brucelosis caprina y ovina OIE

NB: Versin adoptada en la Asamblea Mundial de Delegados de la OIE en mayo de 2009

Manual Terrestre de la OIE 2012 1

C A P T U L O 2 . 7 . 2 .

BRUCELOSIS CAPRINA Y OVINA (no debida a Brucel la ovis )

RESUMEN

La principal causa de la brucelosis caprina y ovina es Brucella melitensis (biovariedades 1, 2 y 3). Se han observado casos espordicos causados por B. abortus, pero los casos de infeccin natural son muy infrecuentes tanto en ovejas como en cabras. Brucella melitensis es endmica en la regin mediterrnea, pero la infeccin est extendida por todo el mundo. Se considera que Norteamrica (excepto Mxico) est libre del agente, como ocurre en el norte y centro de Europa, sureste asitico, Australia y Nueva Zelanda.

Clnicamente, la enfermedad se caracteriza por uno o ms de los siguientes signos: aborto, retencin placentaria, orquitis, epididimitis y, en ocasiones muy infrecuentes, artritis, con excrecin de los microorganismos en las secreciones uterinas y en la leche. El diagnstico depende del aislamiento de Brucella a partir de los abortos, de las secreciones de la ubre o de los tejidos extrados post-mortem. El diagnstico preliminar se puede hacer determinando respuestas celulares o serolgicas especficas frente a los antgenos de Brucella.

Brucella melitensis es muy patgena para el hombre y causa la fiebre de Malta, una de las zoonosis ms graves del mundo. Por lo tanto, todos los tejidos y cultivos infectados, as como el material potencialmente contaminado, deben manejarse en un nivel 3 de contencin para riesgos biolgicos.

Identificacin del agente: Se obtienen presuntos indicios de Brucella poniendo de manifiesto, mediante la tincin de los microorganismos por la tcnica modificada para alcohol-cido resistentes, microorganismos tpicos del gnero Brucella en abortos o secreciones vaginales, sobre todo si estn respaldados por pruebas serolgicas. Los mtodos basados en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), constituyen medios adicionales de deteccin. Siempre que sea posible, las especies de Brucella deben cultivarse utilizando medios de cultivo selectivos o normales a partir de secreciones uterinas, fetos abortados, secreciones de la ubre o tejidos seleccionados, como ganglios linfticos, bazo, tero, testculos y epiddimos. Las especies y biovariedades deben identificarse mediante lisis por fagos y por criterios de cultivo, bioqumicos y serolgicos. Se han desarrollado mtodos moleculares que tambin podran utilizarse para la identificacin complementaria basada en secuencias genmicas concretas.

Pruebas serolgicas y de alergia cutnea: Las pruebas del antgeno tamponado de Brucella (BBAT) y la de fijacin de complemento (CF) se suelen recomendar para el anlisis de rebaos y de animales concretos. Tambin se puede usar el enzimoinmunoanlisis (ELISA) indirecto para la deteccin. La prueba de aglutinacin del suero no se considera fiable para utilizarla en pequeos rumiantes. A efectos de deteccin sistemtica, tambin puede utilizarse el enzimoinmunoanlisis (ELISA) y la prueba de la polarizacin de la fluorescencia (FPA). Para grupos de muestras, no existen pruebas tiles, como lo es la prueba del anillo de leche en el ganado bovino. La prueba de la intradermorreaccin con brucelina puede utilizarse como prueba de cribado o complementaria en rebaos no vacunados, siempre que se utilice una preparacin purificada y estandarizada de antgeno libre de lipopolisacrido (LPS). Los resultados deben interpretarse teniendo en cuenta los signos clnicos, los antecedentes, y los resultados de exmenes serolgicos y del cultivo.

Captulo 2.7.2. Brucelosis caprina y ovina (no debida a Brucella ovis)

2 Manual Terrestre de la OIE 2012

Requisitos para las vacunas y el material biolgico de diagnstico: La cepa Rev. 1 de Brucella melitensis contina siendo la vacuna de referencia para inmunizar ovejas y cabras con riesgo de infeccin por B. melitensis, y es la vacuna respecto a la cual se debe comparar cualquier otra. La produccin de vacuna con antgenos de Brucella o con Rev.1 se basa en un sistema de lotes de inculos. Los cultivos de inculo que van a ser utilizados como antgenos para pruebas serolgicas y cutneas, y para vacunas deben proceder de centros de referencia. Deben cumplir unos estndares mnimos en cuanto a la viabilidad, uniformidad, virulencia residual e inmunogenicidad, pureza, identidad e inocuidad, si resultaran aplicables. Las preparaciones de brucelina para la prueba intradrmica deben carecer de lipopolisacrido liso y no deben producir reacciones inflamatorias inespecficas ni interferir con pruebas serolgicas. Los antgenos para las pruebas del antgeno tamponado de Brucella y de la CF deben prepararse a partir de cepas lisas de B. abortus, cepas 1119-3 o 99. Los antgenos para el ELISA indirecto se preparan a partir de la cepa de referencia 16M de B. melitensis biovariedad 1 o antgenos preparados a partir de otras cepas lisas de Brucella. Todos los antgenos deben cumplir los estndares mnimos de pureza, sensibilidad y especificidad.

