Broussonetia papyrifera en la Polinesia: Evaluación mediante AFLP de...
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UNIVERSIDAD DE CHILE. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Análisis de la variabilidad genética de ejemplares de la especie vegetal Broussonetia papyrifera en la Polinesia: Evaluación mediante AFLP de un nuevo trazador de rutas migratorias humanas. Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización en Toxicología y Diagnóstico Molecular, y Memoria para optar al Título Profesional de Bioquímico. Por Naria Factina Oyanedel Giaverini Directores de tesis: Dr. Sergio Lobos C. Dra. Daniela Seelenfreund H. Santiago, Chile 2010
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UNIVERSIDAD DE CHILE. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Análisis de la variabilidad genética de ejemplares de la especie vegetal Broussonetia papyrifera en
la Polinesia: Evaluación mediante AFLP de un nuevo trazador de rutas migratorias humanas.
Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización en Toxicología y Diagnóstico Molecular, y
Memoria para optar al Título Profesional de Bioquímico.
Por Naria Factina Oyanedel Giaverini
Directores de tesis:
Dr. Sergio Lobos C. Dra. Daniela Seelenfreund H.
Santiago, Chile 2010
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FINANCIAMIENTO.
Esta tesis se realizó en el Laboratorio de Bioquímica General del Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacéuticas de la Universidad de Chile, bajo la dirección del Dr. Sergio Lobos y la
Dra. Daniela Seelenfreund.
El trabajo de investigación aquí plasmado fue financiado por el proyecto
FONDECYT 1080061, titulado “Rapanui Origins: Genetic Analysis of a Culturally
Important Plant of Polynesia.”
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ÍNDICE GENERAL.
Página ÍNDICE GENERAL........................................................................................ ii
ÍNDICE DE FIGURAS................................................................................... v
ÍNDICE DE TABLAS..................................................................................... vii
ABREVIATURAS……................................................................................... viii
RESUMEN.................................................................................................... ix
ABSTRACT................................................................................................... xi
1. INTRODUCCIÓN................................................................................... 1 1.1. Asentamiento de las islas del Pacífico: Un hito importante en la
historia humana............................................................................... 1 1.2. Estudios genético-moleculares en la Polinesia y el Pacífico.......... 4 1.2.1. Trazadores de migración……………………..………………….. 4 1.3. Broussonetia papyrifera: Una nueva alternativa como trazador
de migraciones humanas................................................................ 6 1.4. Marcadores genético-moleculares.................................................. 8
1.4.1. Fingerprinting de ADN........................................................ 9 1.4.2. “Amplified Fragment Length Polymorphism”.......................... 10
1.5. Uso de AFLP para análisis filogenético.......................................... 12 1.6. Análisis filogenéticos……………………..………………………….... 13 1.6.1. Árboles Filogenéticos.............................................................. 13 1.6.2. Métodos de construcción de filogenias………………………... 14 1.6.2.1. Métodos de distancia................................................ 14 1.6.2.1.1. UPGMA...................................................... 14 1.6.2.1.2. NJ............................................................... 15 1.6.2.2. Métodos de caracteres............................................. 15 1.7. Hipótesis……………………..………………………………………….. 16 1.8. Objetivos Generales………..………………………………………….. 16 1.9. Objetivos Específicos..................................................................... 16
2. MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................. 17 2.1. Materiales........................................................................................ 17 2.1.1. Reactivos e insumos generales............................................... 17
2.2.2. Material biológico..................................................................... 18 2.2.3. Tampones y soluciones........................................................... 18
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2.2.4. Programas para análisis filogenético....................................... 19 2.2. Metodología..................................................................................... 19 2.2.1. Recolección de muestras foliares............................................ 19 2.2.2. Mantención de muestras foliares............................................. 19 2.2.3. Extracción de ADN genómico.................................................. 20 2.2.3.1. Análisis de integridad................................................ 21 2.2.3.2. Medición espectrofotométrica................................... 22 2.2.4. Método de AFLP...................................................................... 22 2.2.4.1. Digestión................................................................... 23 2.2.4.2. Ligación..................................................................... 24 2.2.4.3. Pre-amplificación....................................................... 25 2.2.4.4. Marcación con [γ-32P]ATP......................................... 25 2.2.4.5. Amplificación Selectiva.............................................. 26 2.2.4.6. Electroforesis en gel de acrilamida............................ 26 2.2.4.6.1. Preparación de Gel de poliacrilamida al
6% - Urea 7M.............................................. 27 2.2.4.6.2. Análisis electroforético................................ 27 2.2.4.6.3. Auto-radiografía.......................................... 28 2.2.5. Procesamiento de la información............................................. 28 2.2.5.1. Análisis Filogenético.................................................. 28
3. RESULTADOS........................................................................................ 29 3.1. Recolección de muestras foliares.................................................... 29 3.2. Extracción de ADN........................................................................... 31 3.2.1. Estandarización de protocolo................................................... 31 3.2.2. Integridad de ADNg de muestras foliares………………………. 32 3.2.3. Medición espectrofotométrica……………………..…………….. 34 3.2.4. Control de digestión……………………..………………………… 36 3.3. AFLP................................................................................................ 38 3.3.1. Prueba de combinaciones de partidores……………………….. 38 3.3.2. Ejecución protocolo de AFLP en muestras.............................. 39 3.3.4. Reproducibilidad de los ensayos de AFLP.............................. 41
3.3.5. Análisis patrón de bandeo……………………..……………….... 43 3.4. Análisis Filogenético........................................................................ 43 3.4.1. Análisis de Neighbor Joining.................................................... 43 3.4.2. Análisis bayesiano……………………..………………………….. 47
4. DISCUSIONES Y PROYECCIONES...................................................... 48
5. CONCLUSIONES................................................................................... 56
iv
6. REFERENCIAS……………………..……………………..…………………. 58
7. ANEXOS……………………..……………………..…………………………. 65
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ÍNDICE DE FIGURAS.
Página Figura 1. Mapa de las principales etapas propuestas para la migración
humana en el Océano Pacífico....................................................... 3 Figura 2. Esquema general del procedimiento AFLP-PCR........................... 23 Figura 3. Esquema de digestión de ADN genómico …………………………... 24 Figura 4. Esquema de ligación con adaptadores de EcoRI y MseI............... 24
Figura 5. Esquema de amplificación preselectiva de ADN templado............ 25 Figura 6. Esquema de la etapa de amplificación selectiva............................ 26 Figura 7. Mapa de las Islas muestreadas en el Océano Pacífico.................. 29 Figura 8. Extracción de ácidos nucleicos de B. papyrifera a dos escalas distintas ........................................................................................... 31 Figura 9. Comparación de extracción de ADN genómico de hojas de B. papyrifera almacenadas a -20°C y en etanol absoluto.......... ..... 32
Figura 10. ADN genómico de hojas de B. papyrifera de Taiwán.................... 33
Figura 11. ADN genómico de hojas de B. papyrifera…………………………... 34 Figura 12. Control de Digestión de ADNg de B. papyrifera……………………. 37 Figura 13. Autorradiografías de AFLP de muestras de B. papyrifera de diferentes localidades…………………….…………………….…….. 41 Figura 14. Perfiles de AFLP para réplicas biológicas..................................... 42 Figura 15. Árbol de NJ consenso para B. papyrifera basado en distancias de Dice…………………….…………………….……..……….………. 45 Figura 16. Árbol de NJ consenso para B. papyrifera basado en distancias de Jaccard……………….…………………….……..……….………... 46
vi
Figura 17. Árbol de NJ consenso para B. papyrifera basado en modelo de Jukes-Cantor (JC)...................................................................... 66
vii
ÍNDICE DE TABLAS.
Página Tabla I. Muestras foliares recolectadas........................................................... 30 Tabla II. ADNg de muestras polinésicas de B. papyrifera............................... 33 Tabla III. Análisis espectrofotométrico de ADNg............................................. 35
Tabla IV. Combinaciones de partidores para AFLP ensayadas con ADNg de B. papyrifera……………….……..……….………...……………….…… 38 Tabla V. Listado de muestras y las combinaciones de partidores utilizadas.. 40 Tabla VI. Cuantificación de bandas mono y polimórficas del perfil de AFLP
de ADNg de B. papyrifera............................................. .................... 43 Tabla VII. Listado de muestras recolectadas................................................... 64
viii
ABREVIATURAS.
A260nm : Absorbancia medida a 260 nanómetros. A280nm : Absorbancia medida a 280 nanómetros. ADN : Ácido Desoxirribonucleico. ADNa : ADN antiguo. ADNg : ADN genómico. ADNmt : ADN mitocondrial. ADNr : ADN ribosomal. AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphisms. Aprox. : Aproximadamente. Arch : Archipiélago. ARN : Ácido Ribonucleico. Epp : Eppendorf Flc : Falcon HWE : Hardy-Weinberg Equilibrium. ISSR : Inter Simple Sequence Repeats. kb : kilobases. ML : Maximum Likelihood. mm : milimetro. NJ : Neighbor Joining. pb : pares de bases. PCR : Polymerase Chain Reaction. PSA : Persulfato de amonio. RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA. RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism. rpm : Revoluciones por minuto. Sp. : Especie. Stgo : Santiago. SSR : Simple Sequence Repeats. St : Estándar. TEMED : N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina. UPGMA : Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean.
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RESUMEN.
“Variabilidad genética de ejemplares de la especie v egetal Broussonetia
papyrifera: Evaluación mediante AFLP de un nuevo trazador de rutas migratorias
humanas en la Polinesia ”
Esta tesis se enmarca en un proyecto de investigación cuyo objetivo es
investigar el poblamiento humano de la Polinesia utilizando marcadores genéticos, con
énfasis en la colonización de Isla de Pascua. Los estudios de variación genética en
poblaciones humanas modernas presentan diversos inconvenientes para dilucidar los
primeros asentamientos humanos y las posteriores migraciones históricas. Por ello,
para el estudio de las migraciones humanas en el Pacífico se ha utilizado el análisis de
algunas especies estrechamente asociadas a los humanos que sirven como reflejo de
sus movimientos colonizadores. En consecuencia, se ha postulado que identificando
las relaciones genéticas (filogenia) de estas especies trazadoras, se podría dilucidar
las vías de los navegantes que las transportaban. Existen estudios que avalan el uso
de trazadores de las migraciones prehistóricas mediante técnicas genético-
moleculares. Una de las especies introducidas a las islas del Pacífico desde el sudeste
asiático es Broussonetia papyrifera, que fue llevada desde Asia hacia el este a toda la
Polinesia y aún se cultiva abundantemente en muchas islas de Oceanía, incluyendo la
Isla de Pascua.
En este estudio se evaluó la utilidad de B. papyrifera como un nuevo trazador de
migraciones en el Pacífico analizando la variabilidad genética de muestras foliares de
esta especie provenientes de la Polinesia mediante AFLP (“Amplified Fragment Length
Polymorphisms”). AFLP fue la herramienta de elección debido a su alta capacidad de
detectar variabilidad genética, porque no requiere conocimiento previo de la secuencia
nucleotídica y permite una rápida generación de datos.
Los resultados obtenidos mediante AFLP muestran que esta técnica es capaz de
detectar variabilidad genética entre muestras de B. papyrifera de distintas localidades
e islas, pese al corto periodo de tiempo transcurrido. El análisis filogenético permite
x
visualizar una clara distinción entre la muestra de B. papyrifera de Taiwán y las de la
Polinesia, existiendo una tendencia al agrupamiento de gran parte de las muestras
analizadas según regiones insulares.
Se concluye que B. papyrifera presenta una variabilidad genética detectable
mediante AFLP, por lo cual esta especie podría utilizarse como trazador de
migraciones. No obstante, no se logró establecer relaciones de parentesco con un
apoyo estadístico fuerte. Este es un primer acercamiento para resolver esta
interrogante, por lo que es necesario profundizar en estos estudios para esclarecer las
posibles rutas migratorias humanas en el Pacífico.
xi
ABSTRACT.
“Genetic variability of plant specimens of Broussonetia papyrifera:
Assessment of a new tracer of human migrations in P olynesia using AFLP”
This thesis is part of a research project, related to the human settlement in
Polynesia using genetic markers, with emphasis on the colonization of Easter Island.
Studies about genetic variability in modern human populations have several
disadvantages in establishing the origin of the first settlers and later historical
migrations. Therefore, researchers have used some closely related species to humans
for the study of migrations in the Pacific, because these species can serve as a mirror
of the colonizers’ movements. Accordingly, it has been proposed that the identification
of genetic relationships (phylogeny) of these proxy species could elucidate the routes
of the sailors who transported them. Several studies endorse the use of prehistoric
migration tracers through genetic techniques. One species introduced to the Pacific
islands from Southeast Asia is Broussonetia papyrifera, which was carried from Asia to
all Polynesia and is still grown amply on many Pacific islands, including Easter Island.
In this study we evaluated the usefulness of B. papyrifera as a new migration
tracer in the Pacific by analyzing the genetic variability of leaf samples collected in
Polynesia using AFLP (“Amplified Fragment Length Polymorphisms”). AFLP was the
tool of choice due to its high ability to detect genetic variability, because it requires no
prior knowledge of nucleotide sequences and allows rapid data generation.
The results obtained by AFLP show that this technique can detect genetic
variability between samples of B. papyrifera from different localities and islands,
despite the short period of time. The phylogenetic analysis allowed to visualize a clear
distinction between the sample of B. papyrifera in Taiwan and those of Polynesia, as
well as a tendency to grouping of most of the samples analyzed by islands.
We conclude that B. papyrifera presents intra-species genetic variability
detectable by AFLP, so this plant can be used as a migration tracer. Nevertheless, it
was not possible to establish kinship with strong statistical support. This is a first
xii
approach to resolve this question, so it will be necessary to deepen on these studies to
clarify the possible colonization routes of the first settlers of Easter Island and
contribute to the knowledge on prehistoric migrations in the Pacific.
