CAPITUI,O III

BACTERIAS H^TEROTROFAS

i. Fijadoras del nitrógeno atmosférico.

Como ya se ha índicado (prímera paríe - 2g), las bacterias hete-rótrofas, al carecer del poder de síntesis, han de utilizar - para laelaboración de su propio cuerpo y para obtener la energía necesaria almantenimiento de sus funciones vitales - materia orgánica formadapor otros organismos. A estos fines, tales bacterias utilizan compues-tos orgánicos complejos, tales como los proteidos y los productos desu hidrólisis, polipéptídos e incluso aminoácidos, las grasas y ácidosgrasos y los glúcidos, presentando algunas bacterias preferencia^ pordeterminados grupos, raientras que otras pueden utilizar como fuentede carbono y energfa una gran variedad de materias.

El nitrógeno lo obtienen preferentemente unas bacterias de pro-teínas complejas, albumosas o peptonas, mientras que otras son ca-paces de fijar dírectamente el nitrágeno atmosférico. Atendiendo aeste modo de adquirir su nitrógeno, pueden clasificarse las bacteriasheterótrofas de la siguiente forma:

Z. - BACTRRIAS FIJADORAS DRI, NITRbG^NO ATMOSIrk^RICO.

a) Bacterias libres . ^ I• - Anaerobias.^ II. - Aerobias.

b) Bacterias en simbiosis.

2. - BACTERIAS A^ROBIA5 QU^ NECF.SITAN NITRÓGRNO COMBINADO.

a) Formando es fioras.

b) No f ormando es^oras.

^. - BACT^RIAS ANA^ROBIAS QUI3 NDC$SITAN NITRÓGI:NO COMBINADO.

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i. - Bacterias fijadoras del nitrógeno atmosfErico.

a) I. - BACT^ttiAS LisR>rs nxA^xosrAS. -(Véase primera parte,páginas io$-ii3.)

Para el aislamiento de estas bacterias, tuvo Winogradsky la felizidea de utilizar un medio de cultivo desprovisto totalmente de nitró-geno, en el que sólo podrían desarrollarse aquellos organismos capacesde proporcionarse el nitrógeno de la atmósfera. ^1 medio empleadopor Winogradsky ( iog) fué el siguiente:

Fosfato bípotásíco (S^I3P0^) .... .... .. . . . . . . i,o gramos.Sulfato magnEsíco (MgSO^ ' 7Hy0) ... . . . . . . . . o,x rClornro sódico (NaCI) .... . .. . . .. . . . . . . . . . . . o,oi rSulfato ferroao (PeSO^ • ^H^O) .. . . . . . . . . . . . . o,oi •Snlfato de manganeso (MnSO^ • 4Ii^0) .. . . .. . o,oi ►Glucosa ......... ......................... xo,oo ►Carbonato cálcico (CaCos) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30,00 +Agua destilada ............................ iooo c.c.

Para evitar la descomposición de la glucosa, conviene esterilizarel carbonato de cal separadamente. .

El medio se distribuye en matraces pequeños de i5o c. c. de cabida,llenos hasta el cuello, que se esterilizan a iio^ durante treinta minu-tos, añadiendo a cada uno de ellos unos 4 gramos de carbonato de cal.

5e prepara un extracto de suelo pasteurizado, para lo cual seponen 5o gramos de1 suelo en 20o c. c. de agua, calentando Ientamentehasta los $o^, temperatura que se mantiene durante quince minutos.5e enfña rápidamente, y mediante pipetas esterilizadas se inoculanlos matraces, poniendo en cada uno de ellos io c. c. del e^racto desuelo. Se incuban a 25^ ó 30^, observándose la formación de abundantesburbujas gaseosas, índice de la fermentación butírica que se extiendepor todo el Iíquido, mientras que las partículas de carbonato se recu-bren de un mucílago en el que se encuentran bacterias anaerobiaspertenecientes al género Clostridium, y especie denominada por Wino-gradsky Cl. ^astorianum. El cultivo se enriquece haciendo trasplantessucesivos en el mismo medio, utilizando como inóculo una partículadel carbonato de cal del fondo del cultivo. I,as observaciones micros-cópicas hay que efectuarlas en gotas de líquido tomadas del fondo de1matraz con una pipeta esterilizada.

Para obtener cultivos puros se calienta a 7g^, durante diez minutos,un cultivo enriquecido, con lo que mueren las bacterias que no formanesporas, y este cultivo sirve para inocular trozos de patata, que pre-

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viamente han sido espolvoreados con carbonato de cal y esterilizadosen placas de Petri. Las placas inoculadas se incuban a 30^, en condi-ciones anaerobias, en vacío parcial o en atmósfera de hidrógeno, yal cabo de unos seis días pueden observarse sobre la superficie de lapatata colonias amarillentas, redondeadas, llenas de burbujas gaseosas,formadas por Clostridium pastorianum.

Como medio para el aislamiento y cultivo de las bacterias produc-toras de ácido butírico, puede emplearse también el siguiente mediosólido (=4):

Glucosa ................................. I,o gramos.

