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Recibido el 11-12-2010 Aceptado el 20-04-2012Autor de correspondencia e-mail: andradem65@hotmail.com

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Caracterización molecular de zapote mamey(Pouteria sapota (Jacq.) Moore & Stearn)

Molecular characterization of zapote mamey (Pouteriasapota (Jacq.) Moore & Stearn)

T.J. Rodríguez-Rojas1, M. Andrade-Rodríguez2, I. Alia-Tejacal2,V. López-Martínez2, S. Espinosa-Zaragoza3, H. Esquinca-Avilés3

1Estudiante graduado de Ingeniería Hortícola, 2Posgrado en CienciasAgropecuarias y Desarrollo Rural, Facultad de Ciencias Agropecuarias,Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Av. Universidad 1001.62209. Chamilpa. Cuernavaca. Morelos. Tel. 01 (777) 3297046.3Facultad Ciencias Agrícolas, CIV Huehuetán, Chiapas. UniversidadAutónoma de Chiapas.

Resumen

En México se tienen 1.416 ha con zapote mamey (Pouteria sapota (Jacq.)H.E. Moore & Stearn) propagado por semilla con una amplia diversidad genética,por lo cual es necesario caracterizar los materiales genéticos sobresalientes, conel fin de tener la información necesaria para el registro de variedades y la protec-ción de los recursos fitogenéticos. El objetivo fue caracterizar mediante RAPDsárboles de zapote mamey seleccionados previamente. Se seleccionaron muestrasde 150 mg de hojas jóvenes y sanas de árboles de zapote mamey, se efectuó laextracción de ADN y la amplificación usando 10 iniciadores RAPDs. Los datosmoleculares fueron analizados por determinación de tamaño de fragmentos, lacomparación de patrones de bandeo y la presencia o ausencia de bandas. Losresultados mostraron que los 10 iniciadores seleccionados para la caracterizaciónde 15 árboles de zapote mamey generaron 165 fragmentos RAPDs los cualesvariaron de 220 a 3445 pb. El 82,4% de los fragmentos fueron polimórficos ypermitieron caracterizar a 10 de los15 árboles estudiados (6, V3, V6, 109, U1,U2, C2, C11, 21, y 64) con 27 fragmentos marcadores. En los árboles1, 4, V5, U3,y C1, no se obtuvieron fragmentos marcadores que permitierán su caracteriza-ción con los 10 iniciadores usados. Los marcadores RAPDs permitieron caracteri-zar a 10 de los 15 árboles de zapote mamey.Palabras clave: marcadores moleculares, RAPDs, extracción de ADN, caracte-rización de árboles frutales.

Rodríguez-Rojas et al.

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Abstract

Mexico has planted 1.416 ha with (Pouteria sapota (Jacq.) H.E. Moore &Stearn), because this fruit tree is propagated by seed and has a wide geneticdiversity, that is the main reason for why it is necessary to characterize theoutstanding genetic materials, in order to have the information necessary for theregistration of varieties and the protection of plant genetic resources. The objectivewas to characterize previously selected zapote mamey trees with the RAPDtechnique. Samples of 150 mg of healthy young zapote mamey leaves were takenin order to extract DNA, the amplification of DNA was done using 10 RAPDprimers. Molecular data were analyzed by size fragments determination, thecomparison of banding patterns and the presence or absence of bands. The resultsshowed that 10 selected primers characterized 15 zapote mamey trees andgenerates 165 RAPD fragments which were ranged from 220 to 3445 pb. The82.4% of the fragments were polymorphic and allowed characterizing 10 of the 15studied trees (6, V3, V6, 109, U1, U2, C2, C11, 21 to 64) with 27 markersfragments. In the trees 1, 4, V5, U3, and C1, no marker fragments were obtainedto allow their characterization with the 10 primers used. The RAPD markersallowed characterizing 10 of the 15 zapote mamey trees studied.Key words: molecular marker, RAPDs, DNA extraction, characterization offruit trees.

