8/19/2019 Biosensor luminoso detector de plomo

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Informe #3 Taller de Proyecto "Biotecnología" 

Diseño de microorganismos luminosos medianteherramientas de biología sintética 

Integrantes: Sebastián Correa 

Daniela Lasso 

Josué Simanca 

Catalina Vicencio

Grupo número: 4 

Ayudante: Jean Franco Castro 

Docentes: Juan A. Asenjo  

Barbara Andrews 

Junio, año 2015 

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 Resumen

Uno de los grandes problemas a nivel mundial, es la contaminación del agua potable con metales

pesados. Uno de los más peligrosos en pequeñas cantidades es el Plomo.

Se plantea como solución la creación de un kit práctico que detecte la presencia y cantidad de este

metal en alguna muestra de agua que se desee analizar, para así determinar su riesgo de consumo y

prevenir futuros incidentes; la funcionalidad del kit se basa en la presencia de un biosensor

bacteriano que emite señales lumínicas en presencia del Plomo.

La distribución y venta de este kit, será principalmente a las empresas que otorgan el agua a las

comunidades y/o alguna institución o empresa de ventas que desee ofrecer el producto.

Finalmente se concluye con que el proyecto posee múltiples beneficios por sobre los métodos

actuales en la detección del plomo, y que concede tanto a productores como a compradores (y al lasociedad en general), provechos en ámbitos económicos, prácticos y para beneficio de la salud.

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Introducción 

Ante la problemática de los niveles de plomo en el agua, metal muy tóxico en pequeñas cantidades,

se ha propuesto la producción de un kit que permita detectar los niveles de este nocivo metal. Las

acciones tóxicas del plomo se atribuyen a su afinidad por los sitios de acción molecular del calcio,

como la adhesión que tiene a los huesos. Podemos encontrar este metal en el agua potable, muchas

veces debido a las tuberías que se utilizan para la llegada del agua a nuestras casas.

La epidemiología de los casos de intoxicación por niveles de plomo (recordar que los de intoxicación

por niveles en el agua potable es solo una de las fuentes que conlleva a una acumulación de plomo en

el cuerpo y posterior intoxicación) muestra numerosos casos al año, principalmente afectando a los

niños. Se estima que a causa de la exposición al plomo, hay 600.000 nuevos casos de discapacidad

intelectual en los niños, esto debido a que el plomo puede afectar gran parte del sistema nervioso, y

los menores son más vulnerables a estos daños. Se estima que alrededor de 143.000 personas muerenal año debido a la exposición al plomo, registrándose las tasas de mortalidad más altas en las regiones

en desarrollo. La mitad de los casos de mortalidad se atribuyen a Asia Sudoriental, en tanto las

regiones del Pacífico Occidental y Mediterránea Oriental poseen una quinta parte de los casos, según

datos de la OMS. i 

No existe un nivel de exposición al plomo que pueda considerarse seguro, pero la intoxicación por

este metal es totalmente prevenible, lo cual se intentará con nuestro kit, prevenir que la comulación

de plomo en el cuerpo sea mayor. Se ha confirmado que cuanto mayor es el nivel de exposición a este

metal, mayor es la diversidad, gravedad de los síntomas y efectos secundarios asociados al plomo.

Incluso concentraciones en la sangre que no superan 5 ug/dl (nivel hasta hace poco considerado

seguro) puede entrañar una disminución de la inteligencia del niño, así como problemas decomportamiento y dificultades de aprendizaje.

La creación de un biosensor que permita analizar los niveles de agua es imprescindible para este kit.

Se necesitan dos componentes para este biosensor, uno que identifique la presencia de plomo y otro

que de la señal de la presencia. Para la emisión de la señal se extraerá el gen de la bacteria  Vibrio

 fischery , específicamente los operones lux, que sintetizarán componentes necesarios para una

emisión de luz en presencia del metal. Como el mecanismo de expresión de los operones lux es a

través del mecanismo de Quorum Sensing (a mayor cantidad de plomo, mayor es la señal emitida),

nos permitirá medir los niveles del metal ii. Para poder identificar la presencia del plomo se extraerá

de la bacteria Ralstonia metallidurans  los operones pbr (ubicados en el plásmido pMOL30 de la

bacteria), que se encargan de la producción de sustancias capaces de autorregular la expresión de sus

genes y hacerla resistente a concentraciones elevadas de plomo.

