BIOTECNOLOGIA DE LOSMICROORGANISMOS

Enzimas fúngicas involucradas en la degradación de los polimeros vegetales

Dra. Isabel E. Cinto

isa.cinto@gmail.com

Polímeros vegetales

Reserva Almidón

Celulosa

Polisacáridos Hemicelulosa

Pectina

Polímero fenólico Lignina (en pared 2ª)

Estructurales

Pared celular vegetal

Distribución de los polímeros enla pared celular

•Los hongos, por su capacidad hidrolítica y por su distribución, son losorganismos lignocelulolíticos por excelencia

•Secretan enzimas extracelulares que actúan sinérgicamente en ladegradación de los materiales lignocelulósicos

•Presentan nutrición absortiva: sólo son capaces de incorporarmoléculas pequeñas que utilizarán como fuente de materia y energía.

¿Por qué los hongos?

•Al ser incapaces de utilizar polímeros, el paso inicial para su nutrición apartir de estos, es la secreción al medio de enzimas extracelulares quepuedan degradarlas a moléculas pequeñas

•El hecho de que posean crecimiento filamentoso hace que sean losorganismos mejor adaptados al aprovechamiento del sustrato, porqueademás de degradarlo pueden penetrar en él.

•Las formas levaduriformes no son tipicamente degradadoras depolímeron, prefiriendo hábitats donde abundan los azúcares solubles.

Características de las enzimas que degradan polisacáridos

- Extracelulares

- Sistemas enzimáticos: endoenzimasexoenzimasenzimas que actúan sobre oligómeros

- Sinergismo

- Regulación de la síntesis: inducción (polímero)

represión (glucosa)

- Enzimas glicosiladas

- Isoenzimas

Almidón

Es la principal sustancia de reserva en vegetales.Se almacena en forma de gránulos (amiloplastos)

Está compuesto por dos polímeros de alto PM:amilosa y amilopectina

Amilosa: polímero lineal de glucosa α-1,4. Tiene forma helicoidal, las cadena seunen por ptes de Hidrógeno y precipitaexpontaneamenteAmilopectina: es un polímero de glucosaα-1,4 con ramificaciones α-1,6 cada 16-17residuos.

Estos dos polímeros pueden ser separados por ej: con el agregado de butanol.La milosa forma un compuesto insoluble cristalino mientras que la amilopectinapermanece en suspensión.

-α-amilasa: endoenzima, actúa al azar sobre uniones α-1,4 delpolímero, produciendo oligosacáridos lineales y ramificados delongitud variada. La acción de la α-amilasa produce una pérdidad de laviscosidad del sustrato y una rápida reducción de color con yodo.

-β-amilasa: exoenzima que por hidrólisis a partir del extremo noreductor del polímero produce una inversión dando como producto β-maltosa y β-glucosa. Se creía que era particular de plantas y algunas

Principales enzimas fúngicas amilolíticas:

maltosa y β-glucosa. Se creía que era particular de plantas y algunasbacterias, pero ha sido identificada también en hongos

- Glucoamilasa (amiloglucoamilasa): Enzima tipica de hongos, muypoco frecuente en bacterias. Es una exoenzima que actúa a partir delextremo no reductor, ataca uniones α-1,4 preferentemente y α-1,6 conmenor afinidad. Degrada preferentemente polisacáridos de alto pesomolecular dando como producto glucosa

- α-glucosidasa: exoenzima, actúa sobre la maltosa y oligosacáridosdesde el extremo no reductor. Es capaz de actuar en uniones α-1,4 ytambién α-1,6.

Degradación de almidón por varias hidrolasas. Los círculos negos representan a glucosas con extremo reductor

Aplicaciones de amilasas

(Aspergillus oryzae)

- Fabricación de detergentes (para disolver almidones).

- Industria alimenticia:

- jarabes de glucosa (aumentar glucosa en el medio)

- panadería (para sacarificar harinas y favorecer elcrecimiento de la levadura)

La primera enzima producida industrialmente fue la amilasa fúngicatakadiastasa, empleada en USA como agente farmacéutico (para losdesórdenes intestinales)en1894.