Introducción

La fruticultura de México cuen-ta con 63 especies comerciales y 220con potencial alimenticio (Borys yBorys, 2001), entre las cuales están lasdel genero Pouteria; de éstas, el zapotemamey (Pouteria sapota (Jacq.) Moore& Stearn) destaca por su exquisito sa-bor y valor nutritivo. Actualmente setienen establecidas 1.511 ha distribui-das en varios estados de la RepúblicaMexicana; los principales son Yucatán,Guerrero, Chiapas, Michoacán,Tabasco, Puebla, Veracruz, Estado deMéxico, Oaxaca y Morelos (SIAP,2010).

La propagación de esta especie espor semilla principalmente, lo cual hagenerado una amplia diversidadgenética de la que se pueden obtener

Introduction

Fruit farming in Mexico has 63commercial species and 220 with foodpotential (Borys and Borys, 2001),among which are those of Pouteriagenre, from these, zapote mamey(Pouteria sapota (Jacq.) Moore &Stearn) outstand by their exquisitetaste and nutritional value. Currently,are established 1,511 ha distributed indifferent states of Mexico Republic; themain are Yucatán, Guerrero, Chiapas,Michoacán, Tabasco, Puebla,Veracruz, estado de Mexico, Oaxacaand Morelos (SIAP, 2010).

The propagation of this specie ismainly by seed, which has generateda wide genetic diversity where can beobtain outstanding varieties, selectingbased on the organoleptic, agronomic

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variedades sobresalientes, medianteselección con base a las característi-cas organolépticas, agronómicas ymorfológicas. Esta actividad ha sidollevada a cabo por productores de zapotemamey de forma empírica por más de1.000 años, información que ha servi-do de base para identificar los mate-riales de zapote mamey máspromisorios que ha sido utilizada porinvestigadores de Costa Rica, Guate-mala, Estados Unidos de Norte Amé-rica, el Salvador y México, para reco-lectar los más sobresalientes.

El conocimiento de la variabili-dad genética de las especies permitiráel desarrollo de programas orientadosa la conservación de germoplasma deforma in situ o ex situ, así como am-pliar el uso de material vegetal tras-cendente (Azurdia, 2006), programasde certificación (Nascimento et al.,2008), así como proporcionar a los pro-ductores una amplia selección de plan-tas (Carrara et al., 2004).

En el estado de Morelos se hanreportado 27,28 ha de zapote mameyen los municipios de Coatlán del Río yTetecala de la Reforma (Gaona-Garcíaet al., 2004), recientemente se repor-taron 38 ha (SIAP, 2010) con materialseleccionado por los productores porcaracterísticas de rendimiento y cali-dad de fruto. No obstante, las huertascarecen de uniformidad en términos derendimiento y calidad de fruto, por loque la generación de variedades me-diante reproducción vegetativa ayuda-ría a mejorar la producción de zapotemamey.

Los primeros estudios de carac-terización de sapotáceas utilizaron ca-racteres morfológicos, fenológicos, yagronómicos; sin embargo, la clasifi-

and morphologic characteristics. Thisactivity has been carried out by zapotemamey producers empirically for morethan 1,000 years, information thatserves as base to identify the morepromissory zapote mamey materialsthat have been used by researches inCosta Rica, Guatemala, United States,Salvador and México, to collect themost remarkable.

The knowledge of the geneticvariability of the species will allow thedevelopment of programs oriented tothe preservation of the germplasm insitu and ex situ, as well as wideningthe usage of transcending vegetalmatter (Azurdia, 2006), certificationprograms (Nascimento et al., 2008), aswell as providing the producers with agreat selection of plants (Carrara et al.,2004).

In Morelos state, 27.28 ha ofzapote mamey have been reported inCoatlán del Río and Telecala de la Re-forma parishes (Gaona-García et al.,2004), recently have been reported 38ha (SIAP, 2010) with material selectedby the producers by yieldcharacteristics and quality of thefruits. Nevertheless, orchards lack ofuniformity in terms of yield andquality of the fruit, thus, thegeneration of varieties throughvegetative reproduction would help theproduction of zapote mamey.

The first characterizationresearches of Sapotaceae usedmorphological, phenological andagronomical characteristics; however,the classification based on thesecharacteristics can be confusedbecause these are affected byenvironmental factors. The use of iso-enzymes can be of higher utility, on

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cación con base en estos caracterespuede ser confusa porque los mismosson afectados por factores ambienta-les. El uso de isoenzimas puede ser demayor utilidad; al respecto, fueronaplicadas para estudiar la variabilidadde 37 accesiones de P. sapota en Gua-temala (Azurdia et al., 1997); sin em-bargo, éstas pueden ser afectadas porel ambiente y la etapa fenológica de laplanta; Zane et al. (2002) indicaron quelos RAPDs, SSR y AFLP son herra-mientas fundamentales para estudiarla variabilidad genética.