Peptona Witte ........................... I,2 •

Eztracto de carne I,íebig ......... .. . . . . . . . 0,8 •

Goruro sódíco (NaG) .... . . . . . . . . . . . . . . . . o,z •

Agar ................................... I,6 •

Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ioo c, c.

Reacdbn ligeramente alcaliaa.

I,as bacterias del género Clostridium son bastoncillos anaerobioso microaerófilos, que, al esporular, se ensanchan en forma de huso(Clostridium de Fischer) o de palillo de tambor (Pkctridium de Fis-cher). Bredeman (i4) incluyó en una sola especie, Bacillus amylo-bacter, todas las bacterias que tienen la propiedad de fijar nitrógenoatmosférico y llevar a cabo la fermentación de diversos gltícidos conformación de ácido butírico y alcohol butílico. Aun cuando autorescomo Omeliansky (76) se mostraron disconformes con esta agrupa-ción en una sola especie, de bacterias tales como Clostridium, Granu-lobacter, Plectridium, etc., esta misma norma ha sido seguida porBergey en su Manual, que, como se ve a continuación, incluye en laespecie Clostridium butyricum Prazmowsky una serie de bacteriasdescubiertas por diversos investigadores en diferentes medios y pro-cesos, entre ellas el Clostridium ^astorianum, encontrado por Wino-gradsky.

Clostridium butyricum Prazmowsky.(Botan. Zeitung, 37^ 409: 1879•)

Slxoxlnaes. - Vibrion butyrique Pasteur (Compt. Rend., 5z^ 334: 1861). Bacillus

amylobacter van Tieghem (Bul1. Soc. Bot. France, z4: Iz8; 1877). Bacillus butyricus

Botkin (Zeit. f. Hyg., II: 42I; 18gz). Granulobacter saccharobutyricum Beijeriack

yGranulobacter lactobutyricum Beijerinck (Verhandl. d. K. Akad. v. Wetenschappen,

Tweede Sectie, Deel I, Amsterdam, 18g3). Granulobacter butylicum Beijerlnck

(Arch. Neerland., zg, 1896). Clostridium pastorianum Winogradsky (Centbl. Bakt., II,

9^ 43: 19oz). Plectridium plectinovorum Storner (Centbl. Bakt., II, Ig: 171; Igo4).

Bacillus amylobacter Bredemann (Centbl. Bakt., II, z3^ 385: 1909)•

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Bastoncillos, de o,7g a i µ X 3 a zo µ, presentándose aislados,en parejas y en cadenas largas. Pueden producir formas delgadas,de o,s µ de ancho. En los cultivos jóvenes se mueven activamentecon flagelos perítricos. Fsporas ovales centrales de i X 2 a 5 µ. Acu-mula glicógeno en sus células y es Gram positiva.

Picadura profunda en gelatina: No muestra licuación.Colonias en agar-suero (anaerobias): Pequeñas, aplastadas, irregu-

lares, grisá.ceas, semitransparentes.Colonias en agar simple y glucosado, en bisel (anaerobias): Gri-

sáosas, aplastadas, húmedas, eatendidas, con bordes irregulares,laciniados.

Colonias profundas, en cultivos de agar en masa, compactas, de2 a 3 mm. de diámetro, con porción central densa y periferia lanosapoco definida.

I,a picadura profunda en agar muestra un desarrollo filiforme gra-nuloso.

^nturbia el caldo glucosado.Coagulación ácida de 1a leche tornasolada, con formación abun-

dante de gas y reducción precoz del tornasol.Sobre patata (con carbonato de cal), formación de una película del-

gada, estensa, difícilmente perceptible, en la que posteriormente apa-recen puntos elevados amarillentos. El medio se hace blando y friable,con formación de burbujas gaseosas.

No forma indol.No licúa el suero sanguíneo.Reduce los nitratos a nitritos y amonfaco.Fermenta la glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa y el almidón, con

formación de ácidos, gases y alcoholes, en cantidades dependientesde la temperatura, de la cantidad de hidrato de carbono fermentabley de las substancias nitrogenadas de que disponga. Forma principal-mente ácido butírico, con cantidades menores de ácidos propiónico,acético y fórmico. I,os gases formados son CO, y H=. I,os alcoholesformados son los butílico, propílico, etílico y trazas de amílico, de-pendiendo de la composición de las substancias fermentadas. De ordi-nario se forman dos partes de alcohol por una de acetona.

Fija el nitrógeno atmosférico.Anaerobia, aun cuando soporte pequeñas cantidades de oxígeno;

con 3o mmgs. de oxígeno por litro las esporas llegan a germinar.Temperatura óptima: 30o a 400,Reacción mínima: pH = 5. fdem bptima: pH = 6,g a ^,3.