Fue el alemán Otto Röhm quien, en 1913 lanzó el primer detergenteenzimático de la historia, Burnus, basado en un extracto de páncreas decerdo que contenía tripsina, una enzima del aparato digestivo.

En la década de los 60, el 80% de todos los detergentes de lavandería

Amilasas: aceleran la degradación de los residuosde almidón de alimentos como papa, chocolate, etc.Las amilasas no son componentes esenciales delos detergentes porque tienen una acción limitadasobre los carbohidratos. En adición, loscarbohidratos son solubles en agua y tienden a serfácilmente removidos con la mayoría de losdetergentes y agua.

En la década de los 60, el 80% de todos los detergentes de lavanderíacontenía ya enzimas

-LAS ENZIMAS EN LA PANIFICACIÓN-

El uso de las enzimas en la panificación se remonta al año 1850, a medidaque se va conociendo las cualidades de la harina de malta para mantener lamiga del pan más húmeda, las características organolépticas del pan mejora,al mismo tiempo de aporte de una gran mejora en el aspecto final (color de lacorteza) del pan.La alfa-amilasa de la malta de la cebada aumentaba la fermentación con laLa alfa-amilasa de la malta de la cebada aumentaba la fermentación con lageneración de azúcares fermentables (maltosa) a partir del almidón.Un siglo después se descubre que los hongos y bacterias son fuentes deenzimas alimenticias.La amilasa fúngica se empieza a utilizar remplazando a la harina de malta yaque en ella no era controlable su actividad y porque la harina no siempre tieneel mismo contenido enzimático, ya que esto depende de la humedad del trigo.

Amiloglucosidasa. También denominada Glucoamilasa se obtiene tambiénde un hongo, el Aspergillus rhizopus, y actúa sobre las dextrinasproduciendo glucosa, lo que se traduce en una aceleración de lafermentación.

Amilasa de origen fúngico. Es la más utilizada en la fabricación del pan, comoalternativa a la harina de malta. Ello es debido al hecho, entre otros, de que laα-amilasa fúngica tiene una mayor tolerancia a la sobredosificación que la deorigen cereal, lo que se basa en su desactivación durante la primera fase de lacocción (60-65º C), por lo que no existe el riesgo de que se produzca excesode dextrinas, lo cual produciría migas pegajosas.

La actividad de las alfa-amilasas de origen fúngico comerciales se mide en dosunidades:unidades:– FAU (Unidad Fungal Amilasa), que es la cantidad que dextrinizará unasolución estándar de almidón a una velocidad de 1 g/hora a 400 C.– SKB que mide la capacidad de la enzima para degradar una solución dealmidón puro, a un pH de 4,6, durante 60 minutos a 300 C.

La relación entre las FAU y las SKB, es que 1.000 FAU/g aproximadamenteequivalen a 10.000 SKB/g.

Las amilasas de origen fúngico utilizadas en la panadería tienen una actividadvariada que va desde baja actividad 2.500 SKB/g hasta alta actividad 50.000SKB/g.

Actividad α-amilasa frente a la temperatura

Materiales lignocelulósicos

Células vegetales con crecimiento secundario

Maderas

Materiales estructurales en las paredes vegetales

Polímeros estructurales:Celulosa 40-45%Lignina 15-35%Hemicelulosas 20-40 %

Las microfibrillas de celolosase hayan embebida en unamatriz amorfa de lignina yhemicelulosa.

Los tejidos inmadurospueden contener un %importante de otrocomponente: la pectina

Sustancias Pécticas

•Son heteropolisacáridos ácidos de alto PM.•Forman parte de las paredes celulares primarias y la laminilla media.•En los árboles la laminilla media de los elementos xilemáticos jóvenes estáconstituída mayoritariamente por pectina, pero al envejecer se torna altamentelignificada•Son sustancias solubles en agua con alto poder gelificante

Pectina: cadena principal de ácido galacturónico,con uniones α-1,4,parcialmente esterificado con metanol y acetato, azúcares neutros en cortascadenas lateralesÁcido péctico: polímero de ácido galacturónicoProtopectina: es la sustancia péctica madre, insoluble en agua, presente en lasplantas