Otra técnica empleada es lasecuenciación del gen del cloroplastondhF para estudiar la filogenia en lafamilia (Anderberg y Swenson, 2003).Las secuencias simples repetidas (SSR)fueron utilizadas para el análisis de lavariabilidad del DNA del cloroplasto enManilkara hubery (Rennó, 2007). LosRAPDs fueron utilizados para deter-minar el efecto de las condiciones am-bientales en el genotipo de M. sapota(Heaton et al., 1999), determinar laestructura genética espacial deChrysophyllum sanguinolentum(Degen et al., 2001), estudiar la diver-sidad genética de Vitellaria paradoxa(Fontaine et al., 2004). En el caso deP. sapota también se han usado losAFLPs para estudiar la variacióngenética de selecciones cultivadas(Carrara et al., 2004). Majourhat et al.(2008) utilizaron los RAPDs y las SSRpara caracterizar morfotipos deArgania spinosa y observaron que losRAPDs presentaron alto polimorfismoy mayor cantidad de información quelas SSR.

El objetivo de la investigación fuecaracterizar molecularmente árbolesde zapote mamey seleccionados previa-

this matter, these were applied to studythe variability of 37 accessions of P.sapota in Guatemala (Azurdia et al.,1997); however, these can be affectedby the environment, and thephonological phase of the plant; Zaneet al. (2002) indicated that RAPDs, SSRand AFLP are vital tools to study thegenetic variability.

Other technique employed is thesequence of the chloroplast gel ndhF tostudy the phylogeny in the family(Anderberg and Swenson, 2003). Therepeated simple sequences (SSR) wereused for the variability analysis of thechloroplast DNA in Manikara hunery(Rennó, 2007). The RAPDs were used todetermine the effect of the environmentalconditions of M. sapota (Heaton et al.,1999), to determine the spatial geneticstructure of Chrysophyllumsanguinolentum (Degen et al., 2001), tostudy the genetic diversity of Vitellariaparadoxa (Fontaine et al., 2004). In thecase of P. sapota, AFLPs have also beenused to study the genetic variations ofcropped selections (Carrara et al., 2004).Majourhat et al. (2008) used the RAPDsand SSR to characterize morph-types ofArgania spinosa and observed thatRAPDs presented high polymorphismand more information than SSR.

The objective of this research wasto molecularly characterize zapotemamey trees, previously selected inCoatlán del Río and Telecala de la Re-forma, Morelos, Mexico, using theRAPDs technique.

Materials and methods

15 zapote mamey trees wereselected considering for the selection:the fruit’s taste, better yield, size and

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mente en Coatlán del Río y Tetecalade la Reforma, Morelos, México, utili-zando la técnica de RAPDs.

Materiales y métodos

Se seleccionaron 15 árboles dezapote mamey tomando en cuenta parala selección: el sabor del fruto, mayorrendimiento, tamaño y calidad, me-diante entrevistas con los productoresrealizadas por Gaona-García et al.(2008) en Coatlán del Río y Tetecalade la Reforma, Morelos, México. Losárboles fueron 1, 4, 6, 21, 64, 109, C1,C2, C11, U1, U2, U3, V3, V5 y V6.

Recolecta del material vegetalSe recolectaron muestras de ho-

jas jóvenes y sanas de 15 árboles dezapote mamey seleccionados previa-mente por Gaona-García et al. (2008),con base en las característicasmorfológicas y organolépticas. Las ho-jas fueron colocadas en bolsas de plás-tico, marcadas con la clave de cadaárbol y transportadas, a temperaturaambiente, a la Facultad de CienciasAgropecuarias de la Universidad Au-tónoma del Estado de Morelos. Lashojas fueron lavadas y se eliminó elagua de la superficie, posteriormentese pesaron 150 mg de hoja de cada ár-bol y se congelaron a -20ºC hasta laextracción del ADN.

