar, a nivel de esa línea o marca, las muestras y los estándares utili-

zando tubos capilares (no más de 10 μL).h) Colocar la placa de gel de sílice en el tanque cromatográfico, asegurando

que el disolvente quede por debajo de la línea o marca de 2 cm hecha con anterioridad y utilizada como referencia para aplicar las muestras y estándares. El disolvente, por capilaridad, debe ascender en la placa hasta que alcance, aproximadamente, 90 % de la longitud de la placa.

i) Secar las placas en la estufa a temperatura de 60 a 70 °C por 15 min.j) Rociar con ninhidrina: 0,75 g de ninhidrina + 50 mL de n-butanol + 1,5 mL

de ácido acético glacial. k) Calentar las placas a 100 °C durante 10 a 15 min hasta que el color

se desarrolle.


l) Hacer un círculo alrededor de cada mancha, con lápiz preferiblemente, y medir las distancias de cada mancha con una regla milimetrada desde la línea de aplicación hasta el centro de la mancha.

m) Dividir esa distancia por la distancia total de desplazamiento de la fase móvil para obtener los RF.

Cromatografía en papelEl proceso es básicamente el mismo, solo que se emplean tiras de papel

cromatográfico en el tanque de cromatografía.1. Equipos, materiales y reactivos:

a) Tanque cromatográfico.b) Papel cromatográfico Whatman Nº 1.c) Viales plásticos con tapa.d) Puntas de micropipetas. e) Disoluciones patrón a 0,5 % de aminoácidos. f) Fase móvil: n-butanol, acético glacial y agua (12:3:5). g) Rociar con revelador de ninhidrina: 0,75 g de ninhidrina más 50 mL de

n-butanol más 1,5 mL de ácido acético glacial. h) Si se trata de identificar péptidos, es conveniente la preparación siguiente:

disolución de ninhidrina a 0,1 % en etanol con 2 mL de piridina. 2. Procedimiento:

a) Se traza a 2 cm del borde inferior de la tira de papel Whatman una línea con lápiz y sobre ella se marcan los puntos donde serán aplicadas las muestras, identificando cada una.

b) Aplicar sobre cada uno de los puntos, con la punta de una micropipeta o de un capilar de vidrio, cada una de las respectivas disoluciones de modo que se forme una mancha de unos 5 mm de diámetro.

c) Introducir el papel en el tanque, de manera que el líquido no moje la línea, y cerrar la tapa para que la atmósfera interior se sature del vapor de la fase móvil.

d) Se deja, al menos, 30 min para que se desarrolle el proceso.e) Se sacan las tiras antes que el disolvente moje la pinza de sujeción (pinza,

que colocada en la parte superior del tanque cromatográfico, mantiene el papel en posición vertical) y se marca el punto alcanzado por la fase móvil.

f) Las tiras se secan en corriente de aire caliente hasta que no se aprecie olor a butanol.

g) Se rocía (mediante spray) con una disolución de ninhidrina y se seca para que tenga lugar el desarrollo de color.

h) Se mide la distancia desde la línea de aplicación de las muestras hasta cada mancha y se calculan los valores del factor de resolución para cada aminoácido.


Cromatografía de intercambio iónicoLa cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen

una carga neta, positiva o negativa. Esta cromatografía se utiliza para separar sustancias iónicas y solubles en agua. La carga de la matriz de la columna, así como la carga de las moléculas que se han de separar, dependen del pH del disolvente o fase móvil y de su fuerza iónica.

En determinadas condiciones, las moléculas que tengan una carga opuesta a la de la matriz del gel son retenidas en la columna, como se aprecia en el esquema de la figura 9.3. Cuando la fase estacionaria tiene cargas positivas retiene las moléculas con carga negativa de una muestra aplicada en la parte superior de la columna.

Fig. 9.3. Esquema simplificado de la cromatografía de intercambio iónico.

Habitualmente la resina está unida a un contraion; por ejemplo, en las expresio-nes que siguen M es el contraion intercambiado por X+, si se trata de una resina de intercambio de cationes, o Y-, si es intercambiadora de aniones.

Intercambio: Catiónico R-A- M+ + X+ ↔ R-A- X+ + M+ Aniónico R-A+ M- + Y- ↔ R-A+ Y- + M-


Si la matriz de la fase estacionaria tiene carga positiva, une aniones, ya sea los del disolvente o los de la muestra; por esa razón se denomina a esta cro-matografía de intercambio aniónico. Por el contrario, si tiene carga negativa, une cationes, por eso se denomina a estas resinas de intercambio catiónico. El proceso de intercambio se puede llevar a cabo de forma estática (en batch o lote, es decir poniendo en un recipiente la resina, añadiendo a continuación la disolución con los iones y dejando reposar un tiempo) o dinámica en una co-lumna. La unión de los iones de la muestra a la matriz es un proceso reversible, y pueden ser liberados al final cambiando la fuerza iónica o el pH del tampón de la fase móvil.

Las resinas intercambiadoras pueden ser clasificadas, según su composición química, en:

1. Inorgánicas. Entre las inorgánicas se encuentran zeolitas naturales, hidróxido de

cromio y otras. 2. Orgánicas. Las más empleadas en purificaciones de biomoléculas son las orgánicas,

que a su vez se pueden dividir en: a) Naturales. Entre las naturales se encuentras las resinas derivadas de polisacáridos,

como celulosa y dextranos. Por sulfonación u oxidación de la celulosa se obtienen intercambiadores catiónicos con grupos: −COOH o −SO3H.

b) Sintéticas. Las artificiales o sintéticas son las más empleadas y se obtienen por

polimerización de benceno y estireno. También se ha utilizado el ácido metacrílico en lugar de estireno. Los anillos originales del benceno pue-den modificarse de tal manera que presenten grupos −SO3H (intercambio catiónico) o grupos –NR3

+ (intercambio aniónico).

Cualquier resina de intercambio iónico es conveniente que posea las propie-dades siguientes:

1. Tamaño de poro controlable y uniforme.2. Resistencia química y física.3. Estructura de gel hidrófilo.4. Alta capacidad de intercambio.5. Estable en sus características en el tiempo.

Todas estas propiedades son importantes porque el tamaño del poro influye en que mayor número de moléculas iónicas de interés accedan a los sitios de intercambio de la matriz y sean retenidas. Tanto los grupos internos como los más externos de la matriz forman parte del proceso de intercambio. Esto puede determinar que la capacidad teórica de la resina no sea la misma con respecto a la biomolécula de interés.


La capacidad (Q) se define como el número de grupos iónicos en miliequi-valentes por gramo (mEq/g) de resina seca o miliequivalentes por mililitro (mEq/mL) de resina húmeda.

Para una resina determinada, cuanto mayor es la carga del ion, mayor será su retención. Para una resina catiónica el Ca2+ es mejor retenido que el Na+ y para una aniónica, por ejemplo, el SO42- será mejor retenido que el Cl-. A igualdad de carga, los iones con menor radio son mejor retenidos en las resinas.

Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidadLa cromatografía de afinidad se basa en la interacción, específica y reversible,

que se presenta entre una biomolécula de interés (llamada genéricamente afinante por algunos autores) con otra molécula particular que se conoce con el nombre de ligando. En muchas ocasiones el ligando es el que se fija o inmoviliza en el soporte sólido, en otras el afinante se fija al soporte sólido. Aunque esto no siempre es así, los afinantes son muchas veces macromoléculas de alto peso molecular, como proteínas, y los ligandos, moléculas de menor peso molecular.

La interacción de estas dos moléculas, afinante y ligando, es muy específica, similar a la que se presenta en múltiples casos de reconocimiento molecular, como por ejemplo, entre un(a):

1. Enzima y su sustrato.2. Hormona y su receptor.3. Soluto y una proteína transportadora de membrana.4. Antígeno y un anticuerpo.

A finales de los años 60 y principios de los 70 del siglo pasado se publicaron los primeros trabajos que tienen en cuenta esta interacción para separar proteínas específicas.

Cuatrecasas et al. (1968) y Cuatrecasas (1969 y 1970) sentaron las bases que son utilizadas hasta ahora para la purificación de diversas biomoléculas (afinantes), o en otros casos para la purificación de sus ligandos.

En los primeros artículos sobre cromatografía de afinidad se describieron, tanto las características que deben presentar los diferentes soportes, como las metodologías de activación que se emplearon para unir un ligando a la matriz.

El principio de la cromatografía de afinidad es el reconocimiento molecular basado en interacciones muy específicas entre un ligando y una biomolécula. Las interacciones se basan en la complementariedad espacial y las interacciones débiles que pueden existir entre moléculas o partes de estas.

La naturaleza química del ligando puede ser muy variada; puede ser un receptor (proteína) unido a las esferas de la matriz, que selecciona a su afinante o ligante de una mezcla compleja de biomoléculas, o en otros casos puede ser


el antígeno empleado en una inmunización, el que recubre las esferas y retiene, del suero del animal experimental, los anticuerpos (afinantes) que lo reconocen (anticuerpos purificados por inmunoafinidad).

En otro tipo el ligando que recubre las esferas son anticuerpos que retienen en la columna a las proteínas que contienen los epítopes que reconocen esos anticuerpos. En otro caso el ligando unido a la matriz puede ser el sustrato de una enzima.

En algunas ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando, con la disolución que contiene las biomoléculas que se han de purificar. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elución, primero de las biomoléculas no unidas y, posteriormente, de las retenidas o de interés.

La cromatografía de afinidad ha sido una herramienta de enorme importancia para el aislamiento, purificación y caracterización de diversas biomoléculas. Además, se ha empleado ampliamente para determinar diferentes parámetros que rigen la interacción de dos macromoléculas, como son las constantes de asociación o de disociación, concentraciones máximas y mínimas de sustratos, entre otras.

Las etapas fundamentales de la cromatografía de afinidad son las siguientes:1. Inmovilización del ligando en una matriz (o el afinante, según sea el caso).2. Adición a la columna de una mezcla compleja, con una molécula o afinante

de interés.3. Adsorción de la molécula a la matriz, por unión específica afinante-ligando. 4. Desadsorción del afinante.

En la figura 9.4 se muestra un esquema de la cromatografía de afinidad. Las esferas o partículas del gel están unidas a un ligando por el cual tienen afinidad algunas de las moléculas de la mezcla compleja aplicada a la columna. Solo son retenidas las moléculas de la mezcla que establecen una unión muy específica mediante reconocimiento molecular con el ligando de las esferas.

Para “eluir” la molécula retenida en la columna por el ligando se aumenta la fuerza iónica de la fase móvil, o se incluye el mismo ligando disuelto en el disolvente, pero a una concentración elevada para que compita con el ligando fijo en la matriz por la misma biomolécula o afinante. También la “elución” se puede realizar modificando las propiedades de carga del ligando, por ejemplo, si se cambia el pH de la fase móvil.

La afinidad que tenga un ligando por algún afinante específico es una con-sideración de enorme importancia para la correcta selección del ligando. Un modelo matemático simple para describir la adsorción de algún afinante a la columna, en términos de unos cuantos parámetros medibles, puede ser útil para evaluar el posible empleo de un ligando.


Fig. 9.4. Principio de la cromatografía de afinidad.

Si la concentración de un afinante o molécula específica se representa por [M] y la del ligando por [L], entonces:

M + L ↔ ML KD ꞊ [M][L]/[ML] (9.1) Donde: KD: representa la constante de disociación del complejo afinante-ligando.

Si se considera que M0 se refiere a las concentraciones iniciales de la molécula (afinante) y L0 es la concentración del ligando inicial, es posible plantear a partir de la ecuación 9.1:

KD ꞊ [M0 - ML][L0 - ML]/[ML] (9.2)

En la mayoría de los casos L0 >>> M0 y por tanto L0 >>> ML, convirtiéndose

la ecuación (9.2) en la siguiente: KD ꞊ ([M0] - [ML]/[ML])(L0) (9 .3)


Reagrupando esta última ecuación (9.3) se obtiene la siguiente:

[ML]/[M0] = (L0/KD)/(1 + L0/KD) (9.4)

La ecuación (9.4) define la fracción de la molécula afinante unida al ligan-do de la matriz, y a una concentración fija de afinante inicial (M0), cuando la concentración de ligando inicial (L0) es variable. Esta ecuación permite una estimación aproximada del valor máximo de la constante de disociación entre un ligando inmovilizado y un afinante, con la finalidad de que se efectúe una unión útil del afinante a la matriz.

Así por ejemplo, si la matriz tiene un ligando inmovilizado, cuya concentra-ción es 5 μmol/g (o μmol/mL, aproximadamente) de matriz, es decir, 5 mM y se pretende una adsorción cuantitativa (98 %) del afinante a la matriz, la constante de disociación del complejo afinante-ligando inmovilizado debe ser por lo menos de 0,1 mM siguiendo los parámetros de la ecuación (9.4).

A una L0 = 10 mM los cálculos basados en la ecuación (9.4) sugieren que para efectuar una buena unión del afinante la constante de disociación debe ser al menos de 0,5 mM. Con ligandos que exhiben valores de KD > 0,5 mM el problema es otro y consiste en que es necesario acoplar el ligando a una concentración suficientemente alta; pero para eso existe un límite práctico impuesto por la matriz.

Por lo tanto, basados en los datos anteriores se muestra que a una concen-tración típica de ligando inmovilizado de 5 a 10 mM se permiten constantes de afinidad de entre 0,1 y 0,5 mM. Los probables ligandos, cuya KD sea mayor que 0,5 mM deben descartarse y buscar otros con mayor afinidad.

Para activar la columna y después fijar el ligando a las esferas se utilizan los reactivos bromuro de cianógeno, hidracina, glutareldehido, algunos de los cuales son tóxicos.

La fijación del ligando puede ser:1. Directa.2. Indirecta (utilizando un brazo espaciador).

En la figura 9,5 se observan algunos brazos espaciadores utilizados para la fijación indirecta del ligando y los tipos de enlace químico que se establecen con las agrupaciones atómicas del ligando.

Las matrices o soportes utilizados en cromatografía de afinidad son, por lo general, geles que deben cumplir con una serie de requisitos a fin de lograr obtener el producto deseado con menores dificultades y en mayor grado de pureza. Según Cuatrecasas y otros autores la matriz ideal debería tener las propiedades siguientes:

1. Insolubilidad. Este aspecto es muy importante, no solo para prevenir la pérdida del adsorbente sino, también, para evitar la contaminación de la muestra.


Fig. 9.5. Matriz de agarosa con brazos espaciadores para unión indirecta del ligando (L).

2. Gran permeabilidad y área específica. Si la matriz no posee la suficiente permeabilidad (referida como el tamaño del poro) no permite la libre in-teracción del ligando con el afinante, impidiendo así una buena adsorción de este último a la columna y por tanto una buena purificación. Es muy importante hacer notar que el área de superficie específica (área que se encuentra en contacto directo con la molécula que se desea aislar) está directamente relacionada con la cantidad de afinante que se puede aislar; por lo tanto, mientras mayor sea el área específica de la columna, mayor será la cantidad de afinante purificado.

3. Rigidez. Se plantea que la forma de la partícula de la matriz está directa-mente relacionada con el problema de la velocidad de flujo. En general para cromatografía de afinidad se utilizan flujos lentos con la finalidad de dar oportunidad al afinante de penetrar los poros de la matriz y encontrar a su ligando. Altas velocidades de flujo provocan que las partículas de la matriz se deformen por compactación, incrementando la resistencia al flujo. Como recomendación el tamaño de la partícula debe estar entre 5 y 200 μm.

4. Adsorción inespecífica baja. Las matrices deben adsorber lo menos posible (idealmente cero) al afinante. La adsorción inespecífica del afinante a la matriz provoca cantidades subóptimas de recuperación y puede provocar la desnaturalización de la molécula de interés. Es por esta razón que debe evitarse el empleo de matrices que contengan grupos iónicos.

5. Reactividad y resistencia a cambios fisicoquímicos. La matriz debe tener suficientes grupos químicamente reactivos que puedan ser activados o mo-dificados de tal forma que sean capaces de unir la molécula de interés. La


capacidad de una columna, es decir, cuántas moléculas de afinante puede unir, está en función directa del número de grupos reactivos que existan en la matriz. La modificación o activación de la matriz deben hacerse bajo condiciones que no alteren su estructura. De igual forma es importante que la matriz no se altere bajo las condiciones de trabajo, así como a diferentes valores de pH, temperatura, fuerza iónica y bajo la presencia de agentes desnaturalizantes. El hecho de poder reutilizar una columna depende de estos factores.

6. Resistencia a agentes biológicos. La matriz no debe ser degradada por microorganismos o enzimas. Este requerimiento lo cumplen muy satisfacto-riamente las matrices inorgánicas como las de vidrio o polímeros sintéticos (poliacrilamida o hidroxialquilmetacrilato).

Clasificación de las matrices

Las matrices más utilizadas en cromatografía de afinidad se dividen en tres grandes grupos:

1. Matrices de polisacáridos: a) Agarosa. b) Celulosa. c) Dextrano.

2. Matrices sintéticas: a) Poliacrilamida. b) Vidrio.

3. Otras matrices.

Algunas características importantes de las matrices más comunes se describen a continuación.

Matrices de polisacáridos

AgarosaLa agarosa es un polímero lineal de unidades de D-galactopiranosa unida

por enlace β-glucosídico 1-4 a la 3,6 dehidro-L-galactosa (Fig. 9.6.). Se ob-tiene descomponiendo el agar en las dos moléculas que lo forman: agarosa y agaropectina.

La agarosa pura (cuyo nombre comercial más común es sefarosa) permite utilizarla en concentraciones muy bajas (< 0,5 %) y facilita la formación de poros de tamaño muy grande. El agar como tal (agarosa más agaropectina) también


permite la formación de poros muy grandes, además de ser muy estable mecá-nicamente bajo las condiciones que se requieren en cromatografía de afinidad; sin embargo, contiene grupos sulfato y, en menor número, grupos carboxilo que le proporcionan al agar características iónicas que no son deseables en la cromatografía de afinidad.

Fig. 9.6. Unidad de disacárido repetitivo en la agarosa.

Las agarosas comerciales contienen cerca de 0,37 % (w/v) de sulfuros y varían enormemente en el contenido de grupos sulfato. Es recomendable dar un trata-miento previo a la matriz con hidroborato de sodio para remover estos grupos.

La estructura de la matriz de agarosa no se mantiene por enlaces covalen-tes, como sucede en las matrices de dextrano, sino que se debe a puentes de hidrógeno entre cadenas vecinas (probablemente hélices triples). Sin embargo, cuando se adicionan agentes que destruyen estos puentes, como urea, cloruro de guanidina, iones y algunos detergentes utilizados para recuperar la muestra, no se aprecia una disminución en la estabilidad de la matriz. Por lo tanto, existen otras fuerzas involucradas en este fenómeno, pero aun no son bien conocidas.