Sustancias Pécticas

Enzimas pectinolíticas

Protopectinasas: Solubilizan lo protopectina para formar pectinaTipo A: reaccionan con el ácido poligalacturónico en el interior de lamoléculaTipo B: actúan sobre uniones de la protopectina con otros componentes dela pared

Pectin-esterasas: catalizan la desesterificación de la pectina

pectina ác. péctico + metilo

Enzimas despolimerizantes (pectinasas):Actúan sobre uniones α-1,4Preferencia por sustrato: pectina (polimetilgalacturonasas)

pectato (poligalacturonasas)Modo de acción: al azar (endoP)

a partir del extremo no reductor (exoP)Mecanismo de clivaje: hidrólisis (hidrolasas)

Transeliminación (liasas)

Degradación de pectina

tipo A: sobre el polímerotipo B: liberan desde otros componentes

metilo

Hidrolasas (α-1,4)Endo (azar)Exo (ext. no red.)

Liasas (α-1,4)Endo (azar)Exo (ext. no red.)

Aplicaciones de pectinasasfúngicas

Fabricación de jugos

- Manzana:Manzana:- Prensado y separación del jugo. 15 min a 2 hs dependiendode madurez, cantidad, tipo de fruta y temperatura (pueden ser combinadas con celulasas y xilanasas).- Clarificación: Depende del pH, tiempo de contacto y temperatura (5-50ºC y 2-16 hs). (Puede ser combinada conamilasas).- Fabricación de sidra: En clarificación previa (mejorafermentación).

- Pera: Similar a manzana.

- Uva:- Prensado, separación y clarificación del jugo. - Vinos: Reducción de turbidez y nivel de gelificantes en eldistintos estados de producción:

a) Obtención del jugo (aumenta volumen y reducetiempo de prensado).tiempo de prensado).b) Tratamiento del jugo antes de fermentación(reduce partículas suspendidas y microorganismosno deseados).c) Tratamiento del fermentado (mejora filtración yclarifica).

- Fresas, frambuesas y moras:- Despectinización requerida en distintos pasos de fabricación.

- Naranja:Altos niveles de pectinasPosee pectinas parcialmente metiladas (grandescantidades de pectin esterasa).Con Ca se forman pectatos insolubles.Con Ca se forman pectatos insolubles.Puede ser usada en dos pasos:- Antes de terminar la etapa de extracción de la pulpa (reduce viscosidad). - o sobre el jugo resultante de la prensada (mejora extracción de azúcares y sólidos suspendidos).

- Limón:Cáscara y pulpa se minimizan (3-5 mm) y se mezclan conagua (1:1), 95ºC para destruir pectín esterasas y seenfría a 50ºC. Esta mezcla es rica en pectina, polisacáridos,glucoproteínas, ceras y aceites. Se trata con pectinasas.- Recuperación de aceites: Se usan complejos de pectinasas- Recuperación de aceites: Se usan complejos de pectinasasy proteasas para facilitar separación y la calidad de los aceites.- Alimento para animales: Residuos de obtención de jugoes mezclado con cal (pH 8) para activar pectin esterasas,se seca a 8-10%.

- Otras frutas:Banana, mango, papaya, damasco,ananá, guayaba.

pectinasaspectinasas

- Maceración de tejidos vegetales:Se obtiene suspensión de células intactas (pulpa).Usada en jugos con pulpa y dulces, alimentos para bebés,puré instantáneo, budines y yogures.Antes se deben desactivar pectinasas endógenas.Evita degradación de almidón celular.Evita degradación de almidón celular.Se usa sobre zanahoria.

- Licuefacción y sacarificación de biomasa:Se la usa junto con otras enzimas para sacarificar residuosagroindustriales previo a fermentación.

- Aislamiento de protopastos:Se usa en mejoramiento vegetal, investigación sobre tejidosno lignificados.Se hidroliza en un sólo paso (método simultáneo) junto con celulasas o en dos pasos (método secuencial). En este casose aplican en el primero.

