4.3. Identificacin y cuantificacin de Capsaicina extractada.

Para el anlisis de los extractos obtenidos se recurri a la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), utilizando un equipo marca Simadzu, equipado con sistema binrio de bombas, desgasificador y detector de arreglo de diodos (PDA), columna C18 Ascentis RP-Amida 250 x 4,6 mm con partcula de 5 m (Supelco, USA) mantenida a 30 C. La corrida fue realizada por gradiente, con intervalo de 15 minutos entre las corridas; la fase mvil fue compuesta de acetonitrilo (J. T. Baker, grado cromatogrfico)/agua ultra pura (18,2 m. cm, Direct-Q UV - Millipore) (70 %/30 %) por 8 min, Acetonitrilo 100 % hasta los 12 min acetonitrilo/agua (70 %/30 %) hasta 15 min, con flujo de 1.0 mL por minuto. Se inyectaran 10 l de la muestra (3 inyecciones por muestra), y la longitud de onda empleada para el anlisis fue de 280 nm.4.3.1. Metodologa para la determinacin de capsaicina de los frutos de Capsicum chinense utilizando HPLC.

Para la determinacin de capsaicina de los frutos de Capsicum chinense, se utiliz el mtodo reportado por Collins et al., (1995), al cual se le hicieron algunas modificaciones.

1) Los frutos frescos se secaron en una estufa a 55 C durante 72 horas, la reduccin de tamao se llev a cabo en un molino de dos aspas (Krups Mod-F203). 2) Para la extraccin se utilizaron 3 g de la muestra seca y molida, los cuales se pesaron en una balanza analtica con una sensibilidad de 0.1 mg, y se coloc en matraces volumtricos de 125 ml.

3) A cada matraz se le agreg 30 ml de acetonitrilo grado HPLC (J.T. Baker), los matraces se taparon con papel parafilm (para evitar la evaporacin del solvente) y se sometieron a calentamiento en un bao de agua a temperatura controlada a 68 C, durante 4 horas con agitacin constante.

4) Transcurrido el tiempo de calentamiento, se retir la muestra del bao y se dej enfriar a temperatura ambiente, una vez fra, la muestra fue centrifugada a 100 g durante 10 minutos, el sobrenadante fue filtrado a travs de papel Whatman No. 4, y se guard en frascos color mbar roscados, a 4 C, hasta el momento de la cuantificacin.

5) Antes de realizar la cuantificacin de capsaicinoides, el extracto obtenido se filtr con una unidad de filtracin utilizando una membrana de nylon de 0.45 m de tamao de poro y 13 mm de dimetro.

6) Posteriormente para eliminar el color y partculas slidas que an pudiera tener se filtr con un cartucho Sep Pack C18 de 3 cc, de 500 mg marca Waters; desechando las primeras gotas y colocando el lquido restante en un vial previamente lavados con jabn neutro, agua destilada, enjuagados con una solucin de HCL al 3 %, finalmente con metanol y secado, para de esta forma obtener una solucin grado HPLC.

7) Ya acondicionado el concentrado, los viales se colocaron en el Cromatgrafo de Lquidos de Alta Resolucin, para sus anlisis, utilizando el equipo, columna y condiciones descritas en el punto 4.3.

8) La capsaicina fue identificada por comparacin con un estndar marca Sigma con pureza de 95%, para esto se realiz una curva de calibracin para cuantificar los capsaicinoides de las muestras.

4.3.2. Preparacin de las muestras obtenidas en ELL en el MIXXOR para HPLC.

A continuacin se describe el procedimiento a seguir para obtener muestras para analizarlas en HPLC. La fase transparente que se obtuvo al final de la ELL que se describi en el punto 4.2.1.1, se concentr utilizando un rotavapor, para poder separar el solvente (ter o cloroformo).

I. Una vez obtenida la muestra concentrada se le adicionaron 5 ml de metanol grado HPLC (Fermont) para resuspenderla, a la cual se le agrego 0.5 g de sulfato de sodio anhidro, filtrando al vacio utilizando papel Whatman nmero 4 o equivalente.

II. La solucin se afor a 10 ml con metanol grado HPLC.

III. Posteriormente se realizaron los pasos 5 al 8 descritos en el punto 4.3.1.4.3.3. Preparacin de las muestras obtenidas en ELL en la columna Karr para su anlisis en HPLC.

Para el caso de las muestras descritas en el punto 4.2.1.2, se tomaron 50 ml de la fase transparente y 30 ml de la fase opaca se concentraron por separado y posteriormente se repitieron los pasos I al III del punto 4.3.2. 4.3.4. Preparacin del extracto obtenido con fluidos supercrticos para su anlisis en HPLC.

A continuacin se describe el procedimiento a seguir para obtener muestras para analizarlas en HPLC.

I. Fue separada una alcuota (9-20 mg) de extracto, se le adicion 4 ml de metanol y disolvi con la ayuda de un bao ultrasnico por cerca de 3 minutos.

II. La solucin se afor a 5 ml con metanol grado cromatogrfico.

III. Antes de realizar la cuantificacin de capsaicinoides, la solucin se filtr con una membrana de nylon de 0.45 m de tamao de poro.

Ya filtradas las soluciones, los viales se colocaron en el Cromatgrafo, para sus anlisis, utilizando el equipo, columna y condiciones descritas en el punto 4.3.