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I,a presencia del Clostridium en casi todos los suelos del Globo hasido comprobada por diversos investigadores, principalmente porWinogradsky (iog), Omeliansky (^6), Preudenreich (qI) Haselhoffy Bredeman (48).

a) II. - BACT^RIAS I.IBR^s ArROBIAS. - En el anterioi métodopara el aislamiento de bacterias anaerobias, fijadoras de nitrógeno,la pasteurización o calentamiento del suelo hasta 80^ practicada porWinogradsky tenía por finalidad simplificar la flora bacteriana delsuelo eliminando los microorganismos que no eran susceptibles de espo-rular. Beijerinck (6), empleando una tierra de jardín sin pasteurizar,inoculada en un medio sin nitrógeno que contenía manita como fuen-te de carbono, e incubando a 25^ ó 30^, encontró una bacteria enforma de bastoncillos bastante anchos y a veces semejantes a levaduras,inmóviles o móviles con ayuda de un solo flagelo polar, aerobia obli-gada, que de ordinario se desarrollaba formando sobre la superficie delmedio de cultivo una película grisácea que más tarde torna color pardo.Beijerinck denominó a esta bacteria Azotobacter chroococcum, compro-bando su presencia en casi todos los suelos ensayados y en el estiércol.

Una porción de la película formada puede trasplantarse a otromatraz con el mismo medio de cultivo:

Manita .................................... 20,o gramos.

Irosfato bipotásico (g^HPO^) ........ . . . . . . . . . o,z •

Agua corríettte .............................. iooo c.c.

Y después de varios trasplantes, se tiene un cultivo suficientementeenriquecido que permite el aislamiento del Azotobacter. Para ello, deun cultivo reciente en que la pelicula formada sea todavía muy del-gada, se toma con e1 asa de platino una gota, que se diluye en aguaesterilizada, agitando para separar las células bacterianas; a partirde ésta, se hace una segttnda dilución, y luego, una tercera, que seutilizan para inocular, en estrías, placas del rnedio de cultivo, solidi-ficado por la adición de un 2 por ioo de agar. Se incuban las placasa 25^, y a los pocos días aparecen las colonias de Axotobacter, redon-deadas, elevadas, convexas, lisa.s, pálidas, semiopacas, húmedas yviscosas, a menudo de 4 a 8 mm. de diámetro, que se seleccionan cui-dadosamente con ayuda del microscopio para diferenciarlas de lascolonias transparentes y elevadas del Bacterium radioóacter, que, confrecuencia, acompaña al Axotobacter, y al que a veces cuesta trabajoeliminar en la obtención de cultivos puros.

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Fn lugar del medio de Beijerinck, puede emplearse cualquiera delos siguientes:

Solución de Li^man (60):Manita ................................... i5 gramos.

S•HPO^ .................................. 0,2 •

MgSO^ • ^H=O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.2 •

CaCI^ .................................... 0,02 •

Agna deatilada ......... ... . . . . ... . . . . .. .. .. iooo c, c.

FeCI,: Una gota de soludón al ra por ioo.

Una vez disueltas las substancias, se añade la cantidad de soluciónde NaOH, al io por ioo, necesaria para que la fenolftaleína tome colo-ración ligeramente rosa.

Solución de Ashby (i):Manita .................................... io gramos.

SH•PO^ ................................... 0,2 •

MgSOj• ^H^O ............................. 0,2 •

NaCI ..................................... 0,2 •

CaSO^• 2H^0 ............................. o,i r

CaCO• .................................... g,o •

Agua destilada ............................. iooo c. c.

Neutralizar con NaOH como la anterlor.

I,os cultivos puros de Azotobacter se obtienen fácilmente utilizandoel gel silíceo de Winogradsky, que se prepara partiendo de una solu-ción a125 por xoo, hecha con partes iguales, de silicatos sódico y potá-sico, cuyo peso específico se lleva a i,o6. En una placa de Petri secolocan g c. c. de esta solución, agregando una cota de fenolftaleína.Se prepara una solución de ácido clorhídrico a15 por ioo, y se va agre-gando al silicato con una pipeta graduada, hasta que desaparezcael color rojo, y se ajusta la solución de HCl de tal modo que 5 c. c. neu-tralicen 5 c. c. de 1a de silicatos.

Para preparar 1as placas de ge1 silfceo se mezclan en un frasco vo-lfimenes iguales de soluciones de silicatos y de HCI, agitando vigoro-samente y vertiendo con rapidez en placas de Petri, que se colocanhorizontalmente hasta que coagule el gel, lo que tarda de cinco a diezminutos. I,uego se llevan a recipientes de poco fondo, donde se dializanen agua corriente hasta la desaparición de los cloruros, lo que requiereunas veinticuatro horas, trasladándolas después a un vaso estéril quecontenga agua destilada hervida, que se renueva varias veces. Des-pués de bien lavadas, se escurren, y se tratan con la solución nutri-tiva que convenga emplear.

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l^n el caso del Azotobacter, se echa sobre la superficie del gel solu-ción de manita, y se llevan las placas, descubiertas, a una estufa de 60^,para que se evapore el egceso de líquido, cuidando de que el medio nose deseque demasiado (*).

Las placas se inoculan con pequeñas porciones de suelo y se incu-ban a 28^, formándose las colonias de Azotobacter alrededor de laspartículas de suelo, de donde pueden llevarse al medio líquido decultivo.

