BBiioossíínntteessiiss ddee ppuurriinnaass.. Las primeras investigaciones de la biosíntesisde las purinas incluyeron un marcado isotópico.

El ácido úrico fue la primera purina en ser descubierta. En 1776, Karl W.Scheele y Torbern Bergman demostraron que este compuesto está presente en laorina humana y en las piedras de la vejiga. Un siglo después, se descubrió que lamayor parte del nitrógeno ingerido por las gallinas adultas era excretado como ácidoúrico. Los químicos del siglo diecinueve comprobaron que, en los pájaros y enmuchos reptiles, el principal producto final del metabolismo del nitrógeno es el ácidoúrico, análogo a la urea en el metabolismo de los mamíferos.

En 1936, H. A. Krebs (cuando no!) y sus colegas realizaron experimentos quesirvieron de base para la comprobación completa de la vía que produce losnucleótidos de purina. Demostraron que en las palomas, la incorporación deamoniaco (NH3) en ácido úrico se hace en dos etapas. Primero el amoniaco esincorporado en hipoxantina en el hígado. Enseguida, la hipoxantina es oxidada en elriñón a ácido úrico en una reacción catalizada por la xantina oxidasa. Hasta los años50, muchos químicos consideraban que las purinas de los ácidos nucleicosprovenían de una vía diferente a la usada por los pájaros, que forman la hipoxantinacomo un intermediario de la excreción de nitrógeno. No obstante, los experimentoscon moléculas precursoras marcadas isotópicamente demostraron que las purinasde los ácidos nucleicos y el ácido úrico provenían de los mismos precursores y vías.Entonces, se utilizaron homogenados de hígado de paloma —un tejido en el cual sesintetizan activamente las purinas— como una fuente conveniente de enzimas parael estudio de las etapas en la biosíntesis de las purinas. La vía encontrada en elhígado de las aves también fue encontrada en otros organismos.

En los años 40 se utilizaron isótopos de carbono y de nitrógeno para marcarcompuestos sencillos como 13CO2, H13COO- (formiato), 13[C]-glicina y 15[N]-glicina,que fueron incorporados en los estudios metabólicos. Estos compuestos seadministraron a palomas y ratas, y después de su incorporación y procesamientometabólico, se aisló el ácido úrico excretado y se lo degradó químicamente paradetectar la posición en el ácido úrico de los átomos marcados de carbono y denitrógeno. Así pudo dilucidarse la procedencia de cada uno de los átomos delesqueleto básico de las purinas. El carbono del dióxido de carbono es incorporadoen C-6, el carbono del formiato en C-2 y C-8, el N-1 provenía del aspartato, N-3 y N-9, del nitrógeno amido de la glutamina y C-4, C-5, y N-7, de la glicina.

N7

8

N9

4

5

N3

2

N 1

6

Glicina CO2

Aspartato

Glutamina

Formiato

Como ya dijimos, la biosíntesis de purinas se realiza sobre la ribosa-fosfato,por lo que en la primer reacción de esta ruta se requiere fosforribosil pirofosfato(PRPP). Por lo mismo, el producto final de esta ruta biosintética no es la basehipoxantina, sino su 5’-ribonucleótido, denominado inosina 5’-monofosfato (IMP oinosinato). La hipoxantina detectada en el hígado de aves por Krebs y sus colegasse formó por la acción de las enzimas de degradación que catalizan la remoción delos grupos azúcar y fosfato de los nucleótidos. La vía de novo de la síntesis de lapurina comprende una serie de intermediarios que contienen el azúcar unido aesqueletos incompletos de lo que finalmente constituirá el anillo básico de laspurinas. Debido a su complejidad e inutilidad práctica nos abstendremos de incluirlos nombres completos de cada uno de los intermediarios en esta ruta de síntesis.Sin embargo, sí nos detendremos en analizar sus estructuras químicas y lasreacciones en las que intervienen.

En la figura se ilustra la vía de novo para el IMP, que es ensamblado en diezetapas (indicadas con los números en rojo). El orden en el cual los átomos sonadicionados es el siguiente: N-9 de glutamina; C-4, C-5 y N-7 de glicina; C-8 de 10-formiltetrahidrofolato; N-3 de glutamina; C-6 del CO2, N-1 de aspartato; C-2 de l0-formiltetrahidrofolato. Nótese que primero se completa el anillo imidazol de 5 átomos(etapa 5) y después la estructura del anillo de seis miembros (etapa 10).Explicaremos con detalle sólo algunas pocas etapas.