Aislamiento del ADNgenómico

Se usaron muestras de 150 mgde hojas de cada uno de los 15 árbolesde zapote mamey para extraer el ADNde acuerdo a la metodología reportadapor Andrade et al. (2005), sustituyen-do el alcohol isoamilico por octanol. Enel último paso de la metodología deextracción, el ADN obtenido se disol-

quality, with surveys for the producersperformed by Gaona-García et al.,(2008) in Coatlán del Río and Telecalade la Reforma, Morelos, México. Losárboles fueron 1, 4, 6, 21, 64, 109, C1,C2, C11, U1, U2, U3, V3, V5 y V6.

Recollection of the vegetalmatter

Samples of young and healthyleaves from 15 zapote mamey sampleswere recollected and previouslyselected by Gaona-García et al. (2008)based on the morphological andorganoleptic characteristics. Theleaves were put on a plastic bag,marked and transported atenvironment temperature to theAgricultural Science Faculty of theUniversidad Autóctona del estado deMorelos state. Leaves were washed andthe water of the surface waseliminated, later were weighted 150mg of every tree leaf, and frozen to -20ºC until extracting the DNA.

DNA genome isolationSamples of 150 mg were used

from leaves of each of the 15 zapotemamey trees for extracting the DNAaccording to the methodology reportedby Andrade et al. (2005), substitutingthe isoamyl alcohol to octanol. In thelast step of the extraction methodology,the DNA obtained was diluted in 25mL de 0.1 TE (1 mM Tris-HCl pH 8.0,0.1 mM EDTA) with 20 ng.µL-1 ofARNasa, heating at 37ºC for 40minutes and stored at -20ºC until itsusage.

The integrity of the DNA of alltrees was estimated by electrophoresisin agarose gel (ultra pure GIBCO) at1% for what was used 1 mL of theDNA sample. The electrophoresis wasdone at environment temperature in

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vió en 25 µL de 0,1 TE (1 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA) con 20ng.µL-1 de ARNasa, calentado a 37ºCpor 40 minutos y almacenado a -20ºChasta su utilización.

La integridad del ADN de todoslos árboles se estimó medianteelectroforesis en gel de agarosa(ultrapura GIBCO) al 1% para lo cualse uso 1 µL de muestra de ADN. Laelectroforesis se realizó a temperatu-ra ambiente en buffer TAE (0,04MTris-base, ácido acético glacial, 1 mMEDTA) a 75 voltios durante dos ho-ras. El gel se tiñó con bromuro deetidio (1 mg.µL-1). Las muestras deADN se visualizaron y se documenta-ron en un analizador de geles (SyngeneGVM20).

La concentración del ADN y supureza fueron cuantificadas en unespectrofotómetro Genesys 6® de luzultravioleta, para lo cual se preparóuna dilución de 1:150 [5 µL de ADN dela muestra más 745 µL de TE 10X (10mM Tris HCl pH 8,0, 1 mM EDTApH 8,0)]. La concentración se determi-nó mediante la fórmula:

[ADN (ng.µL-1)] = (DO260) (FD)(50 mg.µL-1).

Donde:DO260 = Densidad óptica de la so-

lución de ADN leída a la longitud deonda de 260 nm.

FD = Factor de dilución.50 mg.µL-1 =Concentración de

ADN determinada para un valor de 1,0a 260 nm.

La pureza se evaluó como la pro-porción de las lecturas a longitudes deonda de 260 y 280 nm (260/280). Losvalores entre 1,8 y 2,0 de densidad óp-tica (DO) indicaron alto grado de pu-reza. Valores menores a 1,8 indicaron

buffer TAE (0.04M Tris-Base, glacialacetic acid, 1mM EDTA) at 75 voltsfor 2 hours. The gel was colored withethidium bromide (1 mg.µL-1). TheDNA samples were visualized anddocumented in a gels analyzer(Syngene GVM20).

The DNA concentration and itspureness were quantified in a Genesys6 ® spectrophotometer with ultravioletlight, for which was prepared a dilutionof 1:150 [5 µL of DNA of the sampleplus 745 µL of TE 10X (10 mM TrisHCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0)]. Theconcentration was determined usingthis formula:

[ADN (ng.µL-1)] = (DO260) (FD) (50mg.µL-1).

