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ISCIPrNARIA DE CI eIAS DEL MAR

TAMENTb DE BIOLOG˝A MARINA

caracterización de la

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fESIQUE P A O ENER El

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Lf Paz laja Califorwa Sur Sepfiembre 2001

UNIVERSIDAD AUTÓNOMADE

BAJA CALIFORNIA SURApartado Posta119 B

Codìgo Postal 23080

La Paz BC S

Tels 1280440 1280569

y1280432Fax 1280801 Y 128 08 80

AREA INfERDISCIPLINARIADECIENCIAS DEL MAR

IXpartamento de Biología Marina

Fecha21 DE MAYO DE 2001

BIOL MAR EMELIO BARJAU GONZALÉZJEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOG˝A MARINA

PRESENTE

Los abajo f˝Imantes comunicamos a Usted que habiendo revisado el Trabajo de Tesis querealizó ron el la pasante s NORMA ANGÉJ ICA ESTRADA MUÑoz

Con el Titulo EVALUACION DE LA ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LAS TOXINAS DE CARYBDEA

MARSUPIALIS LINNE 1758 CNIDARIA CUBOZOA

Otorgamos nuestro voto aprobatorio y consideramos que dicho Trabajo est

defensa a fin de obtener el titulo de Licenciado en Bio gía na

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RESÚMEN

Se evalœa la actividad biológica del extracto crudo de las toxinas de la cubomedusa

Carybdea marsupialis de la Laguna arrecifal de Puerto Morelos Quintana Roa Lascubomedusas se recolectaron manualmente con equipo de buceo libre y se trasladaron

al laboratorio para su procesamiento Se aislaron y caracterizaron los nematocistos delos tentÆculos La liberación de las toxinas de los nematocistos se logró mediante lautilización de perlas de vidrio y homogeneizado Se utilizó un amortiguador de acetatode amonio 10 mM pH 5 5 conteniendo cloruro de sodio 0 15 M Y en otros casos aguadesionizada en algunos de los procedimientos se agregaron inhibidores de proteasasAsimismo se utilizaron los tentÆculos sin nematocistos así como los nematocistos quehabían sido descargados Con estos materiales se obtuvieron 9 extractos crudos loscuales se liofilizaron para procesarlos y ademÆs se determinó la concentración de

proteínas de cada uno Se evaluó la letalidad en cangrejos de la especie Ocypodequadrata vía intramuscular y en peces de las especies Harengula humeralis víaintravenosa y Abudefduf saxatilis dilución en agua de mar La concentración letal

media CLso se evaluó en nauplios de Artemia salina La dosis letal media DLso se

obtuvo en sardinas Harengula humeralis Los ensayos hemolíticos se realizaron con

eritrocitos de oveja humano res y carnero

Los resultados muestran que C marsupialis es muy abundante en el Ærea investigadadurante los meses de junio a octubre causando lesiones cutÆneas considerables en los

baæistas durante esta Øpoca Los tentÆculos de C marsupialis poseen tres tipos de

nematocistos Heterotricos microbÆsicos euriteles 70 Holotricos isorrizas

haplonemes 20 y Atricos isorrizas haplonemes 10 El mØtodo mÆs efectivo paraobtener la descarga de los nematocistos fue aquel en el que se utilizaron las perlas devidrio con amortiguador acetato de amonio e inhibidores de proteasas En los ensayosde letalidad con los organismos de las especies Ocypode quadrata y Harengulahumeralis todos los extractos ocasionaron la muerte con excepción de los tentÆculos

sin nematocistos sín embargo no se observó ningœn efecto con los peces de la

especie Abudefduf saxatilis Esto puede deberse a que las toxinas de C marsupialisson lÆbiles frente a compuestos polares y a temperaturas elevadas por lo que se

requiere de una penetración rÆpida de las toxinas en el organismo lo que se puedelograr vía intravenosa o intramuscular La DLso se obtuvo a una concentración de 0 003

mg de proteína por gramo de animal con un tiempo de supervivencia de 6 22 hrs Con

los nauplios de Artemia salina no se observó efecto alguno La actividad hemolítica se

obtuvo con bajas concentraciones de toxina en los eritrocitos de oveja sin embargo no

fue así con los eritrocitos de humano res y cerdo donde se utilizaron concentracionesmÆs elevadas Es probable que existan otros componentes extra nematocistos queestØn involucrados en la toxicidad de C marsupialis pero que no provienen de lostentÆculos y ademÆs que existan algunas proteasas que puedan llegar a degradar lastoxinas puede ser que las toxinas contengan algœn tipo de fosfolipasa que sea la

causante de la lisis en las cØlulas sanguíneas

Ul

Dedico esta tesis a mi grandiosa familia en especial a mis

papÆs por apoyarme siempre en todo y quererme mucho

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Autónoma de Baja California Sur por haberme brindado

enseæanzay a todas las personas que de alguna manera estÆn involucrados en

las actividades que ahí se realizan

A la Unidad AcadØmica Puerto Morelos de la UNAM y en especial a las Doctoras

Lourdes Segura Judith SÆnchez Patricia ThomØ y al Doctor Edgar Heimer por el

apoyo en la realización de la tesis Así como a Daniel y Amauri por esos viajestan divertidos en panga

Al M C Enrique GonzÆlez Dra Rosalba Encamación y M C Alma Sobrino por

haber colaborado en la revisión del trabajo

A la Dirección General de Intercambio AcadØmico UNAM por fmanciar mI

estancia caribeæa

A todo el personal acadØmico y à dministrativo de la estación y sobre todo a todosmis amigos mayitas y Co por sus enseæanzas y su gran cariæo

Al espectacular pueblo de Puerto Morelos por los ceviches de caracol pescadolangosta bailes y diversión y en especial a todos sus habitantes y a loselementos que encontrØ por ese viaje en el Caribe

A mis amiguitos científicos caribeæos Di Tapón Rene Claus Mago Frank

Lorench Chupis Tony Tiger Tomatita y Tito Capotito por las super aventuras en

los mares muy profundos y en losmangles

A todos mis compaæeros y amigos paceæos que estuvieron conmigo de principio a

fm compartiendo lo mejor de la vida y el mar Venade Mariguas ChepaCamitas Yetto Jimmy Rafa Karla Gus Juan Manuel Oaxaca Ray Miriam

Alita Gaby Elisa Vinatier Coromueles Lula Doc Lenin Enrique Onofre Paco

Oso Tonatiuh Champ Mario Che Elena Emanuel Caballo y a todas las

personas que hicieron que mi vida en La Paz fuera algo especial jaja

A mis amigos que aunque lejos estÆn siempre conmigo con los cuales he crecido y

compartido mivida

Brenda Tania Toæa Alma Daniela Emilio Beto ChinoLobo y a toda la banda

chilanga

A la Pacífico y a la Montejo

A todo el Juan Ma sss por esos dfas que nunca olvidarØ

A la brisa sucaliforniana por haberme baæado de enseæanza y permitirmeestudiar la carrera en un lugar fenomenal

y al marpor existir

IV

TABLA DE CONTENIDOPÆgina

RESÚMEN iii

AGRADECIMIENTOS ivTABLA DE CONTENIDO v

1 INTRODUCCiÓN 1

1 1 Productos naturales derivados del mar1

1 1 2 Metabolitos secundarios 2

1 1 3 Diferencias entre veneno toxina y ponzoæa 2

1 2 Sustancias bioactivas en el Phylum Cnidaria 3

1 2 1 Tipo y función de los Cnida Nematocistos 4

1 2 2 Importancia del estudio de las toxinas provenientes de los nematocistos 5

1 3 Clase Cubozoa 9

1 3 1 Carybdea marsupialis 9

1 3 2 Posición sistemÆtica 10

2 OBJETiVOS 11

3 JUSTIFICACiÓN 11

4 HiPÓTESiS 11

5 `REA DE ESTUDIO 12

6 METODOLOGíA 14

6 1 Actividades de campo 14

6 2 Actividades de laboratorio 14

6 2 1 Aislamiento descarga y caracterización de los nematocistos 14

6 2 2 Obtención del extracto 15

6 2 3 Letalidad 16

Dosis letal media DL5o 16

Concentración letal media CL50 17

6 2 4 Ensayo hemolítico 17

6 2 5 Determinación de proteínas 18

7 RESULTADOS 20

7 1 Caracterización de los nematocistos 20

7 2 Obtención del extracto 23

7 3 Concentración de proteínas 23

7 4 Letalidad 237 5 Ensayo hemolítico 28

8 DiSCUSiÓN 32

9 CONCLUSiONES 43

10 BIBLIOGRAFíA 44

11 ANEXOS 47

v

11NTRODUCCIÓN

1 1 PRODUCTOS NATURALES DERIVADOS DEL MAR

El estudio de productos naturales que presentan actividad biológica derivados de las plantas y

animales ha sido por mucho tiempo de gran valor biomØdico y los productos crudos aislados de

tales organismos han servido como una fuente de drogas así como de materiales de los cuÆles

pueden sintetizarse Østas Baslow 1977 A lo largo de su historia evolutiva muchas especies han

desarrollado rutas fisiológicas productoras de metabolitos que presentan características

interesantes y hoy en día la industria farmacØutica destina gran cantidad de recursos humanos y

financieros para la bœsqueda de nuevos productos naturales Braeckman Daloz 1983

Existen varios estudios donde se resalta la presencia de algunas sustancias interesantes

con actividad biológica aisladas de organismos marinos pero son pocas en comparación con las

que se han obtenido de animales y plantas terrestres si se toma en cuenta que los ocØanos y

mares del mundo cubren aproximadamente el 71 de la superficie de la Tierra Baslow 1977

Las investigaciones realizadas sobre la bœsqueda de compuestos bioactivos de origen marino

tanto para aplicaciones industriales agrícolas o farmacológicas cobraron auge en la dØcada de los

40 y 50 conforme se incrementaron las posibilidades de exploración oceÆnica Ross el al 1967

Asimismo durante las dØcadas de los aæos setenta y ochenta varias compaæías farmacØuticas en

colaboración con universidades iniciaron programas de investigación para la evaluación

sistemÆtica de los compuestos presentes en organismos marinos en Estados Unidos Japón