Las bacterias del género Azotobacter tienen, como hemos indicado,forma de bastoncillos anchos, y a veces redondeada, obteniendo laenergía que necesitan para su desarrollo mediante la ozidación deglúcidos. Son móviles o inmóviles; en el primer caso pueden poseerun solo flagelo polar o un manojo de flagelos también polares.

Varios autores, Beijerinck entre ellos, niegan la formación de espo-

ras en este género, mientras que Ashby, Fischer y Krzemieniewski

creen en ella, toda vez que puede resistir la desecación durante pro-

longados períodos. Prazmowski (78) demostró que la formación de

esporas tiene lugar en condiciones normales, con suficiente aireación,

en presencia de humatos. I,as principales especies del género Azoto-

bacter son las siguientes (9):

Azotobacter chroococcum Beijerinck.

(Centbl. Bakt., II, 9: 3-43: i9o2•)

Bastoncillo, de 2 a 3 µ X 3 a 6 K, presentándose en parejas y paque-tes y rara vez en cadenas. I,as células presentan tres o cuatro gránulosrefringentes y están rodeadas de una membrana mucilaginosa de espe-sor variable, que toma color pardusco en los cultivos viejos. I,a ma-teria colorante es soluble en agua, alcohol, éter y cloroformo. Móvilpor medio de un flagelo polar.

Colonias en gelatina: Pequeñas, circulares, amarillas, granulosas.Con el tiempo toman color pardo amarillento.

Picadura profunda en gelatina: Crecimiento débil. No lícúa Iagelatina.

Picadura profunda en agar-manita: Gris tendiendo a pardusco.

(^) 7,os medios silfceos no necesitan esterilizatse, toda vez que los lavados conagua esterilizada, seguidos del empleo de medios muy selectivos, son suficientes paraasegurar la esterilidad en lo que se refiere a contaminaciones de la atmósfera.

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Caldo: No se desarrolla.Leche tornasolada: Se aclara de diez a catorce días.Patata: Brillante, escasamente perceptible, viscosa y rugosa, pardo

achocolatado.Pste organismo fija nitrógeno atmosférico y desprende CO=, utili-

zando las siguientes substancias como fuente de energía: glucosa, levu-losa, maltosa, manita, inulina, dextrina, galactosa, arabinosa, lactosa,almidón, glicerol, alcohol etílico, acetatos, butiratos, citratos, lactatos,malatos, propionatos y succinatos.

Aerobia.Temperatura óptima: 250.Habitat: Se ha comprobado su presencia en casi todos los suelos

con pH supenior a 6,0.

Axotobacier agilis Beijerinck.

(Cex^bl. Bakt., II, ^: g61-g8z; 190I.^

Bastoncillos, de 4 a 6 µ de longitud, casi esféricos.Muy movible con ayuda de una manojo polar de cuatro a diez

flagelos.Se desarrolla en medios carentes de compuestos orgánicos de ni-

trógeno.Colonias sobre agar-manita: Circulares, blancoagrisadas, translú-

cidas, con centro blanquecino.Colonias sobre agar lavado: Muestran ligera fluorescencia verde

azulada.Cultivo sobre agar-manita en bisel: Grisáceo, translúcido, fluores-

cente.Cultivo sobre agar lavado, en bisel: Blanco amarillento, liso, bri»

llante, translúcido, con centro opaco.Caldo: Se enturbia, con formación de anillo.I,eche tornasolada: Se aclara de diez a catorce días.Cultivo sobre patata: Blanco amarillento, mucilaginoso, tomando

más tarde color pardo amarillento.^n presencia de ácidos orgánicos, se forma un pigmento verdoso

o rojizo.Aerobia.Temperatura óptima: 280.Habitat: 1^ncontrada en las aguas de los canales de Delft.

-$Z^

Aaotobacter vinelandii 7,ipman.(New Jersey Agr. Exp. Sta. Rapt., z4: ziy-z8g; igo3.)

Bastoncillos, de 2 a 3 µ X 3 a 6 µ. Se presentan aislados, en parejasy en cadenas cortas. Móvíles por medio de un flagelo polar.

Colonias sobre agar-manita: Grandes, circulares, blancas, ligera-mente transparentes, con fluorescencia verdosa.

Caldo glucosado: Enturbiamiento eon ligero sedimento algodonoso.I,eche tornasolada: Se aclara de diez a catorce días.Cultivo sobre patata: Aplastado, amarillento, pasando a pardo

claro.Aerobia.Temperatura óptima: 2go.Habitat: ^ncontrada en suelos de Nueva Jersey.

Azotobacter Beijerinckii I,ipman.(New Jersey Agr. Ezp. Sta. Rep., z4^ ^i7-z$5. 1903: 25^ 237-289. 19o4 Ĵ

Células, de 3 a 4 µ X 5 a 6 µ, que se presentan aisladas, en pares o,más raramente, en cadenas. Móviles por medio de un flagelo polar.

Colonias sobre agar-manita: Circulares, blancas o amarillo deazufxe.