Where:DO260 = Optic density of the DNA

solution read at a wave longitude of260 nm

FD = Dilution factor50 mg.µL-1 = DNA concentration

determined for a value of 1.0 to 260nm

The pureness was evaluated asthe proportion of the readings at waveslongitudes of 260 and 280 nm (260/280).Values from 1.8 to 2.0 of optical density(DO) indicated high degree of pureness.Lower values to 1.8 indicatedcontamination of the DNA sample withproteins and/or elements absorbers ofUV light. While, values higher to 2.0indicated contamination by chloroform,phenol or other organic substances.Once obtained the reading for each ofthe DNA samples, the solutions wereprepared at 20 ng.µL-1.

RAPD analysis30 initiators were used: 20 with

the sequences of the B kit, the A-08(Operon Technologies Inc.) and eight

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contaminación de la muestra de ADNcon proteínas y/u otros elementos ab-sorbentes de luz UV. Mientras quevalores mayores a 2,0 indicaron con-taminación por cloroformo, fenol u otrasustancia orgánica. Una vez obtenidala lectura para cada muestra de ADN,se prepararon las soluciones de traba-jo a 20 ng.µL-1.

Análisis RAPDSe utilizaron 30 iniciadores: 20

con las secuencias del kit B, el A-07, elA-08 (Operon Technologies Inc.) y ochocon las secuencias diseñadas porAndrade en 2006 (cuadro 1) para estainvestigación, todos con secuencia ar-bitraria de 10 nucleótidos, de los cualesse seleccionaron 10 que presentaron elmayor número de productos amplifica-dos y con bandas más brillantes.

La mezcla de reacción y progra-ma de amplificación se utilizó paracada una de las 15 muestras de ADNde los árboles de zapote mamey, conlos 10 iniciadores seleccionados; la cualconsistió de 10 µL de dNTPs (5 µM decada dNTP), 2,5 µL amortiguador PCR(10X), 1,5 mL de MgCl2 (75 mM), 2,0µL de iniciador (20 pmol), 0,3 µL DNApolimerasa nativa INVITROGEN (1,5U), 4 µL de ADN (80 ng) ajustando aun volumen de 25 µL con 4,7 µL deagua destilada deionizada estéril. Laamplificación del ADN se hizo median-te la reacción en cadena de lapolimerasa (PCR) en un termocicladorTechne TC-412. El programa deltermociclador consistió de un ciclo depredesnaturalización de ADN a 94ºCpor 4 min y 35 ciclos integrados porlas etapas siguientes: 1 min a 94ºCpara separar hélices de ADN, 1 min a36ºC para la alineación de iniciador, 2min a 72ºC para la polimerización de

with the sequences designed byAndrade in 2006 (table 1) for thisresearch, all with randomized sequenceof 10 nucleotides, from which wereselected 10 that presented the highestnumber of amplified products and withbrighter bands.

The reaction mix andamplification program was used foreach of the 15 DNA samples of zapotemamey trees with the 10 initiatorsselected, which consisted on 10 µL ofdNTPs (5 µM of each dNTP), 2.5 µLrear PCR (10X), 1.5 mL of MgCl2 (75mM), 2.0 µL of initiator (20 pmol), 0.3µL DNA native polymeraseINVITROGEN (1.5 U), 4 µL of ADN(80 ng) adjusting at a volume of 25 µLwith 4.7 µL of distilled sterile deionisedwater. The DNA amplification wasdone with the chain reaction ofpolymerase (PCR) in a thermal cyclerTechne TC-412. The thermal cyclerprogram consisted on a pre-denaturalization cycle of DNA at 94ºCfor 4 min and 35 integrated cycles forthe following phases: 1 min at 94ºC todivide the DNA helixes, 1 min at 36ºCfor aligning the initiator, 2 min at 72ºCfor the polymerization of the DNA anda final extension cycle of 10 min at72ºC.

The separation of amplifiedfragments was done by electrophoresisin ultrapure agarose gel(INVITROGEN) at 1.5% (p/v). Theelectrophoresis was done with a rearTAE 1X applying 75 volts for 4.5 hours.The gels were tinted with ethidiumbromide (1 mg.mL-1) to provide theDNA bands, later, were photographedwith a photodocumentator SyngeneGVM0. The size of the DNA fragmentsproduced by RAPDs, were obtained

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ADN y un ciclo final de extensión de10 min a 72ºC.