A. INTRODUCCIN

La brucelosis caprina y ovina (no debida a Brucella ovis) est causada principalmente por una de las tres biovariedades de B. melitensis. Se han observado en cabras y ovejas infecciones espordicas debidas a B. abortus o B. suis, pero tales casos son muy infrecuentes. Desde el punto de vista anatomopatolgico y epidemiolgico, la infeccin de las ovejas y las cabras por B. melitensis es muy similar a la infeccin del ganado bovino por B. abortus (vase el captulo 2.4.3. Brucelosis bovina). En la mayora de los casos, las principales vas de contagio de Brucella son la placenta, los lquidos fetales y las secreciones vaginales eliminados por las ovejas y las cabras infectadas cuando abortan o paren al trmino de la gestacin. La excrecin de Brucella tambin es frecuente en las secreciones de la ubre y en el semen, y se puede aislar Brucella de varios tejidos, como los ganglios linfticos de la cabeza, el bazo y los rganos relacionados con la reproduccin (tero, testculos y epiddimos), y tambin de lesiones artrticas (2).

La infeccin por Brucella melitensis de las especies domsticas y salvajes que son susceptibles (vase el captulo 2.4.3) no resulta infrecuente cuando estas especies se cran en estrecho contacto con ovejas y cabras en zonas enzoticas. Los signos de brucelosis en estos animales son similares a los del ganado bovino u ovino y caprino.

El manual de bioseguridad del laboratorio de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), clasifica a Brucella (y en concreto a B. melitensis) en el Grupo de Riesgo III. La brucelosis es fcilmente transmisible al hombre y causa una enfermedad febril aguda - fiebre ondulante- que puede progresar a una forma crnica y producir graves complicaciones que afectan al msculo esqueltico, al sistema cardiovascular y al sistema nervioso central. A menudo la infeccin se debe a una exposicin ocupacional y se contrae fundamentalmente por va oral, respiratoria o conjuntival, aunque, para el pblico en general, la ingestin de productos lcteos constituye el principal riesgo. Los veterinarios, los matarifes y los ganaderos que manejan animales infectados y fetos abortados o placentas tienen un riesgo ocupacional. La brucelosis es una de las infecciones ms fciles de contraer en el laboratorio y deben observarse precauciones de seguridad muy estrictas cuando se manejan cultivos y muestras muy contaminadas, como lo son los productos del aborto. Se han realizado recomendaciones especficas sobre las precauciones de seguridad que se han de observar con los materiales contaminados por Brucella (para ms detalles, vase el captulo 1.1.2. Bioproteccin y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa y en las instalaciones de los animales, y las referencias 1, 39, 94 y 95 del captulo 2.4.3.). La manipulacin en el laboratorio de cultivos vivos o de material contaminado procedente de animales infectados es peligrosa, as como el manejo de grandes volmenes de Brucella, y debe realizarse bajo un nivel de contencin 3 o superior, como indica el captulo 1.1.2, para reducir la exposicin ocupacional.

La clasificacin, as como las propiedades microbiolgicas y serolgicas del gnero Brucella y especies y biovariedades relacionadas se especifican en el Captulo 2.4.3 Brucelosis bovina.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO

1. Identificacin del agente

Consltense los detalles sobre el procedimiento de identificacin de Brucella en el Captulo 2.4.3 Brucelosis bovina.


OIE Terrestrial Manual 2009 3

2. Pruebas serolgicas

Cuando el examen bacteriolgico no resulta practicable, el diagnstico de la infeccin por Brucella se basa con frecuencia en los mtodos serolgicos (2, 21). En pruebas sistemticas se detectan anticuerpos anti-Brucella en el suero. Las pruebas serolgicas ms utilizadas para el diagnstico de las infecciones por cepas lisas de Brucella en las ovejas y las cabras son las pruebas con antgeno de Brucella tamponado (BBAT), y la prueba de fijacin de complemento (CF). La prueba del anillo de leche, que ha sido tan til en el ganado bovino, resulta ineficaz en los pequeos rumiantes.