Sobre agar-manita, en bisel: Blanco, pasando a amarillo de azufre.Caldo glucosado: No se enturbia. Sobre la superficie flotan peque-

ñas masas circulares blancas.I,eche tornasolada: Se aclara de diez a catorce días.Sobre patata: Aplastado, amarillento, brillante, pasando a amarillo

pardusco.Aerobia.Temperatura óptima: 250.Habitat: 5uelo.

Axotobacter vitreus I,óhnis y Westerman.

(Centbl. Bakt., II, ^z: z34-z54• 1908.)

Células esféricas, de unos 2 µ de diámetro, inmóviles, que se pre-sentan aisladas o en grupos.

Colonias en agar-manita: Pequeñas, circulares, blancas,ligeramentetranslúcidas, brillantes.

Caldo glucosado: Sedimento mucilaginoso.

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I,eche tornasolada: Se adara de diez a catorce días.Patata: Desanollo ligero, escasamente vísible.Aerobia.Temperatura óptima: 2g^.Habitat: Suelo.

* * s

Además de 1as bacterias de los géneros Clostrádium y Axotobacter,se ha observado en cultivos de otras bacterias existentes en el suelola propiedad de fijar el nitrógeno atmosférico. »ntre otras, mencio-naremos el Bacillus asteros^orus (Meyer) Migula, que puede fijarde i a 3 mgs. de nitrógeno por gramo de glucosa consumido (14);el Bacterium radioóacter (63}, y una forma afín al Proteus vulgaris, ca-paz de fijar de r,& a 4,^ mgs. de nitrógeno por gramo de azúcar con-sumido (94) •

Sin embargo, para Winogradsky, las bacterias fijadoras de nitró-geno, cuya presencia se ha señalado en el suelo, deben agruparse endos categorlas:

I.s Agentes fijadores neutrales, que comprenden a Ios dos gruposclásicos del Clostrádium ^iastorianum y Axotoóacter, cuya función nor-mal consiste en la fijación del nitrógeno; y

2.s Agentes fijadores artificiales, que comprenden aquellos orga-nismos que pueden fijar pequeñas cantidades de nitrógeno en lascondiciones artificiales del laboratorio, y que no parece tomen parteen el proceso de fijación de nítrógeno del suelo.

b) BACTERIAS ^x sl^slosls. -(Véase primera parte, pági-

nas I14-I16.) - Poco tiempo después de los trabajos de Hellriegel y

Wilfarth sobre el origen de las nudosidades de las raíces de las legu-

minosas y su intervención en la fijación del nitrógeno atmosférico,consiguió Beíjerinck (4) aislar en cultivo puro al microorganismo cau-

sante del proceso, que denominó Bacillus radicicola, y que, según él,se encontraba en el suelo en forma de pequeños bastoncillos, capaces

cie penetrar en los pelos absorbentes de las raíces de las leguminosas,

pasando luego al interior de la raíz, evolucíonando en bacilos móviles,

y posteriormente en bacterioides inmóviles, ahorquillados o ramifica-

dos, que funcionan como organísmos simbiótícos.

A raíz de este descubrimiento se llevaron a cabo numerosas inves-tigaciones, especialmente las de Bewley y Hutchinson (io), y posterior-

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mente las de Thorton y Gangulee {q2), que confirmaron la opinión deWinogradsky sobre el ciclo evolutivo que e$perimentaban las célulasdel Bac. radicicola, tanto en el labotario, en medios de cultivo arti-ficiales, como en su medio habitual de vida, parecíendo exístir unarelación entre la alimentación y este ciclo.

A partir de un cultivo joven de Bac. radicicola, se observan las si-guientes fases: Micrococos inmóviles, que al cabo de un cierto tiempocrecen hasta duplicar su diámetro primitivo; células elipsoidales, pro-vistas de un flagelo, que poseen una movilidad extraordinaria, cons-tituyendo lo que algunos denominaron afase de enjambres, ►; bacilosmóvfles provistos de flagelos peritricos, que van perdienda paulati-namente hasta quedar inmóviles, y, finalmente, bacterioides, muchosde ellos ramificados en T o en Y, vacuolados, y presentando el conte-nido protoplásmico concentrado en fajas o bandas transversales.

I,a multiplicación celular se verifica en dos fases: por biparti-ción de los bacilos móviles o por divisíón múltiple de Ios bacte-rioides, en la que cada banda protoplasmática da lugar a un nuevoindividuo.

I,a formación de bacterioides en los medios de cultivo es estimu-lada por la adición de azúcares o pequeñas cantidades de ácidos orgá-nicos de los contenidos en la savia de la planta hospitalaria (8g). I,aformacián de micrococos, que se transforman rápídamente en uenjam-bres», se estimula fuertemente por la adición de fosfatos o de leche.

^n el suelo, el Bac. radicicola experimenta las mismas transforma-ciones que en los medios de cultivo, y también aquf viene estimuladala movilidad por la adición de fosfatos. En condiciones favorables dehumedad, temperatura y compacidad del suelo, la forma móvil puededesplazarse con una velocidad de un mílímetro por hora.