La separación de fragmentosamplificados se hizo por electroforesisen gel de agarosa ultrapura(INVITROGEN) al 1,5% (p/v). Laelectroforesis se efectuó con amortigua-dor TAE 1X aplicando 75 voltios du-rante 4,5 horas. Los geles fueron teñi-dos con bromuro de etidio (1 mg.mL-1)para evidenciar las bandas de ADN,posteriormente se fotografiaron con elfotodocumentador Syngene GVM20. Eltamaño de los fragmentos de ADN,producidos por RAPDs, se obtuvo uti-lizando el programa Gen Tools versión3.06 de Syngene.

El análisis de los datosmoleculares para la caracterización delas 15 selecciones de zapote mamey serealizó a través de la comparación depatrones de bandas generados por cadaárbol. Se consideraron las bandas pro-ducidas por los 10 iniciadores seleccio-nados.

Resultados y discusión

Los iniciadores seleccionados fue-ron OPB-05, OPB-06, OPB-07, OPB-09, OPB-10, OPB-11, OPB 12, OPB-15, OPB-17, y SAP-04 por presentarel mayor número de productos ampli-ficados, con bandas más brillantes ymejor definidas. Estos iniciadores ge-neraron 165 fragmentos RAPD quevariaron de 220 a 3.445 pb. El 82,4%de los fragmentos fueron polimórficosy permitieron caracterizar a 10 de losárboles estudiados (6, V3, V6, 109, U1,U2, C2, C11, 21, y 64) con 27 fragmen-tos marcadores (cuadro 2). En los ár-boles 1, 4, V5, U3, y C1, no se obtuvie-ron fragmentos marcadores que per-

using the Gen Tools program, 3.06version of Syngene.

The molecular data analysis forcharacterizing 15 zapote mameyselections was done comparing thebands’ pattern generated by each tree.The bands produced by the 10 selectedinitiators were considered.

Results and discussion

The selected initiators were OPB-05, OPB-06, OPB-07, OPB-09, OPB-10, OPB-11, OPB 12, OPB-15, OPB-17, and SAP-04 by presenting thehighest number of amplified productswith brighter and better defined bands.These indicators generated 165 RAPDfragments which varied from 220 to3.445 pb. 82.4% of the fragments werepolymorphic and allowedcharacterizing 10 of the studied trees(6, V3, V6, 109, U1, U2, C2, C11, 21,and 64) with 27 marker fragments(table 2). In trees 1, 4, V5, U3, andC1, were not obtained markerfragments that allow theircharacterization to the initiators used.

The electrophoresis generated bythe tree 11 with the 10 initiators, wascharacterized by being different fromthe rest of the 14 trees (figure 1), whichindicated a different geneticprecedence. Tree 21 produced adifferent electrophoresis profile compa-re to the rest of the trees when usingthe initiators OPB-17 (5’AGG GAACGA G 3’) and SAP-04 (5’GGA GCTACC T 3’) (table 2).

The initiators that allowedidentifying a higher number of zapotemamey trees (three each) were OPB-09, OPB-10, OPB-17 and SAP-04. Onthe contrary, OPB-05, OPB-06, OPB-

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36U

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PB17

AG

GG

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CG

AG

2119

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636

, 225

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1018

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313

, 698

, 118

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pb: p

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senc

ia.

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mitieran su caracterización con losiniciadores usados.

El perfil de electroforesis genera-do por el árbol 11 con los 10 iniciado-res, se caracterizó por ser distinto delos 14 árboles restantes (figura 1), loque indicó procedencia genética dife-rente. En tanto que el árbol 21 produ-jo un perfil de electroforesis distinto encomparación con los demás árboles alusar los iniciadores OPB-17 (5’AGGGAA CGA G 3’) y SAP-04 (5’GGA GCTACC T 3’) (cuadro 2).