Una matriz de agarosa pierde su estabilidad cuando es expuesta al calor por periodos prolongados. Se recomienda no utilizarla por debajo de 0 °C ni por arriba de 40 0C. La esterilización por calor debe evitarse. Por otro lado, estas matrices son estables en un rango de pH de 4 a 9.

Aunque la tolerancia no es indefinida, se ha demostrado que estas matrices no se afectan durante la exposición a:

1 a 2 M de NaCl 8 M de urea 6 M de cloruro de guanidina 0,4 % de deoxicolato de sodio 3 % de SDS 0,5 % de tritón X-100

También, toleran bajas concentraciones de disolventes orgánicos como: Etilenglicol Etanol


Metanol Acetona Butanol Piridina (80 % v/v) Dimetilformamida (50 %)

Celulosa

Es un polímero lineal de β1-4-D-glucosa (Fig. 9.7). Es una matriz fibrosa y poco uniforme, que no permite la formación de poros grandes, por lo que impide el paso de grandes macromoléculas.

Las fibras de celulosa comprenden una agregación de cadenas de este poli-sacárido unidas unas a otras por varios puentes de hidrógeno. Esta estructura da lugar a zonas “cristalinas” de alto grado de agregación y a zonas “amorfas” o desordenadas. La relación entre estas dos zonas es, particularmente, sensible a las condiciones fisicoquímicas utilizadas en la preparación del ligando.

A pesar de los inconvenientes las características de la celulosa han permitido emplearla en varios protocolos de purificación. La celulosa comercial está preparada en forma de microfibras o microcristales esferoides que exhiben buenas velocidades de flujo.

Fig. 9.7. Estructura repetitiva en la celulosa.

Dextrano

Es un polímero de glucosa unido por enlaces α1-6-glucosídico, con enlaces cruzados también, que es producido por varias cepas de Leuconostoc mesente-roides (bacteria asociada con la fermentación) y comercialmente se prepara en disoluciones acuosas con alto contenido de azúcar (Fig. 9.8).

El dextrano soluble, preparado por precipitación fraccional con etanol de dextrano parcialmente hidrolizado, contiene más de 90 % de enlaces α1-6-glu-cosídico y se ramifica en enlaces 1-2, 1-3 y 1-4. Cuando se entrecruza con 1-cloro,2,3-epoxipropano en disolución alcalina el dextrano obtiene una con-formación tridimensional.


La forma comercial de las matrices de dextrano se conoce como sephadex. Esta matriz tiene una naturaleza altamente hidrofílica debido al gran número de grupos hidroxilos presentes, lo cual permite que se hidrate fácilmente con disoluciones electrolíticas. El proceso de hidratación y secado es reversible y no afecta de forma significativa las propiedades cromatográficas de la matriz aun después de varios ciclos.

Fig. 9.8. Estructura molecular parcial del dextrano.

El sephadex es muy estable químicamente. Por ejemplo, resiste 2 meses en 0,25 M NaOH a 60 0C, 6 meses en 0,02 M HCl o de 1 a 2 h en 88 % de ácido fórmico. Más aun puede ser calentado a 110 0C por 40 min sin pérdida de propiedades.

Comercialmente el sephadex puede tener un rango de exclusión que llega hasta los 800 kDa. El rango de exclusión se refiere a los pesos moleculares mínimos y máximos de la moléculas para ser fraccionadas convenientemente, lo cual se explicara detalladamente más adelante, en la descripción de la cromatografía de exclusión molecular. La activación de estas matrices por los métodos conven-cionales da lugar a un considerable grado de entrecruzamiento, lo cual baja su rendimiento aun en la purificación de afinantes de bajo peso molecular.

A pesar de esta dificultad, el tener un poro de pequeño tamaño ha sido con-siderado como una ventaja. Dado que el afinante no va a penetrar los poros, se puede unir el ligando a la superficie de las partículas de la matriz con la finalidad de permitir el mayor grado de interacción. Esta idea ha sido, particularmente, explotada para purificar complejos supramoleculares como ribosomas, poli-somas, virus, organelos, fragmentos de membrana o hasta células completas.


Matrices sintéticas

Poliacrilamida

Para producir la poliacrilamida se mezcla acrilamida, en diferentes pro-porciones, con el agente entrecruzante N,N’metilen-bis-acrilamida (ver Fig. 8.3).

La ausencia de grupos cargados en esta matriz no permite la adsorción inespecífica del afinante. Sin embargo, moléculas con características ácidas o básicas, así como, con grupos aromáticos pueden absorberse al esqueleto de la matriz.

Una ventaja de las matrices de poliacrilamida es que pueden ser activa-das con diversos procedimientos y permiten la unión de muchos posibles ligandos. Aun cuando se han utilizado para purificar una gran cantidad de compuestos (enzimas, linfocitos, anticuerpos entre otros) tiene baja permeabilidad, lo cual puede provocar que el ligando inmovilizado quede lejos del alcance del afinante.

Vidrio

Las matrices de vidrio han sido poco utilizadas en cromatografía de afinidad. Se obtienen al calentar borosilicato de sodio a temperaturas entre 700 y 800 °C, y luego lixiviarlas con ácido.

La lixiviación es un proceso por el cual se extrae uno o varios solutos de un sólido, mediante la utilización de un disolvente líquido; por ejemplo, el azúcar se separa por lixiviación de la remolacha con agua caliente.

Las matrices de vidrio tienen las características siguientes:1. Una distribución uniforme del tamaño de los poros.2. Buena permeabilidad.3. No son atacadas por microorganismos.4. Tampoco son afectadas por cambios de pH.5. La fuerza iónica del eluyente no las altera.

Sin embargo, presentan cierto grado de adsorción inespecífica, por lo que su empleo se ha visto restringido.

Cromatografía de exclusión molecularActualmente la cromatografía de exclusión molecular es un procedimiento

muy utilizado en laboratorios de investigaciones con el propósito de separar proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos y otras biomoléculas. Es una de las


técnicas cromatográficas más simples y se emplea con frecuencia en las pri-meras etapas de aislamiento y caracterización, por ejemplo, de una proteína, para después emplear otras técnicas de purificación como la cromatografía de intercambio iónico o la electroforesis en poliacrilamida.

Si se logra una proteína purificada, esta puede ser empleada para preparar anticuerpos contra esta misma proteína u otros fines.

A esta cromatografía de exclusión molecular también se le denomina filtración en gel o tamiz molecular.

La cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel se basa en que las moléculas son separadas por su tamaño y forma. En esta técnica, a diferencia de la cromatografía de afinidad y la de intercambio iónico, las moléculas no se unen al medio cromatográfico y las características del tampón utilizado no afecta la resolución o separación de los diferentes componentes obtenidos al final.

La fase estacionaria en esta técnica consiste en esferas de un material espon-joso que contiene poros por los que atraviesan moléculas de proteína u otras, de diferentes tamaños. La fase móvil consiste en una disolución acuosa con moléculas de diferentes tamaños como soluto.

Si esta disolución acuosa con estos solutos pasa a través de una columna, por ejemplo, de sephadex, las proteínas u otras macromoléculas muy grandes no pueden entrar en los poros de las esferas y entonces realizan un rápido viaje por la columna. Las biomoléculas pequeñas sí logran penetrar en estas cavidades y, por lo tanto, migran en la columna más despacio. La disolución (o eluyente) que sale de la columna por su parte inferior es constantemente reemplazada por un volumen idéntico por la parte superior, a partir de algún reservorio.

Para la separación de proteínas y polisacáridos se utilizan, como fase es-tacionaria, polímeros lineales entrecruzados, es decir, que forman enlaces transversales.

Los polímeros lineales entrecruzados más comunes son:1. Dextranos (marca comercial Sephadex).2. Agarosa (Sepharosa y Biogel A).3. Poliacrilamida (Biogel P).

Estos materiales, en forma de pequeñas partículas de forma esférica, se ex-panden o hinchan al sumergirlos en disoluciones acuosas y generan un retículo o matriz tridimensional, con poros de tamaño definido.

Cada uno de estos geles se caracteriza por un rango de fraccionamiento o rango de exclusión que depende de los tamaños del poro, correspondiendo el menor de estos al peso molecular de una sustancia que difunde, perfectamente, a través de los poros del gel, y el mayor, al peso molecular de una sustancia que


es excluida, es decir, que no penetra en las esferas del gel. Las moléculas con un peso molecular fuera de ese rango no son fraccionadas adecuadamente, sino que se extraen con el volumen vacío (V0) las de peso molecular mayor que el rango, o con el volumen total (VT) las más pequeñas de dicho rango.

La mezcla de biomoléculas se deposita con cuidado en la parte superior de la columna, de manera que al ir hacia abajo, las proteínas se van separando por las distintas interacciones con las esferas sólidas (Fig. 9.9).


La colección de las distintas fracciones se puede realizar de manera manual o mediante un dispositivo automático acoplado a un sistema de detección y registro (Fig. 9.10).

Fig. 9.9. A y B: dibujos esquematicos de la cromatografia de exclusion mo-lecular. Las moléculas de mayor peso molecular eluyen primero en la croma-tografía de exclusión molecular.

Fig. 9.10. Dispositivo para colección y detección de componentes de las fracciones obtenidas por cromatografía de exclusión molecular.

B


Los componentes separados de la muestra se detectan en el eluato: 1. Mediante el análisis continuo, por ejemplo: a) Midiendo absorbancia a 280 nm para proteínas. b) Midiendo absorbancia a 260 nm para ácidos nucleicos. c) Midiendo radiactividad.

2. Mediante el análisis de las fracciones, una vez recogidas:a) Cualquier tipo de análisis (absorbancia, radiactividad, ensayo enzimático,

ensayo biológico, etc.).

La separación mejora (es decir, la resolución) a medida que es mayor la longitud de la columna. Otros factores que pueden afectar la resolución son:

1. Relación volumen de la muestra/volumen de la columna.2. Viscosidad de la muestra o del tampón.3. Tamaño de los poros de las esferas o partículas del gel. 4. Tamaño de las partículas.5. Empaquetamiento de la columna.6. Velocidad del flujo del eluyente.

La concentración de proteínas en el tampón de elución debe estar entre 1 y 3 mg/mL, según recomiendan varios autores. El volumen total de la muestra debe ser alrededor de 1 % del volumen total de la columna. Más adelante se explica cómo realizar estos cálculos. Un amortiguador de elución adecuado puede ser el siguiente:

50 mM de Na2HPO3/NaH2PO3 en 0,15 M de NaCl, a pH 7.0

El comportamiento de una molécula en una columna particular puede ser caracterizado, cuantitativamente, por su volumen de elución (VE). Antes de conocer este parámetro VE es necesario determinar el volumen de la fase esta-cionaria (VS). Este parámetro se halla por la diferencia entre el volumen total de la columna (VT) y el volumen (V0), que es el volumen nulo, muerto, o vacío (void volume), que es el volumen de la fase móvil que se encuentra fuera de las esferas (Fig. 9.11).

Se considera que en una columna bien empacada este volumen nulo debe ser igual a 30 % del volumen total. El volumen de la fase estacionaria, aunque imposible de medir con exactitud, puede ser calculado mediante:

VS = VT - V0

En la figura 9.12 se representan las relaciones existentes entre estos volúmenes en una columna cromatográfica.

Fig. 9.12. Relaciones entre los parámetros volumen nulo (V0), el volumen de elución o retención (VE) de una biomolécula que se logra separar, y el volumen total (VT) en una separación por cromatografía de exclusión molecular.

Fig. 9.11. Representación esquemática del significado del volumen nulo o vacío (V0), el volumen total de la columna (VT) y el volumen estacionario (VS) de la columna cromatográfica.


El volumen total también se calcula fácilmente por la fórmula geométrica πr2h, conociendo el largo o alto de la columna (h) y su radio (r). El volumen nulo se puede medir como el volumen de elución necesario para que un soluto, cuya masa o peso molecular (PM) sea mayor que el límite de exclusión del gel, pase por la columna. El dextran azul, un polisacárido, es comúnmente empleado con este propósito.

Se plantea que el volumen de elución para determinada molécula es:

VE = V0 + VS Kav

Sustituyendo la ecuación 9.6 en 9.7, se obtiene la expresión siguiente: VE = V0 + (VT - V0) Kav

Donde:Kav: es una aproximación al coeficiente de partición de las moléculas

(también nombrado Kd o Kp por distintos autores) en las fases lí-quidas dentro y fuera de las esferas; puede ser calculado a partir de las otras variables:

Kav = VE - V0/(VT - V0)

Aunque Kav no es idénticamente igual al KD o coeficiente de distribución de una biomolécula entre 2 fases, ya que no toma en cuenta el volumen de la matriz esponjosa, se puede considerar una muy buena aproximación. Su valor varía entre 0 y 1. Es 0, si la molécula no penetra en las esferas y VE = V0; y, si la molécula es muy pequeña y queda retenida, completamente, en la fase estacionaria, entonces VE = VT y KD será igual a 1.

En la literatura algunos autores prefieren referirse a tiempo muerto (TM) y a tiempo de retención (TR), en lugar de a volumen nulo, vacío o muerto y al volumen de elución, respectivamente. Pero, el tiempo muerto es equi-valente al volumen nulo o vacío y el tiempo de retención al volumen de elución o retención.

Con propósitos prácticos es posible determinar de forma experimental el volumen de elución de cada molécula y, conociendo los otros parámetros de la columna, estimar el Kav de cada molécula. La importancia de este parámetro es que existe una relación lineal inversa entre el logaritmo del peso molecular y el Kav de cada molécula. Utilizando patrones comerciales de proteínas con peso molecular conocido es posible construir una curva de calibración, a partir de la cual puede ser calculado el peso molecular de


cualquier proteína desconocida. Mediante un programa como Excel es posible construir esa curva de calibra-

ción, dibujarla y conocer sus parámetros. También puede ser utilizado un papel

Fig. 9.13. Curva de calibración en cromatografía de exclusión molecular.

semilogarítmico como en la figura 9.13.Aunque, sin lugar a dudas, el objeto de la cromatografía es separar diversos

componentes moleculares de una mezcla, es de gran importancia considerar la separación de esos componentes.

La separación entre dos bandas se evalúa teniendo en cuenta dos parámetros: 1. El cociente α o volumen de elución relativo entre dos bandas o picos: a y

b (α = VEa/VEb). 2. La resolución, que se define como el cociente entre las distancias entre las

dos bandas y el ancho promedio de las dos bandas en su base.

Por ejemplo, la resolución de una columna con respecto a la separación de dos proteínas, por ejemplo c y d en el diagrama de la figura 9.13, puede apreciarse visualmente o calculado de la manera siguiente:

1. Medir la diferencia entre los volúmenes de elución de los picos c y d en el máximo M de los picos (VEMd - VEMc).

2. Medir el ancho A de los dos picos de elución en su base y calcular el valor medio (Ad + Ac)/2.

Entonces la resolución (R) es calculada por la expresión:

R = (VEMd - VEMc) /(Ad + Ac)/2


Otro parámetro que se tiene en cuenta en una cromatografía es el factor ca-pacidad (C) que se puede determinar a partir de la expresión siguiente:

C = (VT - V0)/V0

Este factor C adimensional (también simbolizado por muchos como k’) ex-presa la capacidad de una columna cromatográfica para retener alguna biomo-lécula, independientemente del volumen de la fase móvil, con las propiedades termodinámicas de la columna y a una temperatura determinada. Normalmente se considera que debe estar entre 1 y 15 para no alargar mucho los tiempos de separación.

Algunos geles de sephadex están disponibles comercialmente y los que se utilizan con más frecuencia son los siguientes:

G-10 Útil en la separación de biomoléculas, tales como péptidos con peso molecular entre 100 y 700 Da (Daltons). También útil para eliminar sales, colorantes.

G-25 Recomendado para la separación de proteínas globulares. Este medio es excelente también para remover sales y otros contaminantes de moléculas con peso > 5 kDa.

G-50 Para la separación de moléculas entre 1,5 y 30 kDa. G-100 Recomendado para la determinación de pesos moleculares.

En resumen, la cromatografía de exclusión molecular tiene en el laboratorio de bioquímica clínica las aplicaciones siguientes:

1. Purificación de una biomolécula (al igual que otras técnicas cromatográficas).2. Establecer una correlación entre el tamaño molecular y la movilidad en la

columna de exclusión; por lo que esta técnica se emplea para determinar pesos moleculares.

3. Eliminar: a) Sustancias de pequeño tamaño molecular de una muestra proteica o de

otras macromoléculas (por ejemplo, las sales inorgánicas en un “desa-lado” de la muestra).

b) Exceso de reactivos tras tratar una proteína en el laboratorio. c) Inhibidores enzimáticos, etc.El resultado es similar a una diálisis, pero más rápido.

Cromatografía líquida de alta presión o alta eficaciaEn la cromatografía líquida de alta presión o alta eficacia (HPLC: del ingles

High pressure liquid chromatography/high performance liquid chromatogra-phy) se emplean partículas muy pequeñas en la fase estacionaria y una presión relativamente alta de la fase líquida.


En este tipo de cromatografía líquida, al igual que en otras ya descritas, la fase móvil es un líquido o disolvente que fluye a través de una columna que contiene la fase estacionaria; pero, en lugar de permitir que el disol-vente fluya o gotee en la parte superior de la columna por efecto de la gravedad, es forzado a fluir mediante altas presiones, las cuales pueden ser de hasta 400 atm.

En la fase estacionaria es posible utilizar partículas muy pequeñas, lo que permite una mayor superficie de interacción entre las moléculas contenidas en la fase móvil y la fase estacionaria.

Todo lo anterior determina que la cromatografía líquida de alta presión o alta eficacia tiene como ventajas:

1. Es un procedimiento rápido y tiene una gran resolución.2. Consiste en que los métodos de detección pueden ser altamente sensibles

y automatizados.3. Que, a diferencia de la cromatografía de gases, esta cromatografía no está

limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra.4. Que es capaz de separar: a) Macromoléculas. b) Especies iónicas. c) Productos naturales lábiles. d) Materiales poliméricos. e) Una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso

molecular. 5. Ofrecer la posibilidad de una mayor variedad de fases estacionarias, lo que

permite un mayor número de interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.

6. Con estas técnicas ha sido posible obtener resultados más rápidos y con mejor resolución que en cromatografía de adsorción, de afinidad, de inter-cambio iónico y de exclusión molecular.