BØlgica Francia y Australia conociendo el gran potencial que representa el medio marino

encontrando aproximadamente 2500 nuevos compuestos activos de una amplia variedad de

organismos desde microbios procariontes e invertebrados de cuerpos blandos hasta vertebrados

siendo los grupos mÆs representativos los de las macroalgas cnidarios equinodermos y esponjasBacker 1984 Attaway Zaborsky 1993 Estudios recientes de organismos marinos se han

enfocado en las aplicaciones potenciales particularmente para el tratamiento de enfermedades

humanas y para el control de plagas en la agricultura Attaway Zaborsky 1993

Debido a la reciente y creciente investigación en el Ærea de los compuestos naturales

derivados del mar y a la carencia de revisiones adecuadas en este campo no sólo es importanteobtener agentes biomØdicos œtiles para el tratamiento de enfermedades sino que tambiØn se

necesita tener un mejor conocimiento de los efectos farmacológicos de estas sustancias y

ademÆs de las toxinas provenientes de fuentes marinas que puede dar como resultado un

tratamiento mÆs efectivo para las intoxicaciones humanas

1

1 1 1 Metabolitos secundarios

En general los compuestos que presentan actividades importantes desde el punto de vista

farmacológico y que se aíslan de los organismos marinos son los metabolitos secundarios o

productos naturales biológicamente activos Los metabolitos secundarios son molØculas

producidas por un organismo que no intervienen directamente en las reacciones esenciales de su

metabolismo pero que determinan las relaciones de los seres vivos con su medio aumentando su

competitividadEl significado del por que estos metabolitos presentan actividades farmacológicas se debe

a que muchas de estas sustancias han sido seleccionadas en el curso de la evolución como

mensajeros químicos por lo que estos vectores de información deben tener una acción selectiva

sobre los receptores bioquímicos de los seres vivos Un medicamento debe tener esta misma

propiedad por lo que los metabolitos secundarios y en especial las toxinas constituyen una

fuente importante de nuevos medicamentos Sobrino 1996

1 1 2 Diferencias entre toxina veneno y ponzoæa potencia y especificidad

Los tØrminos toxina veneno y ponzoæa han sido ampliamente discutidos Toxina es un tØrmino no

específico utilizado para describir una sustancia daæina a las cØlulas vivas restringida a

sustancias de origen proteico y antígeno tanto los venenos como las ponzoæas son toxinas Las

toxinas son sustancias de origen biológico que confieren ventajas adaptativas a los organismos

empleÆndolas para ejercer efectos biológicos adversos en otros organismos Una toxina implica

un sitio anatómico específico de origen un œnico modo de despliegue y una función biológicaespecífica Hashimoto 1979 Hessinger 1988 Williamson et al 1996 Un veneno es

usualmente una toxina o un conjunto de toxinas que son secretadas por glÆndulas venenosas o

por organelos celulares altamente especializados y que se introducen al cuerpo de otros

organismos por inyección dentro de los tejidos por medio de un aparato especializado como es el

caso de los nematocistos o las espinas del pez piedra Hessinger 1988 Williamson et al 1996

La ponzoæa es un agente que causa intoxicación debido a la ingesta de organismos marinos los

cuales poseen sustancias tóxicas en todo el cuerpo o en órganos específicos Hashimoto 1979

Williamson et al 1996

Potencia es un tØrmino cuantitativo que se refiere a la toxicidad efectiva o letalidad La

letalidad se toma en tØrminos de valores DL50 en animales estandarizados y se expresa en

unidades de g kg de peso corporal Unidades anÆlogas pueden ser utilizadas para expresar la

toxicidad en tØrminos de efectos fisiológicos o bioquímícos La especificidad es un tØrmino

cualitativo que no se expresa en unidades definidas pero se refiere a la restricción relativa y o al

sitio de acción siendo difícil de medir objetivamente Hessinger 1988

2

Los venenos marinos poseen una serie de propiedades que son relevantes en los

envenenamientos humanos Entre ellos se diferencian los siguientes

Toxicidad incluyendo letalidadLabilidad

Tamaæo de la molØcula

Quimica

AntigenicidadAcciones fisiológicas y bioquimicas

Asimismo existen otros factores de importancia clinica que incluyen el volumen de la toxina

involucrada en un proceso de envenenamiento o ponzoæa la condición de la victima y el tamaiio

físico de esta así como el mecanismo que el animal utiliza para administrar la toxina Williamson

etal 1996

1 2 SUSTANCIAS BIOACTIVAS EN EL PHYLUM CNIDARIA

Uno de los grupos de invertebrados marinos en los que se han encontrado sustancias bioactivas

es el Phylum Cnidaria que incluye a las conocidas hidras medusas anØmonas y corales A este

grupo pertenecen cerca de 10 000 especies de las cuales aproximadamente 100 se consideran

tóxicas paras los humanos y otros organismos Los cnidarios son responsables del mayor nœmero

de envenenamientos que cualquier otro Phylum marino Baslow 1977 Hashimoto 1979

Hessinger 1988 En países como Australia China Italia Malasia OmÆn PakistÆn y Estados

Unidos entre otras se cuenta con una serie de datos de mortalidad de envenenamientos marinos

Williamson et al 1996 y aunque muchas personas son urticadas cada aæo por cnidarios

proporcionalmente pocos casos son fatales Baslow 1977

Los extractos obtenidos de los tejidos de cnidarios tienen una gran variedad de sustancias

quimicas que exhiben actividad biológica en varios sistemas estudiados Se han encontrado

sustancias tóxicas de naturaleza peptidica y proteica neurotoxinas hemolisinas cìtolisinas

antimicóticos antihØlmicos inhibidores enzimÆticos diterpenos con actividad antinflamatoria

prostaglandinas con acción antiviral antidiabØticos aglutininas entre otros

El conocimiento que se tiene sobre el efecto producido por las toxinas en el hombre se ha

incrementado en las œltimas dØcadas y se ha afirmado que las toxinas que poseen estos

organismos se encuentran dentro de los venenos mÆs potentes hasta ahora conocidos Halsted

1965 Los efectos fisiológicos y dermatológicos tales como toxicidad letal en mamiferos actividad

hemolítica actividad dermonecrótica y efecto cardiotóxico de varias toxinas de cnidarios han sido

bien documentados en especial aquellos estudios realizados con la fragata portuguesa Physalia

physalis la avispa de mar Chironex f1ecken y la ortiga de mar Chrysaora quinquecirrha

Azuma et al 1986

3

1 2 1 Tipo y función de los Cnida Nematocistos

Los enida o enidoeistos se encuentran entre los productos de secreción mås complejos que se

conocen en los organismos vivos y es el tØrmino colectivo que se utiliza para denominar las tres

principales categorías de organoides capsulares presentes en los cnidarios nematocistos

espirocistos pticocistos Williamson et al 1996 Fig 1 De las tres categorías de cnida sólo los

nematocistos son de importancia mØdica ya que son los œnicos que se conocen que penetran la

piel Los otros dos tipos los espirocistos y los pticocistos se encuentran exclusivamente en la

clase Anthozoa Williamson et al 1996

Así los nematocistos constituyen la característica distintiva de los cnidarios Son organelos

especializados localizados a lo largo de la epidermis y estÆn alojados entre las cØlulas epitelio

musculares o invaginados dentro de ellas principalmente en los tentÆculos Los nematocistos son

probablemente los organelos intracelulares estructuralmente mÆs complejos y grandes que se

conocen y se cree que son productos de secreción originados en el aparato de Golgi Holstein

Tardent 1984 Son estructuras urticopunzantes cuya principal función es la defensa y captura de

las presas Aunque la mayoría de ellos penetran e ínmovilizan a la presa algunos estÆn

adaptados para adherirse sostener o enredar a Østa Los nematocistos en la mayoría de los

casos se distribuyen en todo el cuerpo del animal incluyendo los tentÆculos la región oral y el

estómago así como en la epidermis exumbrelar Williamson et al 1996 Hessinger 1988

Se conocen mÆs de 24 diferentes tipos morfológicos de nematocistos Mariscal 1974

Williamson et al 1996 Fig 1 Estos son estructuras que constan principalmente de una cÆpsulade doble pared compuesta principalmente de queratina y colÆgeno y un tœbulo o filamento

enrollado dentro de la cÆpsula el cual varía en estructura y función Fig 2 El tœbulo puede tener

varias estructuras accesorias como espinas estiletes barbas y lamelas el cual penetra se

adhiere o enreda en la presa cuando el nematocisto se descarga debido a un estímulo apropiadoEl tœbulo descargado varía en tamaæo diÆmetro y estructura entre los distintos tipos de

nematocistos y generalmente posee diferentes tipos de espinas donde su tamaæo y arreglo son

importantes para la identificación de los nematocistos asimismo pueden presentar una porciónbasal alargada importante tambiØn para su determinación Williamson 1996 Bloom et al 1998

En los anexos se presentan las claves de identificación

4

Los nematocistos se descargan en respuesta a un estimulo fisico o contacto quimico cuando se

responde a la presencia de la presa o agresor y probablemente se debe tambiØn a estlmulos

nerviosos Es probable que tal respuesta produzca el proceso de descarga y envenenamiento

cuando los humanos entran en contacto con los tentÆculos Williamson etal 1996 No se conoce

con certeza en que compartimiento del nematocisto sin descargar se almacena el veneno o cual

es la ruta de liberación del mismo una vez que el nematocisto ha sido descargado Hessinger1988

1 2 2 Importancia del estudio de las toxinas provenientes de los nematocistos

Los nematocistos contienen mezclas complejas de polipØptidos tóxicos y o antigØnicos asf como

enzimas de alto peso molecular y patógenas para los humanos que actœan tanto de manera local

como sistØmica Williamson et al 1996 Barnes 1977 El efecto tóxico de los nematocistos de la

mayoría de los cnídarios no es perceptible para el hombre sin embargo algunas especies pueden

llegar a producir sensación de quemazón irritación e incluso la muerte Bames 1977 La mayoríade las toxinas producidas por los cnidarios particularmente las de las medusas son de gran

significado mØdico ya que son lÆbiles exhiben efectos miotóxicos en el corazón vascularización

pulmonar y sistØmica producen efectos dermonecróticos y hemoliticos efectos neurotóxicos asi

como fenómenos alØrgicos Williamson et al 1996 Burnett et al 1998

Los estudios clfnicos y farmacológicos de las toxinas de los nematocistos así como los

efectos químicos y fisiológicos han sido de gran relevancia desde los aæos setentas

especialmente en Australia y Estados Unidos pero no se han investigado a fondo debido a la

limitada disponibilidad de materiales Entre estos trabajos destacan los de Halstead 1965 1967 Y

Russell 1965

Las toxinas de los nematocistos han sido extraídas principalmente de los tentÆculos y se

han obtenido una variedad de componentes tóxicos que tienen diferentes propiedades químicas y

farmacológicas Hashimoto 1979 En general se han aislado sustancias con acción citotóxica y

lactonas con acción antifœngica citotóxica y antineoplÆsica Sobrino 1996 donde para la

caracterización de la actividad de tales toxinas se han utilizado peces y animales de sangre

caliente u órganos aislados Hashimoto 1979

5

1

1Nematocisto Espirocisto Ticocisto

A B e

B @e IWðAcróforo Anacróforo Euaploneme Espirotele Aspirotele Atrico

Isorriza11 11I IV V VI

1u ò CilÓ 6 BJ U

Holotrico Merotrico Apotrico Atrico Homotrico HeterotricoIsorriza isorriza isorriza anisorriza anisorriza anisorriza