Se utilizará la bacteria  Escherichia coli  DH5α, la cual ya posee un plásmido con la resistencia a un

antibiótico (vector pBR322). Para insertar en el plásmido deseado, se romperá el enlace fosfodiéster

que mantiene unidas las bases nitrogenadas, utilizando la enzima de restricción  Bam HI, reconocerá

el lugar del gen de la tetraciclina, donde se comenzará la inserción de los operones. Primero el gen de

reconocimiento pbr y luego el de la señal lux. Utilizando la técnica de PCR, se pretende obtener

numerosas copias del vector de interés. La ligación se realiza por la ligasa ADN T4 y ATP.

Para la inserción del plásmido en las bacterias se utilizará el método de transformación mediada por

Ca2+ . Para cultivar las bacterias genéticamente modificadas se aislarán en agar, donde solamente las

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bacterias con el plásmido que contiene el gen que expresa la resistencia a ese antibiótico sobrevivirán

y proliferarán.

Este kit requiere de un luxómetro, para que pueda entregar los datos numéricos de los niveles de

plomo de una muestra de agua. Contará con placas de petri portadores de   un cultivo de E.coli  

modificadas que contengan el plásmido creado y expresen la bioluminiscencia en presencia de plomo.Además contará con pipetas que servirán para obtener muestras de agua que deseen ser analizadas.

Por último, este kit incorpora un manual del usuario indicando paso por paso el uso del kit.

Detección de Plomo en la Actualidad y

Beneficios del Proyecto 

La determinación de las concentraciones de plomo en agua con métodos actuales suele ser difícil y

costosa debido a sus bajas concentraciones en las que se encuentra, por lo que requiere un trabajo

muy minucioso y con maquinaria capacitada para tal acción. Unos de los métodos actuales que seutilizan son la espectrometría de la emisión atómica asociada al plasma acoplado inductivamente y

la espectrofotometría en fase sólida, esta última sin requerir demasiada maquinaria y mejor

sensibilidad a volúmenes grandesiii.

Un método que está al alcance de las personas que se sienten en riesgo de consumir agua

contaminada es el análisis de esta, enviando muestras desde sus hogares a ciertas empresas que se

encargan del análisis y reenvío de resultados al pasar unos días. El costo promedio de este servicio

varía entre los 80 y 120 dólares aproximadamente.

Se pretende que el producto sea vendido a las empresas que proporcionan el abastecimiento de

agua potable en los hogares o bien a alguna institución pública y/o privada que desee contar coneste equipamiento. En primer lugar el kit constará de lo necesario para hacer un solo análisis y será

desechable, por lo que cabe recalcar que el luxómetro que se necesita para extraer los datos de la

muestra se venderá por separado, así se disminuirán costos del kit y no se desecha el luxómetro

usado una única vez (no son desechables). 

Lo que favorece a este proyecto es que el análisis no se lleva a un laboratorio, si no que se puede

hacer desde el mismo lugar de donde se extrae la muestra. Es de fácil utilización y está destinado a

la manipulación de cualquier adulto, con los respectivos cuidados que requiere.

Financiamiento y Capital inicial  

Este proyecto requiere de un fondo inicial considerable y no tan sencillo de conseguir, sin embargo

con la originalidad, relevancia y beneficios que puede traer este proyecto; se cree que son

suficientes para obtener el capital inicial.

Existen distintas formas de financiar proyectos innovadores emergentes que busquen un fin

beneficioso para la sociedad. De parte de Corfo por ejemplo, existen fondos destinados a

microempresarios emergentes, proyectos emprendedores, innovadores sociales, etc iv. A estos

fondos se puede llegar de manera sencilla postulando con el proyecto a través de la página web de

Corfo.

Otras maneras de comenzar el proyecto, son por ejemplo solicitar un crédito de apoyo emprendedoral gobierno, obtener un subsidio de alguna empresa contratista que quiera especializarse en la venta

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del producto, entre otras maneras que son capaces de cubrir el capital que se requiere para

comenzar el proyecto.