1;1 modo de penetración del organismo en las rafces ha sido estu-diado por diversos investigadores, y recientemente por Thornton,quien ha podido comprobar que los nódulos no suelen aparecer enla planta recién germinada hasta que se empiezan a formar las hojasverdaderas (qi), época en que la planta segrega por sus raíces unasubstancia que estimula la multiplicación de las bacterias a su alrededor.Cerca de la egtremidad de los pelos absorbentes se desarrollan pe-queñas colonias de bacterias que segregan una substancia termoesta-ble susceptible de separarse de las bacterias por filtración (93), queprovoca un cxecimiento asimétrico del pelo, a consecuencia del cualéste se riza o encorva, penetrando 1as bacterias por la región encorva-da mediante un proceso que se ignoxa. Una vez dentro de Ia rafz las

- ss -

bacterias, se multiplican, formando un filamento o cordón mucilaginosoque se extiende por el parénquima cortical de la ratz, y al llegarjunto a las células de la endodermis excita 1a multiplicación de lascélulas próximas, iniciándose de este modo la formación de la nudo-sidad, que progresa de modo distinto según la especie de la plantahospitalaria. )^n los Lupinus y Phaseolus, la infección produce unarápida multiplicación de las células infestadas, dando lugar a la for-macián de la nudosidad, que en estas plantas suele tener su origen enla zona del cambium. En otras muchas plantas, las células infestadasdejan de dividirse, y la nudosidad se origina a expensas de célulasmás externas que no han sido alcanzadas por las bacterias (bg). Amedida que la nudosidad crece, se forman en ella elementos vascu-lares, unidos a los de la rafz, por los cuales reciben hidratos de carbonoIas bacterias.

$n todos los tipos de nudosidad, las bacterias se multiplican den-tro del citoplasma de la células hospitalarias, llenándolas por com-pleto y tomando, en su mayor parte, forma de bacterioides, lo quehace suponer que sean éstos los agentes que llevan a cabo la fijacióndel nitrógeno.

El Sac. rqdicicola puede aislarse de1 suelo o mejor aún de Ias nudasidades, que se esterilizan ezteriormente con sublimado corrosivoal 2 por I.ooo durante dos o tres minutos, lavándolas luego variasveces con agua destilada esterilizada, y, finalmente, mediante unavarilla de vidrio esterilizada se machacan en un tubo que contengaun poco de agua esterilizada, utilizando esta agua, que lleva en sus-pensi8n las bacterias, para hacer las siembras en medio de cultivo,que puede ser el de Ashby (pág, go) o alguno de los siguientes:

i) Madio a óase da glucosa (3g):

Glucosa ..................................... 20,0o gramos.F'osfato monopotásirn {KFI^P04) . . . . . . . . . . . .. . i,oo rSulfato magttésíco (MgSO^ • qHrO) ........ ... .. o,io rCloruro sódico (NaCI) .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Indicfos.Sulfato ferroso (PeSO^) ........ . . . . . . . . . . . . . . . fdem.Sultato mangattoso (MnSO4) .. .. . . . .. . . . . . .... fdem.Cloruro cálcico (CaCI,) .......... .. ...... .. .. .. fdem.Agua deatilada .. .. .. . ..... .. . ... .... . .. ..... iooo c. c.

M b2) edio a ase de ma^nita (iis):

Manita ..................................... io,o gramos.Goruro sódico (NaG) .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 •Fosfato bipotásico (K^HPO^) ........ . . . . . . . . . . o,g ,r

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Sulfato magaEsico (MSSO^ ' 7Hr0) . ...... . . . . . . o,s gramos.

Sulfato cáldoo (CaSO^ • aH^O) ...... . ........ . o,c ^

Carbonato cálcIco (CaCO^) ..... . . ... . . . . . . . . . . i,o •

Agus dtlevadura ............................ ioo c. c.

Agua destilada .............................. goo c. c.

Agarlavado ................................. i5,o gramos.

Para preparar el agua de levadura se diluye levadura, libre de al-midón, en diez veces su peso de agua corriente; se calienta en baño devapor durante dos o tres horas, agitando de vez en cuando; se esteri-liza durante veinte minutos a iio^, y después de dejarla en reposodurante cuarenta y ocho horas, se decanta el líquído con ayuda deun sifón.

3) M^dias a óase de txtractos de legurwixosas.

Para su preparación se maceran dos o tres horas ioo gramos desemillas en tooo c. c. de agua; luego se hierven durante dos horas y sefiltran, añadiendo agua hasta completar los iooo c. c. y un i por ioo desacarosa, 0,5 por ioo de carbonato de caI y i5 gramos de agar.

1~n lugar del extracto de semillas puede emplearse el de partesverdes y raíces de leguminosas hervidas en agua.

I,as bacterias productoras de nudosidades en las leguminosas hanrecibido diversos nombres, según el criterio de clasificación seguido.Beijerinek Ie dió la denominación de Bacillus radicicola, que Praz-mowski cambió por la de Bacterium radicicola, teniendo en euenta queno esporulaba, y por tanto, moría a temperaturas entre 60^ y 70^.Algunos investigadores las incluyeron en el género Pseudomonas, porel hecho de que varias razas poseen un solo flagelo polar. Finalmente,Smith (88) y Bergey, así como el Comité de la Sociedad de Bacteríó-logos Americanos, han concedido prioridad al nombre de Rhizobiumleguminosarum que le dió h'rank (38), y que en la actualidad es el másusado.