VII VIII IX X XI XII

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MacrobÆsico Basitrico Heterotrico Heterotrico MicrobÆsico pMicrobÆsico p MicrobÆsico p

mastigóforo microbÆsico b microbÆsico b microbÆsico b mastigóforo mastigóforo mastigóforomastigóforo mastigóforo mastigóforo Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3

Tipo A Tipo B

XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX

Fig 1 Ilustraciones de los 31 tipos de nematocistos Williamson et al 1996 Ver claves deidentificación en anexos

6

t

Q jJ ö o O JMicrobÆsico MacrobÆsico Triropaloide Biropaloide Estenotele Pseudoestenotele

amastigóforo amastigóforo

xx XXI XXII XXIII XXIV XXV

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10 loSemiofórico Homotrico Heterotrico Holotrico Telotrico MerotricomicrobÆsico microbÆsico microbÆsico macrobÆsico macrobÆsico macrobÆsico

euritele euritele euritele euritele euritele euritele

XXVI XXVII XXVIII XXIX XXX XXXI

Fig 1 Continuación

7

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1 3 CLASE CUBOZOA

En el Phylum Cnidaria uno de los grupos de animales marinos mÆs venenosos es el de las

Cubomedusas Clase Cubozoa que habitan las aguas nerfticas de los trópicos y subtrópicosEstas medusas alcanzan tallas por encima de los 20 cm de altura y un diÆmetro de 2 a 12 cm

Kramp 1961 La mayoría de las especies de Cubomedusas son capaces de infligir al menos una

ligera urticaria y se han registrado una serie de casos fatales a lo largo de las costas de Australia

Indonesia Malasia y Filipinas Calder Peters 1995 Varias especies de cubomedusas han sido

consideradas como fuentes potenciales de toxinas pero la mayoría presentan cierta dificultad

para obtenerlas y ademÆs las toxinas presentes en este grupo difieren en su composiciónTheoarides 1984

La principal acción de las toxinas se presenta en los sistemas respiratorio cardiovascular

nervioso y renal Estos agentes pueden inducir ciertos síntomas acompaæando a las lesiones

cutÆneas con gangrena contracciones neuritis hyperpigmentación ulceraciones córneas etc

Los indicios de las manifestaciones pat6genas y clínicas de estas lesiones se han obtenido de

datos de envenenamientos humanos y experimentación animal Burnett 1991 Burnett et al

1998

1 3 1 Carybdea marsupialis

Carybdea marsupialis LinnØ 1758 es una cubomedusa muy abundante en las Antillas menores y

el Caribe usualmente en aguas tropicales con una amplia distribución en los ocØanos AtlÆntico

Pacífico e Indico Kramp 1961 Su cuerpo es transparente en forma de cubo pequeæo y mide

alrededor de 2 cm de ancho Posee cuatro tentÆculos que extendidos alcanzan los 30 cm de

largo que se localizan en cada una de las esquinas del cuerpo la base de los tentÆculos es

aplanada pedalia y ornamentada con cœmulos de nematocistos los nematocistos tambiØn se

encuentran a lo largo de la umbrela Kramp 1961 Fig 3

La literatura referente a los aspectos biológicos toxicológicos y mØdicos del gØnero

Carybdea es escasa Zakj et al 1986 estudiaron los efectos contrÆctiles de la toxina extraída de

C rastonii en aorta aislada de conejo En la misma especie Nagase et al 1987 estudiaron los

efectos contrÆctiles y relajantes de la toxina en tejidos vasculares e intestinales Azila Othman

1991 encontraron que los tentÆculos contienen factores activos hemolíticos hemorrÆgicos y

edØmicos Kokelj et al 1993 evaluaron las afecciones dermonecróticas en humanos

ocasionadas por C marsupialis Rottini et al 1995 purificaron y estudiaron las propiedades de

9

una toxina citolítica presente en C marsupialis que presentó actividad hemolítica en cØlulas de

oveja pero no así en cØlulas de conejo y humano siendo una proteína con una masa molecular

aparente de 102 a 107 kDa Othman et al 1996 mostraron que los componentes hemolíticos y

miotóxicos de C rastonii pueden ser parcialmente purificados con retención de actividad

biológica Milla et al 2000 describieron las afecciones cutÆneas ocasionadas por C marsupialisen el Caribe mexicano

1 3 2 Posición sistemÆtica

Tomando en cuenta que Carybdea marsupialis es muy abundante en la laguna arrecifal de Puerto

Morelos a Roo se decidió trabajar con esta especie La posición sistemÆtica de C marsupialis

segœn Williamson et al 1996 es la siguiente

Reino Animal

Phylum Cnidaria Hatschek 1888Clase Cubozoa Werner 1975

Orden Cubomedusae Carybdeida Gegenbaur 1856Familia Carybdeidae Haeckel 1877

GØnero Carybdea PØron Lesueur 1810

Especie Carybdea marsupialis LinnØ 1758

Dado que una simple toxina puede exhibir varios modos de acción o mÆs de una toxina

puede estar presente en un extracto dado es una ventaja probar con varios bioensayosdiferentes Así el propósito fundamental de este trabajo es evaluar la actividad hemolítica y

citotóxica de las toxinas de C marsupialis como indicadoras del posible potencial que puedantener estos compuestos

Fig 3 Fotografia que muestra a la cubomedusa en estudio Carybdea marsupialis ObsØrvese el pez

que contiene en la cavidad gastrovascular

10

2 OBJETIVOS

OBJETIVO GENERALEvaluación de la actividad biológica del extracto crudo obtenido de los nematocistos de

Carybdea marsupialis

OBJETIVOS ESPECíFICOSRecolección de los ejemplares de Carybdea marsupialis en la Laguna Arrecifal de Puerto

Morelos Q Roo

Aislamiento y caracterización de sus nematocistos

Obtención del extracto crudo mediante 9 diferentes tratamientos

Evaluación de la acción hemolítica de los extractos crudos en eritrocitos de humano res

camero y ovejaEvaluación de la acción citotóxica y la actividad biológica de los extractos crudos mediante

bioensayos en nauplios de Artemia salina en cangrejos Ocypode quadrata y en peces

Harengula humeralis y Abudefduf saxatilis determinando la Dosis Letal Media DLso Y la

Concentración Letal Media CLso

3 JUSTIFICACiÓN

De las 10 000 especies de cnidarios conocidos aproximadamente 100 especies han sido

consideradas como fuente potencial de toxinas por lo que la detección de compuestos

bioactivos en estos invertebrados marinos es el primer paso de una serie de estudios que se

deben realizar para conocer su potencial

4 HIPÓTESIS

Los extractos de varias especies de cnidarios contienen toxinas por lo que se espera obtener

de Carybdea marsupialis sustancias con actividad hemoHtica y citotóxica

11

5 `REA DE ESTUDIO

La laguna arrecifal de Puerto Morelos se encuentra ubicada en la porción Nororiental de la

Península de YucatÆn entre los 200 52 N Y los 860 52 O Ruíz Rentería el al 1998 Tiene una

extensión aproximada de 7 km y una profundidad que varía entre 1 y 8 m Fig 4

El clima es cÆlido con una temperatura media mayor a los 220C y poca oscilación tØrmica

Es del tipo Aw1 x i g y el Aw2 i esto es subhœmedo con lluvias abundantes en el verano

Los vientos Alisios dominan de febrero a julio Entre julio y septiembre se presenta un período de

calmas que precede a la Øpoca de nortes la cual se extiende de octubre a enero Merino

Otero 1991 Durante los meses mÆs cÆlidos del aæo Ounio a noviembre transitan por la zona

tormentas tropicales y huracanes El rØgimen de mareas es semidiurno y mixto con dos

pleamares y dos bajamares en 24 hrs con un intervalo de oscilación diurna promedio de 20 a

30 cm

A lo largo de la costa de Puerto Morelos se encuentra un arrecife de barrera que se

extiende en forma discontinua desde la Isla Contoy hasta Belice JordÆn 1980 Entre la barrera

coralina y la costa se localiza la laguna arrecifal La amplitud de la laguna varía entre 350 y

1600 m y tiene una profundidad media de 3 m y una profundidad mÆxima de 8 m en la zona sur

El medio marino estÆ dominado por la corriente de YucatÆn que fluye paralela al borde de la

Plataforma Continental en dirección Sur Norte En la laguna arrecifaI dominan corrientes con

velocidades de alrededor de 10 cm s pudiendo alcanzar velocidades superiores a los 50 cm s

Merino Otero 1991

Las condiciones ambientales de la laguna presentan un carÆcter oceÆnico y oligotrófico

con gran estabilidad vertical elevada transparencia y bajos niveles de nutrientes Las principales

comunidades de la zona costera son bosque tropical perennífolio manglares y pastizales halófitos

Merino Otero 1991

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6 METODOLOGíA

6 1 ACTIVIDADES DE CAMPO

La recolección de los ejemplares de Carybdea marsupialis fue realizada en la Laguna arrecifal de

Puerto Morelos a Roo durante los meses de mayo a octubre del aæo 2000 La recolección se

llevó a cabo por medio de buceo libre en las Æreas mÆs someras de la laguna capturÆndolas con

la mano y sosteniØndolas de la umbrela para evitar ser urticado ya que con el mØtodo sugeridomediante el uso de redes con mango largo y una abertura de malla de 300 11 los tentÆculos se

adher an a la malla y se romp an Los ejemplares fueron colocados en cubetas de plÆstico con

capacidad de 20 litros con aireación y trasladados al laboratorio para su procesamiento

6 2 ACTIVIDADES DE LABORATORIO

6 2 1 AISLAMIENTO DESCARGA Y CARACTERIZACiÓN DE LOS NEMATOCISTOS

La identificación de la especie fue corroborada con la ayuda de un microscopio estereosc6pico

Los tentÆculos se cortaron inmediatamente despuØs de la recolección y se siguieron varios

tratamientos para obtener distintos extractos crudos

1 Se suspendieron 12 g peso hœmedo de tentÆculos en 100 mi de agua desionizada por

2 hr a 50C despuØs se agitaron en el mismo medio por 30 min entre 040C los tentÆculos

que no se procesaron inmediatamente se almacenaron a 400C La suspensión resultante

fue filtrada a travØs de una red de plancton de 0 5 mm de abertura de malla y se

centrifugó a OOC por 15 min a 5 000 rpm en una centrífuga Sorvall El procedimiento se

repitió dos veces mÆs utilizando los mismos tentÆculos y la misma agua desionizada El

precipitado conjunto de nematocistos sin descargar se resuspendió en agua desionizada

y se almacenó en viales Eppendorf y se congeló a 20oC Para lograr la descarga de los

nematocistos esta preparación se volvió a resuspender en 9 mi de amortiguador acetato

de amonio 10mM pH 5 5 conteniendo NaCI 0 15 M Los nematocistos se homogeneizaroncon un homogeneizador de vidrio para lograr la descarga y as liberar la toxina La

muestra se observó al microscopio para determinar el momento en que la mayor cantidad

de nematocistos se habían descargado para despuØs centrifugar a 20 000 rpm por 5 min a