La cromatografía líquida de alta presión o alta eficacia, es la técnica escogida para aislamiento y purificación de productos de valor en las industrias químicas y farmacéuticas, así como en la biotecnología y la bioquímica.

En resumen la cromatografía preparativa analítica puede ser utilizada en la identificación y caracterización de compuestos, tales como:

1. Antibióticos, sedantes esteroides y analgésicos.2. Aminoácidos, proteínas, carbohidratos y lípidos.3. Productos de alimentación: a) Edulcorantes artificiales. b) Antioxidantes. c) Aflatoxinas. d) Aditivos.


4. Productos de la industria química: a) Aromáticos condensados. b) Tensoactivos. c) Propulsores. d) Colorantes.

5. Contaminantes: a) Fenoles. b) Pesticidas. c) Herbicidas.

6. En química forense: a) Drogas. b) Venenos. c) Alcohol en sangre. d) Narcóticos.

7. Medicina clínica: a) Ácidos biliares. b) Metabolitos de drogas. c) Extractos de orina. d) Estrógenos.

Otras aplicaciones importantes de cromatografía son:1. Separación y purificación de metabolitos.2. Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de

muestras de orina.3. Separación y purificación de enantiómeros.4. Purificación de compuestos naturales.5. Purificación y caracterización de enzimas y proteínas.

Capítulo 10. Calidad en el laboratorio 159

Calidad en el laboratorio

Un principio importante en un laboratorio de bioquímica clínica, o de in-vestigación en bioquímica, consiste en alcanzar el máximo de calidad en el procesamiento de las muestras y en los análisis que se realizan, para que los resultados tengan valor.

El laboratorio de bioquímica clínica tiene una gran responsabilidad con las pruebas que realiza, ya que el diagnóstico y tratamiento de los pacientes se basa, en gran medida, en los resultados de estos análisis; las determinaciones que se llevan a cabo en un laboratorio de investigaciones también implican una gran res-ponsabilidad del investigador, porque resultados erróneos dan lugar a conclusiones equivocadas, pérdida de tiempo y gastos innecesarios y llevan a una violación ética importante, debido a que la investigación que no tiene buena base científica, ni buen diseño metodológico y no brinda resultados confiables, no es ética.

Si el trabajo se realiza con calidad, ello implica un máximo de confiabilidad en lo realizado, en primer lugar, por los propios laboratoristas, y quizás tan importante o más será la confianza que en esos datos tengan las personas ajenas al laboratorio.

Antiguamente, cuando un clínico recibía los resultados del laboratorio y no coincidían con la clínica del enfermo era muy común que se expresara ante los otros colegas durante el pase de visita de la manera siguiente: “Seguro que estamos en presencia de una ‘laboratoriopatía’ pues este paciente no puede tener esas cifras”.

En la actualidad, las ideas sobre la calidad se han desarrollado en tan alto grado, que en este ejemplo el laboratorista podría responderle al clínico: “Revise mejor el diagnóstico clínico de su paciente, pues estoy seguro de que esas cifras son verdaderas y no ocurrió ningún error del laboratorio”.

Estos enfrentamientos entre colegas (que no deben ocurrir porque ambos tienen como objetivo común mejorar la salud de un ser humano) cada vez se

Capítulo 10


están viendo menos en los hospitales y otras instituciones de salud, gracias a los sistemas de aseguramiento de la calidad y la calidad total.

Es conveniente definir algunos conceptos de la calidad y realizar un recorrido histórico breve de la evolución que estos han experimentado en el laboratorio, desde que surgieron hasta la actualidad.

En particular, resulta interesante la definición del concepto de calidad adop-tada por el Consejo de Acreditación Canadiense de los Servicios de Salud:

1. Realizar el procedimiento correcto o más apropiado (Fig. 10.1).2. Hacer bien ese procedimiento.3. Satisfacer al cliente.

Fig. 10.1. Procedimientos correctos en el laboratorio.

Evolución del concepto de calidadLos primeros laboratoristas se preocuparon por hacer los procedimientos

correctos en la fase analítica. Su inquietud principal era que los distintos reac-tivos, mezclados convenientemente, condujeran a una cifra que se aproximara lo más posible a la real del paciente.

Después, y como consecuencia de la implementación de técnicas estadísticas en la industria, allá por la década de 1940, se extrapolaron al laboratorio las técnicas de control de la calidad que permitían rechazar algún resultado o un grupo de estos, cuando se produjera una desviación significativa del comporta-miento esperado. Con estas técnicas se puso en evidencia que en un laboratorio no bastaba con trabajar con sumo cuidado, porque podían ocurrir tanto errores evitables como otros inevitables.

160 Bioquímica clínica... Capítulo 10. Calidad en el laboratorio 161

Se evidenció que no era suficiente controlar la calidad, ya que esto era como una necropsia; si ocurría algún error durante el proceso del análisis, sencilla-mente el laboratorio no entregaba los resultados, pero eso resultaba costoso en términos económicos, además de las molestias que les causaban a los pacientes y sus médicos.

De este modo surgió la necesidad de asegurar la calidad de todos los procesos que se realizan en el laboratorio, y que son:

1. Organización del laboratorio. 2. Utilización de reactivos de calidad en todas las técnicas. 3. Implantación del sistema de buenas prácticas de laboratorio, etc.

En la actualidad, tanto el control de calidad, como el aseguramiento de esta son componentes importantes del laboratorio clínico.

Pero, además, la calidad no es un proceso estático y se demuestra en el mundo moderno que una empresa que se conforme con la calidad de sus productos en un momento determinado termina por arruinarse en la competencia con las demás. Es necesario la mejoría continua de la calidad del laboratorio, sistemá-ticamente, introduciendo nuevas técnicas más eficientes y reproducibles, con métodos mejores para controlarlas.

También se ha hecho hincapié que para la mejoría continua de la calidad es muy importante conocer a las personas a las que sirve el laboratorio, estimular el liderazgo y mejorar, constantemente, todas las actividades del laboratorio.

Por último, ha aparecido el concepto de calidad total, que ya se aplica en las industrias modernas y que esencialmente se basa en que el laboratorio es un sistema y forma parte de otro sistema mayor y más complejo, como puede ser el hospital al cual brinda servicios, y mientras los conceptos de calidad no se apliquen como un todo al sistema completo, los resultados exitosos serán limitados.

El concepto de calidad total también implica toda una filosofía de dirección que incluye:

1. Organización del laboratorio.2. Educación y el entrenamiento del personal.3. Control.4. Aseguramiento.5. Mejoramiento continuo de la calidad.

Los problemas en el laboratorio se originan, básicamente, porque algunos procedimientos o procesos son incorrectos y la mayoría de las veces las causas no se deben a imperfecciones de las personas.

Los problemas de calidad son, primariamente, problemas de dirección, porque solo quien dirige tiene la posibilidad de cambiar determinados procesos en el laboratorio. Como es natural, la colaboración entre el director y el trabajador involucrado en determinado problema permite una solución más rápida.


Otra idea, planteada por Deming, W. E. (1969) es que el mejoramiento de la calidad reduce los costos, ya que un laboratorio con mejor calidad analítica elimina los análisis repetidos e incrementa su productividad.

Según algunos autores, la calidad total está basada en cinco aspectos fun-damentales:

1. Calidad de los procesos.2. Control de calidad.3. Aseguramiento de la calidad.4. Mejoría de la calidad.5. Planificación.

La unión de estos permite que el laboratorio alcance sus objetivos y cumpla sus metas.

La mayoría de los directores de laboratorio considera que no solo es impor-tante la calidad de la fase analítica para alcanzar resultados de alta calidad, sino que también lo es la calidad de las fases preanalítica y posanalítica, así como el mejoramiento continuo de la calidad. Un laboratorio puede integrar todos los elementos enumerados, con un sistema estandarizado.

Normas ISOLa Organización Internacional para la Estandarización (ISO, del inglés) ha

elaborado unas guías muy útiles que facilitan alcanzar esto. El programa de las normas se desarrolló desde 1970 y se continúa aplicando en la actualidad. Para el caso del laboratorio clínico, hasta hace algunos años la norma más apropiada fue la ISO 9001.

Como los conceptos de calidad están continuamente en evolución y perfec-cionándose, la norma recomendada actualmente para los laboratorios clínicos es la 15189 (Norma ISO 15189: 2013, www.grupoacms.com ). Algunos apartados importantes de esta norma contemplan los aspectos siguientes:

1. Requisitos de la gestión: a) Organización y gestión. b) Sistema de gestión de la calidad. c) Control de los documentos. d) Revisión de los contratos. e) Análisis efectuados por laboratorios subcontratados. f) Servicios externos y suministros. g) Servicios de asesoramiento. h) Resolución de reclamaciones. i) Identificación y control de las no conformidades. j) Acciones correctivas.


k) Acciones preventivas. l) Mejoría continua de la calidad. m) Registros de la calidad y registros técnicos. n) Auditorías internas. ñ) Revisión por la dirección.

2. Requisitos técnicos: a) Personal. b) Instalaciones y condiciones ambientales. c) Equipos de laboratorio. d) Procedimientos preanalíticos. e) Procedimientos analíticos. f) Asesoramiento de la calidad de los procedimientos analíticos. g) Procedimientos posanalíticos. h) Informes del laboratorio.

El laboratorio clínico tiene nuevos retos con el impetuoso desarrollo de la tecnología. Baste citar como ejemplos, la introducción en muchos laboratorios de equipos automatizados capaces de realizar cientos de análisis por hora y los llamados análisis en el sitio de atención (point of care), que implican cambios en algunas concepciones de control y aseguramiento de la calidad.

Control de variables preanalíticasLa responsabilidad de hacer análisis sin errores y en tiempo recae en el labo-

ratorio; por lo tanto, es importante conocer qué problemas pueden surgir antes de la fase analítica y controlarlos.

Según un estudio de Ross y Boone (citado por Cembrovski, G. S.; 1997) de un total de 363 incidentes relacionados con el laboratorio clínico en un hospital del tercer nivel de atención, 46 % de los fallos correspondieron a la fase prea-nalítica y 47 % a la posanalítica, es decir, solo 7 % de los errores estuvieron relacionados con la fase analítica y el personal del laboratorio fue responsable de 29 % de esos fallos.

Algunos de los problemas que ocurren en la fase preanalítica tienen lugar, incluso, fuera de las áreas tradicionales del laboratorio y, por eso, resulta difícil evitarlos.

A continuación se mencionan algunos posibles problemas y cómo tratar de resolverlos.

Identificación del paciente

En esta fase, los errores más comunes ocurren por la letra manuscrita en las órdenes de análisis y las etiquetas de las muestras o por distracción del personal


que realiza esta faena. Un método para chequear la identificación correcta es comparar identificadores, como el nombre y apellidos del paciente con su historia clínica y el número asignado a la orden de análisis y a la etiqueta en el recipiente o tubo de ensayo que contiene la muestra. La introducción de la tecnología del código de barras ha reducido notablemente este problema.

Tiempo de procesamiento

Con alguna frecuencia ocurre que se producen importantes dilaciones en la entrada de las muestras, en su procesamiento y en la entrega del reporte del resultado final, y esto es causa de importantes errores que llegan, incluso, hasta el extravío de la orden de análisis. La solución de este problema puede realizarse haciendo un análisis de sistema para identificar el proceso que está dando lugar a estos retrasos; también resulta conveniente monitorear el tiempo que tarda el laboratorio en realizar los análisis.

Preparación del paciente

Los análisis que se realizan en el laboratorio, como se revisó en el capítulo 3, se afectan por numerosos factores, como:

1. Ingestión previa de alimentos, alcohol y medicamentos.2. Fumar.3. Hacer ejercicios.4. Estrés.5. Postura del paciente, etc.

Por esa razón, la preparación del paciente es algo muy importante antes de realizar cualquier análisis. A los pacientes se le deben dar instrucciones orales, y escritas en algunos casos, y el técnico que extrae la sangre o recoge otro tipo de muestra debe preguntarle al paciente si hizo la preparación correcta.

Obtención de la muestra

Recordar que un torniquete prolongado puede causar anoxia local y excesiva presión venosa: La anoxia provoca que pequeñas moléculas e iones salgan de las células (potasio, por ejemplo), y la presión venosa elevada incrementa la concentración de proteínas plasmáticas y de las sustancias que se unen a estas, como el calcio.

No se debe hacer una extracción de sangre en un brazo que tiene una veno-clisis, pues se puede producir un efecto de dilución. La hemólisis es otra causa importante que puede afectar la calidad de una muestra de sangre, plasma o


suero. La mejor manera de controlar este problema es contar con un grupo de técnicos bien entrenados en recolectar las muestras. Estas personas debe regis-trar y comunicar cualquier incidencia que haya ocurrido durante la colección de la muestra.

Transporte y almacenamiento

En el mundo una gran parte de los laboratorios no monitorean el importante paso del transporte y, por lo tanto, no se le presta mucha atención si las mues-tras llegaron descongeladas, cuando debieron hacerlo congeladas, o si llegan destapadas.

La conclusión es que el laboratorio debe rechazar las muestras que no arriben a sus instalaciones de manera correcta.

Asimismo, el tiempo y las condiciones de almacenamiento de las muestras, en dependencia del analito que se quiere determinar, es algo muy importante que se debe tener en cuenta para obtener un resultado final confiable.

Control de la fase analíticaLos laboratorios clínicos actuales utilizan equipos cada vez más automati-

zados y sofisticados, capaces de procesar cientos de muestras por hora con una gran confiabilidad. Esto es algo muy diferente a lo que ocurría en los labora-torios hace 50 años, cuando la mayoría de las técnicas eran manuales y más susceptibles de error.

Aun con esta alta tecnología, la cual está provocando que exista menos perso-nal entrenado para ejecutar técnicas manuales, se mantiene el reto de controlar la calidad, aunque las evaluaciones de rutina están siendo más dirigidas a conocer cómo está trabajando el equipo.

Sin embargo, como aun se mantienen muchas de estas técnicas manuales, en este acápite se revisan algunos procedimientos clásicos para controlar la calidad.

La confiabilidad de los métodos analíticos se alcanza, solo si se sigue un correcto proceso de selección, evaluación, implementación o montaje de la técnica, seguimiento y control sistemáticos.

Los métodos analíticos pueden ser monitoreados analizando una muestra de concentración conocida y comparando los valores observados con los espe-rados. Usualmente, los valores conocidos son representados por un rango de valores aceptables, con un límite superior y otro inferior, denominados límites de control. Cuando los valores observados caen dentro de los límites de control, el laboratorista puede asegurar que el método está trabajando correctamente. Si los valores observados caen fuera de los límites de control, el laboratorista debe suponer que existen problemas con la determinación analítica.


A la muestra de concentración conocida, que es analizada para este propósi-to de controlar la calidad, se le conoce como muestra o material control. Los materiales de control se pueden clasificar en dos tipos:

1. Material control con valor asignado, que permite el control de la exactitud y la precisión.

2. Material control sin valor asignado, que permite el control de la precisión y de los cambios de exactitud.

Los materiales de control deben ser estables y estar disponibles en alícuotas que puedan ser analizadas periódicamente durante un tiempo más o menos lar-go y, además, tener la misma disolución matriz que la muestra problema. Por ejemplo, si las muestras problemas son de suero, el material de control debe ser preparado en una disolución de proteínas.

Aunque el material procedente de humanos puede ser el mejor, los riesgos de algunas enfermedades (como la hepatitis B o el sida) han determinado que se utilicen otros materiales, como suero de ganado bovino, por ejemplo.

Muchos laboratorios producen estos sueros controles en forma liofilizada, que se reconstituyen, simplemente, añadiendo agua.

También están disponibles otros materiales que representan orina, líquido cefalorraquídeo y sangre total.

En muchas ocasiones es conveniente tener varios materiales de control, de tal manera que abarquen un rango de concentraciones desde las más bajas hasta las más altas, como se observan en las enfermedades.

Es conveniente adquirir materiales de control de varios fabricantes, para mi-nimizar posibles problemas con alguno de estos. Por lo general, los materiales de control vienen con una lista donde se relacionan las concentraciones de los diferentes analitos. Estos valores se representan por la media, la desviación estándar y un rango, especificando la técnica de determinación utilizada.

En el laboratorio, ademas de los materiales de control, es necesario utilizar patrones o estándares de calidad para la calibración de las técnicas y los equipos. Recordar que la calibración es el proceso de comparar los valores obtenidos por un instrumento de medición con la medida correspondiente de un patrón de referencia (o estándar). A este material de refrencia, que se utiliza en una función de calibración, se le conoce como calibrador.

Un método clásico de llevar el control interno de calidad en un laboratorio para variables de química clínica consiste en hacer un gráfico de Levey y Jen-nings. Para hacer esto es necesario realizar los pasos siguientes:

1. Con cada determinación diaria de muestras problemas, realizar una deter-minación con el material control.

2. Después de realizar alrededor de 30 determinaciones se calculan la desvia-ción media (X) y la desviación estándar (DS) y se plotean en una gráfica los valores de X ± 1DS, 2DS y 3DS. Se asume que el método analítico tiene una distribución normal.


3. A continuación, con cada corrida diaria de muestras problemas se introduce una muestra de material control y se plotea el valor obtenido en la gráfica previamente construida. Como se puede apreciar, es necesario tener sufi-cientes cantidades en alícuotas del material control.

4. Mediante la observación y el cumplimiento de algunas reglas de decisión establecidas por Westgard (1996), es posible saber si el comportamiento del control puede aceptarse o debe rechazarse como normal. Si se rechaza el comportamiento del control, tampoco se deben dar los resultados de las muestras problemas.

Recientemente, además de evaluar el comportamiento de un material control en el rango normal, se está recomendando utilizar un material control en el rango patológico.

En la figura 10.2, donde solo se dibujaron los límites de dos desviaciones estándar, se aprecia que el método analítico presenta problemas en los últimos días, sobre todo con la exactitud. Cuando el método analítico está bien, los valores del control caen dentro de los límites de las dos desviaciones estándar y fluctúan alrededor de la desviación media. Cuando existe un problema de precisión, se observa una fluctuación amplia del control.

Fig. 10.2. Detección de cambios en la exactitud de una técnica analítica mediante un gráfico de Levey y Jennings.

En la figura 10.3 se aprecia que el método analítico está bajo control en los primeros días, pero en los últimos experimenta problemas de precisión y, por lo tanto, los resultados de las muestras problemas no deben ser reportados.

Además del método clásico basado en la estadística para controlar la calidad de las técnicas analíticas, recién se están proponiendo otras alternativas, como son:

1. Control electrónico, sobre todo, del funcionamiento de los equipos.


2. Datos de pacientes individuales, comparando, por ejemplo, dos muestras de un mismo paciente, o los resultados con los límites fisiológicos.