Los mtodos ms utilizados en los pequeos rumiantes son la BBAT y la CF (20). El enzimoinmunoanlisis indirecto (I-ELISA) y la prueba de polarizacin de la fluorescencia (FPA) han ofrecido un rendimiento diagnstico similar. Todas estas pruebas estn indicadas para el comercio internacional. La prueba BBAT no es completamente especfica, pero resulta adecuada como prueba de deteccin de los rebaos infectados o para garantizar la ausencia de infeccin en los rebaos libres de brucelosis. No obstante, debido a la relativa falta de sensibilidad de ambos mtodos, no son infrecuentes las discrepancias entre los resultados obtenidos mediante la prueba del Rosa de Bengala (RBT) y mediante la CF en poblaciones de ovejas y cabras infectadas (7). Por tanto, deben considerarse simultneamente los resultados de ambas pruebas, con el fin de aumentar la posibilidad de detectar los individuos afectados y mejorar el control de la enfermedad en las reas donde no se ha erradicado por completo (1, 5, 7). Si en los programas de erradicacin no se puede utilizar en paralelo la CF con la RBT, por razones prcticas o econmicas, se recomienda mejorar la sensibilidad de la RBT utilizando tres volmenes de suero y uno de antgeno (por ejemplo, 75 l de suero y 25 l de antgeno) en lugar de volmenes iguales. Esta sencilla modificacin aumenta la sensibilidad de la RBT y disminuye las discrepancias entre los resultados de las dos pruebas (7). Como ninguna de ambas pruebas permite distinguir los anticuerpos inducidos por la vacunacin con Rev.1 de los inducidos por la infeccin con B. melitensis, los resultados de la RBT y de la CF deben interpretarse con cautela en funcin del estado de vacunacin del rebao. Adems, estas pruebas no son lo suficientemente especficas como para diferenciar las reacciones serolgicas debidas a B. melitensis de los falsos positivos debidos a las bacterias que generan reaccin cruzada, como Yersinia enterocolitica O:9.

Se han obtenido buenos resultados diagnsticos en ovejas y cabras con enzimoinmunoanlisis (ELISA) indirectos (I-ELISA) o de competicin (C-ELISA) utilizando varios antgenos pero, en general, los de alto contenido en lipopolisacrido (LPS) en fase lisa son los ms fiables. El C-ELISA tiene una sensibilidad similar a la de las pruebas clsicas, RBT y CF, y una mayor sensibilidad que estas. Pero al igual que las pruebas clsicas, ambas pruebas ELISA son incapaces de distinguir entre los animales infectados por B. melitensis y los animales recin vacunados con la vacuna Rev.1 (22) o infectados con bacterias que generan reaccin cruzada. Algunos de estos ELISA tienen potenciales ventajas en la sensibilidad y/o la especificidad respecto a la BBAT y la CF (17). Se han aplicado estudios preliminares con C-ELISA con una protena periplasmtica de B. abortus (27) o B. melitensis (12) como antgeno en ovejas, y se han observado resultados prometedores de diferenciacin entre animales vacunados con Rev.1 y animales infectados por B. melitensis (11, 14).

Sueros de referencia Los estndares de referencia de la OIE son aquellos con los cuales se comparan y calibran otros estndares. En el caso de la BBAT y de la CF, en el captulo 2.4.3. Brucelosis bovina se detallan los protocolos de estandarizacin de antgeno y analticos. Se ha desarrollado un estndar de referencia caprino para los ELISA y la FPA de deteccin de anticuerpos ovinos y caprinos, del que pronto dispondrn los laboratorios nacionales de referencia1.

Produccin de clulas Consltese el captulo 2.4.3. Brucelosis bovina. Las nicas cepas recomendadas para la preparacin de la BBAT y de la CF en las ovejas y las cabras son las cepas 99 o 1119 de la biovariedad 1 de Brucella abortus.

a) Prueba de antgeno tamponado de Brucella (prueba prescrita para el comercio internacional)

Consltese el captulo 2.4.3. Brucelosis bovina.

Produccin de antgeno Consltese el captulo 2.4.3. Brucelosis bovina. Advirtase que normalmente se utiliza antgeno RB producido con B. abortus para las pruebas de B. melitensis La estandarizacin del antgeno RB, como se describe en el captulo 2.4.3, proporciona una sensibilidad suficiente para la BBAT a efectos del mercado internacional. Adems, permite asegurar una especificidad suficiente en reas libres donde tienen lugar

1 Se puede conseguir en el Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis, en Veterinary Laboratories Agency

(VLA) Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, Reino Unido.



falsos positivos debidos a bacterias que dan una reaccin cruzada, como Yersinia enterocolitica O:9. Sin embargo, esta estandarizacin es probablemente la causa principal de la baja sensibilidad de algunos lotes de antgeno RB y de las discrepancias con la CF (7). Por tanto, cuando se usa la RBT en programas de erradicacin en las reas endmicas, podra ser aconsejable ajustar el ttulo del antgeno RB, de modo que sea positivo a una dilucin de OIEISS (suero estndar internacional de la OIE) a 1/45 y negativo a una dilucin 1/55, sin que afecte a la especificidad de la prueba. Las discrepancias con la CF pueden reducirse tambin usando tres volmenes de suero y uno de antgeno (por ejemplo, 75 l de suero y 25 l de antgeno) en lugar del mismo volumen de ambos, como se mencion en el procedimiento analtico estndar.