La vía se inicia con el desplazamiento del grupo pirofosforilo de PRPP por elnitrógeno amídico de la glutamina, reacción catalizada por la glutamina-PRPPamidotransferasa (etapa 1 en la figura de más abajo). El grupo amino del productofosforribosilamina, es entonces acilado por la glicina para formar glicinamidaribonucleótido (etapa 2). El mecanismo de esta reacción, implica la formación de unintermediario glicil-fosfato, que finalmente permite incorporar el grupo glicina sobreel nitrógeno de la fosforribosilamina. Este mecanismo, se asemeja al de la glutaminasintetasa, la cual tiene al glutamil-fosfato como intermediario, antes de formar elenlace entre el glutamilo y el nitrógeno.

Enseguida (etapa 3), un grupo formilo aportado por el 10-formiltetrahidrofolatoes incorporado sobre el grupo amino destinado a convertirse en el N-7 del IMP. Enla etapa 4, una amida es convertida en una amina, (R)-HN—C=NH, en una reaccióndependiente de ATP que requiere glutamina como el donador de nitrógeno. Laenzima que cataliza esta etapa, una amidotransferasa, es inhibida irreversiblementepor los antibióticos que son análogos de la glutamina, por ejemplo, la azaserina y la6-diazo-5-oxo-norleucina. Estos compuestos, reaccionan con un grupo sulfhidrilo dela enzima modificando, por una unión covalente, el sitio activo.

La etapa 5 es una reacción de deshidratación que permite cerrar el anillo yrequiere ATP. En la etapa 6, el CO2 es incorporado fijándose en el carbono que seconvertirá en el C-5 de la purina. En algunos organismos, esta carboxilación esinusual ya que ni la biotina, ni el ATP son necesarios. El C-5 del anillo imidazol esun nucleófilo activado porque en parte es una enamina (H2N—C=C), con el grupoNH2 que es análogo al grupo OH de un enol. El mecanismo por el cual estenucleófilo reacciona con el CO2 electrofílico se muestra en la siguiente figura.

En las dos etapas que siguen (7 y 8), el grupo amino del aspartato esincorporado dentro del sistema anular de la purina en crecimiento. Primero, elaspartato se une al grupo carboxilo recientemente adicionado para formar unaamida, específicamente una succinilcarboxamida. Entonces, una liasa,adenilosuccinato liasa, cataliza una reacción no hidrolítica de ruptura que libera

fumarato. Este proceso en dos etapas da como resultado la transferencia de ungrupo amino que contiene el nitrógeno destinado a convertirse en N-1 del IMP.