40C El sobrenadante extracto crudo se almacenó en viales Eppendorf y se congelaron a

20oC

14

2 Los tentÆculos utilizados en la agitación se guardaron en viales Eppendoæ 20oC3 El precipitado obtenido con el mØtodo 1 despuØs de la homogeneización y centrifugación

cÆpsulas de nematocistos descargados se almacenó en viales Eppendoæ 20oC

4 El sobrenadante agua desionizada utilizada para la agitación obtenido despuØs de la

agitación y centrifugación con el mØtodo 1 tambiØn se almacenó en viales Eppendoæ200C

5 Se siguió el mØtodo 1 a diferencia de que antes de la homogeneización la preparación

resultante se resuspendió en amortiguador acetato de amonio 10mM pH 5 5 conteniendo

NaCI 0 15 M Y una pastilla de inhibidor de proteasas Complete Mini BoerhingerMannheim

6 Se siguió el mØtodo 1 a diferencia de que antes de la homogeneización la preparación

resultante se resuspendió en agua desionizada y de esa manera se homogeneizó7 Se siguió el mØtodo 1 sólo que en lugar de homogeneizar se utilizaron perlas de vidrio de

0 5 mmde diÆmetro Sigma en una relación 1 1 nematocistos sin descargar mg perlasde vidrio mg las cuales se colocaron junto con los nematocistos en tubos Eppendorf y 3

mi de amortiguador acetato de amonio 10mM pH 5 5 conteniendo NaCI 0 15 M Y se

agitaron en el vortex 40 seg y posteriormente 1 min de reposo a 40C Esta operación se

repitió 3 veces mÆs

8 Se siguió el procedimiento anterior sólo que al amortiguador se la agregó media pastilla de

inhibidor de proteasas antes de la agitación9 Se siguió el procedimiento 4 pero en lugar de colocar las perlas y los nematocistos en el

amortiguador se colocaron en agua desionizada para posteriormente llevar a cabo la

agitaciónLos mØtodos de obtención de los diferentes extractos crudos así como los bioensayos

realizados con cada uno se muestran en la Tabla 1

La caracterización de los nematocistos presentes en el material insoluble se basó en las

claves de identificación propuestas por Mariscal 1974 y Williamson et al 1996

6 2 2 OBTENCiÓN DEL EXTRACTO

Los extractos crudos obtenidos de los tratamientos anteriormente descritos fueron liofilizados con

la ayuda de un aparato Freeze Drying Model 77 500 LABCONCO a una temperatura de 450C

La tØcnica se basa en la remoción del agua u otro solvente de un producto congelado por un

proceso llamado sublimación el cual ocurre cuando un líquido congelado pasa directamente al

estado gaseoso sin pasar a travØs de la fase líquida Una vez liofilizado el material se realizaron

los ensayos correspondientes

15

6 2 3 LETALIDAD

Para probar la actividad biológica de cada uno de los tratamientos fueron inyectadas pequeæascantidades de los diferentes extractos crudos obtenidos en cangrejos de la especie Ocypode

quadrata con un peso de 10 a 15 g Y a sardinas de la especie Harengula humeralis con un peso

de 5 a 9 g En los cangrejos las muestras fueron inyectadas via intramuscular en la base de la

tercer pata caminadora y en las sardinas en la arteria caudal con jeringas de insulina Para ello se

disolvieron 10 mg de cada extracto en 1 mi de agua desionizada Alicuotas de 0 1 mI se inyectaron

a cada organismo observando los efectos que esto producia y al control se le inyectó agua

desionizada lo cual no afectó al organismo Las muestras que no produjeron alguna reacción se

consideraron como no letales

Asimismo se colocaron peces de la especie Abudefduf saxatílis en vasos de precipitadosde 250 mi de capacidad un pez por vaso de aproximadamente 2 g de peso con 250 mi de agua

de mar filtrada A cada vaso se le agregaron 80 mg de cada uno de los extractos crudos obtenidos

de todos los tratamientos y se observaron los efectos producidos

Dosis Letal Media DL50

La toxicidad del extracto crudo se determinó de acuerdo al mØtodo de DLso de Molinengo 1979

modificado por Meier Theakston 1986 utilizando sardinas de la especie Harengula humeralis

con un peso de 5 a 9 g Los peces se colocaron en canaletas de 70 1 de capacidad con aireación y

flujo de agua continuo Alícuotas de 0 05 mi se inyectaron vía intravenosa en la arteria caudal con

ayuda de una jeringa de insulina El nivel de toxicidad se estableció por diluciones seriadas 0 5

0 25 0 125 0 0625 0 0312 0 0156 mg del extracto crudo liofilizado del tratamiento 5 y cada

concentración se diluyó en agua desionizada Se utilizaron alicuotas similares como blanco

empleando agua desionizada sin toxina Ocho peces fueron inyectados por cada dilución y la

estimación de la toxicidad aguda se registró midiendo el tiempo que al animal tardaba en morir

tiempo de supervivencia en un intervalo de 24 hr anotando ademÆs el peso de cada animal

Segœn Molinengo 1979 al graficar DIT dosis tiempo supervivencia en el eje de las abscisas

contra la dosis D en el eje de las ordenadas se obtiene una Iinea recta y las constantes de a

pendiente y b ordenada al origen de esta Iinea de regresión se extraen con cÆlculos simplesEl punto b donde la Iinea de regresión intercepta la ordenada es la dosis mÆs pequeæa del

veneno que mata al 50 de los animales experimentales en un tiempo ilimitado y el punto a es el

tiempo mínimo de supervivencia Con lo que tenemos la ecuación lineal D b a DIT

16

Concentración Letal Media CLso

Asimismo la toxicidad del extracto crudo se probó en nauplios de Artemia salina reciØn

eclosionados La eclosión se realizó colocando una cucharadita de quistes del organismo en una

solución de agua comœn conteniendo 10 de hipoclorito de sodio agitando constantemente hasta

que los quistes adquirieran un color rosado Posteriormente se lavaron con agua comœn y se

mantuvieron 24 hrs en frascos cónicos con aireación continua la mayoría eclosionaron en un día

y otros hasta el tercer día Los nauplios fueron separados de los quistes aprovechando el

fototropismo positivo de los primeros y trasladados cuidadosamente a los frascos de cultivo vasos

de precipitados de 250 mi de capacidad que contenían agua de mar filtrada 0 2 Jl 100 mi por

vaso y aireación constante Las pruebas se hicieron por triplicado colocando 30 organismos por

vaso A las 24 48 Y 72 hrs de la eclosión se les agregó la toxina colocando diluciones seriadas de

la toxina 5 10 15 25 50 80 mg por vaso al control no se le agregó toxina obteniendo los

estadios de instar instar 11I e instar IV respectivamente Se registró el nœmero de organismosmuertos despuØs de 1 3 5 Y 10 hrs de observación

6 2 4 ENSAYO HEMOLíTICO

Para evaluar la actividad hemolítica del extracto crudo fue utilizado el mØtodo modificado descrito

para citólisis bacteriana Rottini et al 1990 Se utilizaron eritrocitos de humano res camero y

oveja Para los eritrocitos de humano res y camero se utilizaron muestras del extracto

proveniente del tratamiento 5 y los extractos derivados de los tratamientos 1 2 3 4 5 7 Y 8 se

probaron en eritrocitos de oveja Tubos conteniendo 1 mi de suspensión de eritrocitos 0 05 en

solución de Alsever pH 7 4 se incubaron a 370C por 30 min con diferentes concentraciones de

toxina concentraciones que variaron de 0 08 a 5 33 mg de los distintos extractos para los

eritrocitos de oveja mientras que para los eritrocitos de humano res y camero se utilizaron de

0 52 a 33 3 mg por mi de solución de Alsever Posteriormente se centrifugó a 2 500 rpm por 4

min la hemólisis se evaluó midiendo la hemoglobina liberada en el sobrenadante mediante un

espectrofotómetro a una longitud de onda de 415 nm El mØtodo se describe a detalle en los

anexos

Otra prueba efectuada fue la observación directa de los efectos Hticos producidos por los

nematocistos en eritrocitos de humano y oveja de acuerdo al mØtodo propuesto por Klug et al

1989 Los nematocistos aislados sin descargar se mezclaron con una densa suspensión de

17

cØlulas rojas sanguíneas de humano suspendidas en solución de Alsever Una gota de esta

mezcla se colocó inmediatamente en un portaobjetos y se cubrió con un cubreobjetos

Para lograr la descarga de los nematocistos presentes sobre la extensión de sangre se le

agregó una gota de agente reductor 20mM de Oithioerythritol OTE la cual fue depositada en el

borde del cubreobjetos para permitir la mezcla con la muestra La descarga de los nematocistos

presentes y la hemólisis resultante que pudiera tener lugar en el espacio circundante a los

nematocistos descargados se observaron con la ayuda de un fotomicroscopio Olympus Los

controles se llevaron a cabo con los nematocistos aislados sin descargar los cuales se calentaron

a 800C por 2 min y posteriormente se mezclaron con las cØlulas rojas sanguíneas

6 2 5 DETERMINACiÓN DE PROTEíNAS

La determinación de la concentración de proteínas del extracto crudo se llevó a cabo de acuerdo

al mØtodo de Bradford 1976 Sigma Es un mØtodo colorimØtrico para estimar el contenido de

proteína por medio del cambio de absorción del colorante azul de Commassie cuando se une a

las proteínas en los anillos aromÆticos de algunos aminoÆcidos La cantidad de colorante unido a

la proteína puede cuantificarse midiendo la absorbancia de la solución a 595 nm

18

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19

7 RESULTADOS

Carybdea marsupialis es una cubomedusa muy abundante durante los meses de junio a octubre

en la Laguna arrecifal de Puerto Morelos Quintana Roo teniendo preferencia por las zonas

someras Esta cubomedusa posee un alto potencial tóxico causando afecciones cutÆneas en

baæistas de la zona a lo largo de estos meses Fig 5

7 1 CARACTERIZACiÓN DE LOS NEMATOCISTOS

Los nematocistos estÆn arreglados en forma de anillos a lo largo de los tentÆculos como lo

muestra la Fig 6

Se encontraron tres tipos de nematocistos los cuÆles se identificaron con la ayuda de un

microscopio compuesto de acuerdo a la clasificación de Mariscal 1974 yWilliamson et al 1996