Procedimiento analtico Consltese el captulo 2.4.3 Brucelosis bovina.

b) Prueba de fijacin del complemento (prueba prescrita para el comercio internacional)

Produccin de antgeno

Consltese el captulo 2.4.3 Brucelosis bovina. Advirtase que se utiliza antgeno para FC producido con B. abortus para las pruebas de deteccin de B. melitensis.

Procedimiento analtico Consltese el captulo 2.4.3 Brucelosis bovina.

c) Enzimoinmunoanlisis (prueba prescrita para el comercio internacional)

Se han descrito distintas variaciones de la tcnica I-ELISA en las que se utilizan diversas preparaciones de antgeno, conjugados antiglobulina-enzima y substratos/cromgenos. Estn disponibles comercialmente varios I-ELISA, pero antes de utilizarlos para el comercio internacional, deben establecerse adecuadamente sus respectivos umbrales con las tcnicas de validacin apropiadas (consltese el Captulo 1.1.4. Principios de validacin para las pruebas de diagnstico de enfermedades infecciosas) y estas pruebas deben estandarizarse contra el estndar anteriormente mencionado.

El mtodo analtico se describe en el Captulo 2.4.3 Brucelosis bovina.

d) Prueba de polarizacin de la fluorescencia (prueba prescrita para el comercio internacional)

La FPA para la deteccin anticuerpos caprinos y ovinos contra Brucella sp. es bsicamente la misma que la descrita para el ganado bovino (se detalla en el Captulo 2.4.3); un ejemplo de la dilucin srica utilizada es 1/15 para la prueba en tubo y 1/10 para la prueba en placa (23-26). Es una tcnica sencilla para medir la interaccin antgeno/anticuerpo. La FPA podra utilizarse como prueba de deteccin sistemtica y/o confirmativa. Antes de utilizarla para el comercio internacional, debe establecerse adecuadamente el umbral de la FPA con tcnicas de validacin apropiadas (consltese el Captulo 1.1.4. Principios de validacin para las pruebas de diagnstico de enfermedades infecciosas) y esta prueba debe estandarizarse contra el estndar anteriormente mencionado

3. Otras pruebas

a) Prueba intradrmica de la brucelina (prueba alternativa para el comercio internacional)

Una prueba de diagnstico alternativa es la prueba intradrmica de la brucelina, que puede utilizarse para detectar la enfermedad en rebaos no vacunados, siempre que se emplee una preparacin antignica purificada y estandarizada (libre de LPS) (por ejemplo, brucelina INRA).

La prueba intradrmica de la brucelina tienen una elevada sensibilidad para el diagnstico de la infeccin por B. melitensis en los pequeos rumiantes y, en ausencia de vacunacin, se considera una de las pruebas diagnsticas ms especficas (2, 5, 17, 20). Esta prueba tiene un valor particular para interpretar los falsos positivos debidos a la infeccin por bacterias que generan reaccin cruzada (los animales afectados que dan falsos positivos siempre dan negativo en la prueba intradrmica), especialmente en las reas libres de brucelosis.

Los animales vacunados con Rev.1 pueden reaccionar durante aos a la misma (17). Por ello, esta prueba no se recomienda como prueba nica de diagnstico ni para el comercio internacional en reas donde se utiliza la vacuna con Rev.1.

Para obtener resultados adecuados es esencial utilizar preparaciones estandarizadas de brucelina que no contengan LPS, ya que este antgeno puede provocar reacciones inflamatorias mediadas por anticuerpos o



inducir anticuerpos que interfieran con el posterior anlisis serolgico. Una preparacin de este tipo es la brucelina INRA, que se obtiene a partir de una cepa rugosa de B. melitensis y est comercializada

2.

Procedimiento analtico i) En el prpado inferior se inyecta por va intradrmica 0,1 ml de brucelina.

ii) La prueba se lee a las 48 horas.

iii) Cualquier reaccin visible o palpable de hipersensibilidad, como una reaccin edematosa que provoca una elevacin de la piel o un engrosamiento del prpado ( 2 mm), se considera una reaccin positiva

Aunque en ausencia de vacunacin la prueba intradrmica con brucelina es una de las pruebas ms especficas de la brucelosis, el diagnstico no debe basarse exclusivamente en reacciones intradrmicas positivas sino que tambin debe estar respaldado por las pruebas serolgicas adecuadas. La inoculacin intradrmica de la brucelina puede provocar una anergia temporal en la respuesta inmunitaria celular. Se recomienda, por tanto, dejar un intervalo de 6 semanas entre dos pruebas consecutivas en el mismo animal.

b) Pruebas con haptenos nativos

Las pruebas de precipitacin en gel basadas en haptenos nativos3 (como se describe en el Captulo 2.4.3) tambin son aplicables a ovejas y cabras, puesto que son muy especficas discriminando las respuestas serolgicas de animales infectados (positivos) de aquellas inducidas en animales vacunados con Rev.1 (normalmente negativos pasado cierto tiempo tras la vacunacin).

La sensibilidad diagnstica ptima (de alrededor del 90%) se obtiene en las pruebas de doble difusin en gel (DGD) o inmunodifusin radial inversa para ovejas y cabras, respectivamente (14, 20).

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL BIOLGICO DE DIAGNSTICO

C1. Brucelina

Consltese el captulo 2.4.3 Brucelosis bovina.

C2. Vacunas

Vacuna con la cepa Rev. 1 de Brucella melitensis

La vacuna ms utilizada para la prevencin de la brucelosis en las ovejas y las cabras es la vacuna de Brucella melitensis Rev.1, que contina siendo la vacuna de referencia con la que deben compararse otras vacunas. La vacuna RB51 no es eficaz en ovejas contra la infeccin por B. melitensis (16). Adems, otros mutantes rugosos defectuosos en la parte central y en la sntesis y exportacin de O-polisacrido inducen anticuerpos que reaccionan en el I-ELISA con LPS y son menos eficaces que la vacuna Rev.1 contra la infeccin ovina por B. melitensis (4). La vacuna con Rev. 1 se utiliza en forma de suspensin liofilizada de cepa viva de B. melitensis biovariedad 1 Rev. 1 para la inmunizacin de ovejas y cabras. Normalmente debe administrarse a corderos y cabritos de entre 3 y 6 meses de edad en forma de una sola inoculacin subcutnea o conjuntival. La dosis estndar es de entre 0,5 109 y 2 109 microorganismos viables. La vacunacin subcutnea induce una fuerte interferencia con las pruebas serolgicas y no debe recomendarse en los programas combinados de erradicacin (15, 22). Sin embargo, cuando esta vacuna se administra por va conjuntival produce una proteccin similar sin inducir una respuesta de anticuerpos persistente, facilitando as la aplicacin de programas de erradicacin combinados con vacunacin (15, 22). Cuando se utiliza la vacuna Rev.1, se debe tener cuidado de evitar la contaminacin del ambiente o causar la infeccin en humanos. En muchos pases en desarrollo y en las zonas endmicas, la mejor opcin para el control de la enfermedad es vacunar a toda la poblacin (6). Sin embargo, se sabe que, a menudo, la vacuna Rev.1 causa abortos y excrecin del microorganismo en la leche cuando los animales se vacunan durante la gestacin, tanto con una dosis completa como con una reducida (6). Estos efectos secundarios se reducen considerablemente cuando los animales adultos se vacunan por va conjuntival

2 Brucellergne OCB, Synbiotics Europe, 2 rue Alexander Fleming, 69007 Lyon, Francia. 3 El procedimiento detallado est disponible en el Departamento de Sanidad Animal, Centro de Investigacin y Tecnologa

Agroalimentaria/Gobierno de Aragn, Avenida Montaana 930, 50059. Zaragoza. Espaa.



(dosis completa) antes de la monta o durante el ltimo mes de la gestacin. En consecuencia, cuando la vacunacin masiva es el nico medio de controlar la enfermedad, se debe recomendar una campaa de vacunacin utilizando la dosis estndar de Rev.1 administrada por va conjuntival cuando los animales no estn gestantes o al final de la estacin de partos y previa a la monta o inseminacin artificial (6).

La vacunacin de animales jvenes por va subcutnea y la vacunacin de animales adultos, incluso con dosis bajas, puede comportar la persistencia de anticuerpos vacunales a largo plazo en una proporcin importante de los animales vacunados que cree graves interferencias en el diagnstico serolgico de la brucelosis. Como se ha indicado anteriormente, la vacunacin por va conjuntival minimiza estos problemas y, por tanto, es el mtodo recomendado para los programas de erradicacin combinados. Por tanto, en el diagnstico serolgico de la brucelosis debe tenerse en cuenta el estado vacunal del rebao y las proporciones generales de ttulos de anticuerpos en el grupo de animales analizado.

1. Manejo del inculo

a) Caractersticas del inculo

El inculo original de Brucella melitensis biovariedad 1 cepa Rev.1 para la produccin de vacunas se puede obtener comercialmente

4. Recientemente, la Farmacopea Europea

5 ha producido una cepa europea Rev.1

de referencia que posee las caractersticas del inculo Rev.1 original.