I,as bacterias de las nudosidades presentan particularidades inte-resantes. I,a primera es que, a diferencia de lo que ocurre con la ma-yoría de las bacterias del suelo, su presencia en éste es discontínua,encontrándoselas solamente allí donde es, o ha sido, cultivada laplanta hospitalaria; de aquí 1a necesidad o conveniencia de las inocu-laciones bacterianas en el caso de cultivar por primera vez en unterreno especies leguminosas o en el de cambiar la especie que sevenía cultivando; ya que la segunda particularidad es que no se trata

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de una sola especie bacteriana que pueda producir nudosidades encualquíer especíe de planta Ieguminosa, sino que esisten razas ovariedades (especies para algunos) cada una de las cuales sólo pro-duce nudosidades en determinados géneros y especies de leguminosas.

Ya en i888 reconoció Beijerinck que no todas las estirpes de bac-terias de nudosidades eran idénticas, y llegó a distinguir siete varie-dades. Hiltner y StSrmer (49), basándose en estudios culturales ymorfolbgícos, distinguieron dos grupos de baeierias: Bac. radicicolaque se desarrollaba bien en medios gelatinados y producía nudosida-des en los géneros Pisum, Vic•áa, Lathyrus, Phaseolus, Tri f©lium., etcé-tera, y Bac. Beijerinckii, que se desarrollaba mal en medios gelatina-dos y formaba nudosidades en los géneros Lu^inus, Ornithopus yGlycine; grupos que tuvieron que subdividir posteriormente.

Utílizando la reacción de aglutinación Zipfel (iIó), llegó a la con-clusión de que 1as bacterias productoras de nudosidades en distintosgrupos de plantas leguminosas no eran razas ni variedades de una solaespecie bacteriana, sino especies diferentes; hipótesis que parece con-firmada por divexsos investigadores que han utilizado los métodosserológicos para el estudio de Ias bacterias simbióticas.

Waksman (io2) establece Ios siguientes doce grupos de plantasleguminosas, cada uno de los cuales posee su raza propia de bac-terias incapaz de formar nudosidades en las plantas de los res-tanies grupos:

GRUro I. - TríJolium pratense, Trif. hybrídum, Trif. alexandrtinum, Trij. incarna-

tum, Trif. repens, Trif. medium

GRLTPO II. - Melilotus alba, Mel. officina/is, Medicago sativa, Med. hispida, Medtica-

go lupulina, Trigonella fa*num-gr^cum.

GxuPO III. - Vigna sinensis, Cassia chamracrista, Arachtis htipogea, Lespedeza

striata, Mucuna utilis, Bapttisia tinctoria, Desmodium canescens, Acacia armata,

Genista tinctoria, Phaseolus lunatus.

GRVPO IV. - Pisum satiuum arvense, Vicia villosa, Vic. sativa, Vic, faba, Lens

sculenta, I_athyrus lati/olíus.

GRUro V. -Glycine hispida (Soja máxima).

GRUro VI. - Pñaseolus vulgaris y Pbas. multi/lorus.

GRUro VII. - Lupinus perennis y Ornithopus sativa.

GRUPO VIII. - Amphicarpa monoica.

GRUPO IX. - Amorpha canescens. ^

GRVro X. - Strophostyles helvola.

GRUro XI. - Robinia pseudoacacia.GRUPO XII. - Dalea alopecuroides.

* * *

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Bergey, en su Manual, que venimos siguiendo para la descripciónde las especies bacterianas del suelo, incluye las bacterias de las nudo-sidades en el género Rhizobium Frank, con seis especies.

Género Rhixobium ^rank, i88g.

Pequeños bastoncillos, móviles cuando jóvenes, que presentanabundantes formas ramificadas características cuando se desarrollanen condiciones adecuadas. Sou bacterias aerobias estrictas, capacesde fijar e1 nitrógeno atmosférico cuando se desarrollan en medioscon hidratos de carbono y carentes de compuestos nitrogenados orgá-nicos. Ocasionan la formación de nudosidades en las raíces de las plan-tas leguminosas. La especie tipo es Rhizobium leguminosarum prank.

i. - Rhixobium leguminosarum lirank.

(Laxdw. Jal^rb., ig: 5z3: 1890•)

Bastoncillos aislados, de i,2 a 3 µ de longitud, y ejemplares enforma de Y. Dentro de los bastoncillos se desarrollan formas secunda-rias, bacterioides, que se tiñen de amarillo con el yodo. ^n las nudosí-dades sobre las rafces de las Ieguminosas se observan filamentos, de losque proceden 1os bacterioides. Móvil con flagelos peritricos.

Sobre caldo de guisantes gelatinado que contenga asparagina sedesarrolla en forma de colonias blanquecinas de superficie brillantey mucilaginosa. I,a substancia mucilaginosa se tiñe de amarillo con elyodo y no presenta las reacciones de la celulosa. I,a gelatína se lícúaa veces.