- Industria textil:En el tratamiento de las fibras dealgodón, se deben extraer las pectinasde la pared de las células primarias delalgodón. Las enzimas pectinasas (quedegradan esta sustancia) son utilizadasdegradan esta sustancia) son utilizadasen el lavado alcalino del algodón.Numerosos estudios realizadosmuestran que un tratamiento usandosolamente pectinasa, seguido por unenjuagado en agua caliente, es capazde hacer que la fibra de algodón sevuelva hidrófila y absorbente,facilitando su posterior utilización.

Hemicelulosa

Heteropolisacárido, uniones β-1,4 y ramificaciones de 1-2azúcares, puede estar acetilado

Se nombran según el/los azúcares predominantes.

Aparecen en las paredes celulares en forma amorfa, asociadas a lasmicrofibrillas de celulosa por uniones hidrógeno y mediante unionescovalente a la lignina

Se nombran según el/los azúcares predominantes.

El más abundante:Xilano: xilosa, β- 1,4 ArabinoxilanoGlucuronoxilanoGlucuroronoarabinoxilano

Las hemicelulosas son a menudo los primeros componentes de la paredcelular que son atacados por hongos causantes de pudrición debido a laextensión de sus cadenas, solubilidad y localización expuesta alrededor delas microfibrillas de celulosa

•Son enzimas hodrolíticas•Patrón de ataque análogo al de degradación de celulosa por celulasas. Sinembargo, las exoenzimas están ausentes, reflejando probablemente el bajogrado de polimerización de la hemicelulosa.•La hidrólisis de estas moléculas complejas requier la interacción denumerosas enzimas que corten la cadena principal y también las laterales.Las distintas enzimas actúan sinérgicamente en la degradación del sustrato.

Enzimas xilanolíticas

Endoxilanasa: actúa sobre la cadena de xilano al azar, disminuyendo elEndoxilanasa: actúa sobre la cadena de xilano al azar, disminuyendo elgrado de polimerización con liberación de: xilooligosacáridos, xilobiosa,xilosaβ-xilosidasa: actúa luego de la endoxilanasa. Actúa sobrexilanooligosacáridos (a partir de los extremos no reductores) o sobrexilobiosa, dando como producto xilosa.

Se producen tempranamente en los procesos de pudrición y están relacionadas conla degradación de la lignina. Degradarían las hemicelulosas que se encuentran“pegadas” al lumen y se introducirían en la pared 2aria abriendo canales como parapermitir el acceso de las enzimas degradadoras de lignina de mayor peso molecular

Aplicaciones de xilanasasfúngicas

Aspergillus niger, Trichoderma sp. y Humicola insolens.

- Alimentos para animales: Junto con otras enzimas.Reducen viscosidad degradando arabinoxilanos (interfieren en lamovilidad y absorción otros componentes en los animales).

- Manufactura de pan, alimentos y bebidas:- Se las combina con pectinasas y celulasas en la fabricación dejugos. - Junto con endoglucanasas forma parte de la hidrólisis de arabinoxilanos y almidón en la separación del gluten del almidónen la harina de trigo.

- Vino: Se introdujo en levaduras el gen xlnA de Aspergillusnidulans. Mejora aroma - Cerveza: Hidrólisis de arabinoxilanos de cebada para reducirviscosidad.

Industria farmacéutica:Industria farmacéutica:Uso limitado en industria farmacéutica. Suplementos dietarioso tratamientos en baja digestibilidad.

Aplicaciones químicas:Intervienen en la producción de etanol y xilitol.

Industria textil:Xilanasas libres de celulasas son usadas para obtener fibrasintactas.Evita oxidación de la lignina.

Industria del papel:Es la principal aplicación industrial.Es la principal aplicación industrial.

Madera pulpa preblanqueada final

KraftNaOH + NaS2

O2

ClO2O3

NaOH, O2, H2O2

ClO2

Xilanasas reducen 30% de ClO2 y 15-20% de organoclorados enefluentes.