3. Datos de múltiples pacientes, útiles para detectar desviaciones de exactitud.4. Inspección de proceso (en las etapas iniciales del método analítico).

Es importante que se realice de manera sistemática el control de algunas variables que pueden afectar la calidad de múltiples técnicas: calidad del agua, calibración de equipos y cristalería volumétrica. Asimismo, es necesario que para cada nueva técnica analítica introducida en el laboratorio (ya sea: cuanti-tativa, semicuantitativa o cualitativa) se lleve a cabo un proceso de evaluación previo a su introducción.

Aunque existen algunas particularidades, se debe prestar atención a los pa-rámetros que se exponen a continuación.

Precisión

Se evalúa por la desviación estándar de n repeticiones sobre la misma muestra en un mismo día, o en días sucesivos. La precisión se afecta por un error aleatorio susceptible de disminuir, pero imposible de hacerlo cero. Siempre la desviación estándar tiende a ser menor cuando las mediciones se realizan el mismo día, ya que las variaciones de la temperatura, del voltaje de los equipos y del volumen son menores. Es común, o se prefiere utilizar, el coeficiente de variación (CV):

CV = (DS /X) 100

Fig. 10.3. Detección de cambios en la precisión de una técnica analítica mediante un gráfico de Levey y Jennings.


Para cada analito se establece, según distintos criterios, un coeficiente de variación analítica que es mayor o menor según el analito. Por ejemplo, para el potasio en suero se ha establecido un coeficiente de variación permisible de 0,8 %; sin embargo, para la urea es de 5,6 %.

Las causas más frecuentes de imprecisión en un mismo día se deben a errores:1. Espectrofotométricos (ver capítulo de fotometría).2. De medición.3. Evaporación de las muestras.4. Variaciones de temperatura y de voltaje en los equipos. 5. Si se trata de corridas diferentes en un mismo día, también hay que tener

en cuenta los errores en la calibración de los equipos y de la técnica. 6. Los errores de imprecisión en días diferentes se deben, fundamentalmente,

a errores en la calibración.

Exactitud

Es la concordancia entre el valor promedio obtenido en la muestra y el valor verdadero. A la diferencia que puede ocurrir entre ambos valores se le denomina error sistemático, el cual puede ser de dos tipos: proporcional y constante:

1. En el error sistemático constante, este es de la misma magnitud cuando cambia la concentración del analito, y puede trazarse una curva de calibra-ción con la misma pendiente y diferente intersecto con el eje Y.

2. En el error sistemático proporcional, la curva de calibración nueva tiene diferente pendiente.

Las fuentes de la desviación se relacionan con el operador, la calibración (estándares de calibración, instrumentos mal ajustados, etc.), con el grado de especificidad analítica de las reacciones involucradas o con interferencias de otras sustancias.

Especificidad analítica

Es la capacidad que tiene un procedimiento de medición de producir una señal que se relacione solo con la presencia de la cantidad de la sustancia que se intenta medir. Por ejemplo: la especificidad de la reacción de Jaffe para de-terminar creatinina en suero se afecta notablemente por la presencia de cuerpos cetónicos.

En su afán por lograr la perfección cada día, los laboratoristas prefieren téc-nicas más específicas; en la actualidad, para determinar glucosa se prefiere el


método de la glucosa oxidasa, en lugar de otros anteriores que, aunque servían para determinar este mismo compuesto, eran capaces de detectar otros mono-sacáridos reductores.

Sensibilidad analítica

Básicamente, este término significa el cambio en la señal detectada, producida por un analito, en dependencia de sus propiedades o de su concentración.

La sensibilidad está relacionada con la pendiente de la curva de calibración. Se refiere a la capacidad que tiene el procedimiento o técnica analítica de detectar pequeñas cantidades de una sustancia cualquiera.

Límite de detección

El límite de detección es el resultado más bajo de una medición que se pueda considerar diferente del resultado del blanco utilizado (en la práctica, el valor promedio del blanco + 2 DS).

En ocasiones, el límite de detección tiende a emplearse como sinónimo de sensibilidad, lo que no es totalmente correcto.

Linealidad

La mayoría de las técnicas analíticas, al menos en determinado rango del analito que se mide por espectrofotometría, deben tener un comportamiento lineal, de acuerdo con la ley de Lambert-Beer (en Burtis, 1996).

Intervalo de medición o rango analítico

Es el intervalo en la escala de medición cuyos límites se conocen, tanto para un valor alto, como bajo.

En el valor alto, la curva de calibración se desvía de la linealidad y, en el valor bajo, la medición comienza a ser significativa.

Si no se obtiene una respuesta lineal, es necesario emplear mayor número de puntos o concentraciones del calibrador para definir la curva adecuadamente.

Interferencias

Las interferencias por otros analitos o sustancias de la técnica en cuestión, deben ser evaluadas.


No es posible evaluarlas todas, pero sí debe realizarse para los analitos que por algún conocimiento previo se tiene la certeza de que pueden ocasionar al-guna interferencia. Es común evaluar la interferencia que produce la hemólisis sobre muchas técnicas.

Error total

Es la suma del error aleatorio y el sistemático, y se define un valor aceptable siguiendo el criterio de expertos y teniendo en cuenta los resultados de varios laboratorios con determinada técnica (Fig. 10.4).

En el laboratorio es posible detectar los tipos de errores por diferentes pro-cedimientos experimentales, los que se exponen en la tabla 10.1.

Fig. 10.4. Error total en el laboratorio y sus componentes.

Es importante que las muestras utilizadas sean frescas, tanto en los experi-mentos de repeticiones, como en los de comparación de métodos; debe tratarse de minimizar efectos que pueden conducir a errores, como los de evaporación.

Otra manera de controlar la fase analítica en el laboratorio es mediante la evaluación externa de la calidad. La finalidad de este procedimiento es comparar la calidad del trabajo analítico en un laboratorio, con el resto de un grupo de laboratorios. Para ello se entregan materiales controles con valores conocidos y después se obtienen los resultados de todos los laboratorios. Se calcula un índice estandarizado de desviación (IED) y se asume que tiene una distribución normal, mediante la expresión:

IED = (Xlaboratorio - Xgrupo)/DSgrupo

La desviación media del grupo de laboratorios se toma como el valor real

del analito en cuestión.Para 95 % de probabilidad, el índice estandarizado de desviación no debe

exceder de 2, si el laboratorio tiene bajo control determinado método analítico.


Se ha afirmado que la evaluación externa de la calidad permite un control retrospectivo porque no se pueden tomar acciones inmediatas, como en el caso del control interno de la calidad; pero, sin duda, se ha convertido en un proce-dimiento muy útil en la evaluación de diferentes laboratorios, principalmente en cuanto a errores de tipo sistemático.

El control interno de la calidad permite la detección de errores de exactitud y precisión a más corto plazo, pero ambas actividades (el control interno y la evaluación externa de la calidad) se complementan.

Control de la fase posanalíticaEn esta fase se registran y reportan los resultados. Son muy importantes

los aspectos de organización de los registros con la finalidad de evitar errores. Las inspecciones o inspecciones internas (y también las externas, desde luego) pueden ser muy útiles para detectar errores en los informes de análisis, en las cifras y unidades, en que el reporte sea del paciente correcto, en el intervalo de referencia, etcétera.

Tabla 10.1. Tipos de errores

Errores Experimento Criterio

Aleatorio Repetibilidad DSobservada < DSaceptable y reproducibilidadSistemático Comparación |(a + bXc) - Xc| < Error sistemático de métodos aceptableSistemático Interferencia Error sistemático < Error sistemáticoconstante aceptable Sistemático Recuperación R-100/100| Xc < Error sistemáticoproporcional aceptableTotal Replicación y 4 ∙ DSobservada + |(a + bXc) -Xc|< Error

comporación total aceptable de métodos DSobservada: desviación estándar observada después de realizar n repeticiones con una misma muestra.DSaceptable: desviación estándar aceptable. R: media de la recuperación (%), cuando a una muestra donde se conoce la concentración

basal de un analito se le añade cierta cantidad conocida de ese analito y se mide la nueva concentración; así se halla la diferencia entre la concentración basal y la nueva; para expresar el porcentaje, se divide por la cantidad añadida y se multiplica por 100.

Xc: concentración de interés del analito en cuestión. a + bXc: utilizando la recta de regresión al comparar dos métodos, permite hallar un valor de

Yc. Por lo tanto el error sistemático es Yc - Xc.


Aseguramiento de la calidad

Una recomendación útil relacionada con el aseguramiento de la calidad es que debe existir, para cada técnica analítica en el laboratorio, un manual de procedimiento, también denominado procedimiento normalizado de operación (PNO) que debe constar, al menos, de los aspectos siguientes:

1. Nombre del procedimiento o técnica analítica.2. Principio del método.3. Características de la muestra utilizada.4. Reactivos y equipos.5. Descripción del procedimiento.6. Valores de referencia.7. Significado clínico.8. Comentarios importantes, tales como: a) Interferencias, condiciones de almacenamiento de la muestra. b) Peligros para el personal. c) Otros.

9. Referencias bibliográficas.

También resulta imprescindible que cualquier procedimiento en el laborato-rio (desde la limpieza de la cristalería hasta cualquier otra actividad) tenga su procedimiento normalizado de operación.

Entre otras acciones o tareas para asegurar la calidad en el laboratorio de bioquímica clínica también se encuentran:

1. Aprobar todos los procedimientos.2. Aprobar los reactivos, diagnosticadores y materiales de laboratorio que se

utilicen.3. Desarrollar y controlar el sistema de documentación.4. Validar los métodos de ensayo.5. Establecer y garantizar el empleo de materiales de referencia apropiados,

tanto calibradores como controladores, en la realización de los ensayos.6. Establecer un programa de control sistemático de equipos y mediciones.7. Establecer y garantizar la aplicación de procedimientos de control interno

de la calidad para todos los ensayos, incluyendo algoritmos que orienten la conducta que se ha de seguir ante las diferentes alternativas posibles.

8. Participar, sistemáticamente, en los programas provinciales o nacionales de evaluación externa de la calidad relacionados con los ensayos que realiza el laboratorio.

9. Garantizar que los informes de ensayo sean revisados antes de su entrega a los usuarios.

10. Elaborar, ejecutar y controlar el programa de inspecciones internas o au-toinspecciones. Tales inspecciones deben llevarse a cabo por un personal calificado, entrenado e independiente de la actividad que se va a inspeccionar.


11. Adoptar las acciones correctivas que son pertinentes como resultado de una inspección interna o inspección de las autoridades sanitarias.

12. Revisar, al menos cada 2 años, el sistema de calidad adoptado.13. Investigar las quejas y reclamaciones que se produzcan.14. Mantener una sistemática interacción y educación continuada con los mé-

dicos usuarios en relación a los métodos, características y resultados de los ensayos que se realizan en el laboratorio.

Inspecciones

Las inspecciones, tanto internas como externas, constituyen una actividad de la que no se puede prescindir en las tareas de aseguramiento de la calidad, de mejoría continua de esta y, en definitiva, en las políticas actuales de calidad total para el laboratorio. El objetivo de las inspecciones es detectar si existen problemas, y constan de los eventos secuenciales siguientes:

1. Evaluación periódica.2. Identificación de problemas.3. Dar prioridad a los problemas.4. Solución de los problemas.5. Seguimiento del problema y de la solución planteada.

La inspección interna la realiza el propio personal del laboratorio y puede comenzar por una autoinspección o la supervisión del jefe del departamento o área. En otro momento la puede realizar un personal que es ajeno al área que se quiere inspeccionar. Se deben contemplar los aspectos siguientes:

1. Solicitud de exámenes (es adecuada la solicitud, se justifica, es legible la solicitud, etc.).

2. Recolección de la muestra.3. Procesamiento de la muestra.4. Ejecución del análisis.5. Informe de resultados.6. Opinión del usuario o cliente.

Las inspecciones externas las realiza un organismo ajeno al laboratorio y debe incluir aspectos tales como:

1. Carga de trabajo del laboratorio. Cálculo de índices como: a) Resultados/paciente. b) Resultados/técnico. c) Pacientes/empleado.

2. Plan y organización del laboratorio.3. Documentación.


4. Recursos humanos y capacitación del personal.5. Normas de bioseguridad.6. Calidad de los equipos.7. Suministro y calidad de reactivos, calibradores y materiales de control.8. Características estructurales y funcionales de las distintas áreas de trabajo.9. Procedimientos normalizados de operación.

10. Control de calidad interno y evaluación externa de la calidad.11. Almacenes de reactivos y otros suministros.12. Almacenamiento y desecho de muestras.13. Disponibilidad del servicio.14. Solicitudes e informes de resultados.

Naturalmente, muchos de los aspectos de una inspección externa pueden ser revisados en una inspección interna.

Las inspecciones se llevan a cabo mediante observación, entrevistas al per-sonal y por medio de verificaciones de los documentos y de los procesos que el laboratorio lleva a cabo.


Automatización

El desarrollo tecnológico, la miniaturización de componentes mecánicos y electrónicos, el empleo de micrométodos y ultramicrométodos analíticos, ade-más del avance del conocimiento científico en medicina, la productividad del trabajo y los factores económicos, han dado un gran impulso al desarrollo de la automatización en el laboratorio de bioquímica clínica en los últimos años.

Casi todos los laboratorios, desde los más sencillos, dedicados a la atención primaria de salud, hasta los de la atención médica de nivel secundario o terciario, tienen numerosos equipos automatizados. Otro tanto ocurre en los laboratorios de investigaciones en bioquímica (Fig. 11.1).

Reseña históricaEl concepto automatización, aplicado en el área de bioquímica clínica, sig-

nifica el proceso mediante el cual un instrumento analítico, o de otro tipo, lleva a cabo, de manera autónoma, alguna tarea o determinación analítica, con una mínima intervención del técnico laboratorista.

Uno de los primeros analizadores para el laboratorio de bioquímica clínica, si no el primero, fue diseñado por Skeggs (2000) para la determinación de urea en un hospital de 1000 camas.

Este eminente investigador mientras realizaba investigaciones acerca de la hipertensión arterial, en particular sobre el sistema renina-angiotensina, también trabajaba en el laboratorio de análisis clínicos con 3 o 4 técnicos más, y obser-vaba que cada día sus técnicos debían realizar cientos de operaciones manuales mientras conversaban de sus asuntos personales o del último juego de béisbol de las Grandes Ligas, lo que le causaba intranquilidad, por temor a una deficiente calidad de los resultados. Con regularidad, él personalmente introducía mues-tras “ciegas” en las corridas y encontraba errores graves en los resultados; por lo que comenzó a soñar con una máquina que hiciera los análisis sin errores.

Capítulo 11

Fig. 11.1. A y B: proceso analítico en el equipo automatizado.

A

B

Capítulo 11. Automatización 177

Desde la década de 1950, cuando eso ocurrió, la automatización ha constituido una poderosa herramienta para mejorar el servicio de salud que brinda el labora-torio de análisis clínicos y para disminuir los costos. También la automatización se ha extendido, con sus particularidades, a los laboratorios de investigaciones.

A lo largo de todos estos años, hasta hoy, la tendencia en la automatización se ha desplazado de:

1. La total automatización del laboratorio a la automatización por módulos.2. De sistemas de hardware a control de procesos mediante software.3. De equipos únicos a equipos más estandarizados.4. Del diagnóstico in vitro en el laboratorio a equipos para la atención primaria.

Algunos avances y tendencias médicas han influido en el desarrollo de la automatización:

1. Aumento de la población y de la esperanza de vida.2. Creciente número de pruebas de bioquímica clínica.3. Incremento de enfermedades crónicas y de otras como las neurológicas,

renales o relacionadas con la tercera edad.4. Aumento de enfermedades autoinmunes.5. Presión económica de gobiernos y entidades privadas por reducir costos.6. Nuevo enfoque de la medicina preventiva.7. Seguimiento y rehabilitación de pacientes.8. Desarrollo tecnológico, en particular de las tecnologías informáticas.9. Diagnóstico genético y la terapéutica basada en características genéticas.

10. Desarrollo creciente de las técnicas de trasplante de órganos.

La calidad de la atención de los enfermos y el mantenimiento de la salud de la población dependen, cada vez más, del diagnóstico de laboratorio con técnicas rápidas, de bajo costo, con alta sensibilidad y especificidad, y no invasivas.

En el año 1991 se ha calculado que de cada dólar gastado en el trabajo del laboratorio de bioquímica clínica, 43 % correspondió a gastos en salario, 35 % a gastos en equipos y reactivos, y 22 % a gastos generales (agua, electricidad etc.). Sin embargo, en 1999 los porcentajes cambiaron a 65; 15 y 20 %, res-pectivamente. Es decir, hubo una disminución importante en gastos de equipos y reactivos por la tendencia a utilizar micrométodos y ultramicrométodos, y procedimientos automatizados (Rodney et al., 2000).

Micrométodos y ultramicrométodosEs conveniente definir que se considera:

1. Ultramicrométodo al que utiliza muestras de volúmenes inferiores a 10 μL (para otros 5 μL).

2. Micrométodo el que utiliza muestras de volumen en un rango mayor que 10 μL y hasta 500 μL.

3. Macrométodos utilizan muestras mayores que 500 μL.


Los micrométodos y ultramicrométodos se desarrollaron como consecuencia de:1. Problemas médico-biológicos, como por ejemplo, la limitación del volumen

de la muestra en niños recién nacidos.2. Grandes avances de la ciencia y la técnica a finales del siglo xx y principios

del xxi.3. Factores económicos, al disminuirse los costos cuando se reducen volúme-

nes de muestras y reactivos, y aumentar la productividad.

El empleo de micrométodos y ultramicrométodos tiene un grupo de ventajas y también algunas desventajas.

Ventajas Desventajas

Bajos volúmenes de muestras, Necesidad de mayor pureza de reactivos como en pediatría

Bajos costos Equipos más sofisticadosAumento de productividad Mayor gravedad de pequeños errores en la preparación de las muestras o en la calibración de los equiposIncremento del número de - - -determinaciones en una sola muestra Disminución de personal - - -Menos fatiga de los técnicos - - -Más rápido - - -Más fácil automatización - - -

Conceptos básicos en automatización del laboratorioUna de las preguntas más importantes para implementar la automatización

de un laboratorio es: ¿cómo puede la automatización disminuir los costos?Según estudios realizados (Paul, 2000 y Rodney et al., 2000) el costo unitario

para producir un resultado de laboratorio descendió de 2,25 USD en 1996 a 1,45 USD en 1998; los costos de reactivos descendieron de 1,65 USD por prueba a 1,50 USD y la capacidad de realizar pruebas aumentó en 40 % sin aumentar el personal en este mismo período. En resumen:

1996 1998

Costo unitario (USD) 2,25 1,45Costos de reactivos (USD) 1,65 1,50Capacidad de realizar pruebas Aumentó en 40 %


Automatización y técnicas manuales

En los últimos años ha existido una tendencia a la automatización total (AT), pero esto solo lo han podido llevar a cabo grandes laboratorios. Por otro lado, la sobrecarga de trabajo de muchos laboratorios no justifica esa gran inversión en automatización.