1^1 desarrollo sobre agar-manita es rápido, con tendencia a exten-derse. I,os cultivos en estría se presentan elevados, brillantes, semi-translúcidos, blancos, mucilaginosos y a veces viscosos, forrnándoseabundante goma.

En caldo: Sedimento mucilaginoso.I,igera producción de ácidos en medios con glucosa, galactosa,

manosa, lactosa y maltosa.Aerobia.Temperatura óptima: 250.

' Habitat: En las nudosidades de Lathyrus, Pisurn, Vicia y Lens.

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2. - Rhixobium trifoiii Dangeard.

(Ls Botanists, Ser. 16: I-z70; Iqs6.)

Bastoncillos móviles con flagelos perítricos. I,os bacterioides delos nódulos son en forma de pera, hinchados y vacuolados.

El desanollo sobre agar-manita es rápido.I,as colonias son blancas, enturbiándose con la edad. Mucilaginosas.

Produce grandes cantídades de goma.I,igera producción ácida en medios eon glucosa, galactosa, manosa,

lactosa y maltosa.Aerobia.Temperatura óptima: 250.Habitat: ^n las nudosidades de las rafces de plantas del género

Tri f olium.

3. - Rhizoóium ^haseoli Dangeard.

(Le Botaniste, Ser. 16: I-z7o; 19z6.)

SlNOrrlaass. - Rkiaobium Frankii var. rnajor Schneider; Rkisobíum Frankii variedadmixor Schnelder (Bull. Torr. Bot. Club, 19: zo3; 18gs).

Bastoncillos móviles con flagelos perftricos. I,os bacterioides tie-nen ordinariamente forma de bastoncillos, a menudo vacuolados.

El crecimiento sobre agar-manita es rápido, con tendencia a exten-derse. I,os cultivos en estría se presentan elevados, brillantes, semi-translúcidos, blancos, mucilaginosos.

Formación ácida muy ligera en medios con glucosa, galactosa,manosa, sacarosa y lactosa.

Aerobia.Temperatura óptima: 250.Habitat: En las nudosidades de las raíces de Phaseolus vulgaris,

Phaseolus angusti f olia y Phaseolus multi f lorus.

4. - Rhixobium melilote Dangeard.

(Le Botaniste, Ser. 16: I-2^o; Igz6.)

SINOxIaue. - Rhiaobium mutabile Schneider (Bull. Torr. Bot. Club, 19: zo3; 189z).

Bastoncillos móviles con flagelos perítricos. Bacterioides mazudosy ramificados.

lwl crecimiento sobre agar-manita es claramente rápido. Cultivós

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en estrías, elevados, brillantes, opacos, blanco perlino, mantecosos.Forma mucha goma.

Formación ácida en medios con glucosa, galactosa, manosa y

sacarosa.

Aerobia.

Temperatura óptima: 25°.Habitat: ^n las nudosidades de las raíces de plantas de los géneros

Melilotus, Medicago y Trigonella.

^. - Rhizobium radicicola (Beijerinck} Bergey y col.

fBacillus radicicola Beijerinck, Bot. Zeit., q6: 7z6; i888).

SrNOrnMtAS. - Bacterium radicicola Prazmowski (Laxdw. Vers-stat., 37; i8qo). Phyto-

mixa leguminosarum J. Schr$ter (Krytogamen Flora, v. Schlesien de Cohn, 3; r889).

Pseudomoxas radicicola G. T. Moore ($ull., ^i, U. S. Dept. Agric. Bur. Plant

Industry, i9o5).

Bastoncillos aislados o en parejas, frecuentemente hinchados en unestremo o en la parte central, que se tiñen desigualmente. Muy moví-bles con ayuda de un solo flagelo polar. Segregan una substancia muci-laginosa.

Sobre agar-glucosa, cenizas: Colonias circulares elevadas, húmedas,blancas, brillantes y enteras.

Sobre agar-maltosa, cenizas: Colonias húmedas, brillantes, trans-parentes, pasando con el tiempo a translúcidas, blancas, mucílaginosas,con tendencia a extenderse.

l^n agua con maltosa y cenizas produce enturbiamiento con sedi-mento mucilaginoso.

Aerobia.Temperatura óptima: 250.Habitat: Forma nudosidades en las raíces de especie de Lu^us, Soya

y Ornitho^us.

6. - Rhixobium japonicum (Kirchner) Baldwin y Bred.

(Kírchner, Beitrage sur Biol. d. P/lanzen de Cohn, y: zr3^ i895•Baldwin y Fréed., Jour. Bact., i7: iqi; i929.)

Bastoncillos móviles con flagelos monótricos.^1 desarrollo sobre agar-manita es lento y escaso. ^1 cultivo en

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estrfa es ligeramente elevado, brillante, opaco, blanco, mantecoso,con ligera formación de goma.

l^l crecimiento es mayor sobre pentosas que sobre heaosas.Hay lenta producción ácida en medios con xilosa y arabinosa.Aerobia.Temperatura óptima: 250.Habitat: Produce nudosidades en las raíces de Soja maxima.