1
1. INTRODUCCIÓN.
El análisis de la diversidad genética y la relación inter o intra especies,
poblaciones e individuos es una tarea central para varias disciplinas en ciencias
biológicas [Weising y cols., 1995]. Los llamados “marcadores genético moleculares”
son alelos útiles para trazar las características genéticas de un individuo, como
también de un gen o tejido [Freeman, 1999]. Debido a sus propiedades son una
herramienta poderosa para estudiar la estructura de la variabilidad genética en una
especie y trazar su historia evolutiva [Grivet y Noyer, 1999]. Así, su desarrollo ha
facilitado, en gran medida, la investigación en diversas disciplinas como taxonomía,
filogenia, ecología, genética [Weising y cols., 1995], agronomía (diferenciación de
cultivares de importancia económica y domesticación de especies), antropología
(migraciones) y arqueología (origen de la especie humana) [Templeton, 2007; Matisoo-
Smith y cols., 2008].
En la presente tesis se utilizó un marcador genético como herramienta para
dilucidar una interrogante referente a las migraciones humanas en el Pacífico.
1.1. ASENTAMIENTO DE LAS ISLAS DEL PACÍFICO: UN HIT O IMPORTANTE EN
LA HISTORIA HUMANA.
El poblamiento humano de las islas del Pacífico y Oceanía representa el último
evento mayor de colonización humana, pues esta travesía abarca una enorme
distancia que cubre un tercio de la superficie de la tierra. Geográficamente, Oceanía
se compone de dos regiones, una Oeste, llamada Oceanía Cercana (Nueva Guinea,
las islas del archipiélago de Bismark y la mayoría de las islas Solomon), y una Este,
llamada Oceanía Lejana (región al este de las islas Solomon) (ver figura 1).
La historia de la colonización de Oceanía, previa al contacto europeo, puede ser
caracterizada por dos eventos principales de expansión humana. El primero
representa a movimientos tempranos desde África hacia Sahul (territorio de Nueva
Guinea y Australia), alrededor de 50.000 a 40.000 años atrás. El segundo evento fue
2
mucho más tardío y llegó hasta la Oceanía Lejana. Algunos sectores de Oceanía
Cercana habrían recibido esta segunda oleada de expansión durante el Neolítico, que
comenzó hace aproximadamente 5.500 años en Taiwán por grupos de individuos que
hablaban lenguajes austronesianos. Esta expansión llegó hace aproximadamente
3.400 a 3.500 años al Archipiélago de Bismarck, lugar donde se habrían desarrollado
los elementos característicos del complejo cultural Lapita, incluyendo la cerámica
decorada distintiva, también como el lenguaje Proto-oceánico. Los elementos de la
cultura Lapita fueron más ampliamente distribuidos hacia el este, a la Polinesia Oeste.
Esta ola de migración, por primera vez en la historia humana, cruzó el borde
biogeográfico entre Oceanía Lejana y Cercana hace unos 3.200 años [Kayser, 2010].
Una de las estrategias de expansión de la gente Lapita fue reproducir su cultura a
donde iban e introdujeron una gama de animales y plantas domesticadas a las islas
colonizadas. Una de las plantas introducidas a las islas del Pacífico desde el sudeste
asiático, y transportada por los lapitas y los polinésicos, fue la morera de papel [Yen,
1991].
El asentamiento de la Polinesia representa la etapa final del poblamiento de las
islas del Pacífico, comenzando hace aproximadamente 2.500 años con dispersiones
hacia el este de Tonga y Samoa [Kirch, 2002]. Los modelos planteados para el
descubrimiento y la subsiguiente colonización del Pacífico Este por los polinésicos,
concuerdan en que los archipiélagos polinésicos del este, tales como Islas Cook, Islas
Sociedad e Islas Marquesas, fueron los primeros en colonizarse hace unos 1700 años
atrás [Rolett, 1998]. Posteriormente se poblaron las islas de Hawaii e Isla de Pascua,
hace 1.200 años, y, finalmente, Nueva Zelanda, aprox. 1.000 años atrás [Kirch, 2002].
En el contexto del asentamiento humano del Pacífico, a nosotros nos interesa
abordar el poblamiento de la Isla de Pascua o Rapa Nui, cuyos orígenes polinésicos
fueron confirmados mediante el uso de ADN mitocondrial (ADNmt) de hueso humano
[Hagelberg y cols., 1994 y 1999; Hagelberg, 1998]. Diversos estudios proponen
distintos modelos migratorios humanos en el Pacífico Este para dilucidar las rutas de
los grupos fundadores de las poblaciones insulares actuales, incluyendo a la isla de
Pascua. Varios arqueólogos consideran a las islas Marquesas como el punto de
dispersión inicial para la colonización de las islas del Pacífico Este, incluyendo a
3
Nueva Zelanda [Green, 1998 y 2000; Irwin, 1989 y 1992; Kirch, 2002; Van Tilburg,
1994]. Para Isla de Pascua se planteó originalmente un poblamiento directo desde las
Marquesas [Sinoto, 1970; Suggs, 1960], existiendo también modelos alternativos. Los
más recientes postulan que el poblamiento de Isla de Pascua, si bien se origina en el
grupo de las Islas Marquesas, toma una ruta indirecta a través del archipiélago de las
Tuamotus y las islas Gambier (Mangareva) hacia Isla de Pascua [Finney, 2001, Green
y Weisler., 2002].
Figura 1. Mapa de las principales etapas propuestas para la migración humana en el Océano Pacífico. Se esquematiza mediante flechas los movimientos migratorios entre las islas del Pacífico y su estimación en años. Las cifras entre paréntesis reflejan mayor incerteza en las últimas oleadas de colonización. Las flechas con las líneas entrecortadas representan las dos rutas alternativas principales planteadas para el poblamiento de la Isla de Pascua.
Los modelos mencionados se basan en estrategias tradicionales (lingüísticas,
bio-antropológicas y arqueológicas), con las cuales se han realizado diversos estudios
con el fin de dilucidar las rutas migratorias humanas. Sin embargo, últimamente los
investigadores han recurrido a nuevas herramientas, como son las de análisis con
marcadores genético-moleculares, que ayudan a trazar estos movimientos
poblacionales.
??
Hawaii
4
1.2. ESTUDIOS GENÉTICO-MOLECULARES EN LA POLINESIA Y EL PACÍFICO.
Los estudios de variación genética en poblaciones humanas modernas de la Isla
de Pascua, y de otras islas polinésicas, presentan inconvenientes para dilucidar las
migraciones históricas y más aún los primeros asentamientos, debido a la mezcla de la
población actual, la severa despoblación por enfermedades en tiempos históricos y
traslados forzosos post contacto con los europeos [McCall, 1996], por lo que ya no
representarían a la genética de los habitantes fundadores. Por otra parte, el análisis de
ADN antiguo (ADNa) humano presenta limitaciones técnicas y es un tema sensible
culturalmente, siendo necesario buscar nuevas estrategias de análisis.
1.2.1. Trazadores de migración.
Para el estudio de las migraciones humanas en el Pacífico Oeste (incluyendo
Polinesia Oeste) se ha utilizado el análisis de especies estrechamente asociadas a los
humanos, tales como plantas y animales, que los colonizadores polinésicos llevaban
consigo. La dispersión de muchas de estas especies era dependiente del ser humano,
sirviendo su variación genética como un reflejo de la humana y de sus interacciones
[Storey y cols., 2007]. Los viajes de colonización eran empresas complejas y
organizadas, en las cuales se trasladaban todas las especies necesarias para el
asentamiento exitoso del grupo [Kirch, 2002]. En consecuencia, se ha postulado que
identificando las relaciones genéticas (filogenia) de estas especies se podría dilucidar
las vías de los navegantes que las transportaban.
Se han realizado estudios en animales (perros, cerdos y pollos) y plantas tales
como calabaza, taro y camote. Por ejemplo, se ha analizado ADNmt de perro (Canis
familiaris) para determinar el origen este-asiático del Dingo australiano [Savolainen y
cols., 2004]. Por otro lado, se ha analizado ADNa y ADNmt de hueso de pollo (Gallus
gallus) para determinar la existencia de un vínculo entre los pollos americanos y
polinésicos [Storey y cols., 2007].
En relación al empleo de especies transportadas por el hombre como
marcadores de las rutas exploradas por los antiguos colonizadores de la Polinesia, se
ha analizado ADNmt de rata polinésica (Rattus exulans) y cerdo (Sus sp.). Estos
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estudios centrados en Oceanía Lejana y Cercana han demostrado que dichas
especies pueden ser excelentes trazadores de las migraciones de los polinésicos
prehistóricos. [Matisoo-Smith y cols., 1998; Matisoo-Smith y Robins, 2004; Larson y
cols., 2007].
También, se han aplicado marcadores de ADN para el estudio de la dispersión
de especies vegetales [Hagen y cols., 2001; Datwyler y Weiblen, 2006]. Por ejemplo,
se ha publicado un estudio de ADNa de calabaza (Lagenaria siceraria) para
determinar el origen asiático de la calabaza americana [Erickson y cols., 2005].
Asimismo, se ha estudiado la dispersión de la calabaza dentro de América [Sanjour,
2002] y desde América hacia el Pacífico utilizando distintas técnicas de marcadores
moleculares [Clarke y cols., 2006].
El grado de variación observado en animales estrechamente relacionados con
las poblaciones polinésicas no ha sido suficiente para determinar el origen específico
de la población de las islas del Pacífico Este, incluyendo a la Isla de Pascua [Barnes y
cols., 2006]. Debido a que cada especie posee una historia diferente, con un origen y
camino distintivos, se podría lograr una visión más completa utilizando un mayor
número de especies.
Se ha analizado la variación genética que presenta el camote (lpomoea batatas),
originario de América [Rossel y cols., 1999-2000], la cual se atribuyó a mecanismos
naturales independientes del hombre. Este análisis se realizó mediante AFLP,
demostrándose que, independientemente del mecanismo de dispersión, este método
es capaz de discriminar entre las variantes genéticas de esta especie.
Nosotros proponemos utilizar una nueva especie vegetal como trazador de la
migración humana en la Polinesia, con el fin de dilucidar el posible origen de los
colonizadores de la Isla de Pascua: Broussonetia papyrifera . Esta especie fue una
de las plantas transportadas por los colonizadores polinésicos debido a su alto valor
cultural, que aún persiste en algunas islas [Métraux, 1971; Bataille-Benguigui, 1997].
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1.3. BROUSSONETIA PAPYRIFERA: UNA NUEVA ALTERNATIV A COMO
TRAZADOR DE MIGRACIONES HUMANAS.
La especie Broussonetia papyrifera fue denominada en 1753 como Morus
papyrifera por Linnaeus, año en que este autor estableció, por primera vez, la
clasificación del género Morus. No obstante, desde ese año ha ido variando el número
de especies pertenecientes a este género, siendo reclasificadas dos de ellas: Morus
tinctoria y Morus papyrifera. Esta última recibió su nombre actual en 1799 por Ventenat
en honor a Pierre Broussonet, un biólogo francés.
B. papyrifera (L.) Vent está clasificada como parte de la división de las
Magnoliophytas, clase Magnoliopsida (dicotiledóneas) y pertenece a la subclase
Hamamelidae que comprende 11 órdenes, 24 familias y 3400 especies. El orden al
cual corresponde es el de los Urticales que incluye a la amplia familia de las
Moráceas, con 52 géneros, entre los que se incluyen Ficus, Morus y Artocarpus, y
comprendiendo en total a 1400 especies. Esta familia se distribuye, principalmente, en
regiones tropicales y sub-tropicales, y, en menor medida, en regiones templadas
[Mauseth, 1991; Sharma, 1993]. El género Broussonetia incluye a 28 especies y
actualmente se distinguen 9 sub-especies y/o variedades de B. papyrifera.
[BayScience Foundation online].
Este pequeño árbol se puede multiplicar por semillas, vástagos y esquejes. Esta
planta, nativa de Japón, sur de China y Taiwán, se introdujo antiguamente a través del
Pacífico hasta Hawái por el este y se cultivó abundantemente en todas las islas altas
de la Polinesia y Melanesia [Matthews, 1996; Whistler y Elevitch, 2006]. Es una de las
fuentes más importantes de fibra textil vegetal en Polinesia y Melanesia, constituyendo
la materia prima para la fabricación de “tapa”, un tipo de textil preparado a partir de su
corteza y uno de los materiales más importantes en la Polinesia antigua por su valor
ritual y económico. En Rapa Nui se conoce como mahute y se usaba en la antigüedad,
tal como en otras islas de la Polinesia, para la elaboración de capas, faldas,
taparrabos y regalos ceremoniales [Métraux, 1971]. Hoy en día en Samoa, Tonga y
otras islas aún se usa para propósitos religiosos y como símbolo de riqueza y poder
[Douaire-Marsaudon, 1997].
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Existen plantas femeninas y masculinas (unisexuales) de morera de papel, sin
embargo, en la literatura se señala la existencia de sólo clones masculinos en el
Pacífico [Whistler y Elevitch, 2006]. No obstante, se han observado ejemplares con
frutos en la Isla de Pascua [observación personal A. Seelenfreund], pero se desconoce
si son fértiles. En el contexto polinésico, la morera de papel se propaga en forma
vegetativa, al igual que muchos otros cultivos, y, además, no alcanza su madurez
sexual debido a que es cortada periódicamente a partir de una etapa temprana de su
desarrollo [Florence, 1997]. De esta manera, la ausencia de la dispersión de esta
planta mediante semillas [Whistler y Elevitch, 2006] y su uso cultural, que persiste
hasta nuestros días, son argumentos a favor del empleo de esta especie como reflejo
de la dispersión humana.
B. papyrifera es nativa de climas templados pero presenta una amplia tolerancia
ecológica, lo que le permite adaptarse a cualquier tipo de suelo, de preferencia
volcánico [Whistler y Elevitch, 2006]. Su corteza es la materia prima, tanto para
textiles, como para papel, por lo cual se le ha llamado morera de papel (“paper
mulberry”) [Cothran, 2003]. Esta corteza también se utiliza en medicina tradicional
asiática para diuresis, el alivio de edema y tos. Por otro lado, los extractos han
mostrado actividad antifúngica [Kim y cols., 1994] y antioxidante [Cheng y cols., 2001],
entre otras. Además, se han aislados varios tipos de flavonoides de esta planta [Fang
y cols., 1995; Fukai y cols., 1986; Lee y cols., 2001].