Cabe resaltar que una vez obtenida la maquinaria no es necesario seguir comprando más, pues la

producción es factible y puede continuar con estos recursos. Solo es necesario ir reponiendo la

despensa de las materias primas utilizadas en la elaboración del kit (bacterias, enzimas, soluciones,etc).

Estudios previos 

La conformación de la empresa dedicada a la producción del kit para detectar niveles de plomo en

agua requiere de estudios iniciales para poder confirmar ciertos datos a la hora de emprender el

rumbo. Primeramente se iniciaría con un estudio que pretendería despejar dudas en el

funcionamiento del biosensor, por ejemplo: saber el rango de concentración de plomo en el que

puede actuar la bacteria genéticamente modificada; a su vez saber cuanta luz(medido en lux)v emite

según los niveles de plomo a los que se ha expuesto; a cuantas concentraciones de plomo resiste lanueva bacteria; cual es la vida útil de los microorganismos y en qué condiciones se conservan mejor.

Son datos que son necesarios a la hora de configurar el kit. El luxómetro necesario para la

determinación de la intensidad lumínica debe ser comprado según el rango de intensidad en el cual

actúa el biosensor.

Otro estudio necesario para el emprendimiento de la empresa es un estudio de mercado que nos

pueda presentar la situación en la sociedad que estaría dispuesta a adquirir el producto que se desea

producir. Con este estudio, se puede saber alrededor de la cantidad a producir, cuales serán los

plazos para obtenerlos y en qué sitios, instituciones y/o empresas es conveniente ofrecer el

producto.

Costos 

Para la instalación de la empresa tendremos que tener en cuenta varios costos irrecuperables como

la maquinaria necesaria para la producción. Se requiere de un termociclador, que se utilizará para el

proceso de PCR. Un shaker, para el cultivo. Cámaras de electroforesis, para la separación de

proteínas y ácidos nucleicos. Además para la correcta proliferación de las bacterias por un periodo

prolongado de tiempo, se piensa aplicar el método de la liofilización a las células ya listasvi, por lo

que se requiere de un liofilizador para bacterias. Finalmente un set de micropipetasvii.

Tabla1.- Costos de maquinaria necesaria en un laboratorio.*

Producto Valor CLP (aprox)

Mecheros (c/u) 90 mil más iva

Termociclador 2,5 millones más iva

Shaker 2,5 millones más iva

Cámaras de electroforesis 1,25 millones más iva

Tubos Eppendorf 1,5 ml (c/u) 11mil iva incluido

Micropipetas 400 mil más iva

Liofilizador 1,75 millones más iva

TOTAL $8.501.000*Fuente: Elaboración Propia

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También hay que considerar los costos variables en los que se incurrir en forma periódica, como el

arriendo de un local para la instalación de la maquinaria y el equipo de trabajar. Asimismo tener en

cuenta las materias primas a utilizar en el proceso, como las enzimas de restricción, las bacterias y el

medio de cultivo LB para estas.

Tabla2.- Materias primas para creación y mantención de cultivo E. coliviii 

Producto Valor CLP (aprox)

Local de trabajo (arriendo) **

Enzimas de Restrición (BamHI) $52.000 (2.500 unidades)

Bacterias (Escherichia Coli) $140.000-180.000(5ml)

Medio de Cultivo LB Agar $195.000 (1Kg)

Ampicilina $1.500 (250 mg)

Peptona de Caseina $50.000 (1 Kg)Agar Bacteriológico $78.000 (1 Kg)

Extracto de Levadura $6.500 (1 Kg)

ClNa $1000 (1 Kg)*Fuente: Elaboración Propia 

**El costo del arriendo del local depende de la preferencia y comodidad que desee el empresario. Sin embargo cabe aclarar que no es

necesario un espacio mayor a 15 mts². 

Inicialmente se requerirá hacer el plásmido de interés que se querrá insertar en el cultivo. Este

consta del plásmido inicial del cual se comenzará el trabajo, es decir de los operones de interés para

la señal y la detección. Los operones se extraerán de las sepas de bacterias en las que han sido

localizados.

Tabla3.- Precios sepas y plásmidos específicos a utilizar en el proceso de la creación del

microorganismo.