Los sistemas automatizados, por lo general, incorporan versiones automati-zadas de técnicas y procedimientos manuales del laboratorio. Es conveniente definir algunos conceptos y términos relacionados con estos equipos:

1. Configuración del analizador. Los analizadores pueden ser de dos tipos: integrados o modulares; en estos últimos, el equipo es ensamblado (por el fabricante o por el usuario) por módulos. Sean integrados o modulares, pueden ser abiertos o cerrados. En el caso de estos últimos, la mayoría de los parámetros son definidos por el fabricante, quien, además, suministra los reactivos en un formato único. En los abiertos, el operador puede modificar los parámetros de la determinación y adquirir reactivos de varias fuentes.

2. Conjunto o batch. Muestras que son procesadas en la misma corrida.3. Flujo continúo. Cada muestra es sometida a la misma reacción analítica y

velocidad que otras muestras.4. Análisis discreto. Cada muestra tiene su propio espacio físico y químico,

el cual está separado de las restantes muestras.5. Análisis multicanal. Cada muestra es sometida a procesos analíticos múlti-

ples, de tal manera que por cada muestra se obtienen un grupo de resultados.6. Análisis monocanal. En cada muestra se obtiene el resultado de un solo analito.7. Análisis paralelo. Todas las muestras son sometidas, a la vez, al mismo

procedimiento analítico de un modo paralelo.8. Análisis secuencial. Cada muestra pasa por el proceso analítico una después

de otra, en dependencia del orden inicial.9. Análisis aleatorio. Cualquier muestra, por una orden en el equipo, puede ser

analizada independientemente del orden inicial en que fue colocada en el equipo.10. Robots. Diseños mecánicos utilizados para suplantar algunas funciones

humanas, como manipulación de muestras, pipeteo, etc. Aunque trabajan más lento que los humanos, pueden hacerlo sin ningún problema y sin de-tenerse 1 min durante 24 h y más. Existe un laboratorio en Japón operado en gran medida por robots, donde solo trabajan 24 técnicos muy calificados, que realizan un número de análisis equivalente al que harían 200 técnicos.

Automatización de un proceso analítico

Las operaciones unitarias que son necesarias para llevar a cabo un proceso analítico se relacionan a continuación:


1. Identificación de la muestra. Actualmente se utiliza el código de barras para realizar esta operación, puesto que esa tecnología aparece integrada a algunos analizadores. En ocasiones, la identificación de la muestra se produce al lado de la cama del paciente y desde allí llega identificada al laboratorio.

2. Preparación de la muestra. En la mayoría de los analizadores, la muestra es de suero, aunque en la actualidad algunos realizan los análisis en sangre total para ahorrar tiempo.

3. Manipulación, transporte y descarga de la muestra. Después de separado el suero, en muchos analizadores, una porción es transferida a una cubeta que se encuentra en la zona de carga del equipo. Generalmente, las cubetas están hechas de polistireno y ocurre poca evaporación en estas, ya que al-gunas están provistas de tapas. En la mayoría de los analizadores se puede preparar una segunda corrida mientras se realiza el procesamiento analítico.

4. Procesamiento de la muestra. En el caso de algunos analitos es necesario eliminar proteínas de la muestra o separar las fracciones libres o unidas; esto se realiza de diferentes maneras: mediante anticuerpos unidos a la fase sólida, micropartículas magnéticas, etcétera.

5. Introducción de la muestra. Los analizadores pueden ser de flujo continuo o de flujo discreto. El método que se utiliza para introducir una muestra en estos equipos es lo que los diferencia: en los de flujo continuo, la mues-tra es aspirada desde la cubeta hacia una corriente continua de reactivos, mientras que en los de flujo discreto las muestras siempre están colocadas en compartimentos diferentes.

En los equipos de flujo continuo se utiliza una bomba peristáltica que comprime un tubo plástico, lo que produce aspiración de la muestra. Las burbujas de aire separan las muestras. En este tipo de analizador se presenta un error (denominado arrastre) por la contaminación de la muestra que se analiza con la que pasó antes por el tubo plástico.

En los sistemas discretos se utilizan pipetas para la introducción de las muestras en las cubetas donde se lleva a cabo la reacción química. También se puede presentar el fenómeno de arrastre por el sistema de pipetas. En algunos equipos es necesario un sistema de lavado para eliminar este efecto indeseable.

6. Manipulación y almacenamiento de reactivos. Algunos sistemas emplean química seca y otros reactivos líquidos. Los analizadores que utilizan reactivos líquidos son abiertos, en los que la mayoría de los parámetros pueden ser modificados por el operador. Unos sistemas utilizan reactivos o anticuerpos que son inmovilizados; otros, enzimas inmovilizadas.

7. Adición de reactivos. Los reactivos son añadidos mediante jeringuillas o por bombas peristálticas hacia la cubeta de reacción; existen sistemas para controlar la exactitud y precisión de los volúmenes de reactivos.


8. Reacción química. La fase de reacción química depende de: a) Recipiente donde la reacción ocurre. b) Mezclado de los reactivos. c) Transporte de los reactivos. d) Condiciones térmicas de los líquidos. e) Tiempo de reacción. f) La medición.

Se utilizan diferentes alternativas para cuantificar las concentraciones de analitos, en dependencia del analizador (de flujo continuo o de flujo dis-creto). Para mezclar los reactivos pueden emplearse variadas técnicas:

a) Agitación magnética. b) Desplazamiento lateral vigoroso. c) Ultrasonido. d) Centrifugación.

9. Mediciones. Para hace las mediciones se utiliza: a) Fotometría. b) Reflectometría: medición de la luz reflejada cuando se ilumina con luz

un soporte. c) Quimioluminiscencia (muy utilizada en inmunoensayos). d) Fluorometría, entre otros.

10. Procesamiento de la señal, manejo de datos y control del proceso. La inte-gración de microprocesadores, microcomputadoras y software específicos para los analizadores ha revolucionado el análisis automatizado con una mínima intervención del operario.

Para el control del proceso es imprescindible llevar a cabo un programa de aseguramiento y control de la calidad. Habitualmente los mismos fabricantes del equipo suministran calibradores y controles para estos propósitos.

Selección del equipo automatizadoEl campo de la automatización está cambiando rápidamente, como es evidente

en las ferias internacionales que sobre equipos médicos se realizan. Los últimos avances de la ciencia y la tecnología, en particular los relativos a la miniaturiza-ción de la electrónica y los componentes ópticos y mecánicos, están permitiendo desarrollar nuevos y más compactos equipos capaces de ser instalados en un consultorio médico o, incluso, al lado de la cama de un paciente en el hogar.

Obviamente ningún instrumento puede servir todas las necesidades de di-ferentes instituciones, laboratoristas, médicos y pacientes. No existe una regla general para seleccionar un instrumento, más bien principios generales que se deben tener en cuenta, como por ejemplo:


1. En la fase de selección del equipo: a) Análisis sistémico del desempeño de la automatización en el laboratorio

en particular. b) Identificación de posibles equipos (ver literatura científica y comercial). c) Análisis del costo-beneficio, incluyendo costo de mantenimiento y

operación. d) Valoración de la aceptabilidad por el personal (explorar experiencias de

otros laboratorios). e) Caracterización de las posibilidades analíticas e instrumentales (hacer

una tabla con candidatos en una columna y en otra dar puntos de 0 a 2 en diferentes parámetros analíticos e instrumentales).

2. Después de adquirir el equipo: a) Evaluación del equipo. b) Entrenamiento del personal. c) Detección temprana de posibles insuficiencias o defectos.

Pruebas diagnósticas

El laboratorio de bioquímica clínica diariamente entrega numerosos resultados de análisis y es responsabilidad, en primer lugar, del médico laboratorista, o del bioquímico clínico, saber interpretarlos. Como es naturalmente, esos resultados llegan hasta el médico de asistencia, quien debe orientar o tratar al paciente en caso de alguna enfermedad.

En la interpretación de la información sobre un paciente, ya sea para realizar un diagnóstico, aplicar un tratamiento o recomendar medidas preventivas, es necesario obtener datos, analizarlos y compararlos con valores de referencia.

Entre los datos que el médico obtiene del paciente se incluyen las pruebas diagnósticas que se realizan a diario en un laboratorio de bioquímica clínica. En el proceso del diagnóstico, el médico sigue un método (nombrado por algunos método clínico) similar al método científico. Así, interroga y examina al paciente, y a partir de esa información plantea una o varias hipótesis diagnósticas, que debe contrastar mediante nuevos datos y exámenes complementarios para llegar a la conclusión final de la enfermedad del paciente.

Si en los datos del laboratorio los valores encontrados se corresponden con los de un intervalo o rango de sujetos normales, el médico puede concluir que los valores de ese analito en el paciente son normales.

Si los valores están fuera del intervalo normal o dentro de otro intervalo ob-tenido a partir de pacientes portadores de determinada enfermedad, el médico concluye que, al menos para ese analito, el paciente no está normal y puede, incluso, plantear el diagnóstico de una enfermedad en particular.

La finalidad del laboratorio clínico es contribuir con el diagnóstico médi-co, confirmando o rechazando sus hipótesis; de este modo se comprende la importancia de saber interpretar, correctamente, las pruebas diagnósticas. El resultado de estas permite clasificar a un individuo como sano o enfermo y orientar su tratamiento, aportar información sobre su pronóstico o contribuir con la aplicación de medidas preventivas.

Capítulo 12


Hace varias décadas, los médicos se podían sentir frustrados porque no detectaban a tiempo determinada enfermedad, pues no contaban con la cantidad ni la calidad de pruebas diagnósticas que existen en la actualidad. Ahora las pruebas diagnósticas tienen más calidad, son más sensibles y específicas desde el punto de vista analítico y los médicos pueden ser cuestionados por no hacer un diagnóstico rápido, lo que ha llevado a que las demandas por la calidad de la atención se hayan hecho más frecuentes.

Un grupo de factores o tendencias han determinado que se haya incrementado la cantidad y calidad de las pruebas diagnósticas.

Evolución del diagnóstico médico y de las pruebasA lo largo de la historia de la medicina se ha observado el afán de los médi-

cos por prevenir y curar las enfermedades, pero antes hay que diagnosticar. En el esquema siguiente se muestra cómo ha evolucionado el diagnóstico médico hasta nuestros días:

Enfermedad → Estado de salud Cuerpo humano → Órganos y tejidos → Moléculas Hospital → Consulta del médico → Hogar Individuo → Comunidad

Las primeras pruebas diagnósticas en el laboratorio de bioquímica clínica fueron cualitativas, los resultados se reportaban como positivos o negativos, es decir, anormales o normales. Pronto se hizo evidente que había casos limítrofes y que se obtenían pruebas con distinto grado de positividad, aunque la mayoría de los médicos se aferraban a la creencia de que las pruebas arrojaban, simple-mente, resultados normales o anormales. Esta interpretación todavía prevalece en muchos médicos, tanto para pruebas cualitativas, como cuantitativas. Estas últimas, a diferencia de las pruebas cualitativas, permiten conocer los valores de un analito en un fluido biológico, en un rango continuo.

En todo este proceso de desarrollo de las pruebas de laboratorio, los inves-tigadores médicos siguieron el consejo de Galileo “…. mide todo lo que sea medible y trata de hacer medible lo que aún no lo sea ...”.

Es necesario destacar que los métodos para evaluar, seleccionar e introducir una nueva prueba diagnóstica en el laboratorio de bioquímica clínica actual se han estandarizado.

Para una prueba diagnóstica cualitativa es común que se tomen en cuenta los parámetros de calidad siguientes:

1. Determinación de la zona gris. Se puede definir como la zona de con-centración del analito donde la prueba puede arrojar resultados erráticos.

Capítulo 12. Pruebas diagnósticas 185

En la zona gris, los valores positivos pueden fluctuar entre 5 y 95 %, lo cual no es conveniente para un buen diagnóstico. Una prueba analítica es mejor que otra, cuanto menor sea el ancho de la zona gris (Fig. 12.1).

2. Interferencias de otros analitos.3. Estabilidad de los reactivos.4. Efectos del técnico que realiza la prueba.5. Sensibilidad y especificidad clínica o diagnóstica.6. Cualquier otro efecto (luz solar, por ejemplo, etc.).

Fig. 12.1. Determinación de la zona gris.

Para un método diagnóstico cuantitativo, la calidad analítica se evalúa me-diante los procedimientos siguientes:

1. Medición de la precisión. Mediante estudio de repetición y reproducibilidad.2. Realización de experimentos de recuperación. En estos experimentos, a

una muestra de concentración conocida, dividida en varias alícuotas o porciones, se añaden diferentes cantidades conocidas del analito puro.

3. Se compara el valor teórico que debe obtenerse con el real obtenido mediante la medición experimental y se hallan los porcentajes de recuperación del analito. Para cada porción se obtienen los valores Xi, Yi con los cuales se puede realizar una prueba estadística de regresión lineal simple y calcular el coeficiente de correlación.

4. Evaluación de características de la curva de calibración. Rango de concen-traciones donde se mantiene la linealidad de la técnica.


5. Estudios de dilución de las muestras. Si una muestra se diluye varias veces, se debe mantener, proporcionalmente, la disminución de las concentraciones.

6. Comparación con otro método ya probado y reconocido.7. Evaluación de materiales de control. Sueros con concentraciones conocidas

del analito.8. Evaluación con un control externo de calidad. Una muestra analizada con

igual técnica por otro laboratorio. 9. Evaluar el blanco y la estabilidad de los reactivos.

10. Determinar el límite de detección. El límite detección se calcula midiendo el blanco de reactivos n veces y calculando la media (X) y la desviación estándar (DS). El límite de detección es X + 2DS.

11. Evaluar efectos de interferencias por otros analitos. Realizar las determina-ciones añadiendo a las muestras algún analito que se supone puede interferir la determinación.

12. Evaluación de muestras de pacientes y determinar sensibilidad y especifi-cidad clínica (también denominada diagnóstica).

13. Registro de impresiones subjetivas de los técnicos que realizan el procedi-miento analítico.

Valores de referenciaCon frecuencia se empleaba el término valores normales para indicar que el

rango de valores de los resultados de las pruebas de laboratorio era sinónimo de buena salud. Pero por las muchas acepciones que tiene este vocablo en di-ferentes especialidades, en la actualidad se prefiere decir valores de referencia.

Se entiende por valor de referencia, un valor obtenido con fines comparati-vos y por observación o medición de una magnitud particular en un individuo seleccionado utilizando determinados criterios de selección.

La Federación Internacional de Química Aplicada define otros conceptos, como:

1. Intervalo de referencia. 2. Población de referencia. 3. Límite de referencia y otros.

El término valores de referencia también se puede aplicar para las enferme-dades.

Deben cumplirse varias condiciones para comparar el valor del resultado de un paciente con los valores de referencia:

1. Para obtener los valores de referencia, los grupos de individuos deben ser claramente definidos y seleccionados.

2. Un paciente examinado debe parecerse, suficientemente, a los grupos de referencia.


3. Las condiciones preanalíticas y la fase analítica de la prueba diagnóstica en un paciente y las realizadas para obtener los valores de referencia deben ser semejantes.

4. La sensibilidad diagnóstica, la especificidad y el valor predictivo positivo de la prueba deben conocerse, así como las desventajas de una clasificación incorrecta de los pacientes.

5. Se debe hacer un correcto empleo de los procedimientos estadísticos para establecer los límites de los intervalos de referencia.

Con relación al primer aspecto existen varias estrategias para la selección de los sujetos (Tabla 12.1).

Con mucha frecuencia es necesario establecer criterios para subclasificar los individuos de referencia. Para hacer esto es muy importante tener en cuenta las variables biológicas no modificables, tales como edad y sexo principalmente, aunque se recomienda no subdividir en muchas categorías la muestra por la reducción del número de individuos. Es posible realizar análisis estadísticos de comparación de medias para determinar si existen diferencias entre las distintas categorías y, si no las hay, procesar a todos los sujetos en conjunto.

Algunos ejemplos de criterios de subclasificación son:1. Edad.2. Sexo.3. Factores genéticos: a) Raza. b) Grupos sanguíneos.

Tabla 12.1. Estrategias para la selección de individuos de referencia Modo de selección Directa o a priori Individuos seleccionados de de los pacientes una población Indirecta o A partir de bases de datos de los

a posteiori análisis de un laboratorio y de la información de los pacientes

Tipo de muestra Aleatoria Los individuos con determinados criterios de inclusión constituyen una muestra aleatoria representativa de la población

No aleatoria Los individuos son seleccionados de acuerdo con determinados criterios de inclusión y facilidades prác ticas (ejemplo, donantes de sangre)


4. Factores fisiológicos: a) Estadio del ciclo menstrual. b) Trimestre del embarazo.

5. Otros: a) Nivel socioeconómico. b) Factores ambientales (por ejemplo, altura sobre el nivel del mar). c) Ritmo circadiano.

Para obtener valores de referencia asociados al estado de buena salud es importante establecer, con frecuencias, los criterios de exclusión siguientes:

1. Enfermedades.2. Factores de riesgo: a) Obesidad. b) Hipertensión. c) Riesgo ocupacional. d) Riesgo genético.

3. Consumo de medicamentos o drogas (que dañan la salud): a) Tratamientos medicamentosos. b) Contraceptivos orales. c) Consumo de tabaco o alcohol.

4. Estados fisiológicos: a) Embarazo. b) Estrés. c) Ejercicio excesivo.

Los aspectos de estandarización de la fase preanalítica y el aseguramiento y control de la calidad en la fase analítica son de suma importancia.

Se necesita información adicional sobre el efecto de algunos factores, tales como medicamentos y ritmos circadianos, porque habitualmente los valores de referencia son obtenidos en condiciones ideales.

Tratamiento estadístico

Una vez obtenidos los valores de referencia, se introducen en una base de datos y se procesan mediante algún programa estadístico.

Lo primero que debe realizarse es identificar valores extremos mediante observación y el empleo de estadísticos descriptivos y gráficos, eliminando los que se consideren errores muy evidentes o groseros, o siguiendo algunos criterios establecidos, como el de eliminar los valores que estén fuera del valor de la X ± 3DS.