El genoma de B. papyrifera no ha sido secuenciado y se han publicado pocos
estudios de su genética. Uno de estos señala que posee un cariotipo 2n con 26
cromosomas. El par de cromosomas más largo mide alrededor de 2,1-2,2 µm de largo
y el resto entre 0,7 y 1,7 µm. Se observan secuencias satélites en las regiones distales
de los brazos cortos en los cromosomas 13 y 14 y, además, existen constricciones
pequeñas en las regiones distales de los brazos largos de los 2 cromosomas más
grandes [Oginuma y Tobe, 1995]. Hasta el momento existen dos estudios sobre su
diversidad genética, uno es de acerca de la relación existente entre su estructura
genética y su distribución geográfica [Ho y Chang, 2006] y el otro pertenece a nuestro
grupo de investigación [Piña y cols., 2010].
8
Existe solamente un estudio de la secuencia ITS que incluye a B. papyrifera,
pero no con el propósito de estudiar sus variedades, sino como “outgroup” para el
género Morus, [Zhao y cols., 2005a]. Distinto es el panorama para el género Morus,
también perteneciente a la familia Moraceae, para el cual se encuentran variados
estudios de marcadores genético-moleculares en la literatura. Esto se debe al interés
que existe en especies de este género, ya que sus hojas son el alimento del gusano
de seda (Bombyx mori) [Sharma y cols., 2000]. Los marcadores que han sido
utilizados son RAPD [Zhao y Pan, 2004; Awasthi y cols., 2004], AFLP [Sharma y cols.,
2000; Yang y cols., 2003], SSR [Zhao y Pan, 2004] e “Internal Transcribed Spacer”
(ITS) del ADN ribosomal (ADNr) [Zhao y cols., 2005b]. Estos estudios demuestran que
las técnicas de AFLP, microsatélites y amplificación de ITS son de utilidad para
diferenciar entre distintas especies pertenecientes al género Morus.
1.4. MARCADORES GENÉTICO-MOLECULARES.
Cada secuencia de ADN es única y propia de un individuo, siendo esta
información útil para estudios de diversidad genética y de relaciones entre organismos
[Weising y cols., 1995]. Los marcadores genéticos nos permiten observar los
polimorfismos de una secuencia de ADN en un cierto número de sitios o loci a través
del genoma. Los polimorfismos genéticos, definidos como la ocurrencia simultánea de
genomas en una población de individuos que muestran variaciones en una posición
específica dada [Lewin, 2004], son producto de modificaciones en las secuencias, bajo
la acción de factores endógenos y exógenos [Grivet y Noyer, 1999].
Existen distintos tipos de marcadores genético moleculares, de los cuales se
obtiene información de diferente naturaleza. Las dos categorías principales son: 1)
Marcadores codominantes (por ejemplo, microsatélites), que revelan las múltiples
variantes de un alelo (multi-alelo), pero analizan sólo un locus, y 2) Marcadores
dominantes [por ejemplo, AFLP (“Amplified Fragment Length Polymorphisms”)], que
permiten la detección de la presencia o ausencia de un alelo por cada locus, pero
simultáneamente para un gran número de loci (multi-locus) [Grivet y Noyer, 1999].
9
Estos multi-locus detectados son, individualmente, menos informativos, sin embargo,
los sistemas de marcadores dominantes alcanzan su poder estadístico al presentar
numerosos loci di-alélicos del genoma entero [Campbell y cols., 2003]. Así, una
técnica de marcadores dominantes puede llegar a superar a una de marcadores
codominantes en la discriminación de taxa y poblaciones. Esto se ha demostrado en
estudios que han comparado el análisis mediante AFLP (marcadores dominantes) con
el de microsatélites (marcadores codominantes) [Woodhead y cols., 2005; Campbell y
cols., 2003].
Para estudios a nivel de género y superior (como familia u orden), están
disponibles en el genoma nuclear y de plastidios un amplio rango de secuencias. Sin
embargo, para estudios entre géneros o especies cercanamente relacionados, las
secuencias a menudo no muestran una variación suficiente. A estos niveles menores,
los fragmentos de restricción podrían ser marcadores filogenéticos adecuados
[Koopman, 2005].
1.4.1. Fingerprinting de ADN.
El término “fingerprinting” de ADN fue introducido originalmente por Jeffrey y
cols. (1985) para describir un método de detección simultánea de varios loci de ADN
altamente variables, los cuales generan patrones tipo “código de barra”. Estos
fragmentos son generados con enzimas de restricción y se hibridan con una sonda.
Posteriormente, surgieron diversas técnicas de detección de polimorfismos de ADN
mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), ampliándose el concepto de
fingerprinting [Weising y cols., 1995]. Los factores que determinarán cuál sistema es el
más apropiado y que se deben considerar al momento de preferir una de éstas
técnicas, se pueden clasificar en tres categorías según Meudt y Clarke (2007):
� Biológica: Se refiere a aspectos como el grado de variabilidad genética, la
amplitud taxonómica (intra o inter-específica) y tamaño del genoma.
� Pregunta de la investigación: Concierne a la aplicación que se le dará a la
técnica y a aspectos prácticos como costos y disponibilidad de equipos.
� Recursos disponibles: En cuanto a calidad y cantidad de muestra, recursos
genéticos previamente establecidos y logística.
10
Los marcadores de fingerprinting más comúnmente usados son RFLPs
(“Restriction Fragment Length Polymorphism”), RAPDs (“Random Amplified
Polymorphic DNA”), Microsatélites o SSRs (“Simple Sequence Repeats”), ISSRs
(“Inter Simple Sequence Repeats”) y AFLPs (“Amplified Fragment Length
Polymorphisms”). Son de carácter dominante RAPDs, ISSR y AFLP, y de carácter
codominante RFLPs y SSR [Meudt y Clarke, 2007].
Las técnicas principales de fingerprinting genómico multi-locus son AFLP,
RAPDs e ISSR. Todas éstas se basan en la PCR, usando partidores para amplificar
fragmentos de ADN que no necesariamente se han sido caracterizados previamente,
por tanto, se pueden usar en organismos en los que no hay conocimiento de su
genoma [Schlötterer, 2004]. Los tres sistemas mencionados difieren en cuanto a la
calidad de sus datos, variabilidad genética y poder discriminatorio, siendo, en muchos
estudios, superior la técnica de AFLP, por su alta reproducibilidad, robustez,
informatividad y menores artefactos de reacción reportados [Bussell y cols., 2005;
Archak y cols., 2003; Savelkoul y cols., 1999].
1.4.2. “ Amplified Fragment Length Polymorphism ”.
La técnica de AFLP es una herramienta muy efectiva para estudiar polimorfismos
y, en un principio, se desarrolló para evidenciar las diferencias entre cultivares de
especies de plantas [Vos, 1995]. También se ha utilizado para analizar polimorfismos
genéticos de hongos [Semblat y cols., 1998], corales [Mueller y cols., 1996], insectos
[Corsini y cols., 1999], nemátodos [Roos y cols., 1998], peces [Liu y cols., 1998] y
mamíferos [Schreiner y cols., 1996].
Los marcadores que genera AFLP, aunque a menudo se encuentren
concentrados en regiones centroméricas, están ampliamente distribuidos a través del
genoma, permitiendo una apreciación de su variación. Son marcadores anónimos y
consisten, principalmente, de ADN no codificante. El origen predominantemente
nuclear de los marcadores generados mediante AFLPs es una ventaja, porque los
marcadores derivados de genomas organelares heredados uniparentalmente (ADN de
cloroplasto y mitocondrial) podrían presentar una variabilidad insuficiente,
11
particularmente en plantas, donde son importantes algunos procesos como por
ejemplo la hibridación [Meudt y Clarke, 2007].
El método está basado en una amplificación selectiva de fragmentos resultantes
de la digestión exhaustiva de ADN genómico (ADNg), y consta de 3 etapas:
1) Digestión del ADN con enzimas de restricción y ligación de adaptadores.
2) Amplificación selectiva de los fragmentos de restricción.
3) Separación y análisis de fragmentos amplificados mediante electroforesis o
cromatografía.
Mediante el uso de partidores genéricos se puede lograr la amplificación de gran
número de fragmentos de restricción a la vez, que se visualizan como bandas o picos
[Vos y cols., 1995]. Las bandas o picos obtenidos corresponden a alelos dominantes,
ya que los individuos homocigóticos que presentan la banda no se pueden distinguir
de los heterocigotos. Así, para cada locus, la ausencia de la banda probablemente
corresponde a un set heterogéneo de secuencias [Grivet y Noyer, 1999]. La
selectividad se puede aumentar agregando nucleótidos específicos a los partidores en
su extremo 3’, pues sólo se amplificarán los fragmentos de restricción cuyos
nucleótidos que flanquean el sitio de restricción sean complementarios. Para genomas
de gran tamaño, tales como los de plantas, se desarrolla un protocolo de amplificación
de dos etapas utilizando una segunda reacción de PCR con un mayor número de
nucleótidos selectivos para ambos partidores (ver figura 2) [Vos y cols., 1995].
El método de AFLP ha sido una herramienta útil para múltiples aplicaciones en
las que se desconoce la secuencia nucleotídica, tales como el mapeo de la
variabilidad genética [Vos y cols., 1995; Eriksen y Topel, 2006], migración de especies
[Skrede, 2006] y análisis filo- o bio-geográficos [Eriksen y Topel, 2006].
La técnica de AFLP puede ser la más indicada en distintas situaciones [Meudt y
Clarke, 2007]:
� Cuando no existe información a priori de la secuencia.
� Para estudios a nivel intra-específico.
� Cuando la variabilidad genética es baja.
� Para la rápida generación de datos.
� Cuando se dispone de alta calidad de ADN.
12
� Cuando no se han establecido marcadores adecuados.
Con los antecedentes recopilados sobre marcadores genético-moleculares
planteamos realizar estudios mediante AFLP en B. papyrifera.
1.5. USO DE AFLP PARA ANÁLISIS FILOGENÉTICO.
La mayoría de los métodos de análisis para marcadores multi-locus dominante
se pueden separar en dos grupos principales [Hollingsworth y Ennos, 2004; Robinson
y Harris, 1999], que corresponden a los basados en poblaciones y los basados en
individuos. El primero implica la comparación de frecuencias alélicas, sin embargo una
complejidad del sistema consiste en que la presencia de la banda puede indicar la
condición homocigótica o la heterocigótica. Por tanto, se puede determinar la
frecuencia del alelo “nulo” (ausencia de banda) si se asume el equilibrio de Hardy-
Weinberg (HWE). No obstante, no siempre se puede asumir este equilibrio como por
ejemplo en el caso plantas auto-fertilizadas, para lo cual existen otros métodos que no
asumen este equilibrio. El segundo grupo de métodos, evalúa relaciones genéticas
entre individuos [Meudt y Clarke, 2007]. Numerosos estudios indican que AFLP se
puede utilizar en reconstrucción filogenética, particularmente para grupos de
organismos cercanamente relacionados [Bussell y cols., 2005; Koopman, 2005].
En los últimos años se han publicado diversos estudios filogenéticos inter e intra-
específicos de plantas [Schönswetter y cols., 2004; Rossel y cols., 1999 y 2000] y de
otros organismos [Savelkoul y cols., 1999]. Esto se debe a que los marcadores de
AFLP son muestreados a través de genoma y podrían revelar diferencias genéticas
poco frecuentes en grupos con baja variación de secuencia [Mendelson y Shaw,
2005].
El principal problema de todos los análisis de construcción de árboles es la
homoplasia, término que engloba a distintos fenómenos (reversión, convergencia y
paralelismo) que conducen a la existencia de caracteres comunes entre taxa, que no
fueron heredados de un ancestro común [Hall, 2001]. No obstante, esta situación no
13
es exclusiva para los datos de AFLP dado que los análisis de datos de secuencia de
ADN también son afectados por fenómenos de homoplasia [Meudt y Clarke, 2007].
1.6. ANÁLISIS FILOGENÉTICO.
La filogenia es una rama de la biología que estudia las relaciones de parentesco
existentes entre los distintos grupos de seres vivos. Esta historia evolutiva se puede
representar gráficamente mediante los llamados árboles filogenéticos.
1.6.1. Árboles filogenéticos.
Tradicionalmente, los árboles filogenéticos corresponden a representaciones de
las relaciones históricas de grupos (taxa) de organismos o especies. Hasta hace unas
tres décadas atrás, estas relaciones se basaban solamente en datos de caracteres
morfológicos de taxa existentes y registros fósiles. Hoy en día, debido al acceso a
métodos de secuenciamiento, también se realizan estudios de filogenia en base a
secuencias nucleotídicas.
Un árbol está compuesto por líneas llamadas ramas que se intersectan y forman
los nodos. Se le llama distancia al número de sustituciones de aminoácidos o ácidos
nucleicos que han tomado lugar a través de una rama. Los nodos en las puntas de las
ramas (nodos externos) representan el taxa (o secuencias) que ha sido analizado y los
nodos internos al taxa ancestral. Todos los descendientes de un ancestro común
pertenecen al mismo clado o nodo monofilético [Hall, 2001].
De esta manera obtenemos un sentido de la topología del árbol, el orden en el
cual las distintas secuencias divergen, pero no de cuán fiable son estas agrupaciones.
Por lo general es importante obtener un estimado estadístico de la fiabilidad de
algunos grupos. En esencia, la fiabilidad se mide como la probabilidad de que los
miembros de un clado dado son siempre los miembros de ese clado. Los filogenetistas
usan un método de muestreo llamado “bootstrapping” para estimar la fiabilidad del
árbol, el cual seudorepite los datos entre 100 a 1000 veces. Así, se considera
14
altamente confiable un clado con un valor de “bootstrap” mayor igual o mayor a 90%,
en cambio un valor de 25% no es del todo confiable [Hall, 2001].
1.6.2. Métodos de construcción de filogenias.
Existen métodos basados en distancias y basados en caracteres. Los principales
métodos de distancia son Neighbor Joining (NJ) y Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic Mean (UPGMA), que además son los únicos dos métodos de uso actual
que construyen árboles filogenéticos a través de algoritmos [Hall, 2001]. Los métodos
basados en caracteres de mayor uso son los de Máxima Parsimonia, Máxima
Probabilidad y Bayesiano. Estos tres construyen varios árboles de forma directa
mediante la comparación de cada carácter, uno a uno. En base a distintos criterios se
decidirá cuál o cuáles árboles son los mejores [Hall, 2001].
1.6.2.1. Métodos de Distancia.
La distancia se expresa como la fracción de sitios que difieren entre dos
secuencias en un apareamiento múltiple. Así, la suposición que a mayor tiempo
transcurrido de divergencia a partir de un ancestro común, más diferirán las
secuencias, es razonable, pero no siempre verdadera.