Aspergillus kawachii, A. niger. A. nidulans, A. fumigatus

CelulosaPolímero lineal de monómeros de glucosa unidos por enlaces β-1,4

Las microfibrillas estanconformadas por zonas cristalinasdónde las moléculas de celulosa sehallan ordenadas y regioneshallan ordenadas y regionesparacristalinas dónde sedeorganizan

Tipos de celulosa:Nativa o cristalina: alto grado de cristalinidad u ordenamiento y depolimerización, insoluble (avicel, papel de filtro)Celulosa modificada: menor grado de cristalinidad y de polimerización,soluble (celulosa amorfa, CMC)

Sólo ciertos hongos y bacterias son capaces de degradar completamente lacelulosa. Hongos: responsables del 80% de celulólisis global.

-endoglucanasas (endoenxima):Cortan al azar sobre el polímero liberando mayormente oligosacáridos.Generan extremos reductores.Actúan sobre zonas amorfas de la fibrilla.Disminuyen el grado de polimerizaciónSustratos sobre los que actúan: carboximetilcelulosa (CMC), celulosaamorfa, celooligosacáridos

Enzimas celulolíticas

amorfa, celooligosacáridos-celobiohidrolasas o exoglucanasas (exoenzima):Actúan a partir de extremos no reductores.Liberan celobiosaActúan sobre la celulosa cristalina-β- glucosidasas:Actúan sobre oligómeros, entre ellos celobiosa liberada por CBH

Degradación de la celulosa

Degradación de la celulosa

Sustratos

Inductores:CelulosaCelobiosaSoforosa (T.reesei)Lactosa

Inducción / Represión

Represores:GlucosaOtros azúcares

Aplicaciones de celulasasfúngicas

En 1985 se introdujo al mercado un tipo revolucionario deenzima celulasa para detergentes, Cellulasa, producida por elhongo Humicola insolens para remoción de suciedad, yrestaurador de suavidad y color de fibras de algodón. Lascelulasas aceleran la degradación de pequeñas fibras que

Detergentes:

endurecen la ropa y opacan los colores sin afectar las fibrasprincipales de la ropa, mejorando así la suavidad y los coloresde la misma.

Las fibras están compuestas básicamente de celulosa la cual, al ser unmaterial no biodegradable, constituye un problema para el posteriortratamiento de efluentes.Se utilizan celulasas para degradar las fibras de la superficie (fibras sueltas ymicrofibrillas) haciendo a los tejidos más lisos y blandos.También son usadas para producir la apariencia “stonewashed” en los jeans.

Industria textil:

También son usadas para producir la apariencia “stonewashed” en los jeans.Tradicionalmente esta apariencia en los tejidos Denim (nombre de la tela conque se realizan los jeans) es otorgada por un proceso que utiliza piedra-pómezpara desgastar el color localmente por roce. Este proceso presenta muchasdesventajas ya que causan el desgaste rápido y rotura de las máquinasutilizadas, provocan gran abrasión empeorando la calidad de la tela y causanproblemas ambientales ya que se generan efluentes no biodegradables.La ventaja en la utilización de celulasas en el proceso de desgaste del jean enrelación al proceso convencional, es que no causa gran degradación de la fibracomo la piedra-pómez y el desgaste es más uniforme.Las celulasas son utilizadas juntamente con las piedras o sustituyéndolastotalmente.

El procedimiento general para su aplicación consiste en:• introducción de los artículos de celulosa en la máquina• ajuste de las condiciones del baño de tratamiento con pH entre 5,5 y 8,0 ytemperaturas de 50 a 60ºC• adición de la enzima y control de las condiciones de reacción (tiempo,temperatura, pH y agitación mecánica)• interrupción de la actuación de la enzima: agregando carbonato de sodio y/oaumentando la temperatura hasta 80ºC durante 10 minutosAl culminar este proceso, se suele realizar un tratamiento de limpieza con unagente blanqueante para resaltar los contrastes y eliminar la reposición demicrofibras teñidas de color azul que enmascaran el efecto logrado.Estas enzimas no sólo se utilizan en el proceso de stone-wash de telas parajeans, sino que también se utilizan en telas destinadas a la confección deblusas y faldas, porque el proceso enzimático les otorga una texturaaterciopelada similar a la seda natural.

Biocombustibles:

El concepto de la utilización de celulosa como materia prima de azúcaresque puedan ser bio-convertidos a combustibles mediante el empleo demicroorganismos, ha retomado gran importancia en los últimos añosdebido a los altos precios del petróleo y a las inconveniencias de loscultivos mencionados

La hidrólisis de la celulosa con celulasas de origen fúngico se lleva a caboen un rango de 50 a 55 °C y alrededor de pH 5. Comercialmente seencuentra disponible una mezcla de celulasas conocida comoAccelleraseTM (de Genencor®) producida por una cepa recombinante deTrichoderma reesei. Sin embargo, otras enzimas necesitan serestudiadas para el desarrollo de nuevas formulaciones comerciales.

Manufactura de pan,alimentos y bebidas:- Se las combina conpectinasas, xilanasas ycelulasas en la fabricación dejugos.

LIPASAS

Lípidos: triglicéridos, esteroles, P-lípidos

lipasa (ester hidrolasa) triglicérido glicerol-P

ácidos grasos

Las lipasas forman parte de una de las familias de enzimas más utilizadasen la industria por su gran versatilidad. Estas enzimas hidrolizantriglicéridos en condiciones acuosas pero también pueden participar enreacciones de esterificación y transesterificación en presencia de solventesorgánicos, por lo que es muy importante tener en cuenta su estabilidad enestas condiciones.

Las lipasas deben mezclarse con los lípidos para romperlos por hidrólisis,pero las lipasas son solubles en agua y los lípidos son insolubles en agua.Por lo tanto, la hidrólisis sólo ocurre en la interfase entre la gota lipídica yla fase acuosa, lo que causa que la reacción sea relativamente lenta einefectiva. Además, las condiciones dentro de una lavadora de ropa son

Detergentes:

Aplicaciones de lipasas fúngicas

inefectiva. Además, las condiciones dentro de una lavadora de ropa sonhostiles para una enzima y la mayoría de las lipasas no sonsuficientemente estables en esas condiciones. Por lo tanto, se buscadesarrollar lipasas que permitan la remoción de manchas de grasas abajas temperaturas de lavado. Una combinación de búsqueda ymanipulación genética ha conducido a la introducción reciente de lipasasen los jabones en polvo. Un ejemplo es la lipasa Humicola , que se logróproducir en Aspergillus oryzae y que se conoce como "Lipolasa".

PROTEASAS

1. según el modo de acción:endopeptidasasexopeptidasas aminopeptidasas

carboxipeptidasas2. según del sitio catalítico: los aminoácidos, o unión con metalesmetales

serin-proteasasaspartil-proteasascistein-proteasasmetalo-proteasas

3. según el pH de actividad:proteasas ácidas proteasas neutrasproteasas alcalinas

En la industria alimenticia: quesería (renina)reducción de amargor de hidrolizados proteicos

Aplicaciones de proteasas

Detergentes:aceleran la degradación de proteínas y producen pequeños péptidos oaminoácidos individuales los cuales pueden ser fácilmenteaminoácidos individuales los cuales pueden ser fácilmentesolubilizados y removidos de los tejidos. Representan cerca del 60%del mercado de enzimas mundial y se usan a altos pH y temperaturassuperiores a 60o C. Las proteasas son el tipo más importante deenzimas en detergentes enzimáticos para uso médico porque existeun alto contenido de proteínas en los fluidos corporales (sangre,tejidos y mucosas) los cuales no pueden removerse con detergentesconvencionales y agua. Las enzimas usadas son producidasprincipalmente por Bacillus licheniformis o B. Amyloliquefaciens yAspergillus flavus mediante fermentación. Existe un considerableinterés en el desarrollo de mejores proteasas para polvos de lavado através de ingeniería de proteínas, para evitar su oxidación.

Enzimas intracelulares

Nucleasas – de P.citrinum para degradar ARN

Glucosa-oxidasa – oxida glucosa con incorporacon de O2 y liberación de H2O2de Aspergillus y P.chrysogenum

- eliminar O de jugos de fruta

Otras enzimas fúngicas de interés

- eliminar O2 de jugos de fruta - kits para detectar glucosa

Alcohol dehidrogenasade S. cerevisiae para determinar alcohol

Fitasa – de A. ficuum expresada en A. nigerÁcido fítico inositol + 6 PO4

2-

Aumenta valor nutritivo en alientos para animales