Fig 6 A continuación se describen cada uno de ellos

1 Heterotricos microbÆsicos euriteles Su cÆpsula es elipsoidal El tœbulo evertido tiene una

porción basal alargada bien definida y dilatada ligeramente en la parte distal con una longitud

aproximadamente igual a la longitud de la cÆpsula La porción basal alargada presenta tres

series de espinas helicoidales planas bien definidas de aproximadamente 2 5 fl de longitudlas cuÆles son claramente visibles a travØs del microscopio compuesto Fig 6 La longitud

total del tœbulo es mayor a 400 fl En las preparaciones se observaron aproximadamente en

un 70

2 Holotricos isorrizas haplonemes Presentan una cÆpsula subesfØrica El tœbulo evertido no

presenta una porción basal alargada bien definida y tiene el mismo diÆmetro a lo largo de Øste

El tœbulo descargado presenta una porción proximal lisa y la porción distal cubierta con

espinas del mismo tamaæo El tœbulo descargado tiene una longitud mayor a 300 fl Fig 6

En las preparaciones se observaron en un 20

20

Fig 5 Lesiones cutÆneas ocasionadas por Carybdea marsupia is Se observan las

partes del cuerpo que tuvieron contacto con los tentÆculos de Østa cubomedusa

21

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10Jm

30Jm

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30 Jm

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fig 6 Micrografias de Carybdea marsupialis a TentÆculo con nematocistos mostrando el

arreglo en forma de anillos b Arreglo de los nematocistos en el tentÆculo los HeterotricosI

microbÆsicos euriteles son los mÆs abundantes c Heterotrico microbÆsico euritele sin

descargar d Heterotricos microbasicos euriteles descargados e Holotricos isorrizas

haplonemes sin descargar flechas f Holotricos isorrizas haplonemes descargados flechasg Atricos isorrizas haplonemes sin descargar flechas h Atrico isorriza haplonemedescargado flecha

22

3 Atricos isorrizas haplonemes Su cÆpsula es elipsoidal El tœ bulo evertido es totalmente liso

El tœbulo descargado presenta una longitud mayor a 200 Fig 6 Estos nematocistos se

observaron en las preparaciones aproximadamente en un 10

Los tœbulos de los nematocistos de los 3 tipos descritos decrecen gradualmente en diÆmetro

hacia la parte distal Asimismo de acuerdo a las morfometrías realizadas se observó un ligerodecremento en la longitud y el ancho de las cÆpsulas descargadas respecto a las cargadasTabla 2

7 2 OBTENCiÓN DEL EXTRACTO

Una vez aislados los nematocistos de los tentÆculos mediante la agitación continua en agua

desionizada se procedió a la liberación de la toxina provocando la eversión del tœbulo por

estímulos mecÆnicos perlas y homogeneizado obteniØndose varios extractos crudos

9 tratamientos con diferentes disolventes amortiguador acetato de amonio 10 mM pH 5 5

conteniendo NaCI 0 15 M Y en algunos casos inhibidores de proteasas así como agua

desionizada y distintos grados de toxicidad Estos extractos crudos se liofilizaron para llevar a

cabo los ensayos correspondientes En la Tabla 1 se resume la obtención de los extractos y los

bioensayos realizados con cada uno

7 3 CONCENTRACiÓN DE PROTEíNAS

Se obtuvo la concentración de proteínas de cada uno de los extractos obtenidos mostrÆndose los

valores en la Tabla 3 Los valores mÆs altos se alcanzaron con los tratamientos donde se

utilizaron las perlas de vidrio seguidos de los tratamientos en los cuÆles se utilizó la

homogeneización

7 4 LETALlDAD

El ensayo de letalidad se realizó en cangrejos Ocypode quadrata y peces Harengula humeralis

y Abudefduf saxatilís Al analizar la actividad biológica con cada uno de los 9 extractos en los

cangrejos por medio de una inyección intramuscular en la base de la tercer pata caminad ora se

observaron las reacciones fisiológicas que se muestran en la Tabla 4 Como se puede apreciar en

todos los casos se presentaron movimientos tetÆnicos seguidos de parÆlisis y muerte a

excepción del extracto 2 donde no se produjo la muerte Respecto a las sardinas Harengula

humeralis tambiØn en todos los casos excepto en el extracto 2 se produjo la muerte

23

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Tabla 3 Se muestra la concentración de proteínas de cada uno de los 9 extractos obtenidos

elJ Jlg de proteínas por cada 0 125 mg de extracto crudo

ConcentraciónExtracto Proteínas JlQ

1 4 876506

2 9 453731

3 7 931343

4 9438805

5 6 397590

6 3 762048

7 10 61445

8 1046889

9 7 361445

25

observÆndose un oscurecimiento en la piel en la porción dorsal tendían a tambalearse de un lado

a otro y presentaban movimientos operculares lentos posteriormente se producía parÆlisis y

despuØs la muerte

Tabla 4 Reacciones fisiológicas observadas en cangrejos de la especie Ocypode quadrataal inyectar 1 mg disuelto en 0 1 mi de agua desionizada de cada uno de los extractosobtenidos

Tratamiento Movimientos ParÆlisis Muerteextracto TetÆnicos seg min

1 X 30 3

2 205

3 X 90 5

4 X 120 7

5 X 15 1

6 X 80 1 7

7 X 20 1 2

8 X 10 0 6

9 X 55 1 4

Asimismo con los peces de la especie Abudefduf saxatilis se agregaron 80 mg de cada

uno de los extractos en 250 mi de agua de mar filtrada 0 2 fl colocando un pez por vaso sin

observar reacción alguna

Dosis letal media DL50

La DLso se obtuvo al inyectar en la arteria caudal de los peces de la especie Harengula humeralis

diluciones seriadas del extracto crudo del extracto 5 uno de los cuÆles presentó mayor actividad

biológica en dosis de 0 5 0 25 0 125 0 0625 0 0312 0 0156 mg disueltos en agua desionizada

Se inyectaron alfcuotas de 0 05 mI utilizando como blanco agua desionizada La DLso se obtuvo

con 0 06 mg de extracto crudo esta concentración equivale a 0 00307 mg de proteína por g de

pez La muerte de los peces ocurrió en un promedio de 6 22 hrs Fig 7 En la figura se muestra la

orrelación entre D dosis y DIT dosis I tiempo de supervivencia con el ajuste lineal de los

jatos de acuerdo a los procedimientos propuestos por Molinengo 1979 y Meier Theakston

1986

26

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27

Concentración letal media CLso

Al realizar la CLso con nauplios de Artemia salina no se observaron efectos de letalidad con

diluciones seriadas del extracto crudo del tratamiento 5 5 10 15 25 50 Y 80 mg

7 5 ENSAYO HEMOL˝TICO

En este ensayo se utilizaron eritrocitos de res carnero oveja y humano obteniendo hemólisis

sólo con los eritrocitos de oveja a concentraciones bajas de toxina Con base en lo anterior se

probaron los extractos crudos de los tratamientos 1 2 3 4 5 7 Y 8 con los eritrocitos de ovejaasí como el extracto del tratamiento 5 con eritrocitos de humano carnero Y res incrementando las

concentraciones de toxina

En la Fig 8a se muestran las curvas dosis respuesta de los extractos obtenidos en los

tratamientos 1 2 3 4 5 7 Y 8 en eritrocitos de oveja Cabe resaltar que con los extractos

probados se llegó al 100 de hemólisis para efectos de comparación con concentraciones que

variaron de 0 08 a 5 33 mg de extracto crudo Asimismo la Fig 8b muestra las líneas de

tendencia de los datos obtenidos Se puede observar que el extracto crudo que presentó una

mayor actividad hemolítica fue el 8 seguido en orden decreciente por los extractos 5 7 3 1 Y 4

Con el extracto 2 no se observaron efectos hemolíticos

Sin embargo al transformar los datos anteriores a concentración de proteínas mg hubo

un ligero cambio en las curvas dosis respuesta con los distintos extractos Fig 9 Se observa que

la sensibilidad de los eritrocitos de oveja varió en orden decreciente con los diferentes extractos

de la siguiente manera 5 8 1 3 7 Y 4

En los ensayos con eritrocitos de res carnero y humano se probaron concentraciones de

f 0 02 a 1 7 mg de proteína obteniendo los resultados que se muestran en la Fig 10 Los eritrocitos

de humano y res alcanzan el 100 de hemólisis con aproximadamente 0 08 mg de proteínas

mientras que los eritrocitos de carnero con aproximadamente 1 7 mg de proteínas

Con respecto a la observación de la descarga de los nematocistos directamente en los

eritrocitos de oveja y humano no se observó ninguna zona de inhibición alrededor del tœbulo

como lo muestran varias micrografías obtenidas por distintos autores Klug et al 1989

28

a 120

fI 100

ıE 80QrQ

60 Tratamiento 11OQ

Tratamiento 3I

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Tratamiento 5o Io 20 lIETratamiento 71

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O 1 2 3 4 5 6

Extracto crudo rng ml

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Tratamiento 1I

Tratamiento 31Tratamiento 4

ITratamiento 5 i

lIETratamiento 7I

Tratamiento 8 i

1 2 3 456

Extracto crudo mg ml

Fig 8 a Curva dosis respuesta de la actividad hemolítica con los diferentes extractos

crudos en eritrocitos de oveja Se emplearon de 0 08 a 5 33 mg de extracto crudo por mi desolución Alsever b Líneas de tendencia para los datos de a

29

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Tratamiento 3

Tratamiento4

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Tratamiento 7

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0 1 0 2 0 50 3 0 4

Concentración de Proteínas mglml

i Tratamiento 11I

Tratamiento 31i Tratamiento 4 ì

Tratamiento 51Tratamiento 7 i

Tratamiento al0 1 0 2 04 0 50 3

Concentración de Proteínas mg ml

Fig 9 a Curva dosis respuesta de la actividad hemolítica de distintos tratamientos deextracto crudo representados en concentración de proteínas en eritrocítos de oveja Se

emplearon de 0 004 a 0 39 mg de proteínas por mi de solución Alsever b Líneas detendencia para los datos de a

30

a 1

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I Humano ICD II Camero IO

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Concentración proteínas mg ml

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CD60C

CD iS 40

I

I Humano Ie 1CD

I Canło Iu

20OQ I Res

O

O 0 25 0 5 0 75 1 1 25 15 1 75 2

Concentración proteínas mg ml

Fig 10 a Curva dosis respuesta de la actividad hemolítica con eritrocitos de humano res ycamero utilizando extracto crudo del tratamiento 5 Se emplearon de 0 02 a 1 7 mg de

proteína por mi de solución Alsever b líneas de tendencia para los datos de a

31

8 DISCUSiÓN

La captura de Carybdea marsupialis representa un problema con los mØtodos convencionales

por lo que se sugiere la captura con la mano sosteniØndolas de la umbrela para posteriormente

introducirlas en las cubetas de plÆstico de 20 litros de capacidad con aireación y de allí

trasladarlas al laboratorio para su procesamiento

Como menciona Hashimoto 1979 es importante detectar la toxicidad en un organismovivo para que a partir de esto se pueda elucidar cual es la importancia de dicha toxina y así

caracterizar su actividad biológica Los cnidarios poseen organelos especializados nematocistos

que es lo que los caracteriza los cuales contienen elementos tóxicos Carybdea marsupialis tiene

una alta incidencia en la zona de estudio Es una cubomedusa urticante que presenta un alto

potencial de sustancias bioactivas por lo que es importante caracterizar el tipo de veneno que

posee

Las afecciones cutÆneas que produce C marsupialis en humanos se caracterizan por una

sensación de quemazón y dolor en la zona urticada y no se presentan síntomas generalizadosobservÆndose una patogØnesis irritante que desaparece despuØs de tres días Casos como Østos

han sido registrados en otras partes del mundo como en el mar AdriÆtico Kokelj et al 1992

Kokelj et al 1993 Peca et al 1997 De acuerdo a Milla et al 2000 las dermatitis producidas

por C marsupialis se denominan como lesiones lineales o aisladas eritematopapulosas

Carybdea marsupialis posee un distintivo armamento de cnidocitos cØlulas que contienen

a los nematocistos los cuales estÆn dispuestos en agrupaciones de baterías a lo largo de los

tentÆculos arreglados en forma de anillos Los nematocistos que contienen una cÆpsula y un

tœbulo enrollado funcionan como un dardo que al ser estimulados descargan el tœbulo y se

disparan liberando el veneno en ellos contenido En general los tœbulos se disparan a gran

velocidad penetrando y paralizando a la presa en aproximadamente 3 milisegundos Williamson

etal 1996

La descarga de los nematocistos es debida a una combinación de estimulos químicos y

mecÆnicos producidos por la víctima o la presa La descarga de los nematocistos en los tejidos de

los seres humanos involucra la eversión del tœbulo dentro de la epidermis y la subyacente dermis

vascular produciendo los síntomas antes mencionados

32

Realizando estudios in situ se observó que la principal acción de los nematocistos era para

la captura de la presa donde la función biológica parece ser inmovilizar a la presa

instantÆneamente para prevenir que escape y como menciona Hessinger 1988 las toxinas

estÆn diseæados ya sea para tener un efecto inmediato de defensa para urticar o inducir dolor en

un depredador potencial o para tener un efecto ofensivo inmediato para matar o paralizar a la

presa

Asimismo con los estudios in situ se observó que C marsupialis captura su alimento

durante la noche dejando a la deriva sus tentÆculos extendidos casi en la superficiealimentÆndose de zooplancton principalmente de pequeæos crustÆceos como isópodos

copØpodos y anfípodos entre otros y peces a los cuales sujetan con los tentÆculos que se

contraen penetrando la toxina de los nematocistos y en cuestión de segundos la presa es

paralizada y posteriormente se produce la muerte La medusa introduce la presa en la cavidad

oral con la ayuda de los tentÆculos luego la deposita en la cavidad gastrovascular para su

digestión y en cuestión de horas menos de tres un pez de 20mm es totalmente digeridoAdemÆs el contacto de los tentÆculos con cualquier cuerpo extraæo durante la noche tambiØn

indujo la descarga de los nematocistos lo que sugiere que tambiØn tienen una función protectoracontra depredadores Durante el día se encontraban nadando en grupos de hasta 300 medusas

por m2 cerca del fondo donde lo œnico que se observaba era la sombra de Østas proyectada en la

arena por el sol de medio día pero de igual manera al entrar en contacto con un cuerpo extraæo

se producía la expulsión de los nematocistos

El analizar el comportamiento de las medusas puede parecer a primera vista sólo del

interØs de un biólogo pero poder prevenir los daæos y dar el tratamiento adecuado ha contribuido

a la reducción de personas urticadas en el mundo

Carybdea marsupialis posee tres tipos de nematocistos en sus tentÆculos Heterotricos

microbÆsicos euriteles Atricos isorriza haplonemes y Holotricos isorriza hap onemes Estas

mismas categorías de nematocistos se encontraron en C marsupialis de la parte Central y Norte

del mar AdriÆtico Avian et al 1995 s610 que estos autores mencionan que los mÆs abundantes

en sus preparaciones fueron los Atricos isorrizas haplonemes a diferencia de la C marsupialis del

Caribe donde los nematocistos mÆs abundantes fueron los Heterotricos microbÆsicos euriteles

33

Es interesante seæalar que estas tres categorias son las mismas que se presentan en

varias especies de escifomedusas como en el caso de Pelagia noctiluca que presenta los

mismos tipos de nematocistos incluso con morfometrias similares

DespuØs de la descarga de los nematocistos se observó un decremento en el tamaæo de

la cÆpsula Este decremento puede deberse a la eversión del tœbulo o al mecanismo de descarga

y al igual que lo seæalan otros autores se observa un decremento en el diÆmetro del tœbulo hacia

su porción distal Östman 1988 Avian et al 1991

Los nematocistos del tipo Heterotricos microbÆsicos euriteles se presentan en varias

especies de la clase Cubozoa Son considerados equivalentes a los tumiteles observados en

Carybdea rastonii y Carukia bamesi Southcott 1967 y son de gran tamaæo como los de

Chiropsalmus quadrumanus Calder Peters 1995 y Chironex fleckeri Endean el al 1969

Rifkin Endean 1983 Hessinger 1988 Este tipo de nematocistos son penetrantes e inyectores

y parecen entrar como un gancho al contacto con el tegumento y como poseen grandes espinasen la parte basal del tœbulo funcionan como un arpón que penetra arrastrando el tegumento de la

presa para lograr un contacto mÆs cercano con el tentÆculo Rifkin Endean 1983 pero el papel

que juegan en el proceso de envenenamiento no se conoce Williamson el al 1996

Los Atricos isorrizas haplonemes tambiØn estÆn presentes en varias especies de la clase

Cubozoa como en Chironex f1eckeri Tripedalia binata Carybdea rastonU Carukia bamesi

Chiropsalmus quadrumanus Halstead 1965 Southcott 1967 Calder Peters 1995 Hessinger1988 Estos nematocistos no poseen espinas pero estÆn rellenos de una secreción la cual

parece ayudar para la adhesión del tentÆculo a la piel o la cuticula de la presa o victima y no se

han observado que penetren la piel Williamson et al 1996

Los Holotricos isorrizas haplonemes se han observado en Carybdea rastonii Chironex

fleckeri Carukia bamesi Chiropsalmus quadrumanus Southcott 1967 Calder Peters 1995

Hessinger 1988 Estos nematocistos sirven para capturar presas pequeæas principalmentecrustÆceos Williamson el al 1996

Como se observa los tres tipos de nematocistos se encuentran en la mayoria de los

organismos pertenecientes a la clase Cubozoa sin embargo no es una caracteristica distintiva

del grupo ya que Østos tambiØn se encuentran en otros cnidarios A pesar de que los

nematocistos son similares se han encontrado diferencias en los tipos de toxinas que poseen

34

Los cnidarios de importancia mØdica tienen nematocistos adaptados para penetrar la piel

humana Estos tipos pueden tener o no espinas y pueden tener o no parte basal alargada

Williamson et al 1996 Se asume que sólo los nematocistos que penetran son venenosos y

capaces de urtícar Hessinger 1988 Se necesita una rÆpida inmovilización de la presa con lo

que un efecto cardiotóxico miotóxico neurotóxico o hemolítico puede tener una acción rÆpida

Williamson et al 1996

Una vez que fueron aislados los nematocistos de los tentÆculos se observó que estos se

encontraban sin descargar asl que se recurrió a medios físicos y mecÆnicos para obtener la

descarga y así lograr la liberación de las toxinas Se utilizó el homogeneizado produciendo la

ruptura de las cÆpsulas de los nematocistos dado que este mØtodo se basa en la acción

mecÆnica para el rompimiento de la cÆpsula TambiØn se utilizaron perlas de vidrio las cuales al

mantenerlas en constante agitación junto con las cÆpsulas sin descargar en una proporción de

1 1 producían el choque de unas con otras liberÆndose las toxinas

Al parecer el mØtodo mÆs efectivo fue el realizado con las perlas de vidrio obteniØndose

un extracto con mayor actividad biológica en los distintos ensayos Respecto a la

homogeneización de los nematocistos como lo demuestran Long Rowe Burnett 1994 se

obtiene la ruptura y la destrucción de muchos de estos organelos y probablemente resulte en una

pØrdida de cierta actividad biológica en el proceso debido a la agregación de ciertos compuestosextra nematocistos que pueden llegar a degradar los componentes del extracto ademÆs otros

constituyentes celulares pueden tambiØn introducirse en el extracto lo que nos indica que el

material puede estar altamente contaminado Bloom et al 1998 mencionan que cualquiertratamiento fuerte con los nematocistos ya sea físico o químico puede alterar químicamente las

toxinas

Asimismo hubo la necesidad de utilizar la solución adecuada para mantener la estabilidad

de las toxinas empleando el acetato de amonio 10 mM pH 5 5 conteniendo cloruro de sodio

0 15 M yen algunos casos inhibidores de proteasas Como lo mencionan Rottini et al 1995 un

pH Æcido y la utilización de inhibidores de proteasas ayudan a la estabilización de la actividad de

las toxinas En otros casos se utilizó agua desionizada ya que varios autores seæalan que es un

buen medio para mantener la actividad de las toxinas sin necesidad de medios químicos que

puedan alterar los procesos

35

En general los mØtodos de obtención del extracto crudo en cnidarios son muy variados

por lo que se decidió realizar varios mØtodos que fueran evaluados en los bioensayos Asimismo

se sabe que sólo en pocas especies de medusas y sifonóforos como en Chironex fleckeri

Physalia physalis y Chrysaora quinquecirrha se tiene la información detallada de los venenos y

toxinas de los nematocistos y esto se debe en parte a la utilización de procedimientos poco

efectivos para la obtención y preparación del veneno Azuma et al 1986 Hessinger 1988

La mayoría de los trabajos que se han realizado sobre los venenos o toxinas de los

nematocistos son difíciles de comparar y no es certero que las toxinas tengan su origen en los

nematocistos Endean et al 1993 Por ello se decidió probar la actividad biológica de

C marsupialis con los tentÆculos Iiofilizados sin nematocistos asi como de los nematocistos

Iiofilizados una vez que habían sido descargados En los tentÆculos no se encontraron indicios de

actividad pero no así en los nematocistos descargados los cuÆles si presentaron una elevada

actividad biológica Esto puede deberse a que las toxinas estØn contenidas dentro de los

nematocistos sin descargar en locaciones específicas y la tras locación de Østas de un

compartimiento a otro parece ocurrir durante la descarga Williamson et al 1996 Las toxinas de

los nematocistos son proteinÆceas mientras que los compuestos activos de bajo peso molecular

de los extractos de los tejidos representan material de la parte externa de los nematocistos Es

necesario considerar la diferencia entre las toxinas que se generan dentro de los nematocistos

como constituyentes de estos y aquellas sustancias ponzoæosas que se originan fuera de los

nematocistos como constituyentes de los tejidos Es decir las muestras de nematocistos que han

de aislarse para obtener las toxinas continuamente se contaminan Los nematocistos

comœnmente son aislados con material adherido conteniendo fibrillas que son las que componen

prinCipalmente este material contaminante Hessinger 1988 demostró que la presencia de

actividad proteolítica en los extractos de los nematocistos de varios cnidarios representacontaminación muestra de pequeæos pØptidos la cual se elimina con enzimas proteolíticas

Es difícil determinar si las sustancias ponzoæozas de origen extra nematocistos participanen la captura de la presa o defensa o si existen como componentes normales de los tejidos los

cuÆles son sólo accidentalmente peligrosos para otros organismos Hessinger 1988 Aœn así en

algunos casos se afirma que las toxinas son extraidas de nematocistos puros pero existe cierta

duda en lo que concierne a la pureza y estabilidad de estas preparaciones Hessinger 1988

Esto se podria resolver si existieran mØtodos confiables y seguros para obtener y estudiar estas

toxinas

36

Hessinger 1988 sugiere que la potencia total de los efectos fisiológicos de las toxinas de

los nematocistos es el resultado de interacciones cooperativas y sinergisticas entre varios

componentes de Østas Es decir los nematocistos mÆs que ser una mezcla simple de proternas

que actœan independientemente de las cuales algunas son tóxicas consisten de una mezcla de

proteinas que interactœan unas con otras Por un lado estas proteinas que interactœan pueden

estabilizarse una a otra mientras estÆn contenidas dentro de la cÆpsula y por el otro permiten la

posibilidad de diversificar la acción de las toxinas a varios puntos de acción en los tejidos cuando

Østas son liberadas de la cÆpsula Esto ha sido demostrado en Aiptasia sp y Physalia sp entre

otros donde algunas de las proteinas que constituyen las toxinas de los nematocistos actœan

sinergisticamente para producir los efectos letales y debido a que se ha observado en varias

clases de cnidarios y diferentes tipos morfológicos de nematocistos se sugiere que la mayoría de

las toxinas de los cnidarios podrran presentar este tipo de interacciones

Asimismo en los bioensayos realizados con C marsupíalis al evaluar la actividad biológicade los extractos crudos por diferentes mØtodos y con distintos tratamientos se observó que en los

procedimientos en los que se utilizaron inhibidores de proteasas dieron la óptima actividad

especifica

Independientemente de la tØcnica que se utilice para aislar los nematocistos las proteasas

parecen estar presentes en las preparaciones del extracto crudo Estas proteasas son

probablemente componentes estables de los extractos crudos ya sea si Østas estÆn almacenadas

en caliente o frío La estabilidad de las proteasas se debe tambiØn al hecho aparente de que las

enzimas del extracto crudo pueden ser detectadas despuØs de que la preparación de la toxina fue

Iiofilizada Long Rowe Burnett 1994

Aunque con los extractos donde se utilizaron perlas y el homogeneizado tanto con agua

como con amortiguador conteniendo inhibidores de proteasas fueron los que presentaron una

mayor actividad biológica en los cangrejos de la especie Ocypode quadrata produciendo la

muerte de manera casi instantÆnea los extractos sin inhibidores de proteasasy con nematocistos

descargados asl como el sobrenadante tratamiento 4 tambiØn ocasionaron la muerte de Østos

no siendo asr con la preparación de los tentÆculos que aunque se observó parÆlisis y una elevada

concentración de proteínas no produjeron la muerte Cuando se probaron los distintos extractos

mediante una inyección intravenosa en la arteria caudal en sardinas de la especie Harengulahumeralis tambiØn se produjo la muerte de Østas

37

Al analizar la letalidad en peces de la especie Abudefduf saxatilis no se observó efecto

alguno al disolver la toxina en agua de mar Se decidió no probar con concentraciones mÆs altas

ya que 80 mg se consideró que era una concentración elevada comparada con las

concentraciones que se utilizaron al probar la letalidad de los cangrejos en los cuales se

presentaron las características anteriormente descritas con tan sólo 1 mg de los distintos extractos

Probablemente la ruta de penetración de la toxina no es vía cutÆnea o a travØs de las branquias

Asimismo esto se puede deber a que como lo mencionan Rottini et al 1995 con las toxinas de

C marsupialis estudiadas en el Puerto de Cesenatico Italia probablemente las toxinas de

e marsupialis del Caribe mexicano tambiØn son altamente inestables frente a compuestos

polares Así para que las toxinas presenten cierta actividad necesitan penetrar rÆpidamente en

el organismo con lo que se logra la mínima pØrdida de estabilidad y la acción es instantÆnea lo

que se puede lograr ya sea vía intravenosa o intramuscular Esto sugiere como lo menciona

Hessinger 1988 que la rapidez de los efectos letales de las inyecciones intravenosas tienen

preferencia en los sitios específicos para los factores letales en el sistema circulatorio

Los bioensayos con cangrejos estÆn bien documentados especialmente con anØmonas lo

que lleva a mØtodos estÆndar como principio de la caracterización de la actividad biológica y los

efectos fisiológicos que Østa pueda producir en el organismo BØress et al 1975 BØress el al

1976 Schweitz et al 1981 Sin embargo en el grupo de los cnidarios no existen referencias de

bioensayos con peces a los cuÆles se les inyecte la toxina vía intravenosa para evaluar la

actividad biológica Podría ser una buena vía para la caracterización biológica de los compuestos

activos presentes en organismos marinos

La Dosis Letal Media DLso es la dosis a la cual se presenta la muerte en el 50 de los

organismos a una concentración dadå La determinación de la DLso se basa en un mØtodo el cual

ha sido discutido por mucho tiempo desde su introducción por Trevan en 1927 para la

estandarización biológica de drogas peligrosas Desde entonces ha ganado amplia aceptacióncomo medida de la toxicidad aguda de todos los tipos de sustancias pero debido a que es

esencial la precisión y se utilizan un nœmero relativamente alto de animales ha sido ampliamente

criticada por el desperdicio innecesario de recursos AdemÆs la DLso no es constante para una

sustancia dada es notoriamente variable y puede ser afectada por un amplio intervalo de distintos

factores Meier Theakston 1986

38

Los extractos de nematocistos y venenos son comœnmente utilizados para realizar

layos de letalidad en ratones y o cangrejos Las toxicidades generalmente se registran como la

ltidad de veneno por unidad de peso corporal que se necesita para matar el 50 de los

nales dentro de un periodo específico y se expresa en valores de DLso Hessinger 1988 La

o ha ganado amplia aceptación como medida de la toxicidad aguda aunque el propósitoinal fue la determinación y estandarización de la potencia biológica Meier Theakston 1986

El mØtodo propuesto por Molinengo 1979 y modificado por Meier Theakston 1986 es

Jn mØtodo aproximado para calcular la DLso donde la utilización de 8 10 animales experimentales

para obtenerla ofrece valores dentro del mismo intervalo estadístico que los obtenidos cuando se

utilizan los bioensayos clÆsicos en donde se emplean 30 o mÆs animales con lo que la ventajade este mØtodo es que permite utilizar una menor cantidad de animales

Para la obtención de la DLso con las sardinas de la especie Harengula humeralis se utilizó

el extracto en el cual se empleó inhibidores de proteasas durante la extracción y para la liberación

de las toxinas se utilizó el homogeneizado extracto 5 ya que fue uno de los mÆs potentes

obtenidos Se utilizaron 8 organismos por concentración lo cual se consideró un nœmero

representativo para los fines propuestos con lo que se evitó el gasto innecesario de animales El

mØtodo utilizado para la obtención de la DLso es un mØtodo fÆcil de aplicar y analizar donde a

partir de cålculos simples se obtuvieron las constantes de correlación a 6 2209 b 0 0605

f O 91 La constante b es la dosis mås pequeæa de una droga que mata al 50 de los

organismos que en este caso fue de 0 06 mg g de extracto crudo las toxicidades se registrancomo la cantidad de toxina mg por unidad de peso corporal g de animal mientras que la

constante a es el tiempo al cual se logra la supervivencia mínima obteniendo un valor de 6 22

horas Esta dosis equivale a 0 00307 mg de proteína por g de animal Con dosis mayores los

peces morían en cuestión de segundos y no se pudo determinar cual fue la causa de la muerte

Segœn Hessinger 1988 el tipo de curva obtenida con C marsupialis es característica de las

toxinas que actœan en sitios ampliamente distribuidos teniendo un amplio intervalo de afinidades

Se han documentado las DLso con el extracto crudo en otras especies del grupo utilizando

principalmente ratones como animal experimental En Chrysaora quinquecirrha una medusa

ampliamente estudiada con un alto potencial tóxico se ha obtenido la DLso a concentraciones que

van de 0 00096 0 00158 mg proteínalg animal Bumett Goldner 1970 Bumett Calton 1973

Kelman et al 1984 Asimismo Chysaora achlyos presenta una DLso que va de 0 0065 0 008

mg g Radwan et al 2000 y PhysaJia physaJis de 0 000145 0 002 mg g En Chironex feckeri otra

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especie que pertenece a la Clase Cubozoa a la que algunos autores la consideran como el

animal mÆs venenoso del mundo la DLso se ha alcanzado en concentraciones que fluctœan entre

0 000028 y 0 00012 mg Ig siendo una de las toxinas mÆs potentes hasta ahora conocidas Crone

Keen 1971 Calton Burnett 1986 Othman Burnett 1990 Endean et al 1993

En los bioensayos con nauplios de Artemia salina no se observó efecto alguno estos

resultados sugieren que la inestabilidad observada en los extractos crudos de C marsupialis y

presumiblemente otras toxinas de cnidarios puede deberse a uno o mÆs componentes

hidrofóbicos posiblemente una enzima proteolítica Comis et al 1989

El empleo de nauplios de Artemia salina para la obtención de la concentración letal media

CL50 es un mØtodo que se decidió realizar debido a que es un buen indicador de la toxicidad

aguda Es un bioensayo estandarizado que requiere poca infraestructura y ademÆs posee varias

ventajas los quistes deshidratados son accesibles todo el aæo y pueden transportarse a cualquier

lugar fÆcilmente se adaptan fÆcilmente a las condiciones de laboratorio y son excelentes

candidatos para pruebas de toxicidad por su ciclo de vida corto entre otros

La hemólisis es la destrucción o rompimiento de las cØlulas rojas de la sangre y la

hemoglobina que contiene es liberada en el medio circundante Un anticuerpo lisina se adhiere a

la cØlula roja pero no causa el rompimiento en ausencia de un componente normal de la sangre

llamado complemento La hemólisis no es normal en cØlulas sanguíneas sanas sin embargo

puede ser causada por ciertos químicos venenos productos tóxicos de los microorganismosentre otros

El bioensayo hemolítico se uj e manera estÆndar para conocer el efecto que podríamer la toxina a nivel celular y asiml5mo conocer el posíble potencial que Østa representa La

actividad hemolítica se ha encontrado en los extractos de un gran nœmero de cnidarios como

Chíronex fleckeri Chrysaora quinquecírrha Physalia physalis Aiptasia palida e Hidra oligactisentre otros Klug et al 1989

Los extractos de C marsupialis que mostraron una mayor actividad hemolítica en los

eritrocitos de oveja fueron aquellos en los que se utilizaron las perlas de vidrio y el

homogeneizado con inhibidores de proteasas incluidos en el amortiguador Como ya se

mencionó los inhibidores de proteasas juegan un papel importante en la estabilidad de las

proteínas y en general de las toxinas en sí Sin embargo al utilizar los nematocistos descargados

40

Østos tambiØn mostraron una alta actividad lo que sugiere como mencionan Klug et al 1989

que la hemolisina no es una propiedad exclusiva de los nematocistos por lo que se podría hablar

de componentes fuera de los nematocistos que estÆn actuando para producir dicha actividad y

que probablemente no provienen de los tentÆculos ya que no se obtuvo hemólisis de Østos

Las curvas de estos tratamientos indican que se presenta un intervalo estrecho en las

dosis probadas entre las dosis mÆximas que causan el 100 de hemólisis y las mínimas que

producen el 0 de hemólisis Esto puede deberse en parte a que los efectos tóxicos presentes

principalmente en sitios específicos especializados de la membrana presentan un intervalo

estrecho de afinidades Hessinger 1988

Asimismo al transformar los datos de los distintos extractos crudos a concentración de

proteínas y obtener distintas curvas indica que pueden existir otros componentes que actœan de

manera sinergística con las proteínas y que no se puede generalizar que las proteínas sean

componentes exclusivos de las toxinas que llegan a causar la hemólisis Investigaciones

realizadas con el veneno de los cnidarios han demostrado la presencia de ciertos carbohidratos

así como otros componentes no proteicos Othman Burnett 1990 Muestras representativas de

las toxinas de las medusas han mostrado contener compuestos cuaternarios de amonio que se

cree se unen a las proteínas en las cÆpsulas de los nematocistos y contribuyen a la toxicidad total

Long Rowe Burnett 1994

La acción hemolitica probablemente se deba a la acción de la fosfolipasa A presente en el

extracto o a otro factor lítico independiente de alguna fosfoJipasa como se ha demostrado en

diversas especies pertenecientes al grupo Bernheimer Avigad 1981 Klug et al 1989

Grotendorst Hessinger 2000

En relación con los eritrocitos de humano res y carnero se utilizaron concentraciones mÆs

elevadas de extracto crudo Iiofilizado del tratamiento 5 Las concentraciones a las cuales se

obtuvo hem61isis difieren de las obtenidas en eritrocitos de oveja con el mismo tratamiento Con

los eritrocitos de oveja se alcanzó el100 de hemólisis con una concentración de proteínas de

0 1 mg mientras que con los eritrocitos de humano res y carnero este valor se obtuvo con

concentraciones de 0 8 0 8 Y 1 52 mg de proteínas respectivamente Se puede decir que debido

a que las toxinas de C marsupialis son inestables frente a compuestos polares son lÆbiles al

calor y ademÆs estÆn sujetas a la actividad de las fosfolipasas esto podría provocar la

inestabilidad de las hemolisinas en las muestras Rottini et al 1995

41

El hecho de que los eritrocitos de oveja fueran mÆs sensibles a la toxina que los otros

tipos se debe a que probablemente estos eritrocitos contienen al menos tres veces mÆs

esfingomielina un componente Iipídico natural de los eritrocitos que los eritrocitos de humano

Rottini et al 1995 Aunque la esfingomielina es considerada como el receptor para las

hemolisinas en las anØmonas Bemheimer 1990 la diferencia en la composición lipfdica entre

los tipos de cØlulas rojas puede ofrecer una posible explicación para la variación en la sensibilidad

al extracto crudo Sin embargo un alto contenido de esfingomielina no explica por sf mismo la

Iisis selectiva del extracto crudo Rottini et al 1995 mencionan como hipótesis que existen

carbohidratos en los eritrocitos que representan el receptor del extracto crudo y que la

esfingomielina estÆ involucrada en la formación de poros en la membrana lo que permite la

liberación de la hemoglobina

Al analizar los resultados de los ensayos hemolíticos con eritrocitos de humano en otras

especies se encontró que la dosis para alcanzar el 50 de hemólisis con Chysaora quinquecirrha

fue de 70 lg ml de proteína y con Chironex fleckeri 0 1 Ilg ml mientras que en C marsupialis fue

de 100 Ilg ml de proteína Como se observa los valores obtenidos con distintas especies varían

principalmente debido a las tØcnicas utilizadas y a la inestabilidad de las hemolisinas presentes en

las muestras las cuÆles dependiendo de su composición son lÆbiles frente a ciertas condiciones

como lo han demostrado varios autores Longe Rowe Burnett 1994

De igual manera al realizar la descarga de los nematocistos directamente en los eritrocitos

no se observó ningœn efecto Es posible que el componente hemolítico exista sin embargo no se

detectó en las condiciones en que se realizó el experimento ya que por ejemplo en los

Hetereotricos microbÆsicos euriteles de otros cnidarios si se han encontrado efectos hemolíticos y

se cree que este tipo de nematocistos posee acción hemolítica en cualquier especie TambiØn

puede ser que los nematocistos por sí solos o algœn componente del tejido contenga una

sustancia hemolíticamente activa

42

9 CONCLUSIONES

Carybdea marsupialis es muy abundante en la Laguna arrecifal de Puerto Morelos QuintanaRoo durante los meses de junio a octubre Se sugiere capturarla manualmente por la parte dela umbrela para evitar la adhesión y ruptura de los tentÆculos

Carybdea marsupialis posee tres tipos de nematocistos Heterotricos microbÆsicos euritelesHolotricos isorrizas haploneme y Atricos isorrizas haplonemes los cuales son liberados en

respuesta a un depredador o para capturar alimento AdemÆs son causantes de afeccionescutÆneas en baflistas de la zona

De los 9 extractos crudos el que mostró una mayor actividad biológica fue el realizado con lasperlas de vidrio conteniendo amortiguador acetato de amonio e inhibidores de proteasas con

lo que un pH Æcido y la utilización de inhibidores de proteasas constituyen un buen medio paramantener la estabilidad de las toxinas

Con los tentÆculos liofilizados sin nematocistos no se obtuvieron indicios de actividad sin

embargo con los nematocistos descargados si se obtuvo actividad Esto sugiere queprobablemente existan componentes tóxicos fuera de los nematocistos que actœansinergísticamente con las toxinas liberadas de Østos y que pueden ser los causantes de latoxicidad total pero que en este caso no provienen de los tentÆculos

Todos los extractos con excepción del que contenía los tentÆculos sin nematocistos

produjeron la muerte en cangrejos de la especie Ocypode quadrata vía intramuscular y

peces de la especie Harengula humeralis vía intravenosa sin embargo no se prOdujo la

muerte de los peces de la especie Abudefduf saxatilis ni tampoco la de los nauplios deArtemia salina estos dos œltimos casos con la toxina disuelta en agua de mar

Probablemente la toxina necesita tener una acción inmediata lo que se logra víaintramuscular o íntravenosa o tambiØn puede deberse a que las toxinas de C marsupialis son

inestables frente a compuestos polares

La DLso en sardinas de la especie Harengula humeralis se obtuvo con un valor de 0 003 mgde proteína por g de animal con 6 22 horas de supervivencia mínima no determinÆndose lacausa de la muerte

En los ensayos hemolíticos se obtuvo el 100 de hemólisis a concentraciones bajas de losextractos con los eritrocitos de oveja por el contrario en eritrocitos de humano res y carnero

se utilizaron concentraciones mÆs elevadas Los extractos que mostraron una mayor actividadfueron aquellos en los que se utilizaron las perlas de vidrio y el homogeneizado con

inhibidores de proteasas incluidos en el amortiguador El hecho de que los eritrocitos de ovejafueran mÆs sensibles a la toxina se puede deber a que contienen una mayor cantidad de

esfingomielina que los otros tipos la cual puede estar involucrada en la formación de poros en

la membrana causando la liberación de la hemoglobina debido probablemente a la acción de

alguna fosfolipasa

43

10 BIBLIOGRAFíA

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ENSAYO HEMOLlTICO

Para el ensayo hemolltico se utilizaron eritrocitos de la siguiente manera

Solución Alsever para un litro

Agua desionizadaDextrosa anhidra

Citrato de sodio 2H20NaCIAcido cítrico anhidro

900 mI

21 0 98 0 94 2 90 4 9

Calibración de eritrocitos

Tomar 2 3 mI de sangre y agregarle 30 mi de solución de Alsever mezclar y almacenar a 40C

Centrifugar a 3 000 rpm por 5 min a temperatura ambiente 3500 rpm por 5 min en la SorvallEliminar el sobrenadante plasma y grasa y el paquete de cØlulas rojas se lavan 3 veces con 20

mi de Alsever frío

Desechar œltimo sobrenadante resuspender con Alsever frlo

Procedimiento Volœmen final 1 mI

Tratamiento Eritrocitos Solución HemólisisA 50 III de eritrocitos Alsever 950 111 0B 50 111 de eritrocitos Agua desionízada 950 111 100

Incubar a 370C por 30 mino

Centrifugar a 2 500 rpm 40C 4 min 1200 xgLeer a una absorbancia a 415 nm

Usar celdas de cuarzo y como blanco Alsever

Concentración final de eritrocitos 50 JI X 1 1 000 1 0 05 de eritrocitos

Procedimiento para la muestra Volumen final 1 mi

rratamiento Eritrocitos Solución Hem6llsisA 50 III de eritrocitos Alsever 950 1 11 0

Muestra 50 Jtl de eritrocitos Alsever 950 Jtl

B 50 j11 de eritrocitos Agua desionizada 950 JlI 100

Incubar a 370C por 30 minoCentrifugar a 2 500 rpm 40C 4 min 1 200 xgLeer a una absorbancia de 415 nm

Usar celdas de cuarzo y como blanco Alsever

la con ntración mÆxima de proteína 60 jlg yel volumen mÆxime 150 Ill