Los iniciadores que permitieronidentificar mayor número de árbolesde zapote mamey (tres cada uno) fue-ron el OPB-09, el OPB-10, el OPB-17y SAP-04. En contraste, el OPB-05, elOPB-06, el OPB-07 y el OPB-11 fue-ron útiles para identificar un árbol porcada iniciador. De los 27 marcadores

Figura 1. Patrón de bandeo generado por el iniciador OPB-06 para 15árboles de zapote mamey del estado de Morelos, México. 1Kb:marcador de peso molecular 1 Kb DNA Ladder.

Figure 1. Banding pattern generated by the initiator OPB-06 for 15zapote mamey trees of estado de Morelos, Mexico. 1Kb: markerof molecular weight 1Kb DNA Ladder.

07 and OPB-11 were useful to identifya tree per each initiator. Out of the 27obtained markers, most (14) were byabsence of bands that were presentedin the rest of the trees, and 13 werefragments that were not present in theelectrophoretic in the other trees.

The methodology used allowedidentifying molecular markers for 10trees, among these the 21 showed ahigher presence of markers (11fragments), the same produced withsix initiators (table 3). This indicatedthat the DNA of the tree presented thehighest number of particular DNAsequences which were complementaryto the initiators OPB-06, OPB-09,OPB-10, OPB-12, OPB-17 and SAP-04. U2 tree had six markers fragmentsgenerated by oligonucleotides OPB-05,OPB-10, OPB-12, OPB-15 and SAP-04

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obtenidos, la mayoría (14) fueron porausencia de bandas que se presenta-ban en los demás árboles, y 13 fueronfragmentos que no se encontraron pre-sentes en los perfiles electroforéticos enlos otros árboles.

La metodología utilizada permi-tió identificar marcadores molecularespara 10 árboles, entre éstos el 21 fueel que reflejó mayor presencia de mar-cadores (11 fragmentos), los mismosque fueron producidos con seis inicia-dores (cuadro 3). Esto indicó que elADN de este árbol presentó el mayornúmero secuencias de ADN particula-

Cuadro 3. Fragmentos de marcadores moleculares para 15 árboles dezapote mamey del Estado de Morelos, México, en paréntesisse indica el tamaño de los fragmentos amplificados por losiniciadores correspondientes.

Table 3. Fragments of molecular markers for 15 zapote mamey trees ofestado de Morelo, Mexico, in parentheses is indicated the sizeof the amplified fragments by the corresponding initiators.

Árbol Fragmentos marcadores

1 ______________4 ______________6 OPB 07 (512), OPB 15 (652)

V3 OPB 17 (1018)V5 ______________V6 OPB 09 (727)21 OPB 06 (931), OPB 09 (597), OPB 10 (733), OPB 12(572), OPB 17 (313)

(698) (1184) (1775), SAP 04 (879) (1129) (1639).64 OPB 10 (1150)

U1 OPB 11 (686)U2 OPB 05 (1354), OPB 10 (1468), OPB 12 (475) (1470), OPB 15 (536), SAP

04 (325)U3 ______________109 OPB 17 (636) (2253)C1 ______________C2 OPB 09 (1636)C11 SAP 04 (688)

(table 3). Trees 21 and U2 weremorphologically less high (less than 20m) and presented lower size of flowers(non shown data). On the opposite,trees 1, 4, V5, U3 and C1 did not pro-duce any marker, the latter meant thata DNA molecule of these trees did notpresent any particular DNA sequencethat would identify it to the basessequences of the evaluated initiators.

The organoleptic characteristicsof fruits were not evaluated, however,a degustation of the mesocarp was doneoutstanding in taste the fruits of trees1, 4, U1, U2, 21, C1, C1 and C11;

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res que fueron complementarias a losiniciadores OPB-06, OPB-09, OPB-10,OPB-12, OPB-17 y SAP-04. El árbolU2 tuvo seis fragmentos marcadores,generados por los oligonucleótidosOPB-05, OPB-10, OPB-12, OPB-15 ySAP-04 (cuadro 3). Los árboles 21 yU2 fueron morfológicamente de menoraltura (menor a 20 m), y presentaronmenor tamaño de flores (datos no pre-sentados). En contraste, los árboles 1,4, V5, U3 y C1 no produjeron ningúnmarcador, lo anterior significó que lamolécula de ADN de estos árboles nopresentó las secuencias de ADN parti-culares que los identificaran con lassecuencias de bases de los iniciadoresevaluados.

Las características organolépticasde los frutos no se evaluaron; sin em-bargo, se realizó la degustación delmesocarpo destacando en sabor los fru-tos de los árboles 1, 4, U1, U2, 21,C1, C2 y C11; no obstante, no se tu-vieron marcadores para todos los ár-boles (cuadro 3).

La metodología RAPDs permitió lacaracterización del 66% de los árbolesde zapote mamey. La posibilidad de en-contrar marcadores moleculares paratodos los árboles aumentó en función dela cantidad de iniciadores usados.

Los fragmentos RAPDs totales ypolimórficos obtenidos en la caracteri-zación de los árboles de zapote mameyfueron mayores a los obtenidos porFontaine et al. (2004) quienes obser-varon un total de 67 loci RAPDspolimórficos y 15 monomórficos quevariaron de 1.670 a 280 pb, en 179 in-dividuos de la sapotacea V. paradoxa,con los iniciadores OPB-07, OPB-11,OPN-15, OPR-15, OPW-9, OPW-12,OPW-13, OPX-3, OPX-6, OPX-11,

nevertheless, none markers wereobtained for all trees (table 3).

The RAPDs methodology allowedcharacterizing 66% of zapote mameytrees. The possibility of findingmolecular markers for all treesincreased in function of the quantityof the used initiators.

The fragments of total andpolymorphic RAPDs obtained in thecharacterization of zapote mamey treeswere higher to the ones obtained byFontaine et al. (2004) who observed atotal of 67 loci polymorphic RAPDs and15 mono-morphic that varied from1,670 to 280 pb, in 179 individuals ofsapotacea V. paradoxa, with theinitiators OPB-07, OPB-11, OPN-15,OPR-15, OPW-9, OPW-12, OPW-13,OPX-3, OPX-6, OPX-11, OPY-6, OPY-13, OPY-20, OPW-5 and OPW-19. Inthis research, the number of bandsvaried from 13 to 21, while Fontaineet al. (2004) only obtained from one tosix. Also, Majourhat et al. (2008),when characterizing A. spinosa onlyobtained from four to nine fragments;with the initiator OPB-07 obtained fourfragments and with OPB-11 observedsix amplified fragments, on theopposite, in this research wereobtained 15 and 18 fragmentsrespectively for such indicators.

Regarding the number of markerfragments, in this research wereobtained 27 different to the uso of 10initiators, while Heaton et al. (1999)when studying chicozapote (M. zapota(L.) P. Royen) using RAPDs with 80indicators only obtained 28 differentbands.

In this research were obtained136 polymorphic fragments, and Degenet al. (2001) using the same

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OPY-6, OPY-13, OPY-20, OPW-5 yOPW-19. En esta investigación, elnúmero de bandas varió de 13 a 21,mientras que Fontaine et al. (2004),sólo obtuvieron de una a seis. TambiénMajourhat et al. (2008), al hacer lacaracterización de A. spinosa obtuvie-ron sólo de cuatro a nueve fragmen-tos; con el iniciador OPB-07 obtuvie-ron cuatro fragmentos y con el OPB-11 observaron siete fragmentos ampli-ficados, en contraste en esta investi-gación se obtuvieron 15 y 18 fragmen-tos, respectivamente para tales inicia-dores.

En cuanto al número de frag-mentos marcadores, en esta inves-tigación se obtuvieron 27 diferentescon el uso de 10 iniciadores, mien-tras que Heaton et al. (1999) al es-tudiar chicozapote (M. zapota (L.) P.Royen) mediante RAPDs con 80 ini-ciadores sólo obtuvieron 28 bandasdiferentes.

En esta investigación se obtu-vieron 136 fragmentos polimórficos,en tanto que Degen et al. (2001), uti-lizando la misma metodología paraestudiar 68 individuos de C.sanguinolentum con 11 iniciadores(OPE-02, OPE-05, OPE-07, OPY-04,OPY-06, OPY-07, OPY-10, OPY-13,OPY-14, OPY -15 y OPY-16) obtuvie-ron sólo 48 fragmentos polimórficos.Sin embargo, Smedmark y Anderberg(2007) obtuvieron 308 fragmentospolimórficos en N. polynesicum(Sapotