C ´ P UTILIZANDO T PTICAS · 2017-01-26 · CLASIFICACION DE´ PIEL UTILIZANDO TECNICAS´ O´...

CLASIFICACI ON DE PIEL

UTILIZANDO T ECNICAS OPTICAS

PorLic. Jose Fabian Villa Manr ıquez

Tesis sometida como requisito parcial para obtener el gradode

Maestro en Ciencias en la especialidad deOptica

en el

Instituto Nacional de Astrofısica,Optica y ElectronicaJulio 2013

Tonantzintla, Puebla

Supervisada por:

Dr. Jorge Castro Ramos, INAOE

c©INAOE 2013Todos los derechos reservados

El autor otorga al INAOE el permiso de reproducir y distribuir copiasen su totalidad o en partes de esta tesis

“Se paciente y no pretendas que llegue todo de inmediato”.Anonimo

“Da tu primer paso ahora. No es necesario que veas el camino completo,pero da tu primer paso. El resto ira apareciendo a medida que camines”.

Martin Luther, Jr.

“Si supiese que es lo que estoy haciendo, no le llamarıa investigacion,¿verdad?”.

Albert Einstein

“Todos somos muy ignorantes. Solo que no todos ignoramos lo mismo”.Albert Einstein

Dedicatoria

A mis padres Guillermo Villa Venegas† quien dedico toda su vida a dar lo mejor a

sus hijos, quien me diera sabios consejos, ensenandome a ser un mejor hombre. Y

Marıa de los Angeles Manrıquez Lopez que siempre ha dado lo mejor de su vida sin

recibir nada a cambio, por ser el unico pilar que sostiene mi vida.

A mis hermanos Lennin, Miguel y Daniel por su gran apoyo, por creer en mı.

A mis sobrinos Kevin, Alan y Emiliano por los grandes momentos de felicidad que

me han dado estos angelitos.

Y a toda mi familia que siempre me ha apoyado.

2

Agradecimientos

Quiero agradecer primero a mis padres que me dieron la posibilidad de estudiar lo

que yo quisiera, ya que si no hubiera sido por ellos yo no estarıa aquı. A mi asesor

el Dr. Jorge Castro Ramos por su apoyo y por confiar en mı. A mi gran amigo el

Dr. Adrian E. Villanueva por su gran ayuda durante toda la tesis. Al INAOE por

permitirme realizar mis estudios de posgrado. A CONACyT por la beca para la

manutencion durante mi estancia en la maestrıa. Al grupo de GIOB por sus crıticas

y comentarios, los cuales han retroalimentado mis conocimientos en el area de optica.

A mis profesores que me dieron cursos por ensenarme lo importante que es la optica

en el mundo moderno. Y a todos mis companeros y grandes amigos que he tenido

en esta institucion.

A mis sinodales los doctores Francisco Javier Renero Carrillo, Gonzalo Urcid Serrano

y Alberto Jaramillo Nunez por sus criticas y comentarios para mejorar esta tesis.

3

Indice general

Dedicatoria 2

Agradecimientos 3

Resumen 12

1. Introduccion 14

1.1. Objetivos y metas de la tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.2. Estructura de la tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2. Teorıa 17

2.1. Espectroscopia Raman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.2. Ruidos en espectroscopia Raman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.2.1. Ruido de disparo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.2.2. Ruido generado por la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.2.3. Ruido generado por la instrumentacion . . . . . . . . . . . . . 24

2.2.4. Ruido de cuantizacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.2.5. Ruido generado por fuentes externas . . . . . . . . . . . . . . 24

2.2.6. vibraciones moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.3. Metodos de Filtrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.3.1. Metodo MinMax . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.3.2. Savitzky-Golay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.3.3. Eliminacion de ruido Wavelet . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.3.4. Ajuste polinomial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

2.4. Analisis de Componentes Principales (PCA) . . . . . . . . . . . . . . 34

4

2.4.1. Matematicas del PCA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.5. Discriminante Linear de Fisher . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

3. Arreglo experimental 38

3.0.1. Componentes del espectrometro QE65000 . . . . . . . . . . . 39

3.1. Tomografıa Optica Coherente (OCT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.2. Skin moisture analyzer SK-III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.3. Interfaz para la eliminacion de ruido . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.4. COBRA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

4. Resultados 59

4.1. Espectros Raman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.2. (PCA) con Matlab . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

4.3. Discriminante lineal de Fisher . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

5. Conclusiones 96

5.1. Trabajo a futuro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

5.2. Participaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

Bibliografıa 99

Indice de figuras

2.1. Experimento de C. V. Raman donde se hace incidir la luz del sol a una

muestra para observar el cambio en la radiacion. . . . . . . . . . . . . . 18

2.2. Diagrama de Janblonsky. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.3. Espectro Raman del sulfuro mostrando las bandas Rayleigh, Stokes y anti-

Stokes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.4. Espectro Raman con los tipos de ruido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.5. Vibraciones moleculares de moleculas triatomicas. . . . . . . . . . . . . . 26

2.6. Ajuste con el metodo MinMax de un espectro con fluorescencia de tipo

Gaussiano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.7. Ajuste polinomial aplicado a la Rodamina 6G. A) Espectro de entrada y

ajuste polinomial por mınimos cuadrados de la fluorescencia. B) Espectro

Raman y curva de ajuste modificada con dos iteraciones hasta el suavizado

de la curva a lo largo de la base del espectro. . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.1. Componentes del espectrometro Raman QE65000. . . . . . . . . . . . . . 39

3.2. Esquema del arreglo experimental para la obtencion de espectrometro Ra-

man en la piel. (1) Computadora, (2) espectrometro QE65000, (3) laser de

785 nm, (4) punta de prueba con dos fibras (excitacion y coleccion), (5)

muestra. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.3. Arreglo experimental para la obtencion de espectrometro Raman en la piel. 42

3.4. Esquema de un OCT con un interferometro de Michelson. . . . . . . 43

3.5. Diagrama esquematico de un sistema OCT. SLD: diodo super luminis-

cente; PD: fotodiodo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.6. OCT Thorlabs SR-OCT con el que cuenta el laboratorio de biomedica. 44

6

3.7. Skin moisture analyzer SK-III. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.8. Interfaz principal creada en MATLAB. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.9. Cuadro de suavizado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.10. Senal sin ruido despues de presionar el boton de S-Golay. . . . . . . . . . 47

3.11. Senal sin ruido despues de presionar el boton de Boxcar. . . . . . . . . . 48

3.12. Senal sin ruido despues de presionar el boton de Wavelet. . . . . . . . . . 48

3.13. Cuadro Baseline para quitar la fluorescencia. . . . . . . . . . . . . . . . 49

3.14. Senal sin ruido y fluorescencia con el metodo MinMax. . . . . . . . . . . 49

3.15. Senal sin ruido y fluorescencia con el metodo GIFTS. . . . . . . . . . . . 50

3.16. Interfaz COBRA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.17. Archivo importado el cual se grafica en la parte izquierda de la interfaz. . . 52

3.18. Cuadro para importar el ruido de fondo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.19. Senal original (grafica izquierda) y sin ruido de fondo (grafica derecha). . . 53

3.20. Regiones del ruido de fondo, con tres regiones definidas. . . . . . . . . . . 53

3.21. Punto seleccionado en la senal filtrada para conocer las coordenadas del

ruido de fondo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.22. Cuadro de ajuste polinomial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.23. Ajuste de la senal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.24. Cuadro de wavelet transform. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.25. La senal despues de 6 niveles de wavelet transform. . . . . . . . . . . . . 56

3.26. Transformada de Fourier y funcion de filtro pasa bajas para la senal filtrada. 57

3.27. Senal filtrada despues de eliminar el ruido y el ruido de fondo. . . . . . . 57

3.28. Cuadro de todos los filtros. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.1. Espectro Raman a tres tiempos de integracion para obtener el mejor en las

mediciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

4.2. Espectro Raman del dedo ındice de 10 voluntarios (lıneas de colores) com-

parados con las bandas del colageno reportadas en la literatura (lınea negra). 61

4.3. Espectro Raman del dedo ındice de 10 voluntarios con un acercamiento en

las bandas 667, 820, 856 y 884 cm−1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62


las bandas 1169, 1205, 1223, 1247, 1267, 1283 y 1340 cm−1. . . . . . . . 62


las bandas 1635 cm−1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

4.6. Espectro Raman del antebrazo de 10 voluntarios (lıneas de colores) com-

parados con las bandas del colageno reportadas en la literatura (lınea negra). 63

4.7. Espectro Raman del antebrazo de 10 voluntarios con un acercamiento en

las bandas 667, 820, 856 y 884 cm−1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64


las bandas 1169, 1205, 1223, 1247, 1267, 1283 y 1340 cm−1. . . . . . . . 64


las bandas 1635 cm−1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

4.10. Espectro Raman del dorso de 10 voluntarios (lıneas de colores) comparados

con las bandas del colageno reportadas en la literatura (lınea negra). . . . 65

4.11. Espectro Raman del dorso de 10 voluntarios con un acercamiento en las

bandas 667, 820, 856 y 884 cm−1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66


bandas 1169, 1205, 1223, 1247, 1267, 1283 y 1340 cm−1. . . . . . . . . . 66


bandas 1635 cm−1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

4.14. Bandas del colageno que mejor se ajustaron al espectro experimental en el

antebrazo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68


dedo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68


dorso. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

4.17. Componentes principales 1 vs 2 y 1 vs 3 del antebrazo. . . . . . . . . . . 72

4.18. Componentes principales 2 vs 3 del antebrazo. . . . . . . . . . . . . . . . 72

4.19. Componentes principales 1 vs 2 y 1 vs 3 del dedo ındice. . . . . . . . . . 73

4.20. Componentes principales 2 vs 3 del dedo ındice. . . . . . . . . . . . . . . 73

4.21. Componentes principales 1 vs 2 y 1 vs 3 del dorso. . . . . . . . . . . . . 74

4.22. Componentes principales 2 vs 3 del dorso. . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.23. Buena separacion obtenida con la funcion de transformacion. . . . . . . . 76

4.24. Espectros de los 18 voluntarios del antebrazo superpuestas con las bandas

del colageno (lınea negra). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

4.25. Espectros de los 18 voluntarios superpuestas del dedo con las bandas del

colageno (lınea negra). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

4.26. Espectros de los 18 voluntarios del dorso superpuestas con las bandas del

colageno (lınea negra). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

4.27. Bandas del colageno de los espectros experimentales de los 18 voluntarios

del antebrazo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86


del antebrazo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87


del antebrazo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

Indice de Tablas

2.1. Bandas Raman del colageno. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27



4.2. Porcentaje de humectacion de cada una de las zonas de cada voluntario

sin y con colageno (las muestras primadas son las muestras a las que

se aplico colageno). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

4.3. Valores de entrada para calcular la funcion discriminante de Fisher

del antebrazo (NH = NoHumectado y H = Humectado). . . . . . . 77


del dorso (NH = NoHumectado y H = Humectado). . . . . . . . . . 78


del dedo (NH = NoHumectado y H = Humectado). . . . . . . . . . 79

4.6. Resultados obtenidos con las ecuaciones 4.2a, 4.2b para el antebrazo

( ∗ son mal clasificados). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

4.7. Resultados obtenidos con las ecuaciones 4.3a, 4.3b para el dedo ındice

( ∗ son mal clasificados). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

4.8. Resultados obtenidos con las ecuaciones 4.4a, 4.4b para el dorso

( ∗ son mal clasificados). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83


sin y con colageno (las muestras primadas son las muestras a las que se

aplico colageno). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

10


sin y con colageno (las muestras primadas son las muestras a las que se

aplico colageno). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

4.11. Resultados de la clasificacion mediante el metodo discriminante de

Fisher del antebrazo (∗ son los resultados erroneos). . . . . . . . . . . 90


Fisher del antebrazo (∗ son los resultados erroneos). . . . . . . . . . . 91


Fisher del dorso (∗ son los resultados erroneos). . . . . . . . . . . . . 92


Fisher del dorso (∗ son los resultados erroneos). . . . . . . . . . . . . 93


Fisher del dedo (∗ son los resultados erroneos). . . . . . . . . . . . . . 94


Fisher del dedo (∗ son los resultados erroneos). . . . . . . . . . . . . . 95

Resumen

Uno de los principales problemas encontrados al realizar mediciones de espectros

Raman en la piel es el de conocer la cantidad de potencia que se debe hacer incidir

sobre esta para obtener la mejor senal Raman. Esto es importante cuando se utiliza

un laser como fuente de excitacion pues se debe tener precaucion para no inducir que-

maduras. Por ello, la importancia de un clasificador de piel mediante humectacion,

el cual ayudarıa a seleccionar la potencia adecuada para medir el espectro. En este

trabajo se hizo un estudio de la espectroscopia Raman en tejido biologico in vivo

para encontrar las principales bandas del colageno, con el fin de clasificar la piel

mediante humectacion y determinar mediante espectroscopia Raman si la piel se en-

cuentra humectada o no-humectada; ya que la humectacion es un factor importante

el cual influye en la intensidad del espectro Raman. Para dicha clasificacion se uti-

lizo la tecnica de la funcion discriminante lineal de Fisher analizando las principales

bandas del colageno en los espectros Raman para obtener los coeficientes de dicha

funcion y con la ayuda de un analizador de humectacion comercial (skin moisture

analyzer SK-III) se corroboraron los resultados obtenidos con una sensitividad de

91.66 % en la mejor zona de medicion la cual fue el dedo ındice, por lo que con-

cluimos que la espectroscopia Raman es un tecnica factible para la clasificacion de

la piel mediante humectacion.

12

Abstract

One of the main problems found when is performed the measurement of skin Raman

spectra is the amount of power delivered to get a better Raman signal, when a laser

is used as excitation source we should to have caution for don’t induce burns. For

that reason, the importance of a classifier using skin moisture that would help us

to select the right power to measure Raman spectra. In this work study of Raman

spectroscopy in biological tissue in vivo to find the main bands of collagen was made,

in order to classify the skin by moisture and Raman spectroscopy to determine if

the skin is moisture or non-moisture; because the moisture is an important factor,

which influences the intensity of the Raman spectrum. For this classification was

used the Fisher linear discriminant function analyzing the bands of collagen in the

Raman spectrum to obtained the coefficients for the function and with help of a

commercial moisture analyzer (skin moisture analyzer SK-III) to corroborate the

results obtained a sensitivity of 91.66 % in the best zone of measurement which is

the index finger, therefore we can conclude that the Raman spectroscopy is a good

technique for the skin moisture classification.

Capıtulo 1

Introduccion

La espectroscopia principal empleada para detectar vibraciones en moleculas esta

basada en el esparcimiento Raman. Esto es extensamente usado para proveer

informacion de estructuras quımicas y para identificar sustancias a partir de las

caracterısticas de los patrones espectrales o “huellas digitales” y para determinar

cualitativamente o semicualitativamente la cantidad de una sustancia en una mues-

tra esta puede ser examinada en una gama de estados fısicos por ejemplo como lıqui-

do, solido o vapor, en estado caliente o frıo, en grandes cantidades como partıculas

microscopicas o como capas superficiales esta tecnica es muy amplia y provee solu-

ciones a una serie de problemas analıticos interesantes y desafiante [22].

La piel humana consiste de epidermis, dermis y capa subcutanea. La dermis es la

capa interior que varıa en espesor de 1 a 4 mm y esta compuesta principalmente

de colageno (principalmente de tipo I y III) que representa el 75 % del peso seco de

la dermis. En la parte superior de la dermis se encuentra la epidermis cuyo espesor

varıa desde las 40 µm en los parpados hasta mas de 1 mm en las palmas [7]. La capa

exterior es llamada estrato corneo, que tiene un espesor entre 10–20 µm. El estrato

corneo juega un papel importante como barrera protectora de la piel entre el medio

ambiente y el cuerpo. Retener la humectacion de la piel es la funcion mas importante

de este. Una medicion cuantitativa del contenido de agua en la piel es requerida en

una amplia variedad de campos tales como la evaluacion de los efectos de productos

cosmeticos y diagnosticos medicos. La tecnica mas usada para medir la hidratacion

1.1 Objetivos y metas de la tesis 15

de la piel se basa en las propiedades electricas tales como la capacitancia e impedan-

cia (bioimpedancia)[16]. Este metodo mide el contenido de agua a una profundidad

entre 40–100 µm de la superficie de la piel, pero dichas mediciones se requieren de

contacto con la piel. Por lo que una medicion ideal podrıa ser el metodo de no con-

tacto para evitar la oclusion de la superficie de vapor. Usando una medicion optica

es una forma prometedora para lograr la medicion del no contacto. La espectroscopia

de infrarrojo cercano permite adquirir informacion de la existencia y concentracion

de los constituyentes biologicos de la muestra [3, 16]. La deteccion de la piel es una

tecnica muy popular usada para la deteccion y rastreo de partes del cuerpo humano.

Esto ha recibido mucha atencion porque tiene un amplio rango de aplicaciones, tales

como: deteccion y rastreo de cara, rastreo de manos y recuperacion de personal en

base de datos. Esta tecnica es otra forma de clasificacion de piel el cual se basa en

el color [12].

Dado que la espectroscopia Raman es una tecnica no destructiva, esta tiene un am-

plio rango de aplicaciones en el area de biomedica. Las principales aplicaciones de

Raman en piel son deteccion de lesiones o cancer [8, 17], contenido de lıpidos [7],

concentraciones de glucosa, colesterol, trigliceridos, urea y albumina presentes en la

sangre [4], cancer de seno [23], modelos clasificacion de piel para el diagnostico de

cancer usando analisis de componentes principales (PCA) y la distancia de Maha-

lanobis como un discriminador [5] y caracterizacion de ruido en mediciones Raman

de piel [20]. Por lo que en esta tesis se abordara la clasificacion de la piel con espec-

troscopia Raman mediante humectacion. Otra de las cosas que se desarrollaron en

esta tesis fue la creacion de una interfaz en MatLab para eliminar ruido en espectros

Raman y la automatizacion de la montura de la punta de prueba del espectrometro

Raman.

1.1. Objetivos y metas de la tesis

El objetivo principal de esta tesis, consiste en obtener espectros Raman en piel in vivo

y determinar mediante metodos multivariables si la piel de una persona se encuentra

humectada o no humectada. Para realizar este objetivo se debe cumplir lo siguiente:

Medir espectros Raman en la piel en tres zonas de la mano derecha, antebrazo, dorso

1.2 Estructura de la tesis 16

y dedo ındice limpiando la zona y aplicando colageno para observar las variaciones,

disminuir el ruido de los espectros con la ayuda de una interfaz grafica, obtener

las bandas Raman del colageno reportadas en la literatura que mejor se ajusten a

los espectros experimentales, tomar los promedios de las bandas del colageno que

mejor se ajusten al espectro experimental y usar analisis multivariable (analisis de

componentes principales (PCA) y discriminante lineal de Fisher), probar el metodo

multivariable para clasificar la piel y corroborar los resultados con la ayuda de un

medidor de humectacion comercial.

1.2. Estructura de la tesis

En el capıtulo 2 se describen las distintas aplicaciones de espectroscopia Raman

en piel, ası como los metodos de filtrado ası como los metodos multivariable que se

usaron para la clasificacion dichos metodos multivariable son PCA y discriminante de

Fisher, en el capıtulo 3 se describira el arreglo experimental utilizado en este trabajo,

ası como la descripcion de la interfaz para la eliminacion de ruido en espectros

Raman, en el capıtulo 4 se presentan los experimentos realizados y los resultados

obtenidos, dividido en una breve explicacion de como funcionan los metodos usados

y la parte de los resultados obtenidos en el capıtulo 5 se muestran las conclusiones

logradas de este trabajo y el trabajo a futuro.

Capıtulo 2

Teorıa

En este capıtulo se describe la teorıa de espectroscopia Raman, los metodos multivari-

able empleados en la clasificacion del tejido son analisis de componentes principales

y discriminante lineal de Fisher, ası como los metodos de filtrado para espectros

Raman usados en este trabajo.

2.1. Espectroscopia Raman

El fenomeno de esparcimiento inelastico de la luz fue postulado por Smekal en 1923

y observado experimentalmente por primera vez en 1928 por el fısico Hindu Chan-

drasekhara Venkata Raman y K. S. Krishnan [19] (figura 2.1). Desde entonces el

fenomeno ha sido referido como espectroscopia Raman. En el experimento original

la luz del sol fue enfocada por un objetivo de telescopio de 18 cm de apertura y

230 cm de longitud focal y por una segunda lente de 5 cm de longitud focal. En el

foco de la segunda lente se coloco el material de esparcimiento que fue ya sea un

lıquido purificado o de vapor libre de polvo. Un sistema de filtros opticos se uso para

mostrar la existencia de radiacion esparcida con una frecuencia alterada de la luz

incidente, caracterısticas basicas de la espectroscopia Raman. Los filtros fueron de

color azul-violeta combinado con un filtro amarillo-verde los cuales se colocaron en

la luz incidente, pero esta desaparecıa por completo cuando pasaba por el lıquido

o vapor. La luz reaparecıa cuando el filtro amarillo-verde se colocaba despues de la

muestra, dicha luz era la radiacion esparcida modificada.

2.1 Espectroscopia Raman 18

Figura 2.1: Experimento de C. V. Raman donde se hace incidir la luz del sol a una muestrapara observar el cambio en la radiacion.

Cuando la luz interactua con la materia, los fotones que constituyen la luz pueden

ser absorbidos o esparcidos o pueden no interactuar con el material y pueden pasar

a traves de este. Las variaciones de frecuencia observadas en el fenomeno de es-

parcimiento Raman, son equivalentes a variaciones de energıa. A cada uno de los

movimientos vibracionales y rotacionales de la molecula le correspondera un valor

determinado de energıa molecular. Si la energıa de un foton incidente corresponde

a la banda prohibida de energıa entre el estado base de la molecula y un estado

excitado, el foton puede ser absorbido y la molecula ascendera al estado excitado

de mayor energıa. Es este el cambio que se mide en la espectroscopia de absorcion

por la deteccion de perdida de energıa de la luz. Sin embargo esto solo es posible

para fotones que interactuan con la molecula y son esparcidas por esta. En este caso

no hay necesidad de que el foton tenga una energıa que coincida con la diferencia

entre los dos niveles de energıa de la molecula. El esparcimiento de fotones puede

ser observado colectando la luz formando un angulo con el haz de luz incidente y

siempre que no haya absorcion de cualquier transicion electronica que tenga energıas


similares al de la luz incidente, la eficiencia incrementa como la cuarta potencia de

la frecuencia de la luz incidente[22].

La espectroscopia Raman usa solo una frecuencia para irradiar la muestra y es esta

la radiacion esparcida de la molecula, una unidad de energıa vibracional del haz in-

cidente que es detectado. Ası a diferencia de la absorcion infrarroja, el esparcimiento

Raman no requiere que coincida la radiacion incidente con la diferencia de energıa

entre el estado base y excitado. En el esparcimiento Raman, la luz interactua con

la molecula y distorsiona (polariza) la nube de electrones alrededor del nucleo para

formar un estado de vida corta llamado “estado virtual”. Este estado no es estable

y el foton es rapidamente re-radiado[22].

Los cambios de energıa que son detectados en la espectroscopia vibracional son los

necesarios para causar el movimiento nuclear. Si solo la nube de electrones distorsion-

ada es envuelta en el esparcimiento, los fotones seran esparcidos con un cambio muy

bajo de frecuencia. Este proceso de esparcimiento es considerado como esparcimiento

elastico y este es el proceso dominante. Para moleculas este es llamado esparcimiento

de Rayleigh. Sin embargo si el movimiento nuclear es inducido durante el proceso

de esparcimiento, la energıa sera transferida ya sea desde el foton incidente a la

molecula o de la molecula al foton esparcido. En este caso el proceso es inelastico

y la energıa del foton esparcido es diferente a la del foton incidente por una unidad

vibracional[19].

La figura 2.2 muestra el proceso basico que ocurre para una vibracion. A temper-

atura ambiente, la mayorıa de las moleculas, pero no todas se encuentran en el nivel

de energıa vibracional mas bajo. Ya que el estado virtual no es un estado real de

la molecula pero es creado cuando el laser interactua con el electron y provoca la

polarizacion, la energıa de este estado es determinada por la frecuencia de la luz de

la fuente usada. El proceso de Rayleigh sera el mas intenso ya que la mayorıa de

fotones se esparcen de esta manera. No se trata de cualquier cambio de energıa y

consecuentemente el retorno de la luz de algunos estados de energıa. El proceso de

esparcimiento Raman del estado vibracional base conduce a la absorcion de energıa

por la molecula y esta asciende a un nivel de energıa vibracional excitado virtual,

este es llamado esparcimiento Stokes. Sin embargo debido a la energıa termica, algu-

nas moleculas pueden presentarse en un estado excitado ν = 1 tal como en la figura


2.2. El esparcimiento de estos estados a el estado base es llamado esparcimiento

anti-Stokes y envuelve transferencia de energıa a el foton esparcido. Las intensi-

dades relativas de los dos procesos dependen en la poblacion de varios estados de la

molecula. Las poblaciones se pueden resolver a partir de la ecuacion de Boltzmann

pero a temperatura ambiente, el numero de moleculas se espera que esten un estado

vibracional excitado otras en cualquiera de las energıas bajas[22].

Figura 2.2: Diagrama de Janblonsky.

Ası comparando el esparcimiento Stokes, anti-Stokes sera debil y sera mas debil que

la frecuencia de incremento de vibracion, debido al decrecimiento de poblacion del es-

tado excitado. Ademas el esparcimiento anti-Stokes se incrementara relativamente al

esparcimiento Stokes conforme se eleva la temperatura. Usualmente el esparcimiento

Raman es recordado solo en la parte de las bajas energıas para dar el esparcimiento

Stokes pero ocasionalmente el esparcimiento anti-Stokes es preferido. Por ejemplo,


cuando hay interferencia en la fluorescencia esta ocurrira a energıas mas bajas que la

frecuencia de excitacion y consecuentemente el esparcimiento anti-Stokes puede us-

arse para quitar la interferencia. La diferencia en intensidades de las bandas Raman

en el esparcimiento Stokes y anti-Stokes puede usarse solo para medir temperatura

[22].

El espectro Raman esta formado por una banda principal o Rayleigh y dos series

de bandas secundarias correspondientes a las bandas Raman Stokes y anti-Stokes,

situadas simetricamente a ambos lados de la banda Rayleigh esto se muestra en la

siguiente figura 2.3.

Cambio Raman (cm ) -1

Int

ensi

dad (

U.A

.)

Esparcimiento Rayleigh

Esparcimiento anti-Stokes

Figura 2.3: Espectro Raman del sulfuro mostrando las bandas Rayleigh, Stokes y anti-Stokes.

Para la absorcion infrarroja cada pico representa una energıa de radiacion absorbida

por la molecula. El eje Y da la cantidad de la luz absorbida y es usualmente mostra-

da con la maxima absorbancia como el punto mas bajo en la senal. El esparcimiento

Raman esta representado solo como el espectro Stokes y esta dado como un cambio

en la energıa de la energıa del haz. Esto se obtiene sustrayendo la energıa esparcida

de la energıa del laser. De este modo la diferencia de energıa correspondiente al esta-

do vibracional base y excitado (figura 2.2) se obtiene. Ası la diferencia de energıa es


lo que esta medido directamente por el infrarrojo. El esparcimiento es medido como

la luz detectada por el espectrometro y el maximo valor de la luz detectado es el

punto mas alto en la senal.

Estrictamente hablando, el esparcimiento Raman debe ser expresado como el cam-

bio en la energıa de la radiacion de excitacion y debe ser referida como ∆cm−1 pero

esto se expresa con frecuencia simplemente como cm−1 [22]. Resaltando que el de-

splazamiento de las longitudes Raman respecto a la longitud de onda incidente ν0 es

independiente de esta ultima y por ello suele tomarse este desplazamiento como ab-

scisa para representar los espectros Raman, situando el centro de la banda Rayleigh

como origen del eje. De tal forma que en el eje de las abscisas aparecera la diferencia

entre la longitud de onda Raman y la de excitacion del laser,

∆R(cm−1) =

(1

λ0(nm)− 1

λ1(nm)

)∗ 107, (2.1)

donde ∆R es el desplazamiento Raman en cm−1, λ0 es la longitud de onda de ex-

citacion en nm y λ1 es la longitud de onda del espectro Raman en nm.

En ocasiones, debido a algunos materiales como tejidos biologicos, unido al efecto

Raman se produce fluorescencia que puede llegar a enmascarar las bandas Raman;

en estos casos, podrıa resultar de interes medir el espectro anti-Stokes ya que a estas

frecuencias, aunque el efecto Raman es mas debil, tambien lo es la fluorescencia y

pueden observarse bandas en la parte anti-Stokes del espectro, que se encuentran

enmascaradas en la parte Stokes [13].

En el proceso de fluorescencia la molecula absorbe completamente al foton incidente

y pasa a un estado electronico excitado y transcurre un tiempo (tiempo de vida

media) cuando la molecula sufre una nueva transicion al estado electronico inferior

remitiendo radiacion normalmente de longitud de onda superior a la que absorbio.

2.2 Ruidos en espectroscopia Raman 23

2.2. Ruidos en espectroscopia Raman

El “ruido” es la informacion indeseada debido a la electronica del instrumento, la

respuesta sin conexion logica y eventos aleatorios. De tal manera que el ruido es

tan solo un nombre que le adjudicamos a aquellas senales que no nos interesan.

En el caso de la obtencion de espectros Raman los ruidos mas habituales pueden

ser clasificados en cinco grupos diferentes: ruido de disparo, ruido generado por la

muestra, ruido generado por el instrumento, ruido computacional y ruido generado

por fuentes externas [22].

2.2.1. Ruido de disparo

El ruido de disparo (Shot noise) es una fuente de ruido inevitable en la medicion de

espectros Raman. Es un tipo de ruido electronico que tiene lugar cuando el numero

finito de partıculas que transportan energıa, tales como los electrones en un circuito

electronico o los fotones en un dispositivo optico, es suficiente pequeno para dar lugar

a la aparicion de fluctuaciones estadısticas apreciables en una medicion [15].

El nivel de este ruido es mayor cuando el valor promedio de la intensidad de corriente

electrica o de la intensidad luminosa es mas grande, segun se trate de un dispositivo

electronico u optico.

Sin embargo, en tanto que el nivel de senal crece mas rapidamente cuanto mayor es

su nivel promedio, a menudo el ruido de disparo solo supone un problema cuando se

trabaja con intensidades de corriente o luminosas bajas.

2.2.2. Ruido generado por la muestra

El ruido generado por la muestra incluye emisiones opticas no deseadas y generadas

por la propia muestra como es el caso de la fluorescencia, fenomeno que se produce

al incidir un foton sobre una molecula, este es absorbido y la molecula pasa a un

estado electronico excitado donde permanece unas decenas de nanosegundos, para

saltar a otro estado excitado pero de menor energıa, liberando un foton de frecuencia

mas baja que el incidente [13]. En los espectros Raman la fluorescencia suele presen-

tarse como una suave curvatura de la lınea de base y puede alcanzar una intensidad

que llegue a enmascarar por completo la intensidad de las bandas Raman. El ruido


generado por la muestra incluye tambien los cambios de intensidad Raman debidos

a cambios en la muestra no relacionados con la concentracion; por ejemplo, tanto la

intensidad de las bandas como la posicion pueden variar en funcion de la temperatu-

ra de la muestra, aunque estos cambios tienden a ser pequenos. La heterogeneidad

de la muestra tambien puede crear ruido ya que el analisis realizado en un punto de

la muestra no tiene que ser representativo de la muestra completa.

2.2.3. Ruido generado por la instrumentacion

Ruido generado por la instrumentacion, depende del diseno especıfico de la instru-

mentacion empleada en el analisis. Este tipo de ruido incluye los ruidos introducidos

por el detector como el ruido termico, el ruido de lectura que es la dependencia de

la eficiencia cuantica del detector con la longitud de onda [13].

2.2.4. Ruido de cuantizacion

Este ruido se refiere al introducido en el proceso de digitalizacion de la senal de salida

del detector.

2.2.5. Ruido generado por fuentes externas

Este ruido es el generado externamente al equipo Raman o la muestra que se esta anal-

izando. Generalmente es causado por alguna fuente de luz externa que contamina la

senal en algun punto del equipo de medicion aunque, si el equipo y el contenedor de

la muestra a medir estan cuidadosamente disenados, deberıan de ser inmunes a las

radiaciones externas. Una fuente de ruido externo de origen no-optico es generada

por partıculas de alta energıa como los rayos cosmicos que pueden llegar directo

al detector del equipo. Los rayos cosmicos liberan un gran numero de electrones

que son indistinguibles de los fotoelectrones. Los electrones generados por los rayos

cosmicos se encuentran en uno o maximo dos de los elementos del detector. El resul-

tado de dicho ruido es un pico muy estrecho y de gran intensidad en el espectro de

esparcimiento Raman. Estos picos ocurren infrecuentemente, en tiempo aleatorio y

posiciones tambien aleatorias del espectro Raman.


Ruido cósmico (Spike)

Ruido de disparo

Bandas Raman

Desplazamiento Raman (cm )-1

Inte

nsid

ad

(U.A

.)

Figura 2.4: Espectro Raman con los tipos de ruido.

2.2.6. vibraciones moleculares

La energıa de una molecula puede ser dividida dentro de un numero de diferentes

partes o “grados de libertad”. Tres de estos grados de libertad se toman para de-

scribir la traslacion de la molecula en el espacio y tres para describir el movimiento

rotacional excepto para moleculas lineales cuando solo dos tipos de rotaciones son

posibles.

Una molecula triatomica tiene tres modos de vibracion. Estos son estiramiento

simetrico el cual es un cambio en la longitud del enlace, modo de flexion o de-

formacion es un cambio en el angulo entre dos enlaces y un estiramiento asimetrico

como se muestra en la figura 2.5. Estos diagramas usan el modelo de “resorte y bo-


la”. El resorte representa el enlace o enlaces entre los atomos. Cuanto mas fuerte es

el enlace mayor es la frecuencia. Las bolas representan los atomos y lo mas pesado

son las frecuencias mas bajas. La expresion que relaciona la masa de los atomos y la

fuerza de enlace a la frecuencia de vibracion es la ley de Hooke [22].

Estiramiento simétrico

Estiramiento asimétrico

Modo de flexióno deformación

Agua

CO2

Figura 2.5: Vibraciones moleculares de moleculas triatomicas.

Dado que se quiere clasificar la piel mediante humectacion y el colageno es una

sustancia importante para considerar una piel humectada a continuacion se muestran

las tablas de las bandas Raman relacionadas con las vibraciones moleculares del

colageno.


Desplazamiento Raman (cm−1) Asignacion

509 banda del colageno

662, 667 colageno tipo I

727, 728 prolina

813, 817 colageno

820 colageno tipo I

855 prolina

856 colageno tipo I

859, 868, 870, 874 colageno

876 hidroxiprolina

884 colageno tipo I

920 prolina

933, 934, 937, 938, 972, 973 colageno

1002, 1004, 1030 fenilalanina

1031 colageno

1032 fenilalanina, prolina

1033, 1034 fenilalanina

1035 colageno

1043, 1066, 1067 prolina

1080, 1082 colageno

1163, 1169, 1171, 1173 colageno tipo I

1204 colageno

1205 diferencias en el contenido de colageno

1206 colageno

1223 colageno tipo I


1247, 1265, 1266, 1267, 1268,

1269

amida III


1280 prolina


1303, 1309, 1313, 1314, 1319,

1322, 1324, 1330, 1335, 1336,

1337, 1339

colageno

Tabla 2.1: Bandas Raman del colageno.

2.3 Metodos de Filtrado 28



1343 colageno


1654 amida I

1401, 1439, 1442, 1445, 1448,

1451, 1460, 1488

colageno

1655, 1657, 1659 amida I


1665 amida I

1666 colageno


2.3. Metodos de Filtrado

El analisis de espectros Raman para la obtencion de informacion de las muestras

a analizar es importante para el estudio de estas, sin embargo la fluorescencia y el

ruido de las muestras (en nuestro caso piel) esta presente en el espectro Raman por

tal motivo se requiere del procesado de senal para quitarla.

Otro de los objetivos del trabajo de investigacion de tesis es la creacion de una

interfaz que nos ayude a remover la fluorescencia mediante la implementacion de

dos metodos como son el ajuste de polinomios y el metodo de MinMax. Tambien el

disminuir el ruido mediante tres metodos como son Suavizado promedio (Boxcar),

Savitzky-Golay [21] y Wavelet Denoising [1]; dicha interfaz se describe en el capıtulo

3. El metodo de ajuste de polinomios difiere de los demas ya que tiene la capacidad

de conservar los entornos espectrales e intensidades de los espectros de entrada [14].

El metodo de MinMax hace una aproximacion para el ajuste de la curva mediante

un criterio de convergencia especificado [6].


2.3.1. Metodo MinMax

El metodo consiste en una serie de ajustes de curvas y reasignacion iterativa de pun-

tos de control. El metodo inicia con un ajuste polinomico del espectro original, en la

siguiente iteracion, para cada valor de x, el valor mınimo de y de cualquiera ya sea

del ajuste polinomico o el espectro original es seleccionado como punto de control

para el siguiente ajuste de la curva. Este proceso se repite hasta que un criterio de

convergencia especificado se cumple, o hasta que el numero maximo de iteraciones

se alcance. El criterio de convergencia es que el numero de los puntos reasignados se

mantendrıa constante durante 10 iteraciones consecutivas o 200 iteraciones, lo que

ocurra primero.

En la practica es posible encontrarse con una amplia gama de proporciones relacion

fluorescencia-senal Raman F/S, dependiendo de la instrumentacion y el tipo de mues-

tra, es dificil predecir la cantidad de correcion necesaria de antemano. Se define la

relacion F/S como la fluorescencia maxima dividida por el esparcimiento Raman

maximo (es decir, restarse el espectro) de la senal cuando se mide con respecto a

un valor mınimo de intensidad de cero. La definicion establece que la razon F/S

permanece constante si el espectro se desplaza a lo largo del eje y (es decir, su inten-

sidad), ya que el perfil (fluorescencia + esparcimiento Raman) sigue siendo identico.

El ajuste polinomial no se realiza sistematicamente en todas las proporciones de F/S,

ya que esta relacion puede variar dependiendo de la muestra.

Por lo que se propone una tecnica de dos pasos que toma ventaja de los beneficios

de cada ajuste polinomial. El primer paso implica el ajuste polinomico con y sin

restricciones para dos diferentes ordenes. El primer orden sera determinado por la

parte adaptada del algoritmo basada en la relacion fluorescencia-senal Raman F/S.

El segundo paso toma el valor maximo entre el punto inicial y el punto final del

ajuste (figura 2.6). A esta tecnica le llaman el metodo “MinMax”. La parte “min”

de la tecnica es la primera parte del algoritmo que toma el punto mınimo entre el

espectro y el ajuste polinomico, esto se hace para evitar el sobreajuste de los datos.

La parte “max” de la tecnica es la segunda parte del algoritmo que toma el valor

maximo entre todos los ajustes polinomicos realizados [6]. En la figura 2.6 se muestra

el ajuste del espectro Raman con el metodo MinMax.



Inte

nsi

dad

Rel

ati

va

Ajuste

Espectro

Figura 2.6: Ajuste con el metodo MinMax de un espectro con fluorescencia de tipo Gaus-siano.

2.3.2. Savitzky-Golay

El filtro de Savitzky-Golay, es un metodo que se basa en el calculo de una regresion

polinomial local (de grado k), con al menos k+ 1 puntos equiespaciados, para deter-

minar el nuevo valor de cada punto; el resultado sera una funcion similar a los datos

de entrada, pero suavizada.

La principal ventaja de esta aproximacion es que tiende a preservar caracterısticas

de la distribucion inicial tales como los maximos y mınimos relativos, ası como el

ancho y alturas de las lıneas espectrales de los datos, que normalmente desaparecen

con otras tecnicas de promediado (como la media desplazada) [21]. Un filtro digital

se aplica a una serie de datos igualmente espaciados fi ≡ f(ti) donde ti ≡ t0 + i∆

para alguna constante espaciada ∆ e i = . . .− 2,−1, 0, 1, 2, . . . . Cada valor de datos

fi se sustituye por una combinacion lineal gi de sı mismo

gi =

nR∑n=−nL

cnfi + n, (2.2)


donde nL y nR son los numeros de puntos utilizados a la izquierda y a la derecha

respectivamente del punto i. Ası, para cada punto fi, se ajusta el polinomio de grado

k a los nL + nR + 1 puntos de una ventana movil mediante el metodo de mınimos

cuadrados y el valor resultante de gi sera el nuevo punto filtrado. Este procedimiento

se repite para los valores sucesivos de puntos fi+n.

La obtencion de los coeficientes cn se basa en ajustar un polinomio de grado k en i,

del tipo a0 + a1i + a2i2 + . . . + aki

k. El valor de gi=0 es el valor del polinomio para

i = 0, es decir a0 [18].

La ventana movil o media movil es el procedimiento donde uno toma un numero fijo

de puntos agregando sus coordenadas y dividiendo por el numero de puntos total

para obtener el promedio ordinario del centro de las abscisas del grupo. Despues el

punto de los extremos del grupo se reducen y el punto en el otro extremo se anade

y el proceso se repite [21], esta descripcion se basa en el concepto de una funcion de

convolucion.

Y ∗j =

∑i=mi=−mCiYj+i

N, (2.3)

donde las C ′s representan un conjunto de integrales de convolucion, para la media

desplazada cada Ci es numericamente igual a uno. Para realizar una convolucion de

las ordenadas en la tabla de datos con un conjunto de integrales de convolucion,

las Ci, de cada numero en el bloque es multiplicado por el correspondiente numero

en la tabla de datos y el producto resultante es dividido entre N que es el numero

integrales de convolucion. El ındice j es el corredor de los datos originales en tu

conjunto de datos.

2.3.3. Eliminacion de ruido Wavelet

El ruido es un fenomeno que afecta todas las frecuencias, mientras que la senal de

interes es mas probable que ocupe una pequena parte del dominio frecuencial, ya que

en la senal tiende a dominar las componentes de baja frecuencia, se espera que la

mayorıa de las componentes de alta frecuencia esten arriba de un cierto nivel debido

al ruido. Esto es la base fundamental del tradicional filtro de Fourier donde el filtro


pasa bajas corta las componentes de las frecuencias altas. Del mismo modo, podemos

esperar coeficientes pequenos de wavelet en escalas cortas que son principalmente

componentes de ruido. El procedimiento del wavelet denoising es el siguiente:

Aplicamos una transformada wavelet a la senal y obtenemos los coeficientes

del vector wavelet ;

eliminamos esos elementos, que se cree contribuyen al ruido; y

aplicamos la transformada inversa de wavelet para obtener la senal sin ruido

[1].

Las wavelets se usan como funciones base para representar otras funciones tal y

como se hace con las funciones seno y coseno en la transformada de Fourier. La

transformada wavelet permite un analisis multi-resolucion, es decir, la observacion

de senales en frecuencias distintas a distintas escalas de resolucion lo que permite

tener una nocion del contenido en frecuencia de la senal. Las componentes de de alta

frecuencia de una senal son localizados con menos error en el dominio del tiempo

mientras que los componentes de baja frecuencia son localizados mejor en el dominio

frecuencial. El analisis multi-resolucion esta disenado para dar una resolucion alta en

el dominio del tiempo y baja en el frecuencial para frecuencias altas y resolucion alta

en el dominio frecuencial y baja en el dominio del tiempo para frecuencias bajas.

Este tipo de analisis es principalmente util para senales que tienen componentes

de alta frecuencia de corta duracion y componente de baja frecuencia de duracion

prolongada. La transformada wavelet es la representacion de una senal en terminos

de una forma de onda de longitud finita o de oscilacion rapidamente decreciente y

con valor medio cero, llamada wavelet madre o funcion prototipo. Esta forma de

onda se escala y desplaza para generar ondas que si se superponen igualando la senal

original. Se puede decir que es una funcion en terminos de oscilaciones tanto en el

tiempo como en la frecuencia.

ψj,k(t) =1√sj0

ψ

(t− kτ0sj0

sj0

), (2.4)


2.3.4. Ajuste polinomial

A pesar de que el metodo de ajuste polinomial de curvas conserva la informacion

importante de los espectros de entrada, simplemente ajusta la curva del espectro

Raman de entrada usando mınimos cuadrados (el ajuste se hace sobre los mınimos del

espectro de entrada) pero esto no reproduce eficientemente la fluorescencia de fondo,

como el ajuste basado en minimizar la diferencia entre el ajuste y el espectro medido

que incluyen fluorescencia de fondo y las bandas Raman. Es de suma importancia

que el ajuste polinomial de la region espectral contenga solamente la fluorescencia de

fondo mientras que las bandas Raman de la region espectral se ignoran. La tecnica

de ajuste polinomial se basa en que el usuario selecciona los lugares del espectro

en las que se basara el ajuste. Desafortunadamente esta intervencion subjetiva tiene

varios inconvenientes, uno de ellos es el consumo de tiempo para el procesado de los

espectros individuales para identificar la no actividad Raman (es decir, para saber

cuales son bandas Raman y cuales ruido o fluorescencia) la cual no es trivial, como en

el caso de espectros biologicos los cuales contienen varias bandas que no son obvias.

Para hacer frente a estas limitaciones se propone el metodo de ajuste polinomico

modificado, el cual suaviza el espectro de tal forma que las bandas Raman se eliminan

dejando solamente la fluorescencia intacta para ser sustraıda del espectro original.

La base de este metodo son los mınimos cuadrados basados en una funcion de ajuste

polinomial de la curva [14]. En la figura 2.7 se muestra la forma en como funciona

el ajuste polinomial.

2.4 Analisis de Componentes Principales (PCA) 34


Espectro de entrada

1er polinomio de ajuste

Ajuste polinomico final

Espectro de entrada

Ajuste polinomico

Figura 2.7: Ajuste polinomial aplicado a la Rodamina 6G. A) Espectro de entrada y ajustepolinomial por mınimos cuadrados de la fluorescencia. B) Espectro Raman y curva deajuste modificada con dos iteraciones hasta el suavizado de la curva a lo largo de la basedel espectro.

2.4. Analisis de Componentes Principales (PCA)

El analisis de componentes principales (PCA) es una tecnica utilizada para reducir la

dimensionalidad de un conjunto de datos. Intuitivamente la tecnica sirve para hallar

las causas de la variabilidad de un conjunto de datos y ordenarlas por importancia.

El PCA busca la proyeccion segun la cual los datos queden mejor representados en

terminos de mınimos cuadrados. El PCA se emplea para construir modelos predic-

tivos. El PCA construye una transformacion lineal que escoge un nuevo sistema de

coordenadas para el conjunto original de datos en el cual la varianza de mayor tamano

del conjunto de datos es capturada en el primer eje (llamado primer componente prin-

2.4 Analisis de Componentes Principales (PCA) 35

cipal), la segunda varianza mas grande es el segundo eje y ası sucesivamente. Para

construir esta transformacion lineal debe construirse primero la matriz de covarianza

o matriz de coeficientes de correlacion. Debido a la simetrıa de esta matriz existe

una base completa de vectores propios de la misma. La transformacion que lleva

de las antiguas coordenadas a las coordenadas de la nueva base es precisamente la

transformacion lineal necesaria para reducir la dimensionalidad de los datos. Ademas

las coordenadas en la nueva base dan la composicion en factores subyacentes de los

datos inıciales.

2.4.1. Matematicas del PCA

2.4.1.1. Calculo de componentes principales

Supongamos un vector aleatorio ~x de p componentes que tienen una matriz de covar-

ianza ~Σ. Sea ~β un vector columna de p componentes, tal que ~β′ ~β = 1. La varianza

de ~β′~x es:

ε(~β′~x)2 = ε~β

′~x~x

′ ~β = ~β′Σ~β, (2.5)

donde ε es el momento conjunto (joint moments)[2]. Para determinar la combinacion

lineal normalizada ~β′~x con varianza maxima, debemos encontrar un vector ~β que

maximiza 2.5. Entonces

φ =∑i,j

βiσi,jβj − λ(Σiβ2i − 1), (2.6)

donde λ son los multiplicadores de lagrange.

El vector de las derivadas parciales (∂φ/∂βi) es

∂φ

∂~β= 2~Σ~β − 2λ~β, (2.7)

entonces debemos encontrar un vector ~β que maximice la expresion 2.7, esto es

(Σ− λI)β = 0, (2.8)

2.5 Discriminante Linear de Fisher 36

la solucion para le ecuacion anterior con β 6= 0 es

|Σ− λI| = 0, (2.9)

la funcion anterior es un polinomio de λ de grado p por lo tanto 2.9 tiene p raıces,

estas deben ser λ1 ≥ λ2 . . . ≥ λp > 0

Cuando se grafican los scores (puntos) de las componentes principales, estos revelan

relacion existente entre la muestra, tales como los datos naturales clustering (datos

agrupados). Tambien cuando se grafican los Loadings (factores) de las componentes

principales como funcion de diferentes variables, estos revelan que variable representa

la mayor diferencia2.

2.5. Discriminante Linear de Fisher

Supongamos que un conjunto de objetos esta ya clasificado en una serie de grupos,

es decir, se sabe previamente a que grupo pertenecen. El analisis de discriminante

se puede considerar como un analisis de regresion donde la variable dependiente

es categorica y tiene como categorıas la etiqueta de cada uno de los grupos de los

objetos. Se pretende encontrar relaciones lineales entre las variables que mejor dis-

criminen en los grupos dados a los objetos. Un segundo objeto es construir una regla

de decision que asigne un objeto nuevo, que no hemos clasificado previamente, a uno

de los grupos prefijados con un cierto grado de riesgo. Para ello es necesario que

existan al menos dos grupos y para cada grupo se necesitan dos o mas casos. El

numero de variables discriminantes debe ser menor que el numero de objetos menos

2, es decir,x1, . . . , xp, donde p < (n− 2) y n es el numero de objetos.

El analisis de la funcion discriminante de Fisher se ocupa de comparar las distribu-

ciones de una o mas variables a lo largo de diferentes grupos o poblaciones. En

particular, el analisis discriminante asume grupos conocidos, identificables y mutu-

amente excluyentes. Se toma una muestra de observaciones de cada grupo, donde

cada observacion esta descrita por un conjunto de variables y haciendo la hipotesis

2∗http://www.uoc.edu/in3/emath/docs/Componentes principales.pdf.

2.5 Discriminante Linear de Fisher 37

acerca de como se distribuyen las variables en cada grupo, este analisis se plantea de

alguna de las siguientes preguntas:

Contrastar si las medias y/o matrices de covarianzas entre los grupos son

iguales.

Construir esquemas para estimar probabilidades de pertenencia a un grupo

para futuras observaciones dada solo la informacion de las variables discrimi-

nantes.

El modelo mas comun es el denominado modelo lineal que descansa en el supuesto

de normalidad de las distribuciones que siguen las variables dentro de cada grupo y

matrices de covarianza iguales en ambos grupos [9].

A partir de q grupos donde se asignan a una serie de objetos y p variables medidas

sobre ellos (x1, . . . , xp) se trata de obtener para cada objeto una serie de ”pun-

tuaciones“ que indican el grupo al que pertenecen (y1, . . . , yp), de modo que sean

funciones lineales de x1, . . . , xp

y1 = a11x1 + ...+ a1pxp + a10

· · · · · · (2.10)

ym = am1x1 + ...+ ampxp + am0

donde m = min(q − 1, p), tales que discriminen o separen lo maximo posible a los q

grupos.

Capıtulo 3

Arreglo experimental

En esta seccion se describe el arreglo experimental utilizado en este trabajo de tesis

y como uno de los principales problemas cuando se obtienen espectros Raman en

tejido biologico es la presencia de ruido y fluorescencia, por ello el desarrollo de una

interfaz con algunos metodos reportados en la literatura para la disminucion de estos.

El arreglo experimental para las mediciones de espectros Raman consta de un laser

de 785 nm como fuente de excitacion1 el cual se hace incidir sobre la piel mediante

una punta de prueba que consta de dos fibras; una de excitacion y otra de coleccion

la cual va conectada al espectrometro QE65000 [15] (figura 3.2) de Ocean Optics

que incluye un arreglo lineal de CCD conectado con la circuiterıa necesaria para la

operacion del espectrometro, dando como resultado un sistema compacto y flexible,

con ninguna de sus partes moviles. La distancia focal de la punta de prueba es de

7.5 mm, distancia en la cual se obtiene una mejor senal Raman. Dicha punta de

prueba esta montada sobre una montura motorizada con desplazamiento vertical el

cual se detiene a la distancia focal cuando el palpador de la punta toca un material

conductor o semiconductor cuando se encuentra en el modo automatico, la montura

en el modo manual se puede desplazar a cualquier distancia deseable, esto con el fin

de no tener limitantes cuando se realizan mediciones de espectros Raman en lıquidos

o materiales dielectricos. El palpador funciona con la tecnica de bioimpedancia el cual

1∗ http://www.inphotonics.com/probeRPB.htmhttp://bwtek.com/products/cleanlaze/

39

cuando detecta un material conductor se detiene. El espectrometro es conectado a

una PC mediante un puerto USB el cual tiene el software Spectra Suiter desarrollado

por Ocean Optics.

3.0.1. Componentes del espectrometro QE65000

En la figura 3.1 se muestran las diferentes componentes (numeradas del 1 al 8) del

espectrometro QE65000.

Figura 3.1: Componentes del espectrometro Raman QE65000.

1. Conector SMA: Asegura la entrada de fibra en el espectrometro. La luz entra

a la fibra de entrada y esta lo conduce al banco optico desde el conector.

2. Rendija (slit): Una pieza de material oscuro que contiene una abertura rectan-

gular, la cual va montada directamente detras del conector SMA. El tamano

de la abertura regula la cantidad de luz que entra al banco optico y controla

la resolucion espectral. Tambien se puede utilizar el QE65000 sin rendija. En

esta configuracion, el diametro de la fibra conectada al QE65000 determina el

tamano de la entrada de apertura.

40

3. Filtro: Restringe las radiaciones opticas de comprobar la validez de las regiones

de longitud de onda determinada. La luz pasa a traves del filtro antes de entrar

al bando optico. Ambos filtros pasa altas y pasa banda estan disponibles para

limitar la radiacion a determinadas regiones de longitud de onda.

4. Espejo colimador: La luz que entra hacia el banco optico es enfocada hacia la

rejilla del espectrometro. La luz entra en el espectrometro, pasa a traves del

conector SMA, la rendija y el filtro, entonces se refleja en el espejo colimador

dentro de la rejilla.

5. Rejilla: La luz reflejada del espejo colimador es directamente difractada por

la rejilla. Las rejillas estan disponibles en diferentes densidades de lınea, lo

que le permite especificar la longitud de onda de cobertura y resolucion en el

espectrometro.

6. Espejo de enfocamiento: este recibe la luz reflejada de la rejilla y la enfoca en

el detector CCD o la lente de coleccion L2 (dependiendo de la configuracion de

espectrometro).

7. Area del detector con enfriamiento: Provee el 90 % de eficiencia cuantica y la

caja de pıxeles de una columna vertical permite adquirir la luz en su totalidad

a la altura de la abertura de la imagen del espectrometro. Esto mejora la luz

recogida y la senal-ruido significativamente.

8. Detector con filtro OFLV: Elimina los efectos de segundo orden y se utiliza con

una rejilla de HC-1 en un sistema de 200-950 nm de longitud de onda en un

QE65000 [15].

41

(1)(2)

(3)

(4)

(5)

Figura 3.2: Esquema del arreglo experimental para la obtencion de espectrometro Ramanen la piel. (1) Computadora, (2) espectrometro QE65000, (3) laser de 785 nm, (4) puntade prueba con dos fibras (excitacion y coleccion), (5) muestra.

En la figura 3.3 se muestra el arreglo experimental en donde se observa la punta de

prueba Raman con el mecanismo automatico de desplazamiento vertical el cual se

optimizo para que la punta de prueba se detuviera a la distancia focal que es donde

se tiene una mejor senal Raman. Este arreglo consta de un motor el cual tiene dos

opciones de movimiento, una es en el modo automatico el cual cuando el palpador

hace contacto con un material semiconductor o conductor se detiene y el otro modo

es manual en donde el usuario puede desplazarlo hacia arriba o abajo tanto como

lo desee. El sistema de funcionamiento del palpador es mediante la impedancia del

material y es por ello que solo con materiales conductores o semiconductores se

detiene al hacer contacto.

3.1 Tomografıa Optica Coherente (OCT) 42

Motor de desplazamientoVertical

Punta de prueba Raman

Palpador

Figura 3.3: Arreglo experimental para la obtencion de espectrometro Raman en la piel.

3.1. Tomografıa Optica Coherente (OCT)

La tomografıa optica coherente (OCT por sus siglas en ingles optical coherence to-

mography) es una tecnica que consiste en la adquisicion de la senal optica y su meto-

do de procesamiento la cual alcanza una resolucion micrometrica, reconstruyendo

imagenes de los medios de esparcimiento optico (como tejido biologico). La tomo-

grafıa optica coherente es una tecnica interferometrica, por lo general emplea luz

infrarroja cercana. El uso de longitudes de onda relativamente largas permite que

penetre en el medio de esparcimiento [15]. La OCT permite hacer “Biopsias opticas”,

dando la imagen de la estructura de los tejidos o patologıa de estos sin necesidad

de analizar las muestras extrayendo tejido como se hace en la biopsia tradicional.

Funciona proyectando una senal de luz de baja coherencia sobre los tejidos, la cual

3.1 Tomografıa Optica Coherente (OCT) 43

se refleja y mide la magnitud y la fase de la luz de las diferentes profundidades de los

tejidos. La sensibilidad de la luz esparcida, ası como su selectividad de un sitio de

retroesparcimiento especıfico, se consigue mediante el uso de la interferencia entre la

luz retroesparcida y el haz de referencia mediante un interferometro de Michelson. El

OCT funciona proyectando una senal de luz de baja coherencia sobre los tejidos, la

cual se refleja y mide la magnitud y la fase de la luz de las diferentes profundidades

de los tejidos. El funcionamiento basico del OCT se puede ver en la figura 3.4, una

fuente emite un haz de luz que se transmite a traves de un divisor de haz, el cual se

divide en un haz de referencia y un haz de muestra. El haz de referencia se refleja sin

cambios a traves de un espejo y el haz muestra se esparce por las diferentes capas

del tejido. Luego, los haces se unen nuevamente en le divisor y son emitidos a un

detector.

Fuente

Espejo de

Referencia

Muestra

Detector

D.H

Figura 3.4: Esquema de un OCT con un interferometro de Michelson.

3.2 Skin moisture analyzer SK-III 44

SLD

PDAcoplador 50/50

Referencia

Muestra

Figura 3.5: Diagrama esquematico de un sistema OCT. SLD: diodo superluminiscente; PD: fotodiodo.

En la figura 3.6 se muestra el tomografo optico coherente Thorlabs SR-OCT que se

tiene en el laboratorio.

Figura 3.6: OCT Thorlabs SR-OCT con el que cuenta el laboratorio de biomedica.

3.2. Skin moisture analyzer SK-III

El medidor de humectacion SK-III (figura 3.7) consta de las siguientes partes:

1. Punta de prueba: la cual se ponen en contacto con la piel para medir la

impedancia.

3.3 Interfaz para la eliminacion de ruido 45

2. Pantalla LCD: la cual muestra el porcentaje de humectacion.

3. Boton de reinicio: el cual se presiona para obtener una nueva medicion o en

algunos caso para medir nuevamente cuando marca error.

4. Boton de encender/apagar.

El medidor de humectacion es un dispositivo portatil que usa analisis de bioimpedan-

cia (BIA). Detectando automaticamente las condiciones de la piel y mostrando el

resultado en la pantalla LCD con un numero en porcentaje. El analizador lee la re-

sistencia electrica de la piel que depende de la hidratacion, la piel seca tiene una alta

resistencia y la piel con alta humectacion tiene una resistencia mucho mas baja ya

que el agua es un excelente conductor electrico. El resultado de la misma zona puede

variar dependiendo de varios factores como son humedad, actividad de las glandulas

sudorıparas, cosmeticos, etc.

1

3

2

4

Figura 3.7: Skin moisture analyzer SK-III.

3.3. Interfaz para la eliminacion de ruido

En la figura 3.8 se muestra el esquema de la interfaz con sus respectivos componentes.

Esta compuesto de nueve botones los cuales son: el boton de cargar datos lo que hace

es cargar el archivo del espectro el cual se mostrara en la grafica de la izquierda de la


interfaz, el boton de normalizacion lo que hace es normalizar los datos del espectro

de entrada el cual tambien se mostrara en la grafica de la izquierda, el boton de

COBRA nos despliega la interfaz COBRA (figura 3.16) [10] con la cual podemos

quitar la fluorescencia de fondo y el ruido de la senal. El boton Salir cierra la interfaz

principal y si se encuentra abierta la interfaz de COBRA, tambien la cierra.

Figura 3.8: Interfaz principal creada en MATLAB.

El cuadro de suavizado (Smothing), figura 3.9 contiene tres botones con los cuales

podemos quitar el ruido de la senal de entrada con los metodos de Promedio (Box-

car), Savitzky-Golay (S-Golay) y Wavelet denoising (Wavelet). Una vez presionados

cualquiera de los botones anteriormente mencionados se mostrara la grafica de la

senal sin ruido en la grafica derecha de la interfaz como se muestra en las figura 3.10,

3.11 y 3.12.


Figura 3.9: Cuadro de suavizado.

Figura 3.10: Senal sin ruido despues de presionar el boton de S-Golay.


Figura 3.11: Senal sin ruido despues de presionar el boton de Boxcar.

Figura 3.12: Senal sin ruido despues de presionar el boton de Wavelet.

El cuadro para quitar la fluorescencia de fondo (Baseline) se encuentran dos botones

como se muestra en la figura 3.13 con los cuales quitaremos la fluorescencia de fondo


de la senal una vez que hayamos quitado el ruido. Antes de presionar cualquiera de

los botones (GIFTS o MinMax) debemos poner el grado del polinomio. La senal sin

ruido y sin fluorescencia se muestra en la grafica de la derecha como se observa en

las figuras 3.14 y 3.15.

Figura 3.13: Cuadro Baseline para quitar la fluorescencia.

Figura 3.14: Senal sin ruido y fluorescencia con el metodo MinMax.


Figura 3.15: Senal sin ruido y fluorescencia con el metodo GIFTS.

Una vez procesada la senal podemos guardar los datos, presionando el boton de

guardar (parte superior izquierda de la interfaz) el archivo guardado sera en “.mat”.

3.4 COBRA 51

3.4. COBRA

La interfaz COBRA es un software libre desarrollado en Matlab que se encuentra

disponible en http://www.victoria.ac.nz/raman/publis/codes/cobra.aspx. [10]. Esta

interfaz tambien sirve para quitar la fluorescencia de fondo y disminuir ruido de los

espectros Raman, solo que dicha interfaz es un poco mas complejo su comprension

por la cantidad de pasos que se deben seguir para disminuir el ruido. Para importar

un nuevo archivo damos click en Import New y seleccionamos el archivo apropiado.

Los datos deben estar contenidos en un archivo .txt. Despues de importar los datos

se grafican en la parte izquierda de la interfaz, mostrando la senal (como se observa

en la figura 3.17).

Figura 3.16: Interfaz COBRA.

3.4 COBRA 52

Figura 3.17: Archivo importado el cual se grafica en la parte izquierda de la interfaz.

Si hay un archivo que contenga solamente el ruido de fondo, el cual se desea eliminar

de las demas senales, entonces se debe importar utilizando el boton Import en el

cuadro Bare Background figura 3.18. Despues de importar el ruido de fondo este

se graficara del lado derecho de la interfaz. El ruido de fondo puede ser modificado

cambiando los valores en las cajas de texto multiplier y addition, el nuevo ruido de

fondo quedara de la forma:

NewBG = Multiplier ∗OriginalBG+ Addition

Figura 3.18: Cuadro para importar el ruido de fondo.

Despues de agregar los valores para multiplier y addition, el nuevo ruido de fondo

puede restarse de la senal original dando click en el boton Remove esto puede ser

realizado tantas veces como sea necesario. En la figura 3.19 podemos ver la senal de

entrada y sin ruido.

3.4 COBRA 53

Figura 3.19: Senal original (grafica izquierda) y sin ruido de fondo (grafica derecha).

Para ayudar con el ajuste polynomiel y wavelet transform es util definir las regiones

donde la senal es completamente ruido de fondo. Para ello seleccione el numero de

regiones que se deseen introducir en el cuadro de lista Background Regions (figura

3.20) y escribimos las coordenadas de entrada y salida para cada region.

Figura 3.20: Regiones del ruido de fondo, con tres regiones definidas.

Una forma de saber las coordenadas del ruido de fondo es dando click en alguna

region de la grafica en la cual nos mostrara las coordenadas de dicho punto como se

muestra en la figura 3.21.

3.4 COBRA 54

Figura 3.21: Punto seleccionado en la senal filtrada para conocer las coordenadas del ruidode fondo.

Una vez que se ingresaron las regiones del ruido de fondo, se da click en Create

Background Region, la region de ruido de fondo se puede modificar con solo cambiar

los valores y numeros de regiones y hacer click en Create Background Region de

nuevo. Tambien es posible guardar la region del ruido de fondo en un archivo de

MATLAB para el uso futuro o importarlo de nuevo utilizando las opciones Save

Background Region e Import Background Region respectivamente.

Con frecuencia es util ajustar la senal con algun polinomio. Definimos el orden del

polinomio y el numero de iteraciones necesarias en el cuadro de texto.

Figura 3.22: Cuadro de ajuste polinomial.

Cada iteracion reduce los picos de la senal en el ajuste de la misma forma que la

iteracion de wavelet transform hace. Si el ruido de fondo fue importado y se resta de

la senal, el ajuste polinomial se llevara a cabo en la senal filtrada que se muestra en

3.4 COBRA 55

la grafica de la derecha. Una vez que el ajuste ha terminado, los puntos se desplazan

en el eje y de manera que todos son mayores que cero. El ajuste del ruido de fondo

de la grafica de la izquierda consistira del ajuste polinomico mas el ruido de fondo,

mientras que la senal filtrada se compondra de la senal original menos el ajuste del

ruido de fondo.

Figura 3.23: Ajuste de la senal.

Si el ajuste polinimial no es satisfactorio, damos click en Reset Single con el cual

eliminaremos el ajuste del ruido de fondo (incluyendo el ruido de fondo inicial).

La wavelet transform se realiza en la senal filtrada. Existen varios parametros que

deben ser definidos antes de que la wavelet transform se pueda realizar. El primero

es el wavelet type. Cada vez que un nuevo wavelet type se elija, se graficara en los

ejes del cuadro wavelet transform.

Figura 3.24: Cuadro de wavelet transform.

3.4 COBRA 56

Hemos encontrado que el mejor tipo de wavelet a utilizar es el nivel 10 (para este

ejemplo) que se muestra en la figura anterior. Sin embargo, otros tipos de wavelet

pueden ser mas adecuados en funcion de la forma de la senal. El segundo parametro

que necesita ser definido es el tranform level. Cuanto mayor sea el tranform level

menor es la frecuencia del ruido de fondo. El ultimo parametro es el numero de

iteraciones. 10 iteraciones son suficientes para el ajuste, pero esto puede cambiar

dependiendo de la relacion de la senal del ruido de fondo. Despues de esta etapa, la

senal filtrada debe eliminar por completo el ruido de fondo.

Figura 3.25: La senal despues de 6 niveles de wavelet transform.

Despues de eliminar el ruido de fondo, es muy util quitar el ruido de la senal filtrada,

para ello se utiliza la Fourier transform pasa bajas. Esto se hace en MATLAB con

la funcion de la transformada rapida de Fourier (fft). Los parametros a definir son

la frecuencia de corte (Filter Cutoff ) y el ancho (Filter Width). Despues se pulsa el

boton Transform. La transformada de Fourier y el filtro pasa bajas se muestran en

la grafica.

3.4 COBRA 57

Figura 3.26: Transformada de Fourier y funcion de filtro pasa bajas para la senal filtrada.

La senal actual no se modificara hasta que el boton Inverse transform se presione. Si

el filtrado no es satisfactorio, entonces se tendra que pulsar Reset Single y volver a

realizar la eliminacion del ruido de fondo que solo deberıa ser necesario presionar un

par de botones ya que los parametros ya estan configurados. Despues de estos pasos

se elimina el ruido de fondo y el ruido de la senal.

Figura 3.27: Senal filtrada despues de eliminar el ruido y el ruido de fondo.

Despues de que todos los parametros se han fijado, se puede eliminar al ruido de

fondo y el ruido de la senal para todas las senales. Haciendo click en Filter All

Events despues de seleccionar los procesos que se van a aplicar a todas las senales.

3.4 COBRA 58

Figura 3.28: Cuadro de todos los filtros.

Este proceso puede tardar varias horas, si todas las opciones son seleccionadas y hay

muchas senales. Las senales y sus filtrados pueden ser escaneados mediante el uso

de los botones Previus y Next o cambiando el numero de evento actual una vez que

el filtro de todo proceso ha terminado. Si los resultados no son satisfactorios, haga

click en Reset All y hacer los cambios apropiados a los parametros iniciales y volver

a realizar todo el proceso de filtrado.

Para guardar los datos en un archivo de MATLAB hacemos click en Save All, este

archivo se puede importar en MATLAB utilizando la opcion import data. Tambien

es posible guardar solo el evento observado actual con el boton Save Single.

Capıtulo 4

Resultados

En esta tesis se realizaron mediciones de espectros Raman, imagenes OCT y se

obtuvo el porcentaje de humectacion con el skin moisture analyzer SK-III (figura

3.7); dichas zonas de estudio fueron el dedo ındice, dorso y parte interna del antebrazo

de la mano derecha de 10 voluntarios dichas zonas se eligieron por que el colageno se

encuentra principalmente en tendones, ligamentos, piel y vasos sanguıneos y como

la yema de los dedos es altamente vascularizada es una buena zona para obtener

informacion. Cabe aclarar que no solo se hicieron mediciones a 10 voluntarios en el

desarrollo de esta tesis si no que se estuvieron haciendo mediciones con muchos mas

voluntarios para checar el tiempo de exposicion mas optimo, la potencia adecuada, si

era mejor aplicar crema corporal o colageno a los voluntarios para tener una variacion

en la humectacion, etc. Pero estos 10 voluntarios que se mencionan en los resultados

sirvieron para crear el modelo de clasificacion el cual se probo con una medicion

posterior de 18 voluntarios para la corroboracion del algoritmo. Tambien se incluye

una breve descripcion de los metodos utilizados para la clasificacion, mostrando los

resultados finales de los experimentos.

4.1. Espectros Raman

Las mediciones de espectro Raman se realizaron a 10 voluntarios los cuales son parte

del INAOE (como estudiantes, trabajadores y doctores), a los cuales se les limpio

con alcohol de 96◦ para limpiar la zona de medicion y tenerla libre de grasa cor-

4.1 Espectros Raman 60

poral, despues de dicha medicion se les aplico colageno lıquido para aumentar la

humectacion de la muestra. Dichas mediciones se realizaron con el espectrometro

Raman QE65000 de Ocean Optics. La potencia utilizada para los espectros Raman

fue de 70 mW (basandonos en la norma ANSI Z136.1-2007) con un tiempo de inte-

gracion de 20 s. En la figura 4.1 se muestra la comparacion de tiempos de integracion

en la cual se observa que 30 s se obtiene una mayor intensidad pero el spectra suite

se satura por lo que se eligio el tiempo de 20 s el cual tambien es bueno.


Inte

nsid

ad (

U.A

)

Figura 4.1: Espectro Raman a tres tiempos de integracion para obtener el mejor en lasmediciones.

De acuerdo con la base de datos de bandas Raman se tomaron 12 bandas pertenecientes

al colageno (las cuales se muestran en la tabla 4.1) [11, 24] y se hizo un espectro

sintetico con estas, las cuales se comparan en las figuras 4.2, 4.6 y 4.16 con los espec-

tros medidos a los 10 voluntarios libre de grasa y aplicando colageno puro, observando

que las bandas reportadas coinciden con las bandas obtenidas en los espectros me-

didos en las personas. Estas bandas se eligieron porque estos tipos de colageno se

encuentran principalmente en la piel, tendon y vasos sanguıneos.



667 colageno tipo I

820 colageno tipo I

856 colageno tipo I

884 colageno tipo I




1247 amida III

1267 amida III





-1

Desplazamiento Raman (cm )

Inte

nsi

dad

(U.A

.)

Figura 4.2: Espectro Raman del dedo ındice de 10 voluntarios (lıneas de colores) compara-dos con las bandas del colageno reportadas en la literatura (lınea negra).


-1Desplazamiento Raman (cm )

Figura 4.3: Espectro Raman del dedo ındice de 10 voluntarios con un acercamiento en lasbandas 667, 820, 856 y 884 cm−1.

Imagen OCT del dedo con colágeno

Imagen OCT del dedo sin colágeno

Figura 4.4: Espectro Raman del dedo ındice de 10 voluntarios con un acercamiento en lasbandas 1169, 1205, 1223, 1247, 1267, 1283 y 1340 cm−1.



Figura 4.5: Espectro Raman del dedo ındice de 10 voluntarios con un acercamiento en lasbandas 1635 cm−1.


Figura 4.6: Espectro Raman del antebrazo de 10 voluntarios (lıneas de colores) comparadoscon las bandas del colageno reportadas en la literatura (lınea negra).



Figura 4.7: Espectro Raman del antebrazo de 10 voluntarios con un acercamiento en lasbandas 667, 820, 856 y 884 cm−1.

Imagen OCT del antebrazo con colágeno

Imagen OCT del antebrazo sin colágeno

Figura 4.8: Espectro Raman del antebrazo de 10 voluntarios con un acercamiento en lasbandas 1169, 1205, 1223, 1247, 1267, 1283 y 1340 cm−1.



Figura 4.9: Espectro Raman del antebrazo de 10 voluntarios con un acercamiento en lasbandas 1635 cm−1.


Figura 4.10: Espectro Raman del dorso de 10 voluntarios (lıneas de colores) comparadoscon las bandas del colageno reportadas en la literatura (lınea negra).



Figura 4.11: Espectro Raman del dorso de 10 voluntarios con un acercamiento en lasbandas 667, 820, 856 y 884 cm−1.

Imagen OCT del dorso con colágeno

Imagen OCT del dorso sin colágeno

Figura 4.12: Espectro Raman del dorso de 10 voluntarios con un acercamiento en lasbandas 1169, 1205, 1223, 1247, 1267, 1283 y 1340 cm−1.



Figura 4.13: Espectro Raman del dorso de 10 voluntarios con un acercamiento en lasbandas 1635 cm−1.

Una vez obtenidas las bandas del colageno que mejor se ajustan al espectro Raman

experimental, se estudiaron solo estas para la clasificacion usando la tecnica de anali-

sis de componentes principales cuyo paquete se encuentra cargado en Matlab, el cual

se detalla un poco en la siguiente seccion. En las graficas 4.4, 4.8 y 4.12 se muestra

el espectro raman junto con las imagenes OCT de cada zona sin y con colageno

con el fin de observar la profundidad de las muestras. En las graficas 4.14, 4.15 y

4.16 se muestra solo las bandas del colageno que mejor se ajustaron en el espectro

experimental los cuales se utilizaron para el estudio de la clasificacion.


Figura 4.14: Bandas del colageno que mejor se ajustaron al espectro experimental en elantebrazo.

Figura 4.15: Bandas del colageno que mejor se ajustaron al espectro experimental en eldedo.

4.2 (PCA) con Matlab 69

Figura 4.16: Bandas del colageno que mejor se ajustaron al espectro experimental en eldorso.

4.2. (PCA) con Matlab

El analisis de componentes principales es una tecnica que sirve para hallar las causas

de variabilidad de un conjunto de datos y ordenarlas por importancia. Matlab

calcula los componentes principales de una matriz de datos n× p y devuelve los coe-

ficientes de las componentes principales, tambien conocidos como los Loadings. Las

entradas de X corresponde con las observaciones y las columnas a las variables. Para

realizar el analisis de componentes principales directamente en una matriz de covar-

ianza o correlacion, se utiliza [COEFF, SCORE] = princomp(X) el cual devuelve

SCORE, la componente principal scores; es decir, la presentacion de X en el espa-

cio de componentes principales. Basandonos en el algoritmo de Matlab se calculo las

componentes principales de las bandas del colageno para obtener la separacion de las

muestras y poder clasificar la piel mediante esta tecnica con la cual no se obtuvieron

resultados favorables, como se muestran en las siguientes graficas en donde no se

observa con claridad la separacion de las muestras por las diferencias en el contenido

de colageno. En las graficas (4.17, 4.18, 4.19, 4.20, 4.21 y 4.22) se muestran todas


las combinaciones de componentes principales con la intencion de poder seleccionar

la mejor combinacion que nos diera la clasificacion por humectacion. En la tabla

4.2 se muestran los valores arrojados por el medidor de humectacion. De acuerdo

con las especificaciones del medidor los valores para los cuales se considera la piel

humectada o no humectada son los siguientes: para el antebrazo y dorso valores

menores a 50 % se considera no humectado, en el dedo menores a 60 % es no humec-

tado, por lo que valores mayores a estos se considera humectado. Con estos valores

y con los resultados del PCA podremos asignar el grupo de muestras humectada y

no humectada.


Antebrazo Dedo Dorso

Muestra % % %

S1 38.3 67.7 41.9

S2 49.1 68.7 45.9

S3 30 85.6 38.6

S4 24.6 77.8 25.5

S5 22.6 74.8 26.9

S6 28.3 68.1 34.5

S7 27.5 56.6 41.5

S8 21.7 64.3 21.5

S9 27.6 51.1 38

S10 31.4 67.8 34.6

S′1 59.7 73.9 56.5

S′2 60.6 74.1 63.1

S′3 57.2 85.7 57.2

S′4 53.4 80.5 54.3

S′5 49.2 90 30.4

S′6 56.2 73.9 38.7

S′7 45.7 58.9 54.4

S′8 46 66.4 51.2

S′9 43.2 74.4 46.4

S′10 49.8 49.8 52.9

Tabla 4.2: Porcentaje de humectacion de cada una de las zonas de cada voluntario siny con colageno (las muestras primadas son las muestras a las que se aplico colageno).


S1

S6

S2 S5

S7

S8

S4

S3

S9

S10

S’6

S’7

S’8 S’10

S’9

S’5

S’3

S’4

S’2

S’1

S1

S6

S2

S5

S7

S8

S4

S3

S9

S10

S’6

S’7S’8

S’10

S’9

S’5

S’3

S’4

S’2

S’1

Figura 4.17: Componentes principales 1 vs 2 y 1 vs 3 del antebrazo.

S1

S6

S2

S5

S7

S8

S4

S3

S9

S10

S’6

S’7

S’8

S’10

S’9

S’5

S’3

S’4

S’2

S’1

Figura 4.18: Componentes principales 2 vs 3 del antebrazo.


S1 S6

S2

S5

S7

S8 S4

S3 S9

S10

S’6

S’7S’8

S’10

S’9

S’5S’3

S’4S’2

S’1

S1

S6

S2

S5

S7

S8S4

S3

S9

S10

S’6

S’7

S’8

S’10S’9

S’5

S’3

S’4

S’2

S’1

Figura 4.19: Componentes principales 1 vs 2 y 1 vs 3 del dedo ındice.

S1

S6

S2

S5

S7

S8

S4

S3S9

S10

S’6

S’7

S’8

S’10S’9

S’5S’3

S’4

S’2

S’1

Figura 4.20: Componentes principales 2 vs 3 del dedo ındice.


S1

S6

S2

S5

S7

S8

S4

S3

S9

S10

S’6

S’7

S’8

S’10

S’9

S’5S’3

S’4

S’2

S’1

S1

S6

S2S5

S7

S8

S4

S3

S9

S10

S’6

S’7

S’8

S’10

S’9

S’5

S’3

S’4

S’2

S’1

Figura 4.21: Componentes principales 1 vs 2 y 1 vs 3 del dorso.

S1

S6

S2S5

S7

S8

S4

S3

S9

S10S’6

S’7

S’8

S’10

S’9

S’5

S’3 S’4

S’2

S’1

Figura 4.22: Componentes principales 2 vs 3 del dorso.

4.3 Discriminante lineal de Fisher 75

Como podemos observar ninguna combinacion de PC’s es buena para poder clasificar

la piel mediante humectacion ya que las separaciones observadas en las graficas

anteriores no corresponden con los valores obtenidos con el medidor de humectacion.

Para el caso del antebrazo figuras 4.17 y 4.18 las muestras que deberıan estar sepa-

radas de las demas son S′1, S

′2, S

′3, S

′4 y S

′6 los cuales son muestras humectadas, para

el dedo ındice figuras 4.19 y 4.20 S7, S8, S8, S9 y S′7 que son los No-humectados y

para el dorso figuras 4.21 y 4.22 S′1, S

′2, S

′3, S

′4, S

′7, S

′8, y S

′10 que son las muestras

humectadas lo cual no es clara su separacion ya que estan mezcladas con las mues-

tras de la otra clase. Con esto no queremos decir que esta tecnica no sea buena o no

funcione si no que para los propositos que deseamos no resulta viable, por lo que se

recurrio al metodo de discriminante de Fisher el cual se describe a continuacion.

4.3. Discriminante lineal de Fisher

El analisis discriminante es usado solo para clasificacion (i.e. con una variable categori-

ca), no por regresion. La variable categorica puede tener dos o mas categorıas. El

analisis de discriminante lineal encuentra una transformacion (“funcion discrimi-

nante”) de dos predicciones (para el caso de nuestro experimento), X1 y X2 que

produce un nuevo conjunto de valores transformados que proporcionan una discrim-

inacion mas precisa.

Objetivodelatransformacion = C1 ∗X1 + C2 ∗X2 (4.1)

Una funcion de transformacion es encontrar la maxima relacion entre las varianzas

de las clases a las varianzas dentro de las clases como se ilustra en la siguiente figura

4.23.


*

*

**

*

***

** ****

***

** *** *** * *

*

Entre las clases

dentro de la clase

Buena separación de clases

Figura 4.23: Buena separacion obtenida con la funcion de transformacion.

La funcion discriminante en la clasificacion asigna el objeto dentro de un grupo.

Si la entrada cumple con las caracterısticas del grupo sera asignada a este, si no, se

considerara como parte del otro grupo. Con los valores de la tabla 4.2 se determinara

la clase a la que pertenecen cada uno de los espectros. En las tablas 4.3, 4.4 y 4.5 se

muestran los valores de los promedios de los maximos de las bandas Raman de cada

zona de la mano de los 10 voluntarios, los cuales son las variables de entrada para la

construccion de la funcion discriminante.


Muestra Valor de entrada 1 Valor de entrada 2 Clase

S1 1.867 0.670 NH

S2 2.115 0.725 NH

S3 2.032 0.621 NH

S4 1.468 0.761 NH

S5 2.605 0.541 NH

S6 1.422 0.678 NH

S7 1.579 0.602 NH

S8 1.682 0.505 NH

S9 1.454 0.661 NH

S10 1.838 0.654 NH

S′1 1.295 0.691 H

S′2 1.535 0.740 H

S′3 1.204 0.575 H

S′4 1.627 0.619 H

S′5 2.394 0.575 NH

S′6 1.532 0.635 H

S′7 1.686 0.597 NH

S′8 1.95 0.632 NH

S′9 2.108 0.632 NH

S′10 1.732 0.646 NH

Tabla 4.3: Valores de entrada para calcular la funcion discriminante de Fisher delantebrazo (NH = NoHumectado y H = Humectado).



S1 2.222 0.622 NH

S2 2.764 0.631 NH

S3 1.906 0.614 NH

S4 1.143 0.639 NH

S5 1.297 0.632 NH

S6 1.77 0.587 NH

S7 1.894 0.598 NH

S8 2.042 0.688 NH

S9 1.135 0.655 NH

S10 2.249 0.649 NH

S′1 2.615 0.844 H

S′2 1.838 0.569 H

S′3 1.53 0.597 H

S′4 1.806 0.569 H

S′5 1.731 0.647 NH

S′6 2.121 0.621 NH

S′7 2.216 0.546 H

S′8 1.884 0.589 H

S′9 1.298 0.585 NH

S′10 2.169 0.548 H

Tabla 4.4: Valores de entrada para calcular la funcion discriminante de Fisher deldorso (NH = NoHumectado y H = Humectado).



S1 1.979 0.636 H

S2 2.941 0.542 H

S3 2.257 0.582 H

S4 2.139 0.854 H

S5 2.786 0.671 H

S6 2.376 0.645 H

S7 2.232 0.555 NH

S8 1.78 0.710 H

S9 2.176 0.733 NH

S10 1.549 0.590 H

S′1 1.913 0.765 H

S′2 1.732 0.642 H

S′3 1.035 0.586 H

S′4 1.835 0.763 H

S′5 1.483 0.699 H

S′6 1.100 0.652 H

S′7 1.877 0.625 NH

S′8 1.735 0.577 H

S′9 1.207 0.524 H

S′10 1.782 0.679 H

Tabla 4.5: Valores de entrada para calcular la funcion discriminante de Fisher deldedo (NH = NoHumectado y H = Humectado).

Con los valores de las tablas anteriores y con el algoritmo desarrollado en Matlab (ver

apendice A) se obtuvieron las siguientes funciones discriminantes para cada una de

las zonas. Las ecuaciones 4.2a, 4.2b son las funciones discriminantes no humectado y

humectado respectivamente para el antebrazo, 4.3a, 4.3b para del dedo y 4.4a, 4.4b

para el dorso.

NH = (26.9895, 210.5909) ∗ x′ − 92.1029, (4.2a)


H = (23.4805, 209.0685) ∗ x′ − 86.4322, (4.2b)

NH = (7.7753, 89.9253) ∗ x′ − 38.7130, (4.3a)

H = (6.7490, 92.7393) ∗ x′ − 36.7658, (4.3b)

NH = (3.9950, 153.3370) ∗ x′ − 52.2241, (4.4a)

H = (5.2842, 146.1099) ∗ x′ − 50.8359, (4.4b)

donde x es la matriz de entrada con los promedios de las bandas, los cuales se quiere

clasificar para determinar si la muestra esta humectada o no.

Con dichas ecuaciones se obtuvieron los resultados para la clasificacion los cuales

se muestran en las siguientes tablas 4.6, 4.7 y 4.8. Donde el mayor valor de cada

ecuacion es la clase a la que pertenece la muestra, i.e. si la funcion NH > H entonces

la muestra se considera no humectada o viceversa si H > NH la muestra se considera

humectada.


Muestra No humectado Humectado Asignacion por el metodo

S1 99.3823 97.4817 NH

S2 117.6582 114.8037 NH

S3 93.5167 91.1117 NH

S4 107.7773 107.1383 NH

S5 92.1344 87.8405 NH

S6 89.0567 88.7055 NH

S7 77.2892 76.5027 NH

S8 59.6418 58.6415 NH

S9 86.3404 85.9027 NH

S10 95.2302 93.4557 NH

S′1 88.3668 88.4413 H

S′2 105.1632 104.3210 NH∗

S′3 61.4822 62.0527 H

S′4 82.1647 81.1839 NH∗

S′5 93.5997 89.9945 NH

S′6 82.9702 82.2984 NH∗

S′7 79.0971 77.9463 NH

S′8 93.6200 91.4860 NH

S′9 97.8844 95.1959 NH

S′10 90.6846 89.2942 NH

Tabla 4.6: Resultados obtenidos con las ecuaciones 4.2a, 4.2b para el antebrazo( ∗ son mal clasificados).



S1 33.8668 35.5727 H

S2 32.8937 33.3477 H

S3 31.1724 32.4410 H

S4 54.7146 56.8697 H

S5 43.2889 44.2650 H

S6 37.7629 39.0866 H

S7 28.5500 29.7683 H∗

S8 38.9739 41.0923 NH

S9 44.1213 45.8979 H∗

S10 26.3868 28.4045 H

S′1 44.9540 47.0906 H

S′2 32.4858 34.4620 H

S′3 22.0306 24.5646 H

S′4 44.1677 46.3787 H

S′5 35.6755 38.0677 H

S′6 28.5356 31.1903 H

S′7 32.0846 33.8641 H∗

S′8 26.6640 28.4542 H

S′9 17.7926 19.9756 H

S′10 36.2018 38.2309 H

Tabla 4.7: Resultados obtenidos con las ecuaciones 4.3a, 4.3b para el dedo ındice( ∗ son mal clasificados).



S1 52.0284 51.7859 NH

S2 55.5737 55.9649 H∗

S3 49.5392 48.9472 NH

S4 50.3245 48.5681 NH

S5 49.8663 48.3591 NH

S6 44.8558 44.2836 NH

S7 47.0379 46.5460 NH

S8 61.4295 60.4780 NH

S9 52.7459 50.8636 NH

S10 56.2763 55.8735 NH

S′1 87.6392 86.2990 NH∗

S′2 42.3674 42.0129 NH∗

S′3 45.4304 44.4765 NH∗

S′4 42.2396 41.8438 NH∗

S′5 53.9002 52.8441 NH

S′6 51.4715 51.1061 NH

S′7 40.3508 40.6498 H

S′8 45.6179 45.1782 NH∗

S′9 42.6635 41.4972 NH

S′10 40.4697 40.6937 H

Tabla 4.8: Resultados obtenidos con las ecuaciones 4.4a, 4.4b para el dorso( ∗ son mal clasificados).

De acuerdo con la definicion de sensitividad el cual es la habilidad a la respuesta

para registrar pequenas diferencias1 tenemos que la sensitividad para el algoritmo es

Sensitividad =falso positivos

falsos positivos+ falsos negativos, (4.5)

1∗ http://www.thefreedictionary.com/sensitivity


Una vez encontrada la funcion discriminante y evaluada en los espectros de los 10

voluntarios encontrando que las funciones tienen una sensitividad de 85 %, 85 % y

70 % para el antebrazo, dedo y dorso respectivamente. Despues de tener la ecuacion

se realizo un experimento prueba para corroborar las funciones discriminantes, este

experimento se realizo con 18 voluntarios a los cuales se les hizo el mismo pro-

cedimiento, es decir se limpio la zona con alcohol se midio su espectro y despues se

les aplico colageno para medir su espectro de nuevo. Los resultados de dicho experi-

mento se muestran a continuacion. En las figuras 4.24, 4.25 y 4.26 se muestran los

espectros de los 18 voluntarios previamente filtrados, a los cuales tambien se super-

pone el espectro sintetico de las bandas del colageno.


Figura 4.24: Espectros de los 18 voluntarios del antebrazo superpuestas con las bandas delcolageno (lınea negra).



Figura 4.25: Espectros de los 18 voluntarios superpuestas del dedo con las bandas delcolageno (lınea negra).


Figura 4.26: Espectros de los 18 voluntarios del dorso superpuestas con las bandas delcolageno (lınea negra).


Una vez visto que las bandas reportadas en la literatura corresponden con las bandas

del experimento real se procedio a trabajar con ellas. En las figuras 4.27, 4.28 y 4.29

se muestran solo las bandas experimentales del colageno de los 18 voluntarios sin y

con colageno de las distintas zonas de la mano.


Figura 4.27: Bandas del colageno de los espectros experimentales de los 18 voluntarios delantebrazo.


Despues de corroborar que las bandas del colageno teoricas se ajustaban a las bandas

experimentales se normalizaron estas y se obtuvieron los promedios de los maximos

para tener las dos variables para la funcion de Fisher de las ecuaciones 4.2a, 4.2b,

4.3a, 4.3b, 4.4a y 4.4b para corroborar las funciones discriminantes comparando

con los valores obtenidos por el medidor de humectacion el cual se muestra en las

siguientes tablas 4.9 y 4.10.

Antebrazo Dorso Dedo

Muestra % % %

S1 31.2 34.1 41.5

S2 24.6 30.4 63.5

S3 32.1 41.4 81

S4 35.4 29.3 60.9

S5 32.3 32.9 70

S6 32.9 36.4 78.1

S7 55.1 55 63.9

S8 23.4 22.5 31.1

S9 31.5 30.3 64.4

S10 29.5 28.9 78.4

S11 22.6 51.1 81.8

S12 32.2 38.5 79.5

S13 32.4 31.8 72.6

S14 54.2 58.9 71

S15 41.1 43.7 64.7

S16 43.2 39 67

S17 52.9 52.3 62.9

S18 33.7 42.8 61.7

Tabla 4.9: Porcentaje de humectacion de cada una de las zonas de cada voluntario sin y

con colageno (las muestras primadas son las muestras a las que se aplico colageno).


Antebrazo Dorso Dedo

Muestra % % %

S′1 47.1 50.3 63

S′2 45.9 48.6 70.2

S′3 51.6 56.9 83

S′4 33.4 34.1 62.8

S′5 48.7 48 74.9

S′6 53 58.3 87.3

S′7 54.3 52.9 72.6

S′8 52.4 49.9 71.8

S′9 42.6 41.6 66.4

S′10 47.1 46 88.1

S′11 44.2 57.4 85.6

S′12 44.8 47.6 87.4

S′13 63.4 48.8 80.1

S′14 59.1 62.8 68.8

S′15 40.1 44.5 64.2

S′16 77.5 51.1 90.8

S′17 51.3 56 66.3

S′18 44.4 44.8 73.1

Tabla 4.10: Porcentaje de humectacion de cada una de las zonas de cada voluntario sin y

con colageno (las muestras primadas son las muestras a las que se aplico colageno).

Los valores obtenidos por los maximos de las bandas del colageno de las graficas

4.27, 4.28 y 4.29 se muestran en las siguientes tablas 4.11, 4.12, 4.13, 4.14, 4.15 y

4.16 junto con la clasificacion arrojada por las funciones discriminantes 4.2a, 4.2b,

4.4a, 4.4b, 4.3a y 4.3b de cada muestra.


Muestra Funcion NH Funcion H Clase asignada por el metodo

S1 140.57 139.70 NH

S2 89.85 89.71 NH

S3 68.10 69.20 H∗

S4 67.32 66.67 NH

S5 78.86 79.26 H∗

S6 86.80 85.11 NH

S7 57.97 59.12 H

S8 91.09 88.97 NH

S9 62.90 62.67 NH

S10 76.91 75.11 NH

S11 61.79 62.52 H∗

S12 69.45 69.73 H∗

S13 68.55 67.66 NH

S14 60.20 60.60 H

S15 55.38 56.35 H∗

S16 57.45 57.66 H∗

S17 52.14 53.64 H

S18 46.75 48.26 H∗

Tabla 4.11: Resultados de la clasificacion mediante el metodo discriminante de Fisherdel antebrazo (∗ son los resultados erroneos).



S′1 96.78 94.47 NH

S′2 72.58 74.16 H∗

S′3 60.69 62.45 H

S′4 70.16 69.78 NH

S′5 103.69 102.55 NH

S′6 76.47 75.04 NH∗

S′7 59.53 60.38 H

S′8 99.55 96.93 NH∗

S′9 59.33 60.65 H∗

S′10 58.55 60.22 H∗

S′11 77.58 77.02 NH

S′12 114.25 115.66 H∗

S′13 47.75 49.41 H

S′14 55.32 55.79 H

S′15 56.48 58.76 H∗

S′16 60.80 61.07 H

S′17 62.67 63.73 H

S′18 57.97 58.46 H∗

Tabla 4.12: Resultados de la clasificacion mediante el metodo discriminante de Fisherdel antebrazo (∗ son los resultados erroneos).



S1 44.94 43.21 NH

S2 55.61 53.80 NH

S3 36.98 35.52 NH

S4 47.20 45.85 NH

S5 37.31 36.63 NH

S6 49.82 48.92 NH

S7 44.55 42.46 NH∗

S8 43.16 41.99 NH

S9 42.24 41.45 NH

S10 45.03 44.18 NH

S11 42.68 41.52 NH∗

S12 51.54 48.98 NH

S13 37.81 37.41 NH

S14 39.79 38.32 NH∗

S15 39.56 39.15 NH

S16 37.76 36.77 NH

S17 36.23 35.26 NH∗

S18 42.67 41.79 NH

Tabla 4.13: Resultados de la clasificacion mediante el metodo discriminante de Fisherdel dorso (∗ son los resultados erroneos).



S′1 45.43 43.79 NH∗

S′2 66.23 65.02 NH

S′3 41.34 40.94 NH∗

S′4 40.84 40.05 NH

S′5 45.60 45.16 NH

S′6 32.74 31.10 NH∗

S′7 34.88 33.31 NH∗

S′8 40.08 38.94 NH

S′9 40.32 38.62 NH

S′10 36.38 36.03 NH

S′11 49.22 48.58 NH∗

S′12 37.82 36.74 NH

S′13 45.34 44.64 NH

S′14 39.74 38.77 NH∗

S′15 39.87 38.37 NH

S′16 38.99 38.35 NH∗

S′17 37.34 36.21 NH∗

S′18 42.93 41.00 NH

Tabla 4.14: Resultados de la clasificacion mediante el metodo discriminante de Fisherdel dorso (∗ son los resultados erroneos).



S1 36.81 38.33 H∗

S2 46.42 48.68 H

S3 58.95 62.37 H

S4 37.46 38.17 H

S5 34.14 34.42 H

S6 31.56 30.68 NH∗

S7 33.57 34.29 H

S8 37.74 38.22 H∗

S9 34.93 35.55 H

S10 72.78 78.41 H

S11 63.43 67.71 H

S12 41.86 43.45 H

S13 45.08 46.10 H

S14 60.12 63.15 H

S15 60.75 64.03 H

S16 112.38 123.13 H

S17 68.52 72.22 H

S18 49.87 53.23 H

Tabla 4.15: Resultados de la clasificacion mediante el metodo discriminante de Fisherdel dedo (∗ son los resultados erroneos).



S′1 29.97 30.34 H

S′2 60.79 65.70 H

S′3 71.08 75.68 H

S′4 29.83 30.57 H

S′5 36.60 36.67 H

S′6 93.81 102.29 H

S′7 39.39 40.00 H

S′8 36.25 37.31 H

S′9 32.39 33.39 H

S′10 37.27 37.83 H

S′11 45.51 47.93 H

S′12 50.13 52.16 H

S′13 27.09 27.77 H

S′14 112.56 122.81 H

S′15 39.09 40.20 H

S′16 41.97 43.21 H

S′17 47.05 48.97 H

S′18 73.74 79.27 H

Tabla 4.16: Resultados de la clasificacion mediante el metodo discriminante de Fisherdel dedo (∗ son los resultados erroneos).

con esto tenemos que el algoritmo tiene una sensitividad de 91.66 %, 66.66 % y

58.33 % para el dedo ındice, dorso y antebrazo respectivamente para los 18 vol-

untarios a los cuales se les probo el algoritmo encontrado con los primeros 10. Con

esto tenemos que el dedo ındice es la mejor zona para determinar si la piel esta

humectada o no humectada.

Capıtulo 5

Conclusiones

En esta tesis se obtuvieron espectros Raman de la piel encontrando la influencia que

tiene una piel humectada con respecto a una no humectada, observando las diferen-

cias en potencia de los espectros Raman, logrando clasificar la piel por humectacion.

Se encontro que la tecnica de PCA no es efectiva para la clasificacion de piel mediante

humectacion ya que la separacion de las muestras son bajo otras caracterısticas que

bien podrıan ser el tipo de sangre, el contenido de ciertas sustancias en los fluidos

intersticiales (como colesterol, glucosa, trigliceridos, etc.) los cuales no sabemos si

estos fueron el factor o si son otras caracterısticas de la piel.

Se encontro que el dedo ındice fue la mejor zona de la mano en donde las mediciones

dan los mejores resultados en la medicion del colageno y por tanto la sensitividad es

la mejor, lo cual coincide con lo reportado en la literatura ya que la yema del dedo

contiene una gran cantidad de vasos sanguıneos.

Se logro clasificar la piel mediante humectacion con el metodo de discriminante lineal

de Fisher con el cual se obtuvo una sensitividad de 91.66 % en el dedo ındice.

Se logro implementar una interfaz de usuario para la eliminacion de ruido en espec-

tros Raman con los distintos metodos conocidos en la literatura el cual servira para

el analisis de espectros Raman en el laboratorio de biomedica del INAOE, siendo

5.1 Trabajo a futuro 97

una interfaz facil de usar sin tener mucho conocimiento de la operacion de esta ya

que los botones implementan los metodos reportados en la literatura sin necesidad

de implementar algun parametro extra.

Se optimizo la montura motorizada de la punta de prueba del espectrometro Raman

para su posicionamiento automatico en piel, a la distancia focal que es donde se

obtiene una mejor senal Raman.

5.1. Trabajo a futuro

Analizar otras zonas del cuerpo donde se tenga mayor concentracion de colageno y

que sean factibles para las condiciones de la montura donde esta colocada la punta

de prueba ya que no cualquier parte del cuerpo puede ser medida por las condiciones

de espacio de dicha montura.

Disenar una montura para poder realizar mediciones de espectros Raman en otras

zonas del cuerpo ya que con la montura que se tiene no es posible analizar cualquier

zona ya que esta limitada por el tamano y la forma de esta, ademas de que la fibra

se puede mover y eso afecta a la senal y no se obtendrıan buenos espectros de la

muestra en analisis.

Implementar un algoritmo para el analisis de imagenes OCT con el fin de obtener

informacion valiosa para una mejor clasificacion de piel mediante humectacion ya

que las imagenes por si solas no muestran una clara diferencia entre una piel con

algun agente humectante o sin este.

Asociar la potencia de excitacion con la humectacion para poder obtener una mejor

senal Raman la cual depende en gran medida de la cantidad de potencia suministra-

da a la muestra.

5.2 Participaciones 98

Realizar mediciones con mas de 20 personas para corroborar la sensitividad del al-

goritmo en la clasificacion.

5.2. Participaciones

Los Resultados de este trabajo de tesis fueron presentados en el European Conference

on Biomedical Optics (ECBO 2013) que pertenecio al 21st International Congress on

Photonics in Europe-Collacated with Laser World of PHOTONICS 2013 en Munich

Alemania, como sesion oral de 15 minutos el cual tuvo el titulo Skin moisture clas-

sification using Raman spectroscopy.

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