La produccin de vacunas vivas de Brucella se basa en el sistema de lotes de siembra descrito anteriormente (seccin B.2.) para los antgenos de la BBAT y de la CF. Las cepas deben cultivarse en un medio adecuado. La cepa Rev.1 debe tener las propiedades de B. melitensis biovariedad 1, salvo que debe crecer ms lentamente. Adems, cuando se incuba en aire (las atmsferas con CO2 alteran los resultados) a 37C, debe crecer en medio slido con estreptomicina (2,5 g/ml) y su crecimiento debe inhibirse en presencia de bencilpenicilina sdica (3 g [5 Unidades Internacionales (UI)]/ml), tionina (20 g/ml) o fucsina bsica (20 g/ml). Recientemente, para una caracterizacin adicional de la vacuna, se ha utilizado la amplificacin por medio de la reaccin en cadena de la polimerasa y otras tcnicas moleculares (3, 13). Tambin debe cumplir las caractersticas del inculo original en cuanto a virulencia residual e inmunogenicidad en ratones.

b) Mtodo de cultivo

Entre los medios slidos satisfactorios para cultivar la cepa Rev.1 estn el agar suero-dextrosa y el agar tripticasa-soja, a los que se puede aadir un 5% de suero o un 0,1% de extracto de levadura (2, 28). La cepa Rev.1 no crece bien en agar patata.

Para la produccin de la vacuna, Rev.1 se puede cultivar en condiciones similares a las descritas para S99 y S1119-3 (vase el Captulo 2.4.3.), excepto que Rev.1 suele necesitar 3-5 das para crecer, que se sustituye la solucin salina con fenol por un estabilizador para liofilizacin, y que los microorganismos no se inactivan sino que se guardan a 4C mientras se realiza el examen de control de calidad que se describe ms adelante. Adems, se recomienda especficamente en la produccin de vacunas con Rev.1 que: cada lote de inculo (es decir, el cultivo empleado como siembra del medio para la produccin de vacuna) no tenga ms de tres pases desde el inculo original, y que la recogida de un lote de vacuna no tenga ms de tres pases desde un lote de inculo o desde un inculo original. Antes de su uso, se debe realizar un cultivo del inculo original para verificar la ausencia de disociacin. El mtodo recomendado para preparar el material de inculo se indica en la referencia 2. Se ha demostrado la utilidad del siguiente estabilizador para liofilizacin (esterilizado por filtracin): hidrolizado enzimtico de casena (2,5 g); sacarosa (5 g); glutamato sdico (1 g); agua destilada (100 ml).

c) Validacin como vacuna

Diversos estudios independientes han confirmado el valor de la cepa Rev.1 de B. melitensis como vacuna para proteger a las ovejas y las cabras de la brucelosis. Su virulencia no cambia a pesar de pases en ovejas o cabras gestantes. Pueden presentarse abortos cuando la vacuna Rev.1 se inocula en ovejas o cabras gestantes. Los abortos inducidos por la vacuna no se evitan con dosis reducidas, y se ha observado que dosis con una concentracin tan baja como de 106, usadas subcutnea o conjuntivalmente, inducen abortos y la aparicin de los microorganismos vacunales en la leche (5).

4 Disponible en el Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Laboratoire de Pathologie Infectieuse et

Immunologie, 37380 Nouzilly, Francia.

5 Disponible en la Farmacopea Europea, BP 907, 67029 Strasbourg Cedx 1, Francia.



Una vacuna Rev.1 es eficaz si posee las caractersticas de la cepa original Rev.1, es decir, las de B. melitensis biovariedad 1, cepa de referencia 16M (ATCC No. 23456), excepto las que son especficas de la cepa Rev.1 (2, 20), y si se demuestra que es satisfactoria respecto a la inmunogenicidad y virulencia residual en el modelo murino (9) (vase ms adelante).

2. Mtodo de fabricacin (2, 21)

Para la produccin de la vacuna de B. melitensis cepa Rev.1, se pueden seguir los procedimientos descritos anteriormente para los antgenos (2), excepto por el hecho de que las clulas se recogen en un estabilizador para liofilizacin y se precipitan por centrifugacin. Una produccin individual est constituida por la masa obtenida de un fermentador o la masa de las clulas agrupadas de una serie de cultivos en frascos Roux que fueron inoculados a la vez con el mismo lote de inculo. Se puede juntar ms de una produccin individual para formar el producto final utilizado para rellenar los recipientes de un lote de vacuna. Antes de juntarlas, debe comprobarse la pureza, la concentracin celular, la disociacin y la identidad de cada produccin individual. El volumen del producto final se ajusta aadiendo el suficiente estabilizador para que la dosis contenga un nmero apropiado de microorganismos viables. Despus de ajustar la concentracin celular del producto final, se llevan a cabo pruebas para comprobar la identidad, la disociacin y la ausencia de microorganismos (vase ms adelante).