Con el empleo de los programas estadísticos se pueden hacer otros análisis, como evaluar la normalidad de las variables y después decidir si se utilizan métodos estadísticos paramétricos o no paramétricos.


Un ejemplo de la búsqueda de valores de referencia para la variable coles-terol en hombres y mujeres de una población, en el que se utilizó el programa estadístico SPSS para analizar la normalidad de la variable, se ofrece en los histogramas de las figuras 12.2 y 12.3, el gráfico (Fig. 12.4) y la prueba de Kolmogorov-Smirnov para el colesterol sérico en varones pertenecientes al área urbana (con distribución de contraste normal):

Colesterol (g/L)

N 153 Parámetros normales: Media 1,5037 Desviación típica 0,31216 Z de Kolmogorov-Smirnov 0,921 Significación asintótica (bilateral) 0,365

Fig. 12.2. Histograma para sexo masculino.

Aunque no hubo diferencias significativas entre hombres y mujeres, al final se reportaron los valores de referencia para cada sexo con los percentiles 2,5 y 97,5 para el colesterol sérico total en hombres y mujeres de 20 a 40 años del área urbana de Santa Cruz, como se muestra en la tabla 12.2.

Fig. 12.3. Histograma para sexo femenino.

Fig. 12.4. Gráfico normal de colesterol (g/L) para sexo masculino.


Tabla 12.2. Intervalo de referencia

Sexo Percentiles 2,5 97,5Colesterol sérico total (g/L) Masculino 0,89 2,11 Femenino 0,91 2,05

Enfoque multivariadoAlgunos piensan que para declarar saludable a una persona para varios ana-

litos es correcto realizarle más y más pruebas diagnósticas y, si los valores que se obtienen están dentro de los límites de los intervalos de referencia asociados a estados de salud o normales, el individuo es normal. Sin embargo, a medida que se realizan más y más pruebas diagnósticas, ocurre algo muy similar a lo que sucede cuando se aplican varias pruebas estadísticas.

La probabilidad de error al encontrar un valor fuera del intervalo normal sería equivalente al valor p = 0,05 y, por lo tanto, la probabilidad de aceptar que pertenece al intervalo normal es 0,95. En 10 pruebas diagnósticas, por el teorema de la multiplicación, eso equivaldría a (0,95)10 = 0,5987.

Así, la probabilidad de encontrar un valor alterado en alguna de las pruebas sería 1 - 0,5987 = 0,4013, es decir, 40 % de falsos positivos. Por esta razón y otras, muchos autores han intentado realizar un enfoque multivariado, obte-niendo para el caso de dos pruebas en conjunto un elipsoide, o para el caso de n pruebas, una hipercaja.

Según este enfoque se ha encontrado:1. De los sujetos analizados, 68 % puede tener, al menos, una prueba diag-

nóstica alterada de 20 realizadas.2. Solo 5 % de los patrones de estos sujetos estuvieron fuera de la región de

referencia multivariada (si es para dos pruebas, ese patrón es un elipsoide).3. Todas las distribuciones deben ser normales o transformadas en normales.4. La región multivariada puede detectar pequeñas desviaciones de múltiples

analitos.5. Sin embargo, puede ser insensible a la desviación importante de lo normal

de un solo analito.6. La sensibilidad puede aumentarse definiendo más categorías.

Otros elementos en la interpretación de las pruebasNo basta con conocer los límites del intervalo de referencia de una prueba

diagnóstica, también es necesario conocer las características de la población de enfermos, y si existe solapamiento entre las dos poblaciones. De manera habitual


es necesario establecer un punto de corte para decidir si, por ejemplo, una prueba cuantitativa como la glucemia es normal o está elevada, como ocurre en los diabéticos. Para eso resulta imprescindible tener en cuenta varios factores que se analizan a continuación.

Características de la muestra de pacientes

Es muy importante definir bien las características de los pacientes, princi-palmente cuando se desarrolla una nueva prueba diagnóstica y se quiere saber cuán útil es para el diagnóstico de determinada enfermedad.

Por ejemplo, alguien ha desarrollado una nueva prueba para el diagnóstico del cáncer de próstata y decide probar si es útil o no; por supuesto, antes debió evaluarla con los procedimientos descritos para pruebas cualitativas o cuantitati-vas. Si esto último ya fue realizado, se selecciona una muestra de pacientes con cáncer y otra de individuos normales. Si en la muestra de los normales también se incluyen pacientes con hiperplasia benigna de la próstata, indudablemente se aumentan los falsos positivos. Por otro lado, si en la muestra de pacientes con cáncer se incluyen pacientes en estadios iniciales, entonces aumentan los falsos negativos.

Hay quienes plantean que para saber si la prueba sirve o no en los estadios iniciales de su evaluación, lo mejor es acercarse lo más posible a lo que ocurre en la vida real a la hora de seleccionar las muestras; otros, por el contrario, consideran que es mejor evaluar primero las situaciones extremas ideales para conocer si sirve o no la prueba; en este caso, seleccionar individuos bien nor-males por un lado y, por el otro, incluir solo los pacientes con cáncer de próstata en estadio avanzado. Además, la muestra debe tener un número adecuado de pacientes enfermos y controles para poder realizar las comparaciones con mayor precisión. Algunos programas estadísticos, como el Epidat 3.1, tienen facilidades para hacer un cálculo correcto de ese número adecuado de pacientes enfermos.

Criterio diagnóstico de la enfermedad

Si se desea saber si la nueva prueba diagnóstica es útil o no para el diagnós-tico, por ejemplo, del cáncer de próstata, es necesario tener “una regla de oro” que permita identificar correctamente a estos pacientes, que, desde luego, no puede ser el mismo examen o prueba (test) que se pretende evaluar. En este ejemplo tampoco puede ser una biopsia prostática, pues desde el punto de vista ético esta prueba resulta injustificable en los sujetos normales, pero tal vez sí es posible un ultrasonido o el simple examen clínico. El mejor consejo es definir muy bien “la regla de oro”.


Sensibilidad y especificidad

Es muy importante evaluar la sensibilidad y la especificidad (diagnóstica), tanto en pruebas cualitativas, como cuantitativas.

Cuando se trabaja con datos cuantitativos procedentes de dos pobla-ciones (la sana y la enferma) hay tres posibles situaciones:

1. La distribución de los individuos normales y enfermos no tiene ningún solapamiento.

2. Las dos distribuciones coinciden (por ejemplo, el ácido úrico al diferenciar entre sanos y enfermos con infarto).

3. Hay un solapamiento de mayor o menor grado, como es el caso de los valores de glicemia en individuos normales y diabéticos (Fig. 12.5).

En este último caso, la probabilidad de que un resultado sea normal o anormal depende de dos factores:

1. Proporciones relativas de las dos poblaciones (relacionado con la preva-lencia de la enfermedad).

2. Grado de solapamiento de estas.

En la figura 12.5, la distribución continua es la de individuos normales y la discontinua la de casos patológicos, por ejemplo, diabéticos. Si el punto de corte se establece por una línea ubicada más a la izquierda, muchos sujetos normales serán clasificados como enfermos, es decir, serán falsos positivos (FP) y su número será alto (especificidad mala). Si por el contrario, el límite superior de lo normal se establece más a la derecha, entonces muchos individuos diabéticos serán considerados sanos y por lo tanto, falsos negativos (FN) y en ese caso, la sensibilidad de la prueba diagnóstica será baja. Lo ideal sería poder establecer un punto de corte que permita identificar lo mejor posible a los verdaderos positivos (VP) y a los individuos verdaderos negativos (VN).

Para determinar el lugar más adecuado donde ubicar el punto de corte, de tal manera que exista un equilibrio entre sensibilidad y especificidad, es indispensa-ble realizar una cuidadosa evaluación en términos de mortalidad o morbilidad, costos, molestias a pacientes, etcétera.

Mediante otro ejemplo se expone cómo calcular la sensibilidad y la especi-ficidad de una prueba diagnóstica, y compárese con el procedimiento para una prueba estadística: un clínico obtiene información por medio del examen médico y las pruebas diagnósticas para confirmar la presencia (o positividad) de una hepatitis, al igual que un investigador colecta datos para determinar la veracidad o no de la hipótesis alternativa (es decir, hay algún efecto), en contraposición con la hipótesis nula (no se espera obtener efecto) y obtiene los resultados que se muestran en la tabla 12.3.


Tabla 12.3. Pruebas para confirmar la presencia de una hepatitis

ALAT (+) ALAT (-) Total

Hepatitis VP (80) FN (20) 100 No hepatitis FP (5) VN (95) 100 Total 85 115 200

ALAT: alanina aminotransferasa o glutámico pirúvica.Sensibilidad = 100 VP/(VP + FN) = 80 %.Especificidad = 100 VN/(VN + FP) = 95 %.Valor predictivo positivo (VP +) = 100 VP/(VP + FP) = 100 (80/85) = 94,1 %.Valor predictivo negativo (VP-) = 100 VN/(VN + FN) = 100 (95/105) = 90,5 %.

Fig. 12.5. Distribución de las poblaciones de individuos normales y diabé-ticos; FN: falsos negativos y FP: falsos positivos.

En el ejemplo de la tabla 12.3 también se han calculado los valores predic-tivos positivo y negativo, que son indicadores de la prueba relacionados con la prevalencia de la enfermedad, como es posible demostrar.

Teorema de Bayes y otras interpretacionesThomas Bayes, un clérigo del siglo xviii, desarrolló el teorema para el cálculo

de probabilidades condicionales, el cual fue conocido después de su muerte:Sea {A1, A2,… Ai,… An} un conjunto de sucesos mutuamente excluyentes y

cuya unión es el total o sea 1, y tales que la probabilidad de cada uno de estos es distinta de cero. Sea B un suceso cualquiera del que se conocen las probabilidades


condicionales P(B | Ai), entonces la probabilidad P(Ai | B) viene dada por la expresión:

Donde: P(Ai | B): probabilidades a posteriori. P(B | Ai): probabilidad de B en la hipótesis Ai. P(Ai): probabilidades a priori. P(B): probabilidad total.

Este teorema es válido en todas las aplicaciones de la teoría de la probabilidad; sin embargo, ha existido mucha controversia sobre el tipo de probabilidades que emplea.

En esencia, los seguidores de la estadística tradicional (también denomi-nada objetivista o frecuencialista) solo admiten probabilidades basadas en experimentos repetibles y que tengan una confirmación empírica; mientras que los llamados estadísticos bayesianos permiten y defienden la utilidad de las probabilidades subjetivas.

El teorema, que ha resurgido con gran popularidad desde hace ya algunos años, puede servir para indicar cómo se debe modificar las probabilidades sub-jetivas cuando se recibe información adicional de un experimento.

Este enfoque, que propugna la estadística bayesiana, está demostrando su utilidad en ciertas estimaciones basadas en el conocimiento subjetivo a priori y permite revisar esas estimaciones en función de la evidencia, lo que está abriendo nuevas formas de hacer conocimiento.

Supóngase una prueba diagnóstica, por ejemplo, nivel de glucosa en sangre, en ayunas, para diagnosticar la diabetes. Se considera que la prueba es positiva, si se encuentra un nivel por encima de cierto valor, por ejemplo 6,1 mmol/L.

Para evaluar una prueba diagnóstica para distintos puntos de corte, a esta se somete un grupo de enfermos diabéticos (E) diagnosticados por otro procedimiento (el patrón de oro o gold standar) y otro grupo de individuos sanos (NE). Los resul-tados de la prueba se representan como positivos (+) y negativos (-) (Tabla 12.4).

Si la prueba fuera perfecta, b = c = 0, desgraciadamente, nunca ocurre. Se denomina falso positivo (FP) al cociente c/t, y es una estimación de la probabi-lidad condicionada P(+ | NE); se denomina falso negativo (FN) al cociente b/u, y es una estimación de la probabilidad condicionada P(- | E). Estos dos valores cuantifican los dos errores que la prueba puede cometer y la caracterizan.

Simétricamente, los coeficientes que cuantifican los aciertos son la sensibi-lidad, P(+ | E), y la especificidad P(- | NE).

Cuando la prueba se utiliza con fines diagnósticos (o de screening) interesa calcular P(E | +) o valor predictivo positivo (VPP) y P(NE | -) o valor predictivo negativo (VPN).

(12.1)


Si se aplica el teorema de Bayes (expresión 12.1) y se consideran los sucesos enfermedad y no enfermedad como una partición de A, se tiene la expresión:

(12.2)

(12.3)

(12.4)

(12.5)

De acuerdo con las definiciones hechas es posible expresar que:

y desde luego, de manera similar se calcula el valor predictivo negativo a partir de:

que también se expresa como:

Por ejemplo, calcular el valor predictivo positivo de un paciente de 25 años, con dolor precordial, fumador y con una elevación en suero de una enzima útil en el diagnóstico de infarto del miocardio, suponiendo 1 % de prevalencia para esta edad, y 90 % de sensibilidad y especificidad de la prueba; un resultado positivo se correspondería con un valor predictivo positivo de 8,3 %.

VPP = (0,90)(0,01)/[(0,90)(0,01) + (1 - 0,90)(1 - 0,01)] = (0,083)(100) = 8,3 %

(12.6)

Tabla 12.4. Prueba para distintos puntos de corte

Prueba NE E Total

- a b r+ c d sTotal t u r + s + t + u


Una prueba positiva en un paciente adulto de 68 años con dolor anginoso, fumador, dolor precordial y estimando 90 % de prevalencia del infarto para este grupo poblacional, el valor predictivo positivo será de 99 %. Es decir, el paciente de 68 años y el joven de 25 años tienen positiva la misma prueba diagnóstica, sin embargo, el de 68 años tiene una probabilidad 10 veces mayor (99 contra 8 %) de tener la enfermedad.

En otro ejemplo se tiene una prueba de laboratorio con 95 % de sensibilidad y 95 % de especificidad, pero se conoce, a la vez, que la prevalencia de la en-fermedad en cuestión es de 5 por cada 1000 individuos en la población adulta. Utilizando la fórmula 12.3 para calcular el valor predictivo positivo se tiene que:

VPP) = (0,95)(0,005)/[(0,95)(0,005) + (0,05)(0,995)] = 0,00475/0,0545 = 0,087

Lo cual significa que en 1000 pruebas positivas, solo 87 corresponden a enfermos y el resto son individuos sanos.

Ambos valores predictivos (VPP y VPN) dependen de la prevalencia de la enfermedad. Una prueba diagnóstica que funciona muy bien en la clínica Mayo de Estados Unidos, puede ser inútil en el Hospital Amejeiras de Cuba, si la prevalencia de la enfermedad es distinta.

El valor predictivo positivo es un indicador útil, pero no tanto para pacien-tes individuales. Un paciente llega a la consulta del médico con determinada enfermedad que tiene una prevalencia o probabilidad de manifestarse en la po-blación, pero también llega con su historia personal, con variados antecedentes que predisponen o no a esa enfermedad.

En un paciente individual, la prevalencia de la enfermedad puede orientar y ser considerada como la probabilidad a priori. También el médico, sobre la base de ese valor de prevalencia en la población en general, pudiera asumir que el pa-ciente tiene un valor mayor o menor de probabilidad de contraer esa enfermedad, teniendo en cuenta su edad, factores genéticos, etc. que conoce con precisión.

Desde luego, existe un componente subjetivo en todas estas estimaciones. Habitualmente, los clínicos expresan esta probabilidad a priori como “tengo la impresión de que este paciente tiene tal enfermedad”. Por eso, otro indicador útil es el odd o razón de probabilidades entre las de tener y no tener la enfermedad.

Nótese que los valores predictivos, positivo o negativo, dependen de la pre-valencia de la enfermedad.

Con el teorema de Bayes (expresión 12.1) es posible calcular los odds finales a partir del conocimiento de la prevalencia de la enfermedad (odds iniciales) y de la calidad de la prueba diagnóstica:

Odds antes = P(E)/P(NE) Odds después = P(E | +)/P(NE | +)

(12.7)(12.8)


El numerador de la expresión 12.8 es equivalente a la 12.2, y el denominador se puede expresar según la ecuación 12.9:

Dividiendo la expresión 12.2 entre la 12.9 se obtiene:

(12.10)

(12.9)

En la expresión 12.10 se observa que el cociente:

P(+ | E)/P(+ | NE) es equivalente a:

sensibilidad/(1 - especificidad)

y que P(E)/P(NE) ya se definió en 12.7 como odds iniciales o antes de co-nocer el resultado de la prueba. Todos los demás términos se anulan y queda:

Odds finales = [sensibilidad/(1 - especificidad)](odds iniciales) Al cociente: sensibilidad/(1 - especificidad) se le conoce como razón de

verosimilitud y para un punto de corte determinado para considerar la prueba positiva, tiene un valor que se relaciona con la calidad de la prueba.

El valor de los odds iniciales se puede calcular, si el médico conoce, o esti-ma, la prevalencia de la enfermedad, mediante su experiencia como médico, la información que posee acerca de esa enfermedad en particular y otros estudios realizados al paciente. La razón de verosimilitud (sensibilidad/1-especificidad) también es factible de calcular para la prueba positiva y un punto de corte es-pecífico. Por lo tanto, es fácil hallar el valor de los odds finales.

Vease el ejemplo siguiente:1. Calcular los odds de que una hepatitis esté presente antes de realizar la ala-

nina aminotransferasa o glutámico pirúvica (ALAT) en suero. Suponiendo que existe una probabilidad estimada de 12 % para esta enfermedad en de-terminada población, y esa probabilidad es, a la vez, la probabilidad a priori para un paciente que llega a la consulta médica. Por lo que la probabilidad de no hepatitis es de (1 - 0,12) = 0,88. Los odds serán 0,12/0,88 = 0,14.

2. Calcular la razón de verosimilitud positiva de la nueva información de la prueba diagnóstica; en este caso una determinación positiva de alanina aminotransferasa en un paciente (para la nueva información se reporta 95 % de sensibilidad y 90 % de especificidad). La razón de verosimilitud es 0,95/0,10 = 9,5.

(12.11)


3. Calcular los odds después de incorporar nueva información. El producto de los pasos 1 y 2 es 0,14 ∙ 9,5 = 1,33.

4. Convertir los odds en probabilidad:

Probabilidad = odds/(1 + odds) = 1,33/2,33 = 0,57

Si la prueba diagnóstica resulta negativa, se utiliza el inverso de la razón de los odds iniciales, es decir, 0,88/0,12 = 7,3 y este valor multiplicado por la razón de verosimilitud negativa (1- especificidad/sensibilidad) sería equivalente a los odds finales de no padecer la enfermedad.