Los dos métodos de distancia más populares, UPGMA y NJ, generan una matriz
de distancia, calculando para cada par de taxa la distancia, o la fracción de
diferencias, entre las dos secuencias.
1.6.2.1.1. UPGMA
Es un método de “clustering”, donde se busca el par de taxa con la distancia más
pequeña y se combinan en un “cluster”, reescribiéndose la matriz con la distancia
desde el “cluster” de cada uno de los taxas restantes, lo cual disminuye el número de
entradas de la matriz. El proceso se reitera hasta que la matriz consta de una sola
entrada. UPGMA construye una suposición que el árbol es aditivo y que éste es
ultramétrico (todos los taxa son igualmente distantes de la raíz), una suposición que es
muy improbable. Por eso y otras razones, hoy en día, UPGMA es menos utilizado.
15
1.6.2.1.2. NJ.
Este método es similar a UPGMA en cuanto a que manipula una matriz de
distancia, reduciéndola en tamaño paso a paso. Sin embargo, difiere en que no
construye “clusters”. Desde la matriz original, NJ calcula una matriz de distancia
corregida. Luego, encuentra el par de taxa con la menor distancia corregida y calcula
la distancia de cada uno de estos taxa al nodo que los une a ellos. Luego, una nueva
matriz es creada, en la que el nuevo nodo es sustituido por estos dos taxa. No
obstante, NJ no asume que todos los taxa son equidistantes a una raíz. NJ es, como
parsimonia, un método de mínimo-cambio, pero esto no garantiza encontrar el árbol
con la menor distancia total [Hall, 2001].
1.6.2.2. Métodos de Caracteres.
Estos métodos usan los apareamientos múltiples directamente por comparación
de caracteres dentro de cada columna (cada sitio) en el apareamiento. El de
parsimonia busca el o los árboles con el menor número de cambios. Sin embargo, a
menudo sucede que hay varios árboles, ligeramente diferentes entre sí, que son
consistentes con el mismo número de eventos y, por tanto, igualmente parsimoniosos.
Por otro lado, el método de máxima probabilidad (ML) casi siempre arroja un solo árbol
al buscar la hipótesis que maximiza la probabilidad de observar los datos con un
modelo de evolución determinado.
Una variante del método de máxima probabilidad es el análisis bayesiano. En
vez de buscar el árbol que maximice la probabilidad de observar los datos, éste busca
esos árboles con la mayor probabilidad dados los datos. En lugar de producir un solo
árbol, arroja un set de árboles de aproximadamente iguales probabilidades [Hall,
2001].
Los antecedentes recopilados señalan una escasez de estudios genéticos de
esta especie en general, y específicamente no se han analizado muestras
provenientes del Pacífico Este. Postulamos que la caracterización genética de
muestras del Pacífico de B. papyrifera puede aportar tanto a la caracterización
16
genética de una especie de gran importancia económica, como para resolver en una
forma novedosa interrogantes relativos al poblamiento humano en el Pacífico.
1.7. HIPÓTESIS.
Con los antecedentes antes expuestos, se propone la siguiente hipótesis:
“El estudio de variaciones polimórficas de muestras de Broussonetia papyrifera
de la Polinesia mediante AFLP permite determinar re laciones filogenéticas
intraespecie”.
1.8. OBJETIVO GENERAL.
Este trabajo contempla el cumplimiento de 2 objetivos generales :
A. Analizar las variaciones polimórficas de B. papyrifera mediante AFLP de
muestras recolectadas en la Polinesia.
B. Determinar relaciones filogenéticas entre las diferentes muestras insulares a
través del análisis de polimorfismos.
1.9. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
A.1. Recolectar hojas de B. papyrifera de la Isla de Pascua y otras islas polinésicas.
A.2. Extraer DNA genómico de alta calidad.
A.3. Someter las muestras a análisis con AFLP para determinar polimorfismos
genéticos entre variedades insulares de B. papyrifera.
B.1. Determinar distancias filogenéticas y parentesco entre variedades insulares
mediante construcción de árboles filogenéticos.
17
2. MATERIALES Y MÉTODOS.
2.1. MATERIALES.
2.1.1. Reactivos e insumos generales.
Fermentas (Glen Burnie, Maryland, EE.UU.): Estándar de ADN 1 kb.
GE Healthcare® (Buckinghamshire, Inglaterra): Films autorradiográficos
(Amersham Hyperfilm™ MP).
Invitrogen® (Carlsbad, California, EE.UU.): Fenol, “AFLP Analysis System I”.
Merck KGaA (Darmstadt, Alemania): NaOH, cloroformo, alcohol isoamílico,
isopropanol, etanol, ácido bórico, acetato de sodio.
New England BioLabs (Ipswich, Massachusetts, EE.UU. ): λ DNA-HindIII Digest.
PerkinElmer (Waltham, Massachusetts, EE.UU.): [γ32P] ATP.
Promega® (Madison, Wisconsin, EE.UU.): Formamida, ADN polimerasa GoTaq,
dATP, dCTP, dTTP, dGTP, Estándar de ADN 25 pb.
USBiological (Swampscott, Massachusetts, EE.UU.): Tris Base, EDTA, SDS, CTAB
y RNasa.
Vetec Química Fina (Duque de Caxias, Río de Janeiro , Brasil): NaCl y ácido
clorhídrico fumante.
Fermelo Biotec (Santiago, Chile): Agarosa Lafken grado analítico.
Winkler Ltda. (Santiago, Chile): Acetato de sodio grado técnico.
18
2.2.2. Material biológico.
Broussonetia papyrifera y Morus sp : Muestras foliares frescas de diversas
localidades e islas del Océano Pacífico. A continuación se señalan los lugares de
donde se recolectaron muestras y quienes colaboraron en ella.
Tonga: Dra. A. Seelenfreund y Dra. D. Seelenfreund.
Taiwán: Dr. Kuenyih- Ho, Universidad Nacional de Chiayi, Taiwán.
Tahiti y Marquesas: S. Tihoni, J.F. Butaud, F. Timau, T. Tereino, J.M. Teiki Teetini y
M. Autushe.
Samoa: M. Atioo, F. Tunupopo, F. Aumale, T. Molipolailoa, F. Salu, W. Chaplin, S.
Naseri y L. Samuelu.
Hawái: M. Gómez y B. Mulloy.
Fiji: V. Campbell, H. Sykes y V. Bonito.
Pitcairn: C. Walter
Isla de Pascua: A Bernacchi, J. Edmunds y A. Seelenfreund.
Santiago (Parque Arrieta, adyacente al Campus Parque Arrieta de la Universidad
Internacional SEK): L. Mena y C. Contreras
Agradecemos a las personas que no son integrantes del proyecto y que colaboraron
en su recolección.
2.2.3. Tampones y soluciones.
Tampón de Lisis: Tris-HCl 100 mM (pH 8), EDTA 50 mM (pH 8), SDS 4% (P/V) y
NaCl 0,3 M.
Tampón de carga para geles de acrilamida (“ formamide dye” ): 98% formamida
(V/V), 10 mM EDTA, 1,5 mg/mL de azul de bromofenol y 1 mg/mL de xilencianol.
Fenol : cloroformo : alcohol isoamílico (25:24:1): Fenol saturado con Tris-Cl pH 8,0
mezclado con igual volumen de cloroformo : alcohol isoamílico (24:1)
Tampón de carga para geles de agarosa ( “Stop mix”) : Azul de bromofenol 0,25%
(P/V), xilencianol 0,25% (P/V), glicerol 30% (V/V) y EDTA 10 mM.
TBE 1X: Tris-borato 90 mM (pH 8) y EDTA 2 mM.
TE: Tris-Cl 10 mM (pH 8) y EDTA 1 mM.
19
2.2.4. Programas para análisis filogenético.
Los programas utilizados para la realización de árboles filogenéticos con el
Método de Distancia Neighbor Joining fueron Mega4 (“Molecular Evolutionary
Genetics Analysis”) y SplitsTree4 (“Software for computing phylogenetic networks”),
ambos descargados gratuitamente en versión Windows desde
http://www.megasoftware.net/ y http://www.splitstree.org/, respectivamente.
Para en análisis bayesiano se contó con la ayuda de la Dra. Rosita Scherson,
que trabajó con el programa Mr Bayes (Bayesian Inference of Phylogeny), versión
para Macintosh, descargado del sitio web http://mrbayes.csit.fsu.edu/.
2.2. METODOLOGÍA.
2.2.1. Recolección de muestras foliares.
Se recolectaron muestras foliares de B. papyrifera y Morus frescas provenientes
de distintas islas y localidades del Pacífico, las cuales debían presentarse visualmente
sanas y libres de parásitos. En lo posible, cada muestra representó a un individuo
independiente, del cual se extrajeron algunas de hojas para el análisis posterior. Así, el
universo de muestras recolectadas dependió del número de plantas o individuos
existentes en las distintas localidades. En las localidades en que se encontraban
muchos ejemplares no fue posible determinar con certeza a cada individuo por
separado.
Este estudio está centrado en Polinesia por lo que fue de interés obtener la
mayor cantidad de muestras de esta zona y, principalmente, de Isla de Pascua.
Además, para el análisis filogenético fue necesario contar con muestras del género
Morus, la cual pertenece a la misma familia que B. papyrifera, pues fue utilizada como
punto de comparación (“outgroup”) para el análisis filogenético.
2.2.2. Mantención de muestras foliares.
Las hojas de B. papyrifera se transportaron en bolsas plásticas selladas y
rotuladas según la localidad y número de muestra, indicando el nombre del
20
archipiélago o isla a la cual perteneciera. Se mantuvieron refrigeradas (en lo posible) o
a temperatura ambiente durante el periodo de recolección y transporte. Una vez
llegadas al laboratorio se almacenaron mediante refrigeración a -20°C y/o a T°
ambiente en etanol absoluto, que protege al ADNg de la acción de nucleasas [Adams
y cols., 1999].
2.2.3. Extracción de ADN genómico.
Se utilizó un protocolo de extracción de ADN de planta basado en el descrito por
Manubens y cols. (1999) con algunas modificaciones. Se ensayó la técnica de
extracción a dos escalas distintas, con microtubos Eppendorf de 2 mL y con tubos
Falcon de 15 mL, con el objeto de aumentar la eficiencia del método, facilitando la
manipulación y las etapas de centrifugación.
Se molieron aproximadamente 0,8 g de hoja de B. papyrifera en morteros de
cerámica estéril, en presencia de hielo seco como abrasivo, hasta obtener un
pulverizado verde. Para muestras almacenadas en etanol absoluto fue necesario dejar
evaporar por completo el etanol a temperatura ambiente antes de proceder con la
molienda de la hoja. Algunas muestras de Taiwán que se hallaron secas luego del
transporte al laboratorio fueron re-hidratadas en una placa Petri a temperatura
ambiente con agua destilada a 65°C durante 10 minut os.
El polvo obtenido se transfirió a microtubos de 2 mL o tubos cónicos plásticos de
15 mL, y durante algunos minutos se esperó a que sublimara el hielo seco. Luego, a
cada microtubo se agregó 200 µL de CTAB 8,4% y 600 µL de tampón de lisis o, en su
defecto, 1,6 mL y 3,4 mL, respectivamente, a tubos de 15 mL. Los tubos se incubaron
a 65°C durante 30 minutos, agitando mediante invers ión a intervalos de 10 minutos,
hasta lograr una solución de color verdoso. Posteriormente, se agregó la quinta parte
de acetato de potasio 5 M, se homogeneizó por inversión y se incubó sobre hielo
durante 15 min, adicionalmente. Se efectuó una extracción fenólica con un volumen de
fenol : cloroformo : alcohol isoamílico (25:24:1) en microtubos o en tubos de
polipropileno (Nalgene) de 30 mL, según sea el caso. La centrifugación se llevó a cabo
a 13.000 rpm en microcentrífuga durante 15 minutos para los microtubos o al
equivalente de SS-34 a 12.500 rpm durante 12 minutos para tubos de polipropileno.
21
En seguida, se transfirió la fase acuosa (superior) a un tubo nuevo, cuidadosamente,
utilizando micro-pipeta con punta cortada. A cada tubo se le agregó 0,6 volúmenes de
isopropanol (enfriado previamente a -20 ° C) y se i ncubaron durante 30 minutos a T°
ambiente. Luego, se centrifugó bajo las condiciones ya señaladas durante 15 a 20
minutos y se descartaron los sobrenadantes. Se lavó el sedimento con etanol 70%
(frío) y se centrifugaron los tubos durante 10 minutos. Finalmente, el sedimentó se
secó por inversión sobre toallas de papel o en centrífuga speedvac durante algunos
minutos y se resuspendió en 100 µL de amortiguador TE pH 8,0 para microtubos
Eppendorf o en 300 µL para tubos de polipropileno, incubando a 65°C dur ante 10
minutos para disolver el sedimento.
Una vez extraídos los ácidos nucleicos, los tubos se incubaron con una décima
parte de RNasa 10 mg/mL a 37°C durante 30 minutos. A continuación, se realizó una
extracción fenólica. Los tubos se centrifugaron durante 15 minutos y en seguida se
rescató la fase acuosa. Además, el ADN se limpió con igual volumen de cloroformo :
alcohol isoamílico (24 : 1), centrifugando a las velocidades indicadas anteriormente
durante 10 minutos. Luego de rescatar la fase acuosa el ADN se precipitó con un
décimo de volumen de acetato de sodio 3M y dos volúmenes de etanol absoluto a
20°C durante 1 hora como mínimo, y después se centr ifugó durante 15 minutos. Se
eliminó el sobrenadante y se lavó el sedimento con 200 µL de etanol 70%,
centrifugando durante 10 minutos. Finalmente, se eliminó el etanol, se secó el
sedimento en una centífuga Speedvac durante 3 minutos y se resuspendió en
aproximadamente 100 µL de amortiguador TE pH 8,0. Para almacenar el ADN, éste se
precipitó en etanol absoluto a -20 °C, como fue ind icado previamente
2.2.3.1. Análisis de integridad
La integridad del ADN genómico se verificó mediante electroforesis horizontal en
geles de agarosa al 0,8% en tampón TBE 1X. Aproximadamente se cargaron 10 µL de
cada muestra con solución de carga (“stop mix”) y se sometió a una electroforesis a
70V durante media hora. Siempre se incluyó una muestra estándar de peso molecular
en los geles de agarosa, el cual consistió de 0,5 µg de ADN del bacteriófago
Lambda/Hind III. Las bandas de ADN fueron visualizadas mediante tinción con
22
bromuro de etidio y exposición a la luz UV. Se estimó que una adecuada integridad del
ADN genómico correspondía a bandas de ADN genómico sin degradación y con un
tamaño superior a la banda de 23 kb correspondiente al estándar Lambda/Hind III.
2.2.3.2. Medición espectrofotométrica.
La concentración de ADN se determinó espectrofotométricamente midiendo la
absorbancia a 260 nm (rango UV) (1 OD equivale a 50 µg/mL de ADN de doble hebra).
También se midió la absorbancia a 280 nm, longitud de onda de cuantificación de
proteínas, para así tener una noción del grado de pureza del ADN. Éste se obtiene
determinando la razón A260nm/A280nm (R), considerándose óptima entre 1,7 y 1,9 para
una solución de ADN de doble hebra.
2.2.4. Método de AFLP.
Los productos de AFLP se obtuvieron utilizando el sistema comercial “AFLP
Analysis System I” de Invitrogen, diseñado especialmente para genomas de gran
tamaño (entre 5 x 108 y 6 x 109 pb) y compuesto durante el “Core Reagent Kit” y el
“AFLP Starter Primer Kit”, según las instrucciones del fabricante.
23
Figura 2. Esquema general del procedimiento AFLP-PC R. (Tomado del manual de instrucciones para AFLP de Invitrogen).
2.2.4.1. Digestión.
El ADNg se digirió con las enzimas EcoRI y MseI (ver figura 3). La reacción se
llevó a cabo en un tubo Eppendorf de 1,5 mL que contenía 5 µL del tampón de
reacción 5X, 2 µL de la mezcla de ambas enzimas, 10 µL de ADNg 25 µg/mL y 8 µL de
agua destilada para completar un volumen final de 25 µL de reacción. Primero se
incubó en baño termo-regulado a 37°C durante 2 hrs para obtener una digestión
completa y luego a 70°C durante 15 minutos para ina ctivar a las endonucleasas
(EcoRI y MseI). Finalmente, se colocó en hielo y se guardó a -20°C.
24
Fig. 3. Esquema de digestión de ADN genómico. Se muestra el sitio de reconocimiento y corte de las enzimas EcoRI y MseI, y los extremos cohesivos de los fragmentos generados. (Modificado del manual de instrucciones para AFLP de Invitrogen).
2.2.4.2. Ligación.
La ligación de los adaptadores se realizó en el mismo tubo, agregando, a los 25
µL de digestión, 24 µL de solución de ligación con adaptadores y 1 µL de ADN ligasa
del fago T4, e incubando en baño termo-regulado a 20°C + 2°C durante 2 hrs o a 12°C
durante toda la noche (ver figura 4). Una vez terminada la reacción se prepararon 100
µL de solución diluida 1:10 en tampón TE. Ambas soluciones de ADN ligado, con y sin
diluir, se guardaron a -20°C.
Figura 4. Esquema de ligación con adaptadores de Ec oRI y MseI. La ligación de los adaptadores a los extremos cohesivos del ADN digerido genera fragmentos de ADN templado con extremos de secuencia conocida. (Modificado del manual de instrucciones para AFLP de Invitrogen).
ADN digerido
ADN templado
ADN genómico
ADN digerido
25
2.2.4.3. Pre-amplificación.
La pre-amplificación de los fragmentos de ADN templado se llevó a cabo en un
microtubo de 0,2 mL agregando 40 µL del “mix” de partidores de pre-amplificación, 5
µL del tampón de PCR 10X (contiene 15mM de Mg2+), 5 µL de ADN templado diluido
1:10 y 1 µL de ADN polimerasa GoTaq (1 unidad). El programa ejecutado en
termociclador fue de 20 ciclos que consistieron en: desnaturación a 94°C durante 30 s,
apareamiento a 56°C durante 60 s y extensión a 72°C por 60 s. (ver figura 5)
Finalmente, en un tubo aparte, se diluyó el producto de PCR de 1:25 (6 µL ADN + 144
µL tampón TE) y se guardaron ambas soluciones, con y sin diluir, a -20°C.
Figura 5. Esquema de amplificación preselectiva de ADN templado. Esta amplificación utiliza partidores con un nucleótido selectivo para distinguir un conjunto de fragmentos determinados, el cual depende de la pareja de partidores escogida. (Modificado del manual de instrucciones para AFLP de Invitrogen).
2.2.4.4. Marcación con [ γ-32P]ATP.
La marcación del partidor se realizó en microtubo de 0,2 mL mezclando
cuidadosamente 18 µL del partidor EcoRI seleccionado, 10 µL de tampón T4-quinasa
5X, 20 µL de [γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol) y 2 µL de nucleótido-quinasa del fago T4. Para
la marcación del estándar de peso molecular se utilizó 2 µL de estándar de 25 pb, 1 µL
de tampón T4-quinasa 5X, 1 µL de [γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol) y 1 µL de nucleótido-
quinasa del fago T4. Se incubó la mezcla a 37°C durante 1 hora y luego se calentó
para inactivar enzima a 70°C durante 10 minutos. Fi nalmente, se almacenó a -20°C.
ADN templado
Conjunto de
amplicones
26
2.2.4.5. Amplificación Selectiva.
En microtubos de 0,2 mL se agregaron 5 µL de la solución de mezcla 1 , 10 µL
de la solución de mezcla 2 y 5 µL de ADN templado diluido de la pre-amplificación. La
reacción de mezcla 1 concentrada 10X consistió en 45 µL de partidor MseI (con
dNTPs) seleccionado y 5 µL del partidor EcoRI marcado. La reacción de mezcla 2
concentrada 10X contiene 20 µL de tampón de PCR, 1 µL de ADN polimerasa GoTaq
(1 unidad) y 79 µL de agua destilada. El programa utilizado constó de 36 ciclos con
temperatura de apareamiento variable. La etapa de desnaturación se realizó a 94°C
durante 30 segundos y la de extensión a 72°C durant e 60 segs. La etapa de
apareamiento fue a 65°C para el primer ciclo, la cu al fue disminuyendo paulatinamente
en 0,7°C para cada ciclo durante los siguientes 12 ciclos. Los 23 ciclos restantes se
efectuaron a una temperatura de apareamiento de 56°C, al igual que la pre-
amplificación (ver figura 6).
Figura 6. Esquema de la etapa de amplificación sele ctiva. Mediante una segunda amplificación, esta vez con partidores que contienen tres nucleótidos selectivos, se escoge un sub-conjunto de los amplicones obtenidos durante la primera amplificación. (Modificado del manual de instrucciones para AFLP).
2.2.4.6. Electroforesis en geles de poliacrilamida.
Con el fin de distinguir y resolver los distintos fragmentos obtenidos mediante la
técnica de PCR, se realizó electroforesis vertical en geles de poliacrilamida de gran
tamaño, del tipo utilizado para secuenciación de ADN.
Primer +3
Primer +3
Conjunto de
amplicones
Sub-conjunto de
amplicones
27
2.2.4.6.1. Preparación de geles de poliacrilamida a l 6% - Urea 7M.
Para un gel de dimensiones 38 cm x 33 cm se prepararon 100 mL de solución.
Se pesaron 40g de urea y se agregó 16 mL de solución concentrada de acrilamida :
bisacrilamida (38% : 2% P/V) y 20 mL de tampón TBE 5X. Se disolvió la urea agitando
y calentando con cuidado a 37°C. Una vez disuelta, la solución se llevó a 100 mL con
H2Odd y se filtró al vacío a través de una membrana de 0,45 µm. La solución se dejó
enfriar a T° ambiente y se le agregó 32 µL de TEMED , homogeneizando suavemente.
Finalmente, se agregó 320 µL de PSA al 10%, se mezcló rápidamente y se vertió con
una jeringa entre los vidrios. Luego, se recostaron suavemente los vidrios sobre un
bloque de madera dejando un ángulo entre los vidrios y el mesón. Las peinetas de
“diente de tiburón” (2 mm) se pusieron al revés (con los dientes hacia afuera) y se dejó
polimerizar durante al menos 1 hora a T° ambiente a ntes de pre-correr.
2.2.4.6.2. Análisis electroforético.
Una vez polimerizado el gel se limpió de los restos de urea y se colocaron las
peinetas en la posición correcta. Se montó el sistema de electroforesis utilizando
tampón TBE 1X y el gel se pre-corrió a 65 Watts constante, durante alrededor de 1
hora, para lograr una T° de 45-50°C. Antes de carga r las muestras de la amplificación
selectiva se agregó 20 µL de tampón de carga “formamide dye” por cada reacción, el
mismo procedimiento se realizó con estándar de peso molecular de 25 pb.
Posteriormente, se calentaron durante 3 minutos a 90°C e inmediatamente se llevaron
a frío (4°C).
Después de la pre-corrida se cargaron 2 µL de cada muestra. Se sometió el gel
a una potencia constante de 55W (aprox.1500V). Cuando el xilencianol alcanza el
último tercio del gel, se agregó acetato de sodio 3M en el ánodo de manera que el
acetato se encuentre a una concentración de 1M. Una vez terminada la electroforesis,
se secó el gel sobre papel cromatográfico en un secador de geles Biorad (modelo 583)
a 80°C durante aproximadamente 90 min.
28
2.2.4.6.3. Auto-radiografía.
Se expuso película Kodak X-Omat AR a -70°C al gel e n cassette con pantalla
intensificadora, durante aproximadamente 2 hrs o durante toda la noche, según los
días de decaimiento de la marca radiactiva. Posteriormente, se reveló la película.
2.2.5. Procesamiento de la información.
Los perfiles de AFLP o patrones de bandeo de una combinación determinada se
obtuvieron mediante inspección visual por al menos dos personas, considerándose
sólo las de tamaño entre 50 y 500 pares de bases (pb). Se presumió que las bandas
de AFLP que presentaron el mismo tamaño correspondían a marcadores homólogos.
Para cada muestra se otorgó un número 1 a la presencia de una banda y un 0 a su
ausencia. Además, se señaló con un signo de interrogación (?) las bandas dudosas y
altamente dependientes del grado de exposición de la autorradiografía. Luego se
transcribieron estos códigos binarios al formato “nexus” para realizar el análisis
filogenético. Alternativamente se generó un código binario basado en letras para el
uso de programas de análisis de secuencia, donde la letra A correspondió a la
presencia de la banda, la T a su ausencia y la N a las bandas dudosas o poco claras.
2.2.5.1. Análisis Filogenético.
Se empleó el Método de Distancia de Neighbor Joining (NJ) con dos programas
distintos. El primero fue SplitsTree4, en el cual se utilizaron los datos con código
binario de 0 y 1 y el análisis de distancias empleado fue el de Dice y Jaccard. El otro
programa usado fue Mega4 con el código binario de letras (A y T) y aplicando el
modelo de Jukes-Cantor (JC). Independientemente, se realizó un análisis Bayesiano
con el programa Mr. Bayes.
29
3. RESULTADOS.
3.1. RECOLECCIÓN DE MUESTRAS FOLIARES.
Se recolectaron muestras foliares de B. papyrifera pertenecientes a distintas
islas y localidades del Pacífico, en base a la disponibilidad de la planta y al número de
muestras existentes en las distintas islas. En Polinesia obtuvimos hojas del Pacífico
Occidental (oeste), en las Islas de Samoa y Tonga; y del Pacífico Oriental (este), en
las Islas de Marquesas, Tahiti, Hawai’i, Raiatea, y Rapa Nui. Además, contamos con
muestras de Fiji, islas contiguas al triángulo polinésico, y de Taiwán, isla perteneciente
a la región nativa de la planta [Whistler y Elevitch, 2006]. También, obtuvimos una
muestra de Santiago, en el Campus Parque Arrieta de la Universidad Internacional
SEK, de la cual no conocemos su origen ni historia. Por otra parte, conseguimos una
muestra del género Morus que fue utilizada como outgroup. En la figura 7 se muestra
la ubicación geográfica de las islas muestreadas en el Océano Pacífico.
Figura 7. Mapa de las Islas muestreadas en el Océano Pacífico . Se enmarcan en rojo los lugares del Océano Pacífico de donde se recolectaron muestras foliares.
30
Se muestreó en total 146 individuos, pertenecientes a 66 localidades distintas
(ver anexo tabla VII). De las 66 localidades, 46 son de Polinesia, representando un
75% de las muestras totales. Sin embargo una de las muestras polinésicas pertenece
al género Morus, la cual se utilizó como outgroup. En la tabla I se resume el número
de muestras por grupo de interés.
Tabla I. Muestras foliares recolectadas. Se señala la totalidad de las muestras según su género y lugar recolección.
Género Sector geográfico Isla/Arch/País N° de Localidades N° de Muestras
Broussonetia
Polinesia
Rapa Nui 11 38 Marquesas 9 17 Tonga 12 19 Samoa 9 28 Tahiti 3 3 Hawaii 1 1 Pitcairn 1 2 Raiatea 1 1
América Chile (Stgo) 1 1 Oceanía Central Fiji 1 3 Asia Taiwán 16 32
Morus Polinesia Pitcairn 1 1
Total 66 146
31
3.2. EXTRACCIÓN DE ADN.
3.2.1. Estandarización de protocolo.
Se realizó en paralelo protocolo de extracción de ADN de hojas, almacenadas a -
20°C, de Broussonetia papyrifera en ambas escalas de tubos, Eppendorf y Falcon. Se
verificó en gel de agarosa el ADN obtenido por ambos protocolos en una etapa
intermedia (sin tratamiento con RNasa) y en la etapa final (con tratamiento de RNasa).
Como se observa en la figura 8, con la extracción de ADN a pequeña escala
(microtubos Eppendorf) se obtuvo una banda de ADN genómico bien definida y sin
fragmentos de ADN degradado, lo cual no sucedió con el ADN extraído a mayor
escala (tubos Falcon). Debido a los buenos resultados obtenidos a pequeña escala, en
cuanto a la integridad y cantidad de ADN, se optó por continuar con este protocolo
para todas las muestras foliares, descartándose la opción de optimizar el protocolo
para extracción de ADN a mayor escala.