Producto Valor CPL (aprox)

Plámido pBR322 (Escherichia Coli DH5α ) 63 mil (50 µg)

Sepa Ralstonia Metallidurans (operones pbr) 300 mil

Sepa Vibrio Fischery (operones lux) 300 mil*Fuente: Elaboración Propia 

El producto que se le entregará al comprador es un kit que contiene una placa de petri con la

bacteria genéticamente modificada, una pipeta para extraer la muestra de agua, guantes para lacorrecta manipulación de las sustancias, un contenedor oscuro en donde se introduzca la placas de

petri con la muestra y las bacterias en ella para ser analizada correctamente por el luxómetro sin

que se vea influenciado por otras fuentes de luz; y dentro un manual que especifica cada paso a

seguir.

Tabla4.- Elementos que componen el kit a entregar.

Producto Valor CPL (aprox)

Luxometro (*) $20.000(**)

Guantes $2.990 (50 pares)ix 

Petri desechable $233- $333 (por unidad)Pipeta desechable $10.193(100 unidades)+envío

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Empaque $700(por kit)

Contenedor oscuro(de PVC) $1000(cada uno)Fuente: Elaboración Propia 

(*) El luxómetro será vendido aparte del kit para no aumentar el valor del producto, pues se pretende que el luxómetro sea reutilizable.

(**) Los precios varían entre los 14 mil y los 30 mil pesos  

Preparación del Cultivo 

Para la preparación del cultivo bacteriano se requiere una cantidad específica e indispensable de

sustratos, a continuación se presenta una tabla que los detalla.

Tabla5.- Componentes necesarios para la producción de bacterias para un Kitx.

Componente Precio

80 µg de célula competente Escherichia Coli 

$2560

1-2 µg de plásmido que se desea insertar  $1260

10g de Peptona de Caseina  $500

5g ClNa  $5

5g Extracto de Levadura  $33

30 g de agar $2340

100 mg de ampicilina  $600

TOTAL  $7298*Fuente: http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/transformaciondeecoli/texto-transfecoli/transformacion-metodo-y-

resultados (26/07/2015) 

Preparación del Kit  

Para la preparación de un kit se requiere una cantidad específica de elementos, a continuación se

presenta una tabla que los detalla.

Tabla6.- Productos necesarios para la producción del kit:

Producto Precio

3 Par de Guantes  $180

3 Capsulas de Petri  $999

1 Pipeta  $102

Bacterias Generadas  $7298xi 

1 Contenedor oscuro  $1000

Empaque  $700

1 Instructivo  $25

TOTAL  $10304*Fuente: Elaboración Propia 

http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/transformaciondeecoli/texto-transfecoli/transformacion-metodo-y-resultadoshttp://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/transformaciondeecoli/texto-transfecoli/transformacion-metodo-y-resultadoshttp://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/transformaciondeecoli/texto-transfecoli/transformacion-metodo-y-resultadoshttp://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/transformaciondeecoli/texto-transfecoli/transformacion-metodo-y-resultados

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Precauciones 

Es necesario resaltar la importancia de un estudio de los riesgos que puedan traer los

microorganismos y que tan inofensivos son en distintas circunstancias. Se debe tener en

consideración que son bacterias alteradas genéticamente, por ende que su exposición y liberación

puede traer fuertes repercusiones ambientales.

Las bacterias, una vez finalizada su función deben ser depositadas en cloro para asegurar que no se

efectúe una contaminación al ambiente ni que existan percances con los residuos. Y las cápsulas que

no se ocupen en el momento deberán estar conservadas a la temperatura indicada en el producto.

Es importante destacar este tema, pues es necesario obtener el certificado de la Autoridad Sanitaria,

el cual se obtiene en el Departamento de Obras Municipales, y además pedir la Calificación Técnica a

la SEREMI de Saludxii (en caso que el producto sea de venta en el propio país).

Se sugiere que tanto en el envoltorio y empaque del kit, como dentro las instrucciones se aclaren las

contraindicaciones del producto. Además tiene que destacar con claridad un teléfono de

emergencias que traten los casos referentes a estas bacterias.

Todos las advertencias (obtenidas de los estudios previos) y sus respectivas instrucciones de uso,

serán mencionadas en el instructivo.