La ventaja del análisis bayesiano al interpretar una prueba diagnóstica, con-siste en que el clínico puede estimar mejor el riesgo de un paciente de tener o contraer una enfermedad.

En el lugar de los cálculos realizados en el ejemplo anterior, son útiles los nomogramas, como el que se muestra en la figura 12.6, disponibles en algunos sitios de Internet.

La línea de la izquierda representa diversos valores de probabilidad previa a la prueba; la línea del medio corresponde a las diferentes razones de proba-bilidad o verosimilitud positivas que pueden encontrarse en una prueba; y la línea de la derecha muestra las probabilidades de tener la enfermedad según el resultado de la prueba.

El procedimiento consiste, sencillamente, en trazar una línea recta entre la probabilidad previa de cada caso y la razón de probabilidad de la prueba que se está utilizando, y la continuación de esa línea recta hacia la derecha se cruzará con el valor correspondiente a la probabilidad de tener la enfermedad posterior al empleo de la prueba.

En este nomograma se puede apreciar que los cambios más significativos en la probabilidad de la enfermedad ocurren con pruebas que tienen razones de probabilidad mayores que 10 o menores que 0,1. Las pruebas con razones de probabilidad positivas mayor que 10 y las pruebas con razones de probabilidad negativas menores que 0,1 son muy útiles para confirmar o descartar, respec-tivamente, una enfermedad.

Una alternativa al empleo de estos nomogramas sería desarrollar un programa de computación sencillo para el cálculo de los odds finales y las probabilidades.

Este tipo de enfoque, basado en el estadístico bayesiano, puede ser útil en otras especialidades médicas no relacionadas con el laboratorio clínico.

Aunque no es el propósito principal de este trabajo, es útil tener en cuenta las similitudes existentes entre las pruebas diagnósticas en general y las pruebas estadísticas:

Fig. 12.6. Nomograma para el cálculo de los odds finales.


Prueba diagnóstica Prueba estadística

Ausencia de enfermedad Hipótesis nula verdadera (H0) Presencia de enfermedad Hipótesis alternativa verdadera (H1) Resultado positivo Resultado positivo (rechazo de H0) (fuera de lo normal) Resultado negativo Resultado negativo (no rechazo H0) (dentro de lo normal) Sensibilidad Potencia Falsos positivos (1 - especificidad) Valor de p o significación estadística Valor predictivo positivo Valor predictivo positivo Probabilidad a priori Probabilidad a priori de la H0 de la enfermedad

Curvas ROC y pruebas diagnósticasUn valioso método para la comparación de pruebas diagnósticas, que incluso

lo incluyen varios programas estadísticos, como el SPSS o el Epidat 3.1, es el de las curvas ROC (Receiver Operating Characteristics).

Como no resulta muy fácil escoger el mejor punto de corte para tener un adecuado equilibrio entre la sensibilidad y la especificidad, algunos autores prefieren utilizar una técnica gráfica denominada curvas ROC. Estos gráficos tienen una historia interesante, pues fueron utilizados por primera vez durante la Segunda Guerra Mundial para determinar la sensibilidad y especificidad asociada a la detección de aviones enemigos.

Estas curvas se generan ploteando la sensibilidad (porcentaje de verdaderos positivos) en el eje y contra (1 - especificidad) en el eje x. Esta última cantidad es equivalente al porcentaje de falsos positivos. Las curvas se obtienen al selec-cionar distintos puntos de corte y calcular los valores de sensibilidad y de falsos positivos. Las curvas son muy útiles cuando se quieren comparar dos pruebas diagnósticas. Una prueba es mejor que otra cuando su curva tienda más hacia arriba y hacia el ángulo izquierdo del eje de coordenadas.

Además de la información brindada por las curvas ROC, es necesario tener en cuenta las implicaciones que puede tener para el individuo (sano o enfermo) y para los servicios de salud de una determinada institución, el seleccionar uno u otro punto de corte. Por ejemplo, si se trata de una prueba de VIH, es muy importante darle preferencia a la sensibilidad de la prueba para que ningún sujeto enfermo quede sin detectar. Por el contrario, si fuera el caso de una prueba diagnóstica para decidir una intervención quirúrgica muy riesgosa para los pacientes, es preferible seleccionar un punto de corte para que la prueba tenga una alta especificidad y de esa manera ningún sujeto sano sea sometido a ese proceder quirúrgico.


En un estudio realizado por R. Zamora y R. Fernández Regalado (Tesis de Maestría, Universidad Autónoma de Tarija, Bolivia, 2007) se evaluó la eficiencia diagnóstica del antígeno prostático (PSA) total y libre, y porcentaje libre/total en el diag-nóstico de tumores prostáticos malignos. Los resultados con el programa SPSS se muestran en la tabla 12.5.

Tabla 12.5. Estadísticos descriptivos del antígeno prostático en pacientes con hiperplasia o cáncer prostático

Prueba Biopsia N Media DS

PSA total (µg/L) Hiperplasia 49 7,9755 3,39187 Cáncer 23 9,9057 5,45294

PSA libre (µg/L) Hiperplasia 49 1,7101 1,13179 Cáncer 23 1,2046 0,88244

% L/T Hiperplasia 49 21,2327 9,70879 Cáncer 23 12,8739 6,62970

Comparaciones realizadas entre ambos grupos por la t de Student.PSA total: t = -1,56; p > 0,05.PSA libre: t = 1,88; p > 0,05. % L/T: t = 3,73; p < 0,001. % L/T: porcentaje PSA libre/PSA total. DS: desviaciones estándar.

Como parte de este estudio se hizo un análisis gráfico, donde se demues-tra que la relación PSA libre/PSA total es un buen indicador diagnóstico para diferenciar pacientes con tumores malignos de la próstata (Fig. 12.7 y tabla 12.6).

Coordenadas de la curva ROC

En el análisis de las curvas ROC se pueden dar tres situaciones:1. Si las dos distribuciones (de individuos sanos y enfermos) no tienen sola-

pamiento, la curva tendría sensibilidad 1 y especificidad 1 para cualquier punto de corte y, en ese caso, un solo punto: 0,1.

2. Si las dos distribuciones coinciden totalmente, la prueba diagnóstica sería inútil y la curva obtenida correspondería a la diagonal, que iría desde el punto 0,0 hasta el punto 1,1.

3. Si las dos distribuciones se solapan en mayor o menor grado, como ocurre con la mayoría de las pruebas, la curva tendría la forma intermedia.


Tabla 12.6. Resultados de la prueba

Positiva si es mayor o igual que Sensibilidad 1 - especificidad

2,5000 1,000 1,0003,8000 1,000 0,9574,1500 1,000 0,8704,2500 0,980 0,8704,9500 0,959 0,8706,5000 0,959 0,8267,7000 0,939 0,8268,1000 0,939 0,7838,3000 0,939 0,7398,6000 0,939 0,6968,9500 0,918 0,6969,4500 0,918 0,6529,9500 0,898 0,652

10,5000 10,5000 0,652

Fig. 12.7. Curva ROC para el índice % L/T (porcentaje PSA libre/PSA total). Área debajo de la curva: 0,773.

En la figura 12.8 se muestran tres curvas ROC correspondientes a pruebas diagnósticas de distinta calidad. Un parámetro útil es el área bajo la curva, la cual toma valores entre 0,5 (prueba inútil) y 1,0 (prueba perfecta). Esta área puede interpretarse como la probabilidad de que ante un par de pacientes, uno enfermo y otro sano, la prueba los clasifique correctamente.


Fig. 12.8. Tipos de curvas ROC.

Las curvas ROC también son muy útiles para realizar comparaciones entre dos métodos diagnósticos. Por ejemplo, para diferenciar el cáncer prostático de la hiperplasia prostática (Fig. 12.9 y tabla 12.7) mediante la determinación del antígeno PSA libre en µg/L y el cociente PSA libre/PSA total expresado en % (L/T). Los análisis que se muestran fueron realizados con el programa Epidat 3.1.

Según los resultados, se aprecia que el cociente L/T es algo mejor para dife-renciar hiperplasias de cáncer de la próstata; sin embargo, el valor de p no fue menor 0,05, aunque está en el mismo límite.

En resumen, las curvas ROC son útiles para:1. Conocer el rendimiento global de una prueba diagnóstica.2. Comparar dos pruebas diagnósticas.3. Comparar dos puntos de corte en una curva.4. Contribuir a elegir el punto de corte más apropiado para una prueba.

Como señalara Jaimes (2007) “El arte del diagnóstico clínico sigue apoyán-dose, fundamentalmente, en los pilares de la historia clínica y el examen físico. Este arte, sin embargo, puede mejorarse sustancialmente para la práctica coti-diana con el empleo y la interpretación apropiados de los componentes básicos de las pruebas de diagnóstico”.

Fig. 12.9. Comparación de curvas ROC entre el antígeno prostático libre (PSA libre) y el cociente PSA libre/ PSA total en % (L/T), como pruebas diagnósticas para diferenciar hiperplasia y cáncer prostáticos. Tipo de curvas: Curvas correlacionadas. Número de curvas: 2. Nivel de confianza: 95,0 %.

Tabla 12.7. Tabla relacionada con el gráfico de la figura 12.9

Curva Área ROC EE (De Long) IC (95 %)

PSA libre 0,6508 0,0730 0,5077 0,7940L/T 0,7733 0,0584 0,6589 0,8877 Prueba de homogeneidad de áreas:Ji-cuadrado = 3,5983 Grado de libertad = 1 Valor de p = 0,0578EE: error estándar.IC: intervalo de confianza.


Para finalizar este capítulo se puede concluir que:1. Las pruebas diagnósticas en la actualidad, ya sean cualitativas o cuantita-

tivas, tienden a ser: fáciles de aplicar, simples, de bajo costo, o se trata de disminuir lo más posible, de carácter no invasivo, con alta sensibilidad, tanto analítica como diagnóstica, y rápidas en brindar un resultado.

2. Los medios diagnósticos cualitativos y cuantitativos que se utilizan en el laboratorio de bioquímica clínica han alcanzado un alto nivel tecnológico y para introducirlos en la práctica médica son rigurosas las exigencias que se les imponen.

3. Para probar la capacidad de una nueva prueba diagnóstica es importante definir, de manera clara, los criterios de selección de los pacientes, disponer de “una regla de oro” para clasificarlos y diferenciar los enfermos de los sanos, y evitar el error sistemático o aleatorio en el proceso de evaluación de la prueba.

4. Para una prueba diagnóstica, ya sea cualitativa o cuantitativa, es conve-niente reportar la sensibilidad clínica, la especificidad y su valor predictivo positivo. Resulta útil auxiliarse de las curvas ROC para escoger el punto de corte adecuado para una mejor sensibilidad y especificidad, aunque aspectos de índole práctica (como las molestias al paciente, la naturaleza de la enfermedad y las implicaciones individuales o sociales de otorgarle más preferencia a la sensibilidad o a la especificidad) son factores muy importantes a la hora de seleccionar el punto de corte.

5. El cálculo de los odds finales, basado en el teorema de Bayes, también puede ser útil para interpretar los resultados de una prueba positiva en determinado paciente.

6. Los procedimientos que se deben tener en cuenta para realizar e interpretar las pruebas diagnósticas están basados en la estadística inferencial.

Sistema Internacional de Unidades

Anexo 1

Los resultados de las mediciones en el laboratorio se expresan con un nú-mero y una unidad de medida. Por lo que, en el laboratorio es común que un especialista o técnico le diga a otro: “Tengo que pesar 20 mg de este reactivo”.

Los primeros sistemas de medidas fueron el denominado CGS (porque las unidades básicas eran el centímetro, el gramo y el segundo) y el MKS (metro, kilogramo y segundo). En la actualidad, el sistema que se está recomendando y se utiliza internacionalmente se denomina Sistema Internacional de Unidades (SI o SIU) y fue aceptado en 1960 como resultado de los trabajos de la XI Con-ferencia Internacional de Pesos y Medidas. La Conferencia General de Pesos y Medidas (CGPM) desde 1889 ha funcionado como la autoridad internacional para las mediciones.

La adopción de este sistema en el campo de la salud en 1977 es una conse-cuencia lógica de la globalización en el campo de la metrología y la normali-zación, con la finalidad de establecer unidades que se aceptan a nivel mundial y su utilización es más sencilla. Algunas de las ventajas de este sistema en comparación con los anteriores son las siguientes:

1. Uniformidad, ya que las conversiones entre múltiplos y submúltiplos re-sultan fáciles de calcular.

2. Su simplicidad es debida a que se eliminan coeficientes de los cálculos.3. Tiene alta coherencia, ya que las unidades derivadas están en función de

unidades básicas.4. Unifica unidades en diferentes áreas del diagnóstico de laboratorio, como

las de hematología y química clínica.5. Elimina las confusiones que se originan por utilizar diferentes unidades

para medir la misma magnitud.6. Elimina las complejidades y confusiones en la literatura científica y en la

docencia al establecer un sistema único de abreviaturas.7. Permite una mejor comprensión de los fenómenos biológicos.8. Actualmente tiene una amplia difusión internacional.


UnidadesExisten tres tipos de unidades: básicas (de base o de referencia), derivadas y

suplementarias. Las unidades básicas fueron propuestas para siete magnitudes físicas dimensionalmente independientes; el número siete es fácil de recordar porque el arcoíris tiene siete colores y son siete las notas musicales. Además, comprende una serie de prefijos que permiten formar múltiplos y submúltiplos decimales de las unidades utilizadas.

Unidades básicas

En la tabla A.1.1 se muestran estas unidades básicas, las cuales están defini-das con una gran precisión y los progresos de la ciencia obligan a redefinirlas cada cierto tiempo, aún con precisión mayor. El término básica no significa más importante, sino que a partir de estas unidades se derivan otras, razón por la cual algunos prefieren llamarlas de base.

Cuando se multiplica una unidad de base, o básica, por sí misma o se asocian dos o más unidades de ese tipo por una simple multiplicación o división, se puede formar un amplio grupo de unidades derivadas; por ejemplo, la unidad derivada para el volumen es el metro cúbico (m3) y la unidad de velocidad es metro por segundo (m/s).

La combinación de unidades básicas para formar unidades derivadas es una de las grandes ventajas del SI. En este sistema no es preciso saber de memoria ni un solo factor de conversión; a un sistema de este tipo se le denomina coherente.

Tabla A.1.1. Unidades básicas del Sistema Internacional de Unidades

Magnitud física Nombre Abreviatura de la unidad

Longitud metro mMasa kilogramo kgTiempo segundo sCorriente eléctrica ampere ATemperatura termodinámica kelvin KCantidad de sustancia mol molIntensidad luminosa candela cd

Anexo 1. Sistema Internacional de Unidades 209

Unidades derivadas

A cierto número de unidades derivadas se les ha dado nombres especiales, en su mayor parte relacionados con hombres de ciencia que han hecho contribu-ciones importantes en determinado campo del conocimiento. En la tabla A.1.2 se muestran algunas unidades derivadas.

Tabla A.1.2. Unidades derivadas

Magnitud física Nombre de la unidad Símbolo SI Unidades básicas

Superficie metro cuadrado m2 m2

Volumen metro cúbico m3 m3

Velocidad metro por segundo m/s m/sAceleración metro por segundo al cuadrado m/s2 m/s2

Concentración de la mol por metro mol/m3 mol/m3

cantidad de sustancia cúbicoDensidad de masa kilogramo kg/m3 kg/m3

por metro cúbico Frecuencia hertz Hz s-2

Fuerza newton N kg ∙ m/s2

Presión pascal Pa (N/m2) kg ∙ m-1/s2

Energía, trabajo, joule J (N ∙ m) kg ∙ m2/s2

cantidad de calor Potencial eléctrico volt V (W ∙A-1) kg ∙ m2 ∙ s-3 ∙ A-1

Carga eléctrica; coulumb C A ∙ scantidad de electricidad Potencia watt W (J/s) kg ∙ m2/s3

Capacidad eléctrica farad F C/VResistencia eléctrica ohm Ω V/AConductancia siemens S A/VTemperatura Celsius grado Celsius 0C K

Unidades suplementarias

Las unidades suplementarias se encuentran en una situación algo anormal por no haber decidido la CGPM si deben considerarse como básicas o derivadas. Solo hay dos: el radián (símbolo rad) que es la unidad de ángulo plano y el estereorradián (símbolo sr) que es la unidad de ángulo sólido. Ninguna de las dos se utiliza con frecuencia en el campo de la biología.


Algunas unidades han sido retenidas, ajenas al SI, para su empleo con el Sistema Internacional. Entre las más comunes utilizadas en bioquímica clínica se encuentran las que se relacionan en la tabla A.1.3.

Tabla A.1.3. Unidades suplementarias

Magnitud física Nombre Símbolo Unidades de la unidad básicas Tiempo minuto min 1 min = 60 s hora h 1 h = 3 600 s día d 1 d = 86 400 sVolumen litro L o l 10-3 m3

Ángulo plano radián rad π/180Masa tonelada t 1 t = 1000 kg

En Norteamérica, el símbolo de litro se escribe con mayúscula.Como se aprecia, el litro y las unidades de tiempo son de gran importancia

en el campo de la salud.Para convertir concentración de masa a concentración de sustancia se presenta

el ejemplo siguiente: Albúmina sérica = 40 g/L PM de la albúmina sérica = 69 000 g/mol 40/69 000 = 5,8 ∙ 10-4 mol/L Albúmina sérica = 580 µmol/L

Prefijos en el Sistema Internacional de Unidades

En numerosas ocasiones, las unidades de base del SI y las unidades derivadas resultan demasiado grandes o pequeñas para determinados fines; por ejemplo, sería desproporcionado expresar la concentración de un analito, en sangre, en metros cúbicos. Para obviar esta dificultad se forman múltiplos y submúltiplos decimales de las unidades.

En la tabla A.1.4 aparecen dieciséis prefijos, algunos más utilizados que otros en bioquímica clínica.

Los prefijos en negritas no se obtienen por multiplicación o división por 103. No es recomendable utilizarlos en los trabajos científicos del campo de la salud.

Anexo 1. Sistema Internacional de Unidades 211

Tabla A.1.4. Prefijos

Factor Prefijo Símbolo Factor Prefijo Símbolo 1018 exa E 10-1 deci d1015 peta P 10-2 centi c1012 tera T 10-3 mili m109 giga G 10-6 micro μ106 mega M 10-9 nano n103 kilo k 10-12 pico p102 hecto h 10-15 femto f10 deca da 10-18 ato a

Anexo 2

Curva de calibración de glucosa

Nombre del procedimiento: Helfa-diagnósticos (Rapigluco-test).Aplicación: para la determinación de glucosa en suero por método enzimático

(glucosa oxidasa y peroxidasa).Materiales adicionales: espectrofotómetro, micropipetas y pipetas, baño

termostatado y cronómetro.Concentración de glucosa del calibrador (C) = 30 mmol/L.Preparación de las disoluciones de glucosa a partir de C y resultado de la

lectura de absorbancia a 530 nm.

Tabla A.2.1. Datos para la curva de calibración de glucosa (Fig. A.2.1)

Volumen C H2O [Glucosa] AbsorbanciaµL µL mmol/L

20 280 2 0,116 40 260 4 0,207 60 240 6 0,300 80 220 8 0,380160 140 16 0,817220 80 22 1,153 Σ - - - 58 2,973

Factor de calibración: Σx/Σy = Σconcentraciones /Σabsorbancias. Factor de calibración = 58/2,973 = 19,508 Cálculo: [Glucosa]muestra = Absorbancia de la muestra · factor de calibración : [Glucosa]muestra = Absorbancia de la muestra · 19,508

Anexo 2. Curva de calibración de glucosa 213

Fig. A.2.1. Curva de calibración de glucosa.

Anexo 3

Preparación de disoluciones

Una disolución es definida como una mezcla homogénea de dos o más sus-tancias. Mezcla homogénea significa que los componentes y las propiedades de esta mezcla son uniformes a través de todo el volumen de la disolución. Los componentes de una disolución pueden ser moléculas, iones, átomos, con un diámetro de estas partículas de 10-9 m (1 nm) o menor aun, y no son visibles al microscopio óptico.

Por lo general en una disolución es posible distinguir dos componentes: el soluto (o los solutos) y el disolvente. La sustancia que se disuelve es el soluto, y el agente que disuelve es el disolvente. El soluto, en una disolución común preparada en el laboratorio de bioquímica, es el componente en más pequeña cantidad, muchas veces en estado sólido; el otro componente, el más abundante, es el disolvente o líquido que disuelve el soluto. En muchos casos el disolvente es el agua. Varios tipos de disoluciones pueden existir, y así se clasifican, de acuerdo con el estado físico de sus componentes, de sólido en líquido, gas en líquido o líquido en líquido.

Algunas características comunes a todas las disoluciones son las siguientes: 1. Es una mezcla homogénea.2. Es un sistema con una sola fase física.3. Las propiedades químicas de los componentes se mantienen inalteradas.4. Las propiedades físicas de la disolución son diferentes a las del disolvente

puro, por ejemplo: puntos de ebullición y congelación.5. Las partículas son estables en un campo gravitacional.6. Las partículas presentes en una disolución no pueden ser observadas con

el microscopio óptico. 7. En una disolución no se observa el fenómeno de difracción de la luz.8. Son mezclas estables.

Para caracterizar una disolución es muy importante especificar su concen-tración, en cuanto a sus magnitudes y las unidades apropiadas. Existen varias maneras de expresar la concentración de una disolución, algunas de las cuales, las más comunes, se definen en la tabla A.3.1.

Tabl

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Otro tipo de mezcla entre las sustancias son las suspensiones o dispersiones groseras. Las partículas en las suspensiones son mayores que las que se en-cuentran en las disoluciones verdaderas; con un diámetro de 10-6 m o mayor. Estas mezclas se obtienen mediante agitación mecánica, pero los componentes suelen sedimentar después de pasado algún tiempo por acción de la gravedad. Fácilmente estas partículas se pueden observar al microscopio óptico; por ejemplo, una mezcla de arcilla en agua de río, de glóbulos rojos en la sangre o de gotas de grasa de la leche.

Las partículas de diámetro intermedio entre las disoluciones y las suspensio-nes, es decir, con diámetros entre 10-9 y 10-6 m forman dispersiones coloidales y son invisibles a simple vista y con el microscopio óptico. Son estables a la gravedad y solo precipitan con centrifugación a altas velocidades. Las partículas coloidales pueden atravesar membranas permeables, como el papel de filtro, pero son retenidas por membranas de diálisis como el celofán. Ejemplos de disper-siones coloidales son las proteínas en la leche y el humo del cigarro en el aire.

En el laboratorio, usualmente los técnicos preparan disoluciones concentra-das (a veces nombradas “disoluciones madres”) a partir de las cuales suelen prepararse otras más diluidas para el trabajo diario. La principal ventaja de este proceder es su conservación, ya que los microorganismos no crecen fácilmente en las disoluciones concentradas y, por el contrario, en las diluidas sí. Sin lugar a dudas, las disoluciones concentradas son de más fácil almacenamiento.

Preparación de disoluciones diluidasPara preparar una disolución diluida a partir de otra más concentrada se

emplean cálculos simples basados en la ley de la conservación de la masa:

C1V1= C2V2

Donde:C1 y V1 son la concentración y el volumen de la disolución concen trada, respectivamente.C2 y V2 son la concentración y el volumen de la disolución diluida que se desea preparar.

Conociendo tres de estas variables, es posible obtener el valor de la cuarta variable.

Ejemplo:Determinar cuántos mililitros de una disolución 5,5 M (molar) de NaOH

(hidróxido de sodio) son necesarios para preparar 300 mL de una disolución 1,2 M de NaOH.

Anexo 3. Preparación de disoluciones 217

Respuesta:

5,5 M · V1 = 1,2 M · 0,3 L V1 = (1,2 M · 0,3 L)/5,5 M V1 = 0,065 L

V1 = 65 mL

Así, para preparar una disolución 1,2 M de NaOH se deben verter 65 mL de la disolución concentrada (5,5 M) de NaOH en un recipiente volumétrico y añadir agua destilada hasta un volumen final de 300 mL.

Preparación de disoluciones de diferentes concentraciones

Composición porcentual de masaTambién se le conoce como fracción de masa (% w/w).Ejemplo: Determinar la fracción de masa de una disolución de sales (100 g de disolución)

que contiene 20 g de NaCl (cloruro de sodio). Respuesta: (20 g NaCl/100 g disolución) 100 = 20 % la fracción de masa de

NaCl en la disolución.

Fracción de volumen de un componente

Este tipo de expresión, o fracción de volumen (% v/v), se utiliza mucho cuando los dos componentes son líquidos:

Volumen del soluto/volumen de la disolución · 100 = v/v %Ejemplo:Preparar una disolución de etanol a 70 %.Respuesta:Tomar 70 mL de etanol a 100 % y agregar agua destilada hasta 100 mL.

Concentración de masa de la sustancia

Ejemplo:Preparar 350 mL de una disolución acuosa a 12 % de NaCl (w/v).Respuesta:

(12 g/100 mL) 350 mL = 12 g · 3,5 = 42 g de NaCl


Deben disolverse en agua y completar hasta 350 mL con agua destilada.

Fracción molar

Esta expresión equivale al número de moles de un componente dividido por el total de moles de todas las especies químicas en la disolución. Téngase en cuenta que la suma de todas las fracciones molares de los componentes debe ser 1.

Ejemplo:Determinar las fracciones molares de los componentes de una disolución

formada cuando 92 g de glicerol se mezclan con 90 g de agua (PM del H2O = 18 y del glicerol = 92). Donde PM es peso molecular.

Respuesta: 90 g de agua = 90 g · 1 mol/18 g = 5 moles de agua

92 g de glicerol = 92 g · 1 mol/92 g = 1 mol glicerol Total moles = 5 + 1 = 6 moles

Fracción molar X agua = 5 mol/6 mol = 0,833

Fracción molar Yglicerol = 1 mol/6 mol = 0,167 Xagua + Yglicerol = 0,833 + 0,167 = 1,000

Molaridad

La molaridad (M) es probablemente la forma de expresión más común de la concentración de una disolución.

Ejemplo 1: Determinar la molaridad de una disolución preparada al disolver 11 g de CaCl2 (cloruro de calcio) en agua para obtener una disolución con un volumen final de 100 mL, si 1 mol de CaCl2 = 110 g.

Respuesta: 11 g de CaCl2/(110 g/mol de CaCl2) = 0,10 mol de CaCl2 100 mL · 1 L/1000 mL = 0,10 L molaridad = 0,10 mol/0,10 L molaridad = 1,0 M (mol/L)

Ejemplo 2:Preparar 1 L de disolución 0,15 molar utilizando un reactivo sólido cuyo

PM = 194,3.Respuesta:

194,3 g/mol · 0,15 moles/L = 29,145 g/LDisolver 29,145 g y completar el volumen hasta 1 L.


Ejemplo 3:4 g de sacarosa (sacarosa: C12H22O11) se disuelven en agua destilada hasta

un volumen final de la disolución de 350 mL. Determinar la molaridad de la disolución de sacarosa. Donde:

M = m/V M es molaridad (mol/L) m = número de moles del soluto.

V = volumen de la disolución (L).Respuestas:1o. Determine la masa molecular de 1 mol de sacarosa, si se conoce que el

peso atómico de cada elemento es: C = 12, H = 1 y O = 16, por lo tanto: C12H22O11 = (12)(12) + (1)(22) + (16)(11)

C12H22O11 = 144 + 22 + 176 C12H22O11 = 342 g/mol

2º. Determinar el número de moles de sacarosa en 4 g: 4g/(342 g/mol) = 0,0117 mol

3º. Determinar el volumen de la disolución en litros: 350 L (1L/1000 mL) = 0,350 L

4º. Determinar la molaridad de la disolución. Donde: M = m/V

M = 0,0117 mol /0,350 L M = 0,033 mol/L

La molaridad de la disolución de sacarosa es 0,033 mol/L.Ejemplo 4Preparar un volumen específico de una disolución molar a partir de un reactivo

en estado sólido. Por ejemplo, 1 mol de glucosa equivale a 180 g/mol (PM de la glucosa 180) y se necesita preparar 25 mL de una disolución 0,15 moles/L (0,15 M), ¿cuántos g de glucosa deben disolverse en 25 mL para hacer esta disolución?

Respuesta: # g/volumen deseado (L) = molaridad deseada (moles/L) · masa de 1 mol (g/mol) # g = volumen deseado (L) · molaridad deseada (moles/L) · masa de 1 mol (g/mol) # g = 0,025 L · 0,15 moles/L · 180 g/mol # g = 0,675 g Para convertir % (w/v) a molaridad o de molaridad a % (w/v) se puede

utilizar la expresión siguiente:


Molaridad = (% de la disolución) · 10/PMPor ejemplo, una disolución a 10 % de glucosa. Para convertir esta expresión

en moles/L:Molaridad = 10 · 10/180 = 0,55 M

Molalidad

La molalidad es el número de moles de soluto disueltos en 1 kg de disol-vente. Debido a que la densidad del agua a 25 0C es, aproximadamente, 1 kg/L, la molalidad se aproxima a la molaridad en disoluciones diluidas; pero no son equivalentes, si la temperatura es diferente, cuando no es una disolución diluida, o el disolvente no es agua.

Ejemplo: ¿Cuál es la molalidad de una disolución con 10 g de NaOH en 500 g de agua?

Respuesta: Masa de NaOH (g)/masa de 1 mol de NaOH (g/mol)

10 g/(40 g/mol) = 0,25 mol de NaOH 500 g de agua = 0,50 kg de agua molalidad = 0,25 mol/0,50 kg molalidad = 0,5 mol/kg

Normalidad

La normalidad (N) se define como el peso equivalente-gramo de un soluto por litro de disolución, aunque no es recomendada en el Sistema Internacional de Unidades, se sigue utilizando. Un equivalente-gramo es una medida de la capacidad reactiva y cantidad de una sustancia, utilizada en cálculos con reac-ciones de transferencia de protones o electrones. Por ello, se puede definir como: el equivalente-gramo de una sustancia es la cantidad en gramos de esta sus-tancia que cede o acepta un mol de protones (en las reacciones ácido-base) o que gana o pierde un mol de electrones (en las reacciones redox).Tam-bién se ha definido como la cantidad de sustancia que reacciona o sustitu-ye a 1,008 g de hidrógeno, es decir a un átomo-gramo de este elemento. En las reacciones se cumple que cualquier pareja de sustancias reaccionan en la proporción de 1 Eq:1 Eq.

Ejemplo 1:1 M de ácido sulfúrico (H2SO4) es 2 N para las reacciones ácido-base, debido

a que cada mol de ácido sulfúrico tiene 2 moles de iones H+. Ejemplo 2:Calcular el volumen de ácido sulfúrico concentrado, con una densidad de

1,842 g/mL y 96,0 % de pureza, necesario para preparar 2 L de una disolución 0,20 N de H2SO4 (PM = 98,08).


Respuestas:1º. Hallar el peso equivalente del H2SO4:

98,08/2 = 49,04 g/Eq

2º. Hallar los gramos de H2SO4 requeridos: 0,20 Eq/L · 2,0 L · 49,04 g/Eq #g H2SO4 requerido = 19,116 g

3º. Calcular el volumen necesario de H2SO4 concentrado que corresponde a esta cantidad de gramos:

#g H2SO4 requeridos = V (mL) · 1,842 g/mL · 0,96 %(0,96 se refiere a % de H2SO4, reportado por el fabricante en el rotulo del

frasco) 19,116 g = V (mL) · 1,76832 V (mL) = 19,116 g/ 1,76832 = 11,1 mL

Es necesario verter lentamente 11,1 mL de H2SO4 concentrado en 1 L de agua destilada y completar hasta un volumen final de 2 L para obtener la disolución deseada.

Preparar disoluciones de ácido sulfúrico es muy delicado y sumamente peli-groso, ya que la reacción es muy exotérmica; es recomendable poner el frasco volumétrico con agua en un recipiente con hielo y añadir el ácido sulfúrico en pequeñas porciones e ir mezclando, se deja una pequeña cantidad de agua para el enrase final.

También la manipulación de otros ácidos y bases concentrados debe realizarse con sumo cuidado. En la tabla A.3.2 se relacionan ejemplos de ácidos y bases que ofertan las firmas comerciales.

Tabla A.3.2. Concentraciones típicas de ácidos y bases de firmas comerciales

Nombre del ácido o la base Peso %

Densidad (g/mL)

Molaridad

Ácido acético (HOOC-CH3) 99,7 1,05 17,4

Ácido clorhídrico (HCl) 37 1,18 12,0

Ácido sulfúrico (H2SO4) 96 1,84 18,0

Ácido nítrico (HNO3) 70 1,40 15,6

Hidróxido de amonio (NH4OH) 28 0,89 14,6


Consejos practicos en el trabajo con ácidos y bases

1. Siempre utilice campana de extracción de gases cuando trabaje con ácidos o bases concentrados.Use delantal, guantes y espejuelos protectores.

2. Los reactivos muy básicos (alcalis) pueden, con el tiempo, degradar o reaccionar con la silica de los recipientes de vidrio. Por esa razon es más conveniente almacenar las disoluciones de bases fuertes en recipientes plasticos debidamente rotulados. Los ácidos fuertes pueden ser almacena-dos en recipientes de vidrio o plasticos, excepto el ácido fluorhídrico que se recomienda almacenar en recipiente plastico.

3. Es aconsejable almacenar ácidos y bases concentrados en los recipientes originales del suministrador.

Ejercicios1. Expresar en % (w/v) una disolución de glucosa 5,2 mmol/L.2. Calcular la normalidad de la disolución obtenida al diluir 0,40 L de una

disolución 0, 5 N de HCl hasta 1 L. 3. Determinar cómo preparar 150 mL de una disolución 0,1 M de HCl.4. Expresar la concentración de una disolución de glucosa 110 mg/dL en

mmol/L.5. Calcular el volumen de una disolución acuosa concentrada de HCl, con una

densidad de 1,188 g/mL y 38 % de HCl (w/v) necesario para preparar 1 L de una disolución 0,2 N de este ácido.

Anexo 4

En un proceso de purificación, por ejemplo en el caso de las proteínas, deben seguirse los pasos siguientes:

1. Obtener información de la literatura acerca de la macromolécula, sus prin-cipales características.

2. Elegir la fuente biológica de donde será obtenida.3. Definir y estandarizar un ensayo especifico de la proteína que permita

cuantificarla.4. Extracción de la proteína de la fuente (lisis osmótica, sonicación, homoge-

nización).5. Evaluación de la estabilidad de la macromolécula en los distintos pasos de

purificación. 6. Aislamiento y concentración.7. Evaluación de la pureza y calidad del producto obtenido.

No existe una secuencia única o recomendación general para diseñar o planear un proceso de purificación de determinada biomolécula, se trata más bien de un proceso empírico, aunque por lo general se dejan para el final las técnicas con más resolución. Así, para la purificación de una proteína, es muy común el orden, que puede ser perfectamente diferente, siguiente:

1. Solubilidad diferencial.2. Cromatografía de intercambio iónico.3. Cromatografía de adsorción.4. Cromatografía de exclusión molecular.5. Cromatografía de afinidad.6. Electroforesis.7. Isoelectroenfoque.

Durante el proceso de purificación es esencial realizar el seguimiento de la actividad biológica de la biomolécula de interés, así como de otros indicadores para la evaluación global del proceso. Estos indicadores son:

1. Actividad específica (AE): unidades totales de actividad biológica en la fracción ki total de proteínas en la fracción ki.

Purificación de proteínas


2. Rendimiento (R) o yield (%): unidades totales de actividad biológica en la fracción ki/unidades totales de actividad biológica en la fracción k = 1 o primera fracción · 100.

3. Grado de pureza (P) = AE en la fracción ki/AE en la fracción original k = 1.

En la tabla A.4.1 se muestra un ejemplo de estos cálculos para seguir el pro-ceso de purificación, en este caso de una proteína enzimática.

Para hacer los cálculos se siguen los pasos siguientes:1. Unidades: se determinaron las unidades internacionales (U) en este ensayo. 2. Actividad específica: dividir la actividad enzimática en 1 mL por la con-

centración de proteínas en ese volumen. Cuanto más alto este valor, mayor la pureza.

3. Actividad total: multiplicar la actividad específica/mL en la muestra por su volumen total.

4. Grado de pureza o factor de purificación: Dividir la actividad específica de cada fracción por la actividad específica de la primera fracción. Este número puede cambiar de acuerdo con la proteína que se esté purificando, y no existe un valor bueno o malo. Sin embargo, si esta valor es bueno y el rendimiento también, el proceso de purificación elegido es correcto.

5. Rendimiento (%): calcular el porcentaje de rendimiento de cada etapa utilizando la actividad total específica de esa etapa y comparándola con la de la etapa inicial.

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Bioquímica clínica s para el laboratorio · E n el capítulo 1 se aborda la seguridad y...

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