3. Control durante el proceso

Deben realizarse controles durante el proceso verificando el crecimiento de la vacuna Rev.1 en medios slidos y lquidos, para comprobar la identidad y asegurar la pureza y ausencia de disociacin a formas rugosas durante la preparacin de los lotes de inculo, las recogidas individuales, el producto a granel final no envasado y los lotes finales (de llenado). Al menos el 99% de las clulas en los lotes de inculo y el 95% de las clulas de los lotes finales deben estar en la fase lisa.

La concentracin celular debe establecerse en el producto no envasado y determinarse con precisin en los lotes finales. La inmunogenicidad y la virulencia residual (50% del tiempo de persistencia o 50% del tiempo de recuperacin) tambin deben determinarse tanto en los lotes de inculo como en los lotes finales. Si estas pruebas dan buenos resultados en un lote representativo de la vacuna problema, no deben repetirse sistemticamente en los lotes de la vacuna que se hayan preparado a partir del mismo lote de inculo y con el mismo proceso de fabricacin.

4. Control de lotes

Con vacuna liofilizada, las pruebas de control deben realizarse con la vacuna reconstituida en la forma en que se va a utilizar.

a) Esterilidad (o ausencia de microorganismos extraos)

Debe comprobarse si la vacuna Rev.1 contiene contaminacin bacteriana o fngica, como se describe en el captulo 1.1.9. Pruebas para comprobar la esterilidad y la ausencia de contaminacin de los productos biolgicos.

b) Inocuidad

La vacuna Rev.1 es per se un producto virulento y debe mantenerse con una virulencia residual para que sea eficaz (vase el apartado C2.4.c. del captulo 2.4.3.).

c) Potencia

Una vacuna Rev.1 es eficaz si presenta las mismas caractersticas que la cepa original Rev.1, es decir, si es satisfactoria respecto a la inmunogenicidad y la virulencia residual (10). Tambin debe comprobarse cul es el nmero de microorganismos viables que contienen los lotes.

Identidad La vacuna Rev.1 reconstituida no debe contener microorganismos extraos. El microorganismo Brucella melitensis presente en la vacuna se identifica mediante pruebas morfolgicas, serolgicas y bioqumicas y de cultivo: cuando se incuba en aire a 37C, la cepa Rev.1 se inhibe por adicin a un medio de cultivo adecuado de 3 g (5 UI) por ml de bencilpenicilina sdica, tionina (20g/ml) o fucsina bsica (20 g/ml); la cepa crece en agar que contenga 2,5 g por ml de estreptomicina.

Lisura (determinacin de la fase de disociacin) Consltese el Captulo 2.4.3 Brucelosis bovina.



A veces se pueden ver en el tamao de las colonias de Rev.1 pequeas diferencias difciles de observar. Las colonias pequeas (de 1-1,2 mm de dimetro) son tpicas de Rev.1, pero pueden aparecer colonias mayores, dependiendo del medio utilizado, de la cantidad de humedad residual en la atmsfera de incubacin y de la presencia o ausencia de CO2. La frecuencia de variacin del tamao de las colonias se presenta, por lo general, en una proporcin de 1 colonia grande por cada 103 pequeas. Ambas variantes Rev.1 son de tipo liso (S). Para evitar un aumento de esta variacin de tamao de las colonias en pases sucesivos, es importante seleccionar siempre colonias pequeas para la preparacin de los lotes de inculo.

Determinacin de bacterias vivas Consltese el Captulo 2.4.3 Brucelosis bovina.

Virulencia residual (tiempo de persistencia al 50% o tiempo de recuperacin al 50%)(8, 18). Los procedimientos indicados para determinar el tiempo de recuperacin al 50% (RT50) de la vacuna S19 (vase el captulo 2.4.3) se aplican tambin a Rev.1, excepto por el hecho de que el lote de inculo de B. abortus S19 (vacuna problema) que se ha de analizar y el cultivo de inculo original de S19 (cepa de referencia) se reemplazan, respectivamente, por el correspondiente lote de inculo de B. melitensis Rev.1 a analizar (vacuna problema) y por el cultivo de inculo original de B. melitensis Rev.1 como cepa de referencia. Para la cepa original de referencia Rev.1, RT50 y los lmites de confianza son de 7,9 1,2 semanas. Para ser aceptable, un lote de inculo concreto de vacuna Rev.1 debe mantener una virulencia residual similar.