O

OHOH

O PO

OHO P

OH

OOH

CH2

OHPO

OHO

COHO

CH2NH2

CO

CH2

NH2

O

OHOH

CH2

OHPO

OHO

NH

OH P

O

OH

O P

OH

O

OH

CO

CH2

NH

CH

O

O

OHOH

CH2

OHPO

OHO

NH

CNH

CH2

NH

CH

O

O

OHOH

CH2

OHPO

OHO

NH

CHC

NH2

NCH

OH

O

OHOH

CH2

OHPO

OHO

NH

CHC

NH2

NCH

O

OHOH

CH2

OHPO

OHO

N

COH

O

CC

NH2

NCH

O

OHOH

CH2

OHPO

OHO

N

CNH

O

CC

NH2

NCH CH

COHO

CH2

COOH

O

OHOH

CH2

OHPO

OHO

N

CH

COHO

CH

COOH

NH2 CH

COHO

CH2

COOH

CNH2

O

CC

NH2

NCH

O

OHOH

CH2

OHPO

OHO

N

CNH2

O

CC

NH

NCH

CH

OO

OHOH

CH2

OHPO

OHO

N

CNH2

O

CC

N

NCH

CH

OHO

OHOH

CH2

OHPO

OHO

N

CNH

O

CC

N

NCH

CHO

OHOH

CH2

OHPO

OHO

N

OHP

O

OH

OH

2

GlnGlu

H2O

H2O

ATPADP + Pi

10-formil-tetrahidrofolato

Tetrahidrofolato

GlnGlu

ATP + H2OADP + Pi

ATP

ADP + Pi

CO2

ATP ADP + Pi

10-formil-tetrahidrofolato

Tetrahidrofolato

H2OInosina-5'-monofosfatoIMP

Fumarato

Apartato

Glicina

5-fosfo-ribosil-1-pirofosfatoPRPP

1 2

3

4

5

6 7

8

9

10

O

OHOH

CH2

OHPO

OHO

NH2

En la etapa 9, la cual se asemeja a la etapa 3, el 10-formiltetrahidrofolatodona un grupo formilo al grupo amino nucleófilo de la aminoimidazol carboxamidaribonucleótido. En la última etapa, 10, el nitrógeno amídico se condensa con elgrupo formilo cerrando el anillo que completa el sistema purina del IMP.

La síntesis de novo de IMP consume considerable energía. El ATP esconvertido en AMP durante la síntesis del PRPP. También las etapas 2, 4, 5 y 7 sondirigidas por la conversión de ATP en ADP. Si se analiza la síntesis de purinasdesde la etapa inicial de la incorporación del NH4

+, se requiere energía adicional delATP para la síntesis de glutamina a partir de glutamato y amoniaco.

SSíínntteessiiss ddeell AAMMPP yy GGMMPP . Estos nucleótidos se sintetizan a partir deIMP, por medio de dos rutas diferentes. Cada una de las rutas, requiere de dosreacciones enzimáticas.

La biosíntesis de AMP a partir de IMP comprende dos etapas que seasemejan estrechamente a las etapas 7 y 8 de la biosíntesis de IMP. Primero, elgrupo amino del aspartato se condensa con el grupo ceto de IMP en una reaccióncatalizada por adenilosuccinato sintetasa dependiente de GTP (reacción 11).Entonces la eliminación de fumarato del adenilosuccinato es catalizada poradenilosuccinato liasa, la misma enzima que cataliza la etapa 8 de la vía denovo(reacción 12). En la biosíntesis de arginina en el ciclo de la urea participanetapas similares a estas reacciones de transferencia de amino.

En la conversión de IMP en GMP, el C-2 es oxidado en una reacción quecataliza la IMP deshidrogenasa (reacción 11’). Esta reacción se efectúa por adiciónde una molécula de agua al doble enlace C-2 = N-3 y la oxidación del hidrato porNADP+. El producto de la oxidación es xantosina monofosfato (XMP). En seguida,en una reacción dependiente de ATP, catalizada por la GMP sintetasa, el nitrógenoamídico de la glutamina sustituye al oxígeno del C-2 de XMP (reacción 12’). En esta

CH

COHO

CH

COOH

NH2 CH

COHO

CH2

COOH

Gln Glu

H2O

GTP GDP + Pi

ATP+ H2O AMP + PPi

Inosina-5'-monofosfatoIMP

Fumarato

Apartato

12

11

NAD+

NADH + H+

C

CNCH

NCH

NHC

O

O

OHOH

CH2

OHP

O

OH

O

N

N

CH

COH

O

CH2

C

O

OH

C

CNCH

NCH

NHC

O

OHOH

CH2

OHP

O

OH

O

N

NH2

C

CNCH

NCH

NC

O

OHOH

CH2

OHP

O

OH

O

N

C

CNCH

NH

C

NHC

O

OO

OHOH

CH2

OHP

O

OH

O

N C

CNCH

NC

NHC

O

NH2O

OHOH

CH2

OHP

O

OH

O

N

12'

11'

ATP

GTP

Kinasas,Fosforilación oxidativa

Kinasas

Adenosil-succinato

Adenosina-5'-monofosfatoAMP

Xantosina-5'-monofosfatoXMP

Guanosina-5'-monofosfatoGMP

etapa, el grupo ceto del C-2 del XMP se tautomeriza a enol antes de latransaminación.

La síntesis de los nucleótidos de purina es regulada mediante retroinhibición.Diversas enzimas que catalizan las etapas de la biosíntesis de los nucleótidos depurina presentan, in vitro, un comportamiento cinético alostérico. La PRPP sintetasaes inhibida por AMP, GMP e IMP. La enzima que cataliza la primera etapa en la rutade la síntesis de nucleótidos de purina, la glutamina-PRPP amidotransferasa,también es inhibida alostéricamente por estos y otros nucleótidos purina.

Las vías que van del IMP al AMP y del IMP al GMP también son reguladaspor retroinhibición. La adenilosuccinato sintetasa es inhibida, in vitro, por el AMP opor ATP, productos finales de esta rama, y la IMP deshidrogenasa es inhibida tantopor XMP como GMP. Obsérvese que los productos finales inhiben tanto las etapasiniciales comunes como a las enzimas después del punto de ramificación. Además,el GTP es sustrato en la síntesis de AMP (etapa 11) y el ATP es sustrato en lasíntesis del GMP (etapa 12’), lo que permitiría equilibrar las concentraciones denucleótidos de purina en la célula.

DDeeggrraaddaacciióónn ddee ppuurriinnaass.. La degradación de purinas en primates, avesy reptiles origina ácido úrico. Aunque la mayor parte de las moléculas libres depurinas y pirimidinas se economizan, algunas moléculas son catabolizadas. Estasmoléculas son originadas por un exceso de nucleótidos ingeridos o por el recambiointracelular (síntesis y degradación continuas), de los ácidos nucleicos.

En las aves, los reptiles y los primates (incluyendo a los humanos), losnucleótidos de purina son convertidos en ácido úrico, el cual es excretado. Para lasaves y los reptiles, el ácido úrico es también el producto de excreción para laeliminación del nitrógeno excedente proveniente del catabolismo de losaminoácidos, una función llevada a cabo por la urea en los primates. Las aves y losreptiles carecen de las enzimas que catalizan la degradación posterior del ácidoúrico, pero muchos organismos degradan el ácido úrico a otros productos.

En la figura de abajo se han resumido aquellas vías que van del AMP y delGMP al ácido úrico. La remoción hidrolítica de fosfato de AMP y GMP produceadenosina y guanosina respectivamente. La adenosina es desaminada a inosina porla acción de la adenosina desaminasa. De modo similar, AMP se desamina a IMPpor la acción de la AMP desaminasa. La hidrólisis de IMP produce inosina, la cualpuede ser convertida en hipoxantina por fosforólisis. La fosforólisis de la guanosinaproduce guanina. Ambas reacciones de fosforólisis (así como la fosforólisis devarios desoxinucleótidos) son catalizadas por nucleótido de purina fosforilasa yproduce ribosa 1-fosfato (o desoxirribosa 1-fosfato), así como una base. Laadenosina no es un sustrato de la purina nucleósido fosforilasa de mamíferos.

La hipoxantina formada a partir de inosina, es oxidada a xantina y la xantinaes oxidada a ácido úrico, el producto final de esta degradación. Las dos reaccionesson catalizadas por la misma enzima, en algún caso interviene la xantina oxidasa yen otro la xantina deshidrogenasa. En la reacción catalizada por la xantina oxidasa,los electrones son transferidos al O2 para formar peróxido de hidrógeno, H2O2. Laxantina oxidasa, una enzima extracelular en los mamíferos, parece ser una formaalterada de la enzima intracelular xantina deshidrogenasa, la cual genera losmismos productos que la xantina oxidasa, pero transfiere los electrones al NAD+

para formar NADH. Las actividades de estas dos enzimas se llevan a caboampliamente en la naturaleza y presentan una amplia especificidad de sustratos.

Sus sitios activos contienen sistemas de transferencia de electrones bastantecomplejos, que incluyen un centro de hierro-azufre, una molibdoproteína y FAD.

En la mayoría de las células, la guanina es desaminada a xantina, en unareacción que es catalizada por la enzima guanasa (guanina aminohidrolasa) peroaquellos animales que no tienen esta enzima excretan guanina como producto dedegradación de algunas purinas. Por ejemplo, los cerdos excretan guanina, pero encambio sí metabolizan la adenina hasta alantoína, el principal producto delcatabolismo de las purinas en la mayor parte de los mamíferos.

La gota es una enfermedad de los humanos causada por la sobreproduccióno la excreción inadecuada del ácido úrico. El ácido úrico es relativamente insoluble,y cuando su concentración en la sangre es elevada, puede cristalizar en el cartílago

NCH

N NCH

N

OCH2

OH

OH OH

NH2

NCH

N NCH

NH

OCH2

OH

OH OH

O

NCH

N N

NH

OCH2

OH

OH OH

O

NH2

NCH

N NH

NH

OCH2

OH

OH OH

O

O

NCH

NH N

CH

NH

O

NCH

NH N

NH

O

NH2

NCH

NH N

H

NH

O

O

NH

NH N

H

NH

O

O

O

AMP IMP GMP XMP

InosinaAdenosina Guanosina Xantosina

Hipoxantina Guanina

Xantina

Ácido úrico

H2O

Pi

H2O

Pi

H2O

Pi

H2O

Pi

Ribosa-1fosfato

Pi

Ribosa-1fosfato

Pi

Ribosa-1fosfato

Pi

H2O

NH3

H2O NH3

H2ONH3

O2 + H2O

H2O2

O2 + H2O

H2O2

5'-nucleotidasa

Adenosinaaminohidrolasa

AMPaminohidrolasa

Purinafosforilasa

Xantinaoxidasa

Xantinaoxidasa

Guaninaaminohidrolasa

y los tejidos blandos, especialmente en el riñón, en los dedos de los pies y en lasarticulaciones. La gota tiene varias causas, entre ellas la deficiencia parcial en laactividad de la hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa. Esta enzima es la quepermite recuperar las bases púricas que se están degradando cuando llegan al nivelde hipoxantina o de xantina, o sea inmediatamente antes de su conversión en elproducto final, el ácido úrico. Así en esta enfermedad se obtiene una recuperaciónmenor de las purinas y una mayor producción catabólica de ácido úrico. Laenfermedad, también puede ser causada por una regulación defectuosa de labiosíntesis de purinas. La gota puede ser tratada por la administración de alopurinol,un isómero posicional C-7, N-8, sintético de la hipoxantina. Debido a que elalopurinol es un inhibidor potente de la xantina deshidrogenasa, su presencia evitala formación de niveles anormalmente elevados de ácido úrico. La hipoxantina y laxantina son más solubles que el ácido úrico, y por consiguiente pueden serexcretadas.

En la mayor parte de los organismos, el ácido úrico puede ser oxidado mástarde. La urato oxidasa cataliza la conversión, dependiente de O2, del ácido úrico aalantoína, H2O, y CO2. En este proceso, se abre el anillo de pirimidina del ácidoúrico. La alantoína es el producto principal de la degradación de purinas en la mayorparte de los mamíferos (aunque no en los humanos, para quienes el producto finales el ácido úrico). También es excretado por las tortugas, algunos insectos, y losgastrópodos.

La enzima alantoinasa cataliza la apertura hidrolítica del anillo imidazol de laalantoina para producir alantoato, la base conjugada del ácido alantoico. Algunospeces de espina (teleosteos) tienen actividad de alantoinasa, pero no puedendegradar el alantoato y por lo tanto excretan alantoato como el producto final de ladegradación de purinas.

La mayor parte de los peces, los anfibios y las moluscos de agua dulce soncapaces de metabolizar el alantoato en una etapa más. Estas especies contienen laenzima alantoicasa, la cual cataliza la hidrólisis del alantoato a una molécula deglioxilato y dos moléculas de urea. Así, en estos organismos, la urea es el productofinal del catabolismo de las purinas.

Finalmente, diversos organismos —que incluyen plantas, crustáceos, ymuchos invertebrados marinos— pueden hidrolizar la urea en una reacción quecataliza la ureasa. Los productos de esta reacción son dióxido de carbono yamoniaco. La ureasa se encuentra solamente en organismos en los cuales lahidrólisis de la urea no trae consigo la toxicidad del amoniaco. Por ejemplo, en lasplantas, el amoniaco generado a partir de la urea, es asimilado con rapidez por laacción de la glutamina sintetasa.

En 1964, Michael Lesch y William Nyhan, describieron una enfermedadmetabólica severa caracterizada por retardo mental, elasticidad semejante aparálisis, y una rara tendencia hacia la automutilación. Los individuos que padecenesta enfermedad, llamada síndrome de Lesch-Nyhan, raramente sobreviven a lainfancia. Las características bioquímicas prominentes de la enfermedad son la

NH

NH N

H

NH

O

O

O

Ácido úrico

CO2 + 2 NH3Uratooxidasa

NH

NH

CH

C

NH

NH2

O

O

O

Alantoína

CO2 + H2O2

NH2

CNH

CH N

H

C

NH2

O

O

COOH

CO

COOH

HNH2

C

NH2

O+ 2

Ácido alantoico Glioxilato Urea

O2 + H2OH2O H2O H2O

Alantoinasa Alantoicasa Ureasa

excreción de hasta seis veces la cantidad normal del ácido úrico y una velocidadmuy aumentada para la biosíntesis de novo de purinas. La enfermedad es causadapor una deficiencia hereditaria de la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa. Debido a que el gen para esta enzima está en elcromosoma X, la enfermedad está restringida usualmente a los varones. En lugar deser convertidas a IMP y GMP respectivamente, la hipoxantina y la guanina sondegradadas a ácido úrico. El PRPP utilizado normalmente para economizar lahipoxantina y la guanina contribuye a la síntesis de novo de cantidades excesivasde IMP, y el IMP en exceso es degradado a más ácido úrico. No se conoce comoeste solo defecto enzimático causa los diversos síntomas de comportamiento. Losefectos catastróficos de la deficiencia indican que la vía de economía de purinas esmás que el simple ahorro de energía adicional a las vías centrales de metabolismode nucleótidos de purina.

DDeeggrraaddaacciióónn ddee ppiirriimmiiddiinnaass.. Las pirimidinas son catabolizadas a acetilCoA y succinil CoA. El catabolismo de los nucleótidos de pirimidina se inicia con lahidrólisis a los correspondientes nucleósidos y Pi, catalizada por las 5’-nucleótidofosforilasas. Esta reacción y las reacciones subsiguientes del catabolismo de losnucleótidos de pirimidina se ilustran en la figura siguiente. En el caso de CMP, lahidrólisis inicial a citidina es seguida de desaminación a uridina es una reaccióncatalizada por la citidina desaminasa. Los enlaces glucosídicos de la uridina y latimidina son entonces rotos por fosforólisis en reacciones catalizadas por uridinafosforilasa y timidina fosforilasa, respectivamente. La desoxiuridina también puedeexperimentar fosforólisis catalizada por la uridina fosforilasa. Los productos de estasreacciones fosforolíticas son ribosa 1-fosfato o desoxirribosa 1-fosfato además deuracilo y timina.

El catabolismo de la base de las pirimidinas produce intermedios delmetabolismo central; así, no se forman productos de excreción distintos. Ladegradación de ambos, uracilo y timina comprende varias etapas. Primero, el anillopirimidina es reducido a 5,6-dihidropirimidina en una reacción catalizada por ladihidrouracilo deshidrogenasa, una reductasa diferente de las que participan en labiosíntesis de novo. El anillo reducido es abierto por ruptura hidrolítica del enlace N-3-C-4 en una reacción catalizada por dihidropirimidinasa. El derivado resultante esun beta aminoácido sustituido o un N-carbamoil-β-aminoácido (ureidopropianato oureidoisobutirato) que es hidrolizado a NH4

+, HCO3- y un β-aminoácido. La β-alanina

y el β-aminoisobutirato (proveniente de la timina) se pueden convertir en acetil CoAy succinil CoA, respectivamente, las cuales pueden entrar en el ciclo del ácidocítrico y ser convertidas en otros productos. En las bacterias, la β-alanina se puedeutilizar en la síntesis de pantotenato, un constituyente de la coenzima A.

CH

CHNH

NH

O

O

CH2

CH2 NH

NH

O

OCH2

CH2 NH

C

NH2

CO

O

OH

CH2

CH2 NH2

CO OH

NH3

Citidina Uridina 2'deoxicitidina

CMP UMP dCMPdUMP

2'deoxiuridina

H2O

Pi

Ribosa-1fosfato

Pi

H2O NH3

aminohidrolasa

deoxiRibosa1-fosfato

Pi

H2O

Pi

H2O

Pi

H2O

Pi

NMPfosforilasa

CO2+ +

NADPH + H+

NADP+

H2O H2O

Dihidrouracildeshidrogenasa

Dihidrouracilhidrasa

β-ureidopropionasa

Uracilo

Dihidrouracilo β-ureidopropionato β-alanina