Discusión y Conclusiones 

El tratamiento y análisis de aguas en la actualidad es un proceso fundamental y de gran importancia

para la obtención y un correcto control de la salubridad del agua potable que llega a los hogares de

las personas. Sin embargo el análisis de metales pesados, como lo es el plomo, el cual en muy bajas

concentraciones ya se cataloga como peligroso, es un proceso de mayor complejidad, donde serequiere una maquinaria capacitada y en varias ocasiones costosa. Para los hogares que deseen este

análisis existe una opción(aclarar que no está presente en todos los sectores) que consta en enviar

una muestra un laboratorio de análisis y luego de unos días recibir de vuelta los resultados de este.

El costo de este servicio, suele encontrarse entre los 80 y los 120 dólares ($52000 y $78000 pesos

chilenos respectivamente).

El proyecto presente ofrece una alternativa eficiente y práctica para el análisis del agua en la

identificación del plomo. Gracias a la especificidad de las bacterias y su emisión proporcional de luz

respecto a las concentraciones de plomo en el agua, es posible identificar las cantidades del metal

incluso en bajas concentraciones. Además, el kit permitirá una manipulación sencilla para todo

adulto, y de fácil comprensión al momento del análisis de datos. La rápida acción de las bacterias

ofrecerá al usuario obtener en el instante los resultados del estudio sin tener que esperar mucho

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tiempo para poder adoptar las medidas necesarias en caso que el agua no se encuentre en

condiciones bebestibles.

Los costos del análisis para el cliente se verán reducidos drásticamente, pues con el kit a un precio

de $40 dólares ($26.000 CLP aprox.) y un luxómetro que solo es necesario comprarlo una vez en el

caso que se deseen hacer más estudios, se alcanza una mejor opción para el comprador máseconómica. Cabe mencionar que el kit permitirá realizar tres análisis, los cuales beneficiarán de una

manera importante a los usuarios.

El costo de producción de cada kit es de $10.304 CLP, lo cual lleva al productor de este bien obtener

sobre un 100% de ganancia a la hora venderlo. Pudiendo recuperar (dependiendo del éxito de

venta), el capital inicial en el caso que se desee recuperar y no haya sido un beneficio otorgado por

el estado o alguna otra institución.

El proyecto puede mejorar y ser mejor aprovechado si se realizan más estudios, tanto para la

compra y venta del producto, como también del diseño y cultivo de las bacterias; lo que puede llevar

al productor de este proyecto de innovación a maximizar aún más sus beneficios. También

favorecerá de una manera más eficiente y accesible , práctica y cómoda, a la sociedad en busca de

una mejor calidad de vida. Por todo lo anterior se considera este proyecto como una alternativa

factible para implementar.

Bibliografía 

i http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs379/es/ (01/07/2015)ii  María José Gallardo Nelson, 2009, Tésis: BÚSQUEDA DEL REGULÓN “QUORUM SENSING” DEAcidithiobacillus ferrooxidans MEDIANTE ESTUDIOS PROTEÓMICOS Y DETERMINACIÓN DELEFECTO DEL FE2+ SOBRE LAS AHLs PRODUCIDAS POR LA BACTERIA  iii  http://www.unne.edu.ar/unnevieja/Web/cyt/com2005/8-Exactas/E-021.pdf (05-07-2015)iv http://www.corfo.cl/programas-y-concursos/programas/fondo-etapas-tempranas-tecnologicas(12:34 25-07-

2015)v http://www.scheitler.com.ar/productos/luxometros/LX-9626.aspx (22:05 23-07-15)

vi http://revista.cnic.edu.cu/revistaCB/articulos/conservaci%C3%B3n-de-cepas-microbianas-por-el-m%C3%A9todo-de-liofilizaci%C3%B3n-para-el-control (20:09 17-07-15) vii http://www.jove.com/video/50684/protocolo-rpido-para-la-preparacin-de-

electrocompetentes?language=Spanish viii http://servetlab.com/archivos/Precios2013.pdf  ( 21:35 18-07-15) ix http://www.arirangplasticos.cl/index.php?productID=7127x 

http://www.madigae.cl/descargas/lista_precios/precios_2011/precios_madigae_quimica_lv_2011.p

df  xi http://labotienda.com/es/catalogo/plastico_material-desechable_pipetas.aspx xii  SAG: Instructivo técnico para Recuento de Escherichia coli Mediante Método Tradicional de Cultivo: AOAC

Official Method 966.24. Código: IT-LAB-17-v02 

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs379/es/http://www.unne.edu.ar/unnevieja/Web/cyt/com2005/8-Exactas/E-021.pdfhttp://www.scheitler.com.ar/productos/luxometros/LX-9626.aspxhttp://www.scheitler.com.ar/productos/luxometros/LX-9626.aspxhttp://www.scheitler.com.ar/productos/luxometros/LX-9626.aspxhttp://revista.cnic.edu.cu/revistaCB/articulos/conservaci%C3%B3n-de-cepas-microbianas-por-el-m%C3%A9todo-de-liofilizaci%C3%B3n-para-el-controlhttp://revista.cnic.edu.cu/revistaCB/articulos/conservaci%C3%B3n-de-cepas-microbianas-por-el-m%C3%A9todo-de-liofilizaci%C3%B3n-para-el-controlhttp://revista.cnic.edu.cu/revistaCB/articulos/conservaci%C3%B3n-de-cepas-microbianas-por-el-m%C3%A9todo-de-liofilizaci%C3%B3n-para-el-controlhttp://revista.cnic.edu.cu/revistaCB/articulos/conservaci%C3%B3n-de-cepas-microbianas-por-el-m%C3%A9todo-de-liofilizaci%C3%B3n-para-el-controlhttp://www.jove.com/video/50684/protocolo-rpido-para-la-preparacin-de-electrocompetentes?language=Spanishhttp://www.jove.com/video/50684/protocolo-rpido-para-la-preparacin-de-electrocompetentes?language=Spanishhttp://www.jove.com/video/50684/protocolo-rpido-para-la-preparacin-de-electrocompetentes?language=Spanishhttp://www.jove.com/video/50684/protocolo-rpido-para-la-preparacin-de-electrocompetentes?language=Spanishhttp://www.jove.com/video/50684/protocolo-rpido-para-la-preparacin-de-electrocompetentes?language=Spanishhttp://servetlab.com/archivos/Precios2013.pdfhttp://servetlab.com/archivos/Precios2013.pdfhttp://servetlab.com/archivos/Precios2013.pdfhttp://www.madigae.cl/descargas/lista_precios/precios_2011/precios_madigae_quimica_lv_2011.pdfhttp://www.madigae.cl/descargas/lista_precios/precios_2011/precios_madigae_quimica_lv_2011.pdfhttp://www.madigae.cl/descargas/lista_precios/precios_2011/precios_madigae_quimica_lv_2011.pdfhttp://labotienda.com/es/catalogo/plastico_material-desechable_pipetas.aspxhttp://labotienda.com/es/catalogo/plastico_material-desechable_pipetas.aspxhttp://labotienda.com/es/catalogo/plastico_material-desechable_pipetas.aspxhttp://labotienda.com/es/catalogo/plastico_material-desechable_pipetas.aspxhttp://www.madigae.cl/descargas/lista_precios/precios_2011/precios_madigae_quimica_lv_2011.pdfhttp://www.madigae.cl/descargas/lista_precios/precios_2011/precios_madigae_quimica_lv_2011.pdfhttp://servetlab.com/archivos/Precios2013.pdfhttp://www.jove.com/video/50684/protocolo-rpido-para-la-preparacin-de-electrocompetentes?language=Spanishhttp://www.jove.com/video/50684/protocolo-rpido-para-la-preparacin-de-electrocompetentes?language=Spanishhttp://revista.cnic.edu.cu/revistaCB/articulos/conservaci%C3%B3n-de-cepas-microbianas-por-el-m%C3%A9todo-de-liofilizaci%C3%B3n-para-el-controlhttp://revista.cnic.edu.cu/revistaCB/articulos/conservaci%C3%B3n-de-cepas-microbianas-por-el-m%C3%A9todo-de-liofilizaci%C3%B3n-para-el-controlhttp://www.scheitler.com.ar/productos/luxometros/LX-9626.aspxhttp://www.unne.edu.ar/unnevieja/Web/cyt/com2005/8-Exactas/E-021.pdfhttp://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs379/es/