Si esta prueba da buenos resultados con un lote representativo de la vacuna problema, no tiene que repetirse sistemticamente en otros lotes de inculo o de vacuna que se hayan preparado con el mismo inculo original y con el mismo proceso de fabricacin

Inmunogenicidad en ratones Los procedimientos indicados para determinar la inmunogenicidad de la vacuna S19 (vase el captulo 2.4.3) se aplican tambin a Rev.1, excepto por el hecho de que el lote de inculo de B. abortus S19 (vacuna problema) que se ha de analizar y el cultivo de siembra original de S19 (utilizado como cepa de referencia) se reemplazan, respectivamente, por el correspondiente lote de inculo de B. melitensis Rev.1 que se ha de analizar (vacuna problema) y por el cultivo original de siembra de B. melitensis Rev.1 como cepa de referencia.

Las condiciones de la prueba control son satisfactorias cuando: i) la respuesta en ratones no vacunados (media de Y) es de al menos 4,5; la respuesta en ratones vacunados con la vacuna de referencia Rev.1 es inferior a 2,5; y iii) la desviacin estndar calculada en cada lote de seis ratones es inferior a 0,8.

Si esta prueba da buenos resultados con un lote representativo de la vacuna problema, no tiene que repetirse en los lotes de inculo o de vacuna que se hayan preparado con el mismo inculo original y con el mismo proceso de fabricacin

d) Duracin de la inmunidad

Se acepta que la vacunacin subcutnea o conjuntival de ovejas y cabras con dosis estndar de Rev.1 confiere una inmunidad slida y duradera. Sin embargo, la evidencia en el campo indica que la inmunidad adquirida disminuye con el tiempo, y se recomienda la revacunacin en las zonas endmicas.

El uso de dosis reducidas de Rev.1 produce una inmunidad menos eficaz, mientras que los efectos secundarios, como las respuestas de anticuerpos o la induccin del aborto, no se eliminan por completo.

e) Estabilidad

La vacuna con la cepa Rev.1 preparada a partir de inculos originales de origen apropiado tiene propiedades estables siempre que se cumplan los requisitos antes descritos de control durante el proceso y de los lotes y no muestre tendencia a la reversin de la virulencia. La vacuna liofilizada presenta una prdida gradual de microorganismos viables, pero debe mantener su potencia durante el periodo de vida til recomendado. Esto se logra asegurando que el recuento de microorganismos de viables inmediatamente despus de la liofilizacin supere ampliamente el mnimo requerido. El mantenimiento de una cadena de fro durante la distribucin de la vacuna asegura su viabilidad.

f) Conservantes

En las vacunas vivas con Rev.1 no se deben utilizar conservantes antimicrobianos. Para la preparacin de la vacuna liofilizada se recomienda un estabilizador como se describe en el apartado C2.4.f. del captulo 2.4.3.



g) Precauciones (riesgos)

Consltese el Captulo 2.4.3. Brucelosis bovina. La cepa Rev. 1 de Brucella melitensis Rev.1, incluso atenuada es capaz de causar la enfermedad en el ser humano. Por ello, los cultivos y las suspensiones celulares deben manipularse en las condiciones apropiadas de contencin del bioriesgo (vase el captulo 1.1.2). La reconstitucin y posterior manipulacin de la vacuna reconstituida deben efectuarse con cuidado, para evitar la inoculacin accidental o la contaminacin ocular o cutnea. Los residuos de vacunas y los equipos de inyeccin deben descontaminarse con un desinfectante adecuado. En caso de exposicin accidental, debe buscarse ayuda mdica. No se ha determinado de forma adecuada la eficacia del tratamiento antibitico de las infecciones causadas por Rev.1 en los humanos, pero datos obtenidos en ratones sugieren que si tiene lugar una contaminacin por Rev. 1, puede recomendarse un tratamiento combinado con doxiciclina ms rifampicina o gentamicina (19).

5. Pruebas en el producto final

a) Inocuidad

Vase el apartado C2.4.b del Captulo 2.4.3.

b) Potencia

En el caso de la vacuna liofilizada, la potencia debe determinarse en el producto final. Las pruebas son las descritas en el apartado C2.4.c. del Captulo 2.4.3.

Para asegurar la eficacia de la vacuna, a los 1520 das de la vacunacin se deben tomar muestras representativas de sangre de los animales que eran previamente seronegativos y que han sido vacunados con cada lote de nueva vacuna, y someter las muestras de suero a la BBAT. Para que la vacuna resulte adecuada, deben ser positivos en dicha prueba ms del 80% de los animales vacunados, independientemente de la va de vacunacin utilizada.

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NB: Existen Laboratorios de Referencia de la OIE para la Brucelosis caprina y ovina (no debida a Brucella ovis) (puede consultarse la lista ms actualizada en la Tabla de la Parte 3 de este Manual Terrestre o en la pgina web

de la OIE : www.oie.int).

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