Figura 8. Extracción de ácidos nucleicos de B. papyrifera a distinta escala. Extracción según protocolo de Manubens y cols (1999). A) Análisis de muestras en etapa previa al tratamiento con RNasa. B) Análisis de muestras en etapa final, posterior a tratamiento con RNasa. Micro = microtubo Eppendorf y Macro = tubo Falcon. Electroforesis en geles de agarosa al 0,8%.
Fra
gm
en
tos d
e A
DN
ADN
ARN
A B
-20°C
Micro Macro
ADN
Macro Micro
-20°C
32
3.2.2. Integridad de ADN genómico de muestras folia res.
Un fingerprinting de AFLP exitoso requiere de ADN de alto peso molecular
(íntegro, sin degradar) y libre de contaminantes que puedan interferir con la digestión,
ligación y amplificación [Vos y cols., 1995; Bonin y cols., 2005].
La integridad del ADNg se evaluó mediante electroforesis horizontal en geles de
agarosa al 0,8% para cada una de las muestras. En cada gel se cargó un estándar de
peso molecular para corroborar la presencia de una única banda de un tamaño
estimado de ADNg superior a 23 kb (banda de referencia del marcador
Lambda/HindIII), que corresponde al esperado según la técnica de extracción utilizada
y es independiente del genoma de la especie en estudio. Además, se realizaron
extracciones de ADNg de hojas almacenadas en etanol absoluto a T° ambiente, las
que presentaron ADN totalmente degradado (ver figura 9).
Figura 9. Comparación de extracción de ADN genómic o de hojas de B. papyrifera almacenadas a -20°C y en etanol absoluto. Las muestras corresponden a distintas localidades de Rapa Nui. 20P = Maunga ToaToa; 22P = Vai Tara Kai Ua; y 34 = Te Pito Kura. Electroforesis en geles de agarosa al 0,8%. Estándar Lambda/Hind III.
Las muestras de Taiwán almacenadas a -20°C se encon traban secas y
quebradizas, dificultando la extracción de ADN íntegro (figura 10.A y 10.B). Por ello
que se probó realizando un proceso corto de re-hidratación previo a la molienda, no
obstante, se obtuvieron resultados negativos (figura 10.C).
-20°C Etanol 100%
St 20P 22P 34P
33
Figura 3.2.2.2. ADN genómico de hojas de B. papyrifera de Taiwán. Se utilizaron hojas almacenadas a -20°C. G1 represe nta a la localidad de Hua Lian, H1 y H2 a la de Bei nan river, y B16 con B22 a la de Da du river. A) ADN extraído según protocolo señalado para tubos Eppendorf. B) ADN concentrado de la extracción de ADN mostrada en panel A. C) ADN extraído según protocolo con microtubos Eppendorf realizado a partir de hojas re-hidratadas. Electroforesis en geles de agarosa al 0,8% con estándar Lambda/Hind III.
Finalmente, se obtuvieron 40 muestras de ADN íntegro provenientes de 35
localidades distintas, tanto de la Polinesia como de Taiwán y Chile. Esto corresponde
a un barrido importante de muestras de la Polinesia, que representa al 70% del total
recolectado en las localidades polinésicas (ver tabla II).
Tabla II. ADNg de muestras polinésicas de B. papyrifera . Resumen del total de muestras polinésicas de morera de papel analizadas.
Isla/Arch. o país
Nº de localidades % analizado
Nº de muestras % analizado Recolectadas Analizadas Recolectadas Analizadas
Rapa Nui 11 8 73 38 11 29 Marquesas 9 7 67 17 7 35 Tahiti 3 2 67 3 2 67 Samoa 9 6 67 28 6 21 Tonga 12 8 67 19 10 53 Hawaii 1 1 100 1 1 100 Raiatea 1 0 0 1 0 0
TOTAL 46 32 70 107 37 35
A B C
G1 H1 H2 st
-20°C
G1 H1 H2 st
-20°C
St B16 B22
-20°C
34
En la figura 11 se observan dos de estas muestras de ADNg de alto peso
molecular que fueron utilizadas para AFLP. Éstas presentaron un tamaño claramente
superior a 23 kilobases.
Figura 11. ADN genómico de hojas de B. papyrifera . Se utilizaron hojas almacenadas a -20°C. 11T = Niut oua, Tongatapu (Tonga) y 16T = Pelehake, Tongatapu (Tonga). Electroforesis en geles de agarosa al 0,8%. Estándar Lambda/Hind III.
3.2.3. Medición espectrofotométrica.
Para evaluar la concentración de ADN y su pureza se midió mediante
espectrofotómetro de luz UV la absorbancia a 260 y 280 nm. Los resultados en la
Tabla 3.2.3 muestran los valores obtenidos para las extracciones de ADNg íntegro.
Las concentraciones de ADN encontradas fluctuaron entre los 190 y los 1369 µg/mL,
que corresponden a un rendimiento de 48 a 342 µg de ADN genómico por gramo de
hoja. Los valores de R (A260nm/A280nm) se alejaron del rango esperado de 1,7 a 1,9,
presentando un promedio de 1,5, lo cual se debería al alto contenido de polifenoles y
polisacáridos en las muestras. Por ello se definió como criterio de calidad la integridad
del ADN y se corroboró dicha calidad realizando controles de digestión, debido a que
una exitosa digestión de AFLP requiere un ADN de alto peso molecular y libre de
contaminantes que puedan interferir con las reacciones [Vos y cols., 1995].
23,130
Kb
6,557 4,361
2,322
2,027
-20°C
St 11T 16T
9,416
35
Tabla III. Análisis espectrofotométrico de ADNg . R corresponde a la razón A260nm/A280nm y los números entre paréntesis al número de la réplica biológica.
Arch. /
Isla o
País
Isla o
Ciudad
Localidad
N° Muestra A 260nm A280nm R Conc
[µg/mL]
Chi
le Rapa Nui
Roiho N°8 0,129 0,088 1,47 1294
N°9 0,049 0,043 1,15 493
Poike N°11 0,132 0,088 1,50 1325
N°15 0,078 0,053 1,49 787
Maunga Toatoa N°20 0,027 0,021 1,29 274
Rano Raraku N°46 (1) 0,019 0,007 2,84 190
N°46 (2) 0,029 0,016 1,85 289
Rano Kao N°51 (1) 0,038 0,024 1,56 380
N°51 (2) 0,036 0,024 1,51 365
Mataveri N°61 0,016 0,008 2,01 157
Ara Tataki Rereo N°62 (1) 0,059 0,042 1,41 591
N°62 (2) 0,046 0,028 1,61 469
Hanga Oteo N°63 0,037 0,024 1,57 373
N°64 0,070 0,043 1,63 705
Stgo Universidad SEK S/N 0,022 0,020 1,07 220
Mar
ques
as
Ua Pou Haka Hau N°2 (1) 0,025 0,017 1,53 255
N°2 (2) 0,046 0,037 1,26 465
Nuku Hiva Taoihae N°4 0,045 0,036 1,26 454
Fatu Hiva Omoa N°6 0,057 0,037 1,53 569
Hanavave N°10 0,079 0,059 1,34 791
Tahuata Vaitahu N°12 0,072 0,045 1,60 726
Hapatoni N°13 0,076 0,058 1,31 759
Ua Huka Arboretum N°15 0,056 0,038 1,48 564
Ton
ga
Tongatapu
Faatai N°1 0,057 0,043 1,33 572
Liahona N°9 0,019 0,013 1,48 192
Vaini N°10 0,061 0,047 1,30 613
Niutoua N°11 0,136 0,092 1,47 1369
N°12 0,047 0,025 1,89 475
Navutoka N°13 0,077 0,051 1,53 778
Pelehake N°16 0,108 0,082 1,33 1089
N°17 0,042 0,033 1,28 424
36
Hamula N°18 0,059 0,041 1,44 597
Fatumu N°19 (1) 0,068 0,044 1,55 685
N°19 (2) 0,064 0,044 1,45 642
Sam
oa Savaii
Salailua N°16 0,040 0,026 1,58 407
Palauli N°18 0,142 0,086 1,66 1425
Safu’a N°20 0,062 0,042 1,47 624
Faga N°22 0,061 0,040 1,55 616
Upolu Maangiangi N°24 0,037 0,027 1,39 372
Apia N°26 0,033 0,021 1,56 329
Pol
ines
ia
fran
cesa
Tahiti
Faa’a N°19 0,100 0,066 1,52 1010
Punauia N°20 0,127 0,093 1,37 1281
Haw
aii
Hawaii Isla Grande N°21 0,028 0,020 1,40 286
Pitc
airn
Pitcairn
(Morus) Adamstown N°22 0,021 0,014 1,48 214
Tai
wán
Taiwán Hua Lian G-2-2 0,034 0,024 1,42 342
3.2.4. Control de digestión de ADNg.
Se corroboró la calidad del ADNg relativo a su tamaño y a ausencia de inhibición
de enzimas que actúan sobre los ácidos nucleicos. Para ello se probó
experimentalmente la actividad de las enzimas de restricción, ensayando nueve
muestras con una concentración aproximada de 125 µg/mL: cinco de Isla de Pascua
(N° 46(1), 51(1), 61, 62 (1) y 63) y cuatro de Marq uesas (N° 4, 6, 10 y 12). Las
muestras se incubaron en las condiciones ya señaladas de temperatura y tiempo, en
dos grupos distintos, uno con enzima y otro sin ella (grupo control).
En la figura 12 se muestran tres de las nueve muestras ensayadas, donde el
grupo control de ADNg incubado a 37°C por 2 horas n o presentó degradación, al
37
contrario del grupo incubado con las enzimas, que se muestra digerido
completamente, corroborándose que hubo una digestión exhaustiva producto de las
enzimas de restricción. Además se descarta la presencia de DNasas durante la
preparación de la digestión, las cuales también podrían ser las causantes de
degradación del ADN.
Figura 12. Control de Digestión de ADNg de B. papyrifera . Muestras de ADNg provenientes de Marquesas (Omoa, Hanavave y Vaitahu, respectivamente) sin digerir y digeridas con las enzimas de restricción EcoRI y MseI. Electroforesis en geles de agarosa al 0,8%. Estándar 1 kb.
Sin digerir Digerido
6M 10M 12M St 6M 10M 12M
38
3.3. AFLP.
3.3.1. Prueba de combinaciones de partidores.
La calidad de los perfiles de AFLP varía ampliamente de una a otra combinación
de partidores selectivos [Bensch y Akesson, 2005], por lo cual es necesario realizar
una exploración previa de éstas en un número pequeño de muestras [Bonin y cols.,
2005], principalmente si no existen estudios previos en la especie de interés. Es por
ello que fue necesario probar cada una de las combinaciones de partidores incluidos
en el sistema comercial “AFLP Analysis System I” de Invitrogen. Éste contempla 8
partidores para el extremo generado por la enzima EcoRI, denominados por la letra E
y 8 para el extremo generado por MseI, a los que se les asignó la letra M, existiendo
64 combinaciones posibles.
Dependiendo de la composición del genoma de interés, una u otra pareja de
partidores generará un número menor o mayor de productos de amplificación [Bensch
y Akensson, 2005]. De esta manera, las secuencias que no son abundantes en un
genoma no generarán amplicones o sólo un número muy reducido de estos. En la
tabla IV se muestran todas las combinaciones ensayadas con cuatro muestras de ADN
de B. papyrifera, categorizando en base al producto de amplificación generado.
Tabla IV. Combinaciones de partidores para AFLP en sayadas con ADNg de B. papyrifera . Se señalan con un “�” las parejas de partidores que presentaron amplificación selectiva y con una “x” las que generaron producto escaso o nulo.
* x = Producto de amplificación escaso o nulo; �= Producto de amplificación < 20; ��= Producto de amplificación > 20 con insuficiente n° de bandas polimórficas y/o baja resolución; ���= Producto de amplificación abundante y resolutivo.
Partidores M-
CAA M-
CAC M-
CAG M-
CAT M-
CTA M-
CTC M-
CTG M-
CTT
E-AAC �� � � � � x x x E-AAG x � � � �� x x x
E-ACA �� � x �� ��� x x � E-ACC x x x x � � x � E-ACG � � � � � � � x E-ACT � � � � � � x �
E-AGC � � � � �� � � �� E-AGG x � � ��� ��� � � ���
39
Una vez ensayadas las 64 combinaciones, se pre-seleccionaron cinco parejas de
partidores que cumplieron con tres criterios que son de importancia al momento de
realizar el análisis del patrón de bandeo: alto número de bandas, buena resolución y
bandas polimórficas abundantes. Éstas parejas, E-ACA / M- CTA, E-ACA / M- CAT, E-
AGG / M-CTA, E-AGG / M-CAT y E-AGG / M-CTT, fueron ensayadas para un mayor
número de muestras, lo cual permitió elegir de manera más clara cuáles de éstas
cumplían de mejor forma los criterios ya señalados.
3.3.2. Ejecución protocolo de AFLP en muestras.
El análisis mediante AFLP se realizó con las parejas de partidores pre-
seleccionadas para las 40 muestras indicadas en la tabla V. Se utilizaron al menos tres
combinaciones para la mayoría de las muestras, salvo en la muestra 64 de Rapa Nui y
la 19 de Tonga, que fueron posteriormente descartadas (ver sección 3.3.3). La
totalidad de las muestras se trabajaron con las combinaciones que presentaron los
mejores patrones de bandeo, E-ACA/M-CTA y E-AGG/M-CTT, las que fueron
seleccionadas para el análisis final.
40
Tabla V. Listado de muestras y las combinaciones d e partidores utilizadas. Se señala con un “�” las combinaciones utilizadas para cada muestra según isla o ciudad.
País o Arch. Isla/Ciudad Nº
muestra E-ACA/ M-CTA
E-ACA/ M-CAT
E-AGG/ M-CTA
E-AGG/ M-CAT
E-AGG/ M-CTT
Chi
le
Rapa Nui
8 � � � 9 � � � 11 � � � 15 � � � 20 � � � 46 � � � 51 � � � � 61 � � � � 62 � � � 63 � � � 64 � �
Santiago s/n � � �
Ton
ga
Tongatapu
1 � � � � 9 � � � � 10 � � � � 11 � � � � 12 � � � � 13 � � � 16 � � � 17 � � � � � 18 � � � � 19 � �
Mar
ques
as
Ua Pou 2 � � � Nuku Hiva 4 � � � �
Fatu Hiva 6 � � � 10 � � �
Tahuata 12 � � � 13 � � �
Ua huka 15 � � �
Sam
oa
Savaii
16 � � � � 18 � � � 20 � � � � 22 � � � �
Upolu 24 � � � � 26 � � �
Pol
ines
ia
fran
cesa
Tahiti
19 � � � �
20 � � � �
Hawaii Hawaii 21 � � � Pitcairn Pitcairn 22 � � � Taiwán Taiwán G22 � � �
41
A modo de ejemplo se muestran en la figura 13, dos autorradiografías obtenidas
con las mismas nueve muestras y que pertenecen a las parejas de partidores
seleccionadas, E-ACA/M-CTA y E-AGG/M-CTT. Cada una de estas combinaciones
posee un perfil distintivo el cual contiene tanto bandas monomórficas como
polimórficas.
Figura 13. Autorradiografías de AFLP de muestras de B. papyrifera de diferentes localidades. Se enmarcan con naranjo algunas bandas polimórficas. Las primeras 5 muestras corresponden a Isla de Pascua y las 4 siguientes a Marquesas. A) Combinación E-ACA / M-CTA; B) Combinación E-AGG / M-CTT. Gel de poliacrilamida al 6% - urea 7M.
A B
46 51 61 62 63 4 6 10 12 46 51 61 62 63 4 6 10 12
Rapa Nui Marquesas Rapa Nui Marquesas
42
3.3.4. Reproducibilidad de los ensayos de AFLP
Como se señaló en la tabla III, realicé, independientemente, en duplicado los
protocolos de extracción de ADN y de AFLP para cinco de las cuarenta muestras, por
lo tanto serían “duplicados biológicos”. De los duplicados biológicos se obtuvo un
patrón de bandeo claro y comparable de dos de ellos (ver figura 14). Además, varias
de las muestras se analizaron en distintos geles de acrilamida, contando así con
múltiples “réplicas técnicas”.
De las 40 muestras ensayadas se seleccionaron las réplicas (biológicas o
técnicas) de las muestras que presentaron un patrón de bandeo definido y con bajo
número de bandas dudosas, descartándose, además, las muestras que mostraron un
perfil variable de un gel a otro. Así se retiraron tres muestras, la 64 de Rapa Nui, la de
Santiago, la 20 de Samoa y la 19 de Tonga, quedando con un número total de
muestras de 36.
Figura 14. Perfiles de AFLP para réplicas biológica s. Se muestran los carriles del duplicado biológico de la muestra 51 de Rapa Nui (Rano Kao) y la 2 de Marquesas (Haka Hau - Ua Pou). 3.3.5. Análisis patrón de bandeo.
Se analizó el perfil de AFLP para cada una de las muestras y se obtuvo dos tipos
de código binario, uno numérico, 0 y 1, y otro con letras, T y A.
En promedio, por combinación se obtuvo un total de 60 bandas (120 en total), de
las cuales un alto porcentaje resultó ser polimórficas (tabla VI).
Rapa Nui Marquesas
51 2
(1) (2) (1) (2)
43
Tabla VI. Cuantificación de bandas mono y polimórfi cas del perfil de AFLP de ADNg de B. papyrifera . Se señala el número de bandas para cada combinación de partidores y el número total de muestras analizadas.
Partidores N° de bandas
% Polimorfismos N° de
muestras Monomórficas Polimórficas Total
E-ACA / M-CTA
25 34 59 58 36
E-AGG / M-CTT
12 49 61 80 36
Total 37 83 120 69
El universo total de muestras fue de 36. Ambos códigos, el de números y el de
letras, se transformaron al formato “nexus”, el cual es leído y procesado por los
programas utilizados, SplitsTree4 y Mega4.
3.4. ANÁLISIS FILOGENÉTICO
Con los datos obtenidos se realizó un análisis con el Método de Distancia de
Neighbor Joining (NJ) y un análisis Bayesiano.
3.4.1. Análisis de Neighbor Joining.
Se realizó el Método de NJ con dos programas distintos. Con SplitsTree4 se
ejecutó un análisis de distancias empleando Dice y Jaccard; y con Mega4 se aplicó el
modelo de JukesCantor (JC). En las figuras 15 y 16 se muestran los árboles
filogenéticos de consenso efectuados con distintos modelos de distancias mediante
SplitsTree4.
El árbol obtenido mediante el modelo de JC (ver anexo figura 17) presentó una
topología marcadamente distinta a la mostrada por los otros dos modelos. La muestra
de Taiwán se observa como la más disímil y lejana, no así el outgroup, el cual aparece
asociado a una de las muestras de Marquesas. Además el apoyo estadístico resultó
ser bajísimo, con sólo dos valores sobre 50%.
44
En cambio, los árboles realizados con los modelos de distancias de Dice y de
Jaccard muestran una topología bastante similar entre sí, en cuanto a la agrupación de
las muestras, aunque las distancias calculadas con cada análisis fueron claramente
diferentes (ver figuras 15 y 16). El modelo de Jaccard no fue capaz de discriminar
entre la muestra de Morus (outgroup) y la de Taiwán (origen), lo cual sí se logró con
Dice. El árbol calculado con las distancias de Dice (figura 15) figuró la mejor resolución
de las muestras y mayor apoyo estadístico, mostrando gran número de los nodos
soportados con un valor de boostrap mayor a 50, y varios de ellos sobre 90. Aún así,
los nodos internos fueron los que presentaron menores valores de “bootstrap”, salvo
los de los taxa más disímiles. En cuanto a la topología y organización de los nodos de
dicho árbol, éste presentó un agrupamiento bastante coherente. Las muestras de
Taiwán y Morus se muestran como las más disímiles, distanciándose claramente de
las muestras Polinésicas. De las muestras polinésicas las más lejanas resultaron ser
una de cada grupo (Tonga, Rapa Nui, Samoa, Marquesas), las cuales forman clados
totalmente separados de las muestras restantes de la Polinesia. En el caso de Tonga y
Marquesas, las muestras pertenecientes al mismo archipiélago se muestran cercanas
y agrupadas en un mismo clado, salvo algunas pocas muestras. No se observa el
mismo tipo de agrupamiento entre las muestras de Samoa y Rapa Nui, ya que se
encuentran bastante más dispersas y formando parte de distintos clados. Además,
para algunas localidades se analizaron dos muestras diferentes (señaladas por un
número 1 y un número 2) con el fin de ver la variabilidad existente dentro de una
misma localidad. Estas muestras se consideraron como muestras independientes, no
como réplicas (ver sección 3.3.4), y su comportamiento también resultó ser
independiente, debido a que no formaron necesariamente parte del mismo clado.
45
Figura 15. Árbol de NJ consenso para B. papyrifera basado en distancias de Dice. Árbol construido con el programa SplitsTree4 con 36 muestras distintas. Representación mediante filograma. Los números representan el porcentaje de “bootstrap” (soporte) obtenido a partir de 1000 réplicas. Sólo se muestran los valores mayores a 50.
46
Figura 16. Árbol de NJ consenso para B. papyrifera basado en distancias de Jaccard. Árbol construido con el programa SplitsTree4 con 36 muestras distintas. Representación mediante filograma. Los números representan el porcentaje de “bootstrap” (soporte) obtenido a partir de 1000 réplicas. Sólo se muestran los valores mayores a 50.
47
3.4.2. Análisis bayesiano.
Este análisis resultó en un árbol consenso de una topología insuficientemente
resuelta. A pesar que muestra una tendencia a la organización de las localidades en
base a su ubicación geográfica, tal como el modelo de Dice, fue incapaz de distinguir
entre varias de las muestras, entre ellas Taiwán, debido a un soporte estadístico bajo
(Resultados no mostrados).
48
4. DISCUSIÓN Y PROYECCIONES.
En esta tesis se abordó la interrogante del origen del poblamiento de la Isla de
Pascua con el fin de tener un acercamiento de la o las rutas migratorias de estos
primeros colonizadores. En base a los antecedentes planteados, B papyrifera podría
ser un excelente trazador de migración humana en el Pacífico debido a sus
características culturales [Métraux, 1971; Douaire-Marsaudon, 1997] y biológicas
[Whistler y Elevitch, 2006; Matthews, 1996; Florence, 1997]. Es por ello que se decidió
explorar su variabilidad genética en las islas de la Polinesia. Como herramienta se
decidió utilizar AFLP por distintas razones, entre ellas: el desconocimiento de la
secuencia nucleotídica de esta planta, que impide el uso de otro tipo de marcadores
como microsatélites; la baja variabilidad genética esperada debido a que es un estudio
intra-específico, a la reproducción asexual de esta planta en la Polinesia y al corto
periodo de tiempo transcurrido desde su llegada; y la duración del proyecto de
investigación, ya que se pueden generar datos rápidamente. No se trabajó con
marcadores co-dominantes, como microsatélites, principalmente por el
desconocimiento del genoma de la planta de interés y por el factor tiempo, ya que al
no ser un marcador multi-locus es necesario analizar un gran número de loci.
Tampoco se optó por el uso de otros marcadores dominantes como RAPDs e ISSR
debido a los antecedentes que señalan a AFLP como un método más reproducible,
robusto e informativo [Bussell y cols., 2005; Archak y cols., 2003; Savelkoul y cols.,
1999].
El primer objetivo específico de este trabajo fue recolectar muestras foliares
frescas de B. papyrifera, debido al requerimiento de un ADNg de alta calidad,
provenientes de un gran número de localidades en la Polinesia. Pese a que en
algunos lugares ya no existen ejemplares vivos, como en Mangareva (Islas Australes),
o eran muy escasos, como en Tahiti, se logró recolectar muestras de 10 países y/o
archipiélagos (ver anexo tabla VII), correspondientes a 66 localidades, que sumaron
un total de 145 individuos. Además, se recolectó una muestra del género Morus, que
sirvió como “outgroup” para este estudio.
49
La estandarización del protocolo de extracción de ADN de planta descrito por
Manubens y cols. (1999) resultó satisfactoria a una escala de microtubos en términos
de su integridad y rendimiento. Por lo tanto, el criterio considerado de mayor
importancia al momento de evaluar la extracción de ADNg fue su integridad, debido a
que el uso de ADN degradado puede resultar en una baja calidad de perfiles de AFLP
y baja reproducibilidad [Bensch y Akesson, 2005].
La razón espectrofotométrica R (A260nm/A280nm) mostró valores bajo el rango
considerado óptimo, lo cual se podría deber a la presencia de compuestos
contaminantes como polifenoles y polisacáridos. Se han desarrollado múltiples
protocolos para la extracción de ADN vegetal [Manubens y cols, 1999; Reddy, 2009;
Keb-Llanes y cols., 2002;] debido a las complicaciones que presenta una extracción de
ADN puro, como lo son la contaminación con polifenoles y con polisacáridos. Se han
reportado múltiples compuestos fenólicos que han sido aislados de B. papyrifera
[Matsumoto y cols., 1985; Cheng y cols., 2001; Lee, 2001; Kim y cols., 1994], no
obstante tanto estos como los polisacáridos deberían ser removidos en su mayoría
con el protocolo utilizado. La importancia de eliminar estos contaminantes se debe a
que pueden interferir con las reacciones de AFLP al inhibir a las enzimas de restricción
y a la ADN polimerasa [Vos, 1995; Bonin y cols, 2005; Keb-Llanes y cols., 2002]. Por
ello, se corroboró la calidad del ADN genómico mediante un control de digestión, el
cual demostró que no existían niveles de contaminantes que podrían llegar a inhibir a
las enzimas de restricción. No se encontró una asociación entre los valores de R y el
perfil de digestión obtenido. Más aún, en las 40 muestras analizadas siguiendo el
protocolo descrito para AFLP, se obtuvo producto de amplificación, confirmando que la
reacción de PCR tampoco fue inhibida y que el ADNg obtenido era apto para esta
metodología. Por otra parte, las muestras que presentaron patrones de AFLP dudosos
y/o difíciles de interpretar fueron eliminadas de este estudio, descartándose así una
posible digestión incompleta, que llevara a un patrón de bandeo erróneo [Vos, 1995;
Meudt y Clarke, 2007], como también errores en la asignación del puntaje o “score”.
La elección de los partidores a utilizar en un estudio determina la calidad y
composición de los perfiles obtenidos [Bensch y Akesson, 2005; Koopman y Gort,
2004]. El tipo de nucleótido selectivo de los partidores elegidos influye en la
50
distribución de los fragmentos amplificados, favoreciendo a los de menor tamaño los
nucleótidos A y T, y a los de mayor tamaño los G y C, producto de los sitios de
reconocimiento de las enzimas de restricción EcoRI y MseI. No obstante las parejas
utilizadas en este trabajo, E-ACA / M-CTA y E-AGG / M-CTT, presentan una
composición heterogénea de nucleótidos selectivos, lo cual llevó a perfiles de AFLP
con una distribución relativamente simétrica en cuanto a la distribución de tamaño de
los fragmentos obtenidos.
Existen múltiples causas de errores de genotipificación en AFLP [Bonin y cols.,
2004], incluyendo aspectos técnicos de generación de perfiles, subjetividad o error
humano en la lectura de los perfiles y diferencias en movilidad e intensidad de las
bandas o peaks. Todos ellos causan una pérdida en el poder de resolución [Meudt y
Clarke, 2007]. El paso crucial de un estudio de AFLP es la asignación del “score” para
generar el código binario [Meudt y Clarke, 2007]. Este paso parte de la premisa que
todos los fragmentos del mismo tamaño son homólogos, o sea, presentan la misma
composición nucleotídica, lo cual no siempre es verdadero. La asignación del código
binario se realizó manualmente, debido a que la asignación automática obtenida por el
programa CrossChecker resultó ser poco fiable. Se asignó un “score” a
aproximadamente 60 bandas por combinación de partidores, descartándose los
fragmentos de un tamaño menor a 50 bp, por lo que se consideraron sólo los
fragmentos de tamaño entre aproximadamente 50 y 500 bp. De esta forma se intentó
lograr un equilibrio entre el número de caracteres obtenidos, considerando además
que un gran número de ellos fueran polimórficos (>50%), y el tamaño de los
fragmentos, con el fin de minimizar los errores de homoplasia. Se ha descrito que la
homoplasia aumenta al disminuir el tamaño de los fragmentos [Koopman y Gort, 2004;
Bussel y cols, 2005], y en consecuencia no se deben considerar los fragmentos más
pequeños para lograr una buena resolución del análisis.
La homoplasia es un tema de importancia en el análisis e interpretación de los
datos de AFLP. Ésta se puede deber a un “score” incorrecto en el estado de presencia
de una banda, por co-migración de fragmentos no homólogos, o de ausencia de una
banda, debido a la pérdida independiente de un fragmento. Por tanto, la homoplasia
resulta en una subestimación de la diversidad génica real entre las muestras y una
51
pérdida de resolución en el análisis. Por otra parte, también existen problemas de
homoplasia asociados a problemas de mal apareamiento de los partidores y pobre
resolución de bandas en los geles, lo cual es inherente a la técnica de AFLP [Meudt y
Clarke, 2007].
La estrategia de combinar datos de AFLP con datos de secuencia de ADN
podría ayudar a lograr filogenias más robustas, tanto por un efecto de
complementación entre los distintos conjuntos de datos que provee resolución en
“distintos niveles” del árbol [Koopman, 2005], como por un aumento en el número de
caracteres disponibles para el análisis filogenético. En este trabajo no se presentan
árboles filogenéticos con complementación de datos de secuencias ITS obtenidas en
el laboratorio [Piña y cols., 2010], debido a que las 290 bases nucleotídicas
secuenciadas en ese estudio no mejoraron la robustez de los árboles construidos.
Respecto al análisis filogenético, se utilizaron dos métodos completamente
distintos en cuanto a su estrategia matemática y al tratamiento de los datos. El método
bayesiano presentó una baja resolución con un “bootstrap” menor al 50%, siendo
incapaz de distinguir entre varias de las muestras polinésicas y Taiwán. Debido al bajo
aporte de los resultados de este análisis para el estudio, éstos no se incluyeron en
este trabajo. El método de NJ realizado con el programa SplitsTree4 se llevó a cabo
con dos modelos de distancia distintos, los cuales fueron elegidos en base a la
documentación encontrada. Simmons y cols., (2007) señalan que las medidas de
disimilitud de Jaccard y Dice, que consideran solamente las presencias compartidas,
como más apropiadas para datos de AFLP. Las medidas que también incorporan las
ausencias compartidas (alelos nulos), como la distancia Euclideana y el coeficiente de
“simple match” son particularmente susceptibles a homoplasia, debido a las múltiples
maneras independientes en que se puede perder un fragmento [Bussell y cols., 2005;
Simmons y cols, 2007]. Por otro lado, se realizó un árbol de NJ con el programa
Mega4, mediante el modelo de Jukes-Cantor (ver anexo figura 17), debido a que este
programa sólo considera el análisis de secuencias de ADN o de proteínas, para lo cual
fue necesario elaborar un código binario de letras y otorgarles igual peso a ambos
caracteres. Jukes-Cantor supone una secuencia nucleotídica distribuida
azarosamente, asumiendo iguales frecuencias y posibilidades de sustitución entre
52
todos los nucleótidos [Koopman y Gort, 2004] (A y T en este caso). De acuerdo a este
criterio, se contemplaron medidas de disimilitud que incorporaron tanto las bandas
presentes como las ausentes. Esto se reflejó en un árbol de características topológicas
distintas a los realizados mediante los otros dos modelos, la cual es totalmente
atribuible o no a la consideración de los alelos nulos compartidos.
Finalmente, se consideró como el árbol más coherente y con mejor soporte
estadístico el realizado por NJ con el modelo de Dice (ver figura 15). Los valores de
“bootstrap” no fueron los óptimos y muy probablemente existen errores de homoplasia
que se reflejan en el bajo soporte en varios de los clados interiores, por lo cual no
podemos establecer relaciones de parentesco ni asegurar con certeza cuál isla o
localidad es precursora de las otras. Aún así, la topología del árbol sugiere un cierto
agrupamiento de las localidades en base al archipiélago al cual pertenecen, en el caso
de Tonga y Marquesas. Sin embargo, podemos afirmar lo siguiente a partir de este
árbol filogenético: Lo primero es que las muestras de Morus (outgroup) y Taiwán (lugar
de origen B. papyrifera) son las más disímiles y son distintas entre sí, presentando
valores de “bootstrap” de 100%. Luego, se observa, con un “bootstrap” = 75%, que la
totalidad de las muestras de B. papyrifera de la Polinesia están formando parte de un
clado diferente al de Taiwán, lo cual confirma la gran cantidad de años que separan a
las plantas de Taiwán de las de la Polinesia. Como se observa en la topología del
árbol, dos muestras de la misma isla e inclusive de la misma localidad (señaladas por
los números 1 y 2) no forman necesariamente parte del mismo clado. Esto era
esperable, ya que hasta el día de hoy existe un constante flujo entre individuos de las
distintas islas, y es altamente probable que el poblamiento de las distintas islas no
haya sido producto de un solo viaje de colonización.
En consecuencia, con la técnica de AFLP se logró evidenciar diferencias a nivel
intra-especie, como ha sido reportado anteriormente para otras especies como
ranúnculos y camote [Schönswetter y cols., 2004; Rossel y cols., 1999 y 2000]. Sin
embargo, éste es el primer reporte de variabilidad intra-especie para un miembro del
género Broussonetia. Asimismo, cabe destacar el hecho que la colonización de la
Polinesia es un evento relativamente reciente, por lo cual hemos sido capaces de
observar variabilidad genética generada durante un periodo de tiempo pequeño, no
53
mayor a 2.500 años [Kirch, 2002; Rollet, 1998]. Otras técnicas, como el análisis
mediante la secuenciación de regiones ITS no han sido suficientemente resolutivas
para detectar esta variabilidad [Piña y cols., 2010].
En el presente trabajo sí se lograron evidenciar polimorfismos en muestras
insulares de B. papyrifera, con lo cual se podemos afirmar que se cumple el primer
objetivo general planteado. Sin embargo, la detección de variabilidad genética no fue
suficiente para establecer relaciones filogenéticas entre dichas muestras con un
soporte estadístico significativo, por lo que s no se cumple el segundo objetivo general
de este trabajo. Con los resultados obtenidos hasta este momento, se rechaza la
hipótesis planteada. Sin embargo, es posible que mediante determinadas
optimizaciones de la técnica empleada sea posible mejorar el análisis de modo de
lograr establecer relaciones filogenéticas entre las muestras de los distintos
archipiélagos o zonas geográficas del Pacífico. Por esta misma razón, hasta el
momento no hemos podido dilucidar la ruta migratoria de los primeros colonizadores
de Rapa Nui. Además, sólo se exploró una de las dos rutas alternativas, debido a la
extinción de la especie en algunas de las islas visitadas que representan una segunda
ruta colonizadora. Para poder incorporar muestras de las Islas Australes (Mangareva)
es necesario utilizar otra técnica, la cual no requiera de muestras vivas para la
obtención de ADNg. También sería de ayuda ampliar el estudio a zonas de Oceanía
Cercana, región donde esta planta ha vivido más años y donde debería mostrar una
mayor variabilidad que en Polinesia. La diversidad genética observada demostró que
la reproducción asexual de esta planta no resultó ser una desventaja, sino una ventaja
para utilizarlo como trazador de migración humana. Por lo tanto, los resultados de esta
tesis sugieren que B. papyrifera sí sería capaz de reflejar la historia humana a través
de su genética.
Es importante considerar que la técnica de AFLP realizada en este trabajo se
basó en la marcación radiactiva de los partidores y la obtención de autorradiografías,
cuyo análisis es más subjetivo que aquel realizado con fluoróforos mediante
electroforesis capilar. Esto también fue una limitante en cuanto a la disponibilidad de
programas para realizar el análisis filogenético, varios de los cuales están diseñados
específicamente para trabajar con datos de electroferogramas (por ejemplo,
54
RawGeno). Otra limitante es que los datos de fingerprinting no pueden ser analizados
por programas diseñados para el análisis de secuencias, nucleotídicas o
aminoacídicas, como Mega4. Por ello, una alternativa sería transformar el “score”
numérico por uno de letras como se realizó en este trabajo. No obstante, estos
programas no permiten un análisis con modelos de distancias para código binario, sino
solamente con los modelos desarrollados para secuencias. Por otra parte, el uso del
radioisótopo P32 presenta desventajas, como lo es la bioseguridad y el variable tiempo
de decaimiento observado en esta tesis. Esto último afectó la reproducibilidad y la
resolución de las autorradiografías, lo cual fue un problema al momento de asignar el
“score” de las bandas, paso clave en la reducción de errores de la técnica per se que
conducen a homoplasia.
Todo esto nos indica que es necesario perfeccionar la herramienta de AFLP
utilizada, para aumentar el poder resolutivo y dilucidar con mayor claridad las
relaciones de parentesco existentes entre las distintas muestras de la Polinesia. Una
alternativa interesante sería trabajar con partidores fluorescentes en vez de
radiactivos, lo cual aumentaría su reproducibilidad, el número de caracteres, y la
resolución entre ellos, además de minimizar la homoplasia. Por las razones expuestas
a futuro será importante seguir trabajando con una modalidad de AFLP más
sofisticada como el uso de sondas marcadas con fluoróforos. También será importante
complementar este estudio con otras herramientas genético-moleculares, como
marcadores co-dominantes, por ejemplo microsatélites. De esta manera podríamos
comparar los resultados obtenidos mediante dos técnicas diferentes e independientes,
las cuales otorgan información de distinta naturaleza. Además, utilizando otra técnica,
que no requiera de ADNg de alta calidad, se podrían analizar las localidades e islas de
donde no se dispone de hojas frescas (muestras secas, por ejemplo, procedentes de
herbarios o de otras fuentes).
La complementación de la información obtenida con distintos marcadores
enriquecería el estudio de la variabilidad genética de B. papyrifera y de las relaciones
de parentesco entre sus variantes geográficas. Así también, dichos resultados pueden
ser comparados con aquellos obtenidos en otras especies utilizadas como trazadores
del poblamiento de la Polinesia, con el fin último de relacionar la información
55
entregada por estos trazadores con los estudios arqueológicos y antropológicos ya
existentes.
Los estudios de filogenia realizados nos conducen a nuevas interrogantes acerca
de cómo flujos migratorios más recientes se pueden ver reflejados en una planta como
B. papyrifera.
56
5. CONCLUSIONES.
Objetivo General A.
� Se logró recolectar 109 muestras foliares de B. papyrifera de la Polinesia,
correspondiente a 47 localidades.
� El protocolo de extracción de ADNg para planta ensayado a escala de
microtubos resultó en un ADN íntegro y de calidad aceptable para AFLP.
� Esta planta, pese a su reproducción asexual, presenta diferencias
genéticas entre sus ejemplares de la Polinesia.
� La técnica de AFLP es capaz de evidenciar diferencias genéticas inter e
intra-islas en B. papyrifera. No obstante para darle mayor robustez al
análisis es necesario un mayor número de caracteres de AFLP.
� Este es el primer estudio reportado de AFLP en B. papyrifera, lo cual
sirve de antecedente para estudios posteriores en esta planta.
� Las características genéticas, biológicas y culturales de esta planta la
postulan como un promisorio trazador de migraciones.
Objetivo General B.
� Existen diferencias entre los árboles filogenéticos obtenidos mediante NJ
con modelos de distancias para datos binarios en comparación a uno
para secuencias.
� El método de NJ mostró una mayor resolución entre las diversas
muestras de B. papyrifera que el bayesiano.
� Las muestras correspondientes a los archipiélagos de Marquesas y
Tonga muestran una tendencia a agruparse en base a su grupo territorial.
� Las muestras de Taiwán y Morus se agrupan en dos clados distintos al
clado interno formado por las muestras de la Polinesia, lo cual los postula
como buenos outgroup para estudios posteriores.
57
� La técnica de AFLP desarrollada fue capaz de mostrar asociaciones y
agrupaciones entre las distintas muestras, pero no de determinar
relaciones de parentesco con un apoyo estadístico suficiente.
� Los estudios filogenéticos realizados nos permiten visualizar la
complejidad de los eventos migratorios humanos, tanto recientes como
antiguos, ocurridos en el Pacífico.
58
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7. ANEXOS.
Tabla VII. Listado de muestras recolectadas. Se señala el número total de muestras por localidad y la Isla y/o archipiélago al cual corresponden.
Género País o Arch.
Isla o Ciudad Localidad N° de
muestras
Bro
usso
netia
Chi
le
Rapa Nui
Roiho 5 Poike 6 Maunga Toatoa 4 Vai Tara Kai Ua 5 Te Pito Kura 2 Rano Raraku 6 Rano Kao 5 Mataveri 1 Ara Tataki Rereo 1 Hanga Oteo 2 Pu Toki Toki 1
Santiago Universidad Internacional SEK 1
Mar
ques
as
Ua Pou Haka Hau 2 Hakahetau 1
Nuku Hiva Taoihae 1 ---------- 2
Hiva Oa Atuona 1
Fatu Hiva Omoa 3 Hanavave 2
Tahuata Vaitahu 2 Hapatoni 2
Ua Huka Arboretum 1
Pol
ines
ia
fran
cesa
Tahiti
Pirae 1
Faa’a 1
Punauia 1
Raiatea ------------- 1
Sam
oa
Upolu Siumu 2 Maangiangi 2 Apia 1
Savaii
Salailua 4 Siutu 4 Palauli 4 Safu’a 4 Faga 5 Safune 2
66
Ton
ga
Tongatapu
Faatai 2
Tekiu 2
Foui 1
Kanokupolu 2
Liahona 2
Vaini 1
Niutoua 2
Navutoka 1
Malapo 2
Pelehake 2
Hamula 1
Fatumu 1
Haw
aii
Isla Grande Jardín botánico 1
Fiji
Suva South Pacific University (SPU) 3
Pitc
airn
Pitcairn Adamstown 2
Tai
wán
Taiwán
Da Han River 4 Da Du River 4 Jhuo Shuei 4 Zeng wun 4 Lao Nong 4 Lan Yang 4 Hua Lian 4 Bei Nan River 4
Mor
us
Pitc
airn
Pitcairn Adamstown 1
TOTAL 66 146
67
Figura 17. Árbol de NJ consenso para B. papyrifera basado en modelo de Jukes-Cantor (JC). Árboles realizados con Mega4 y representados como filogramas. Los números representan el porcentaje de “bootstrap” obtenido a partir de 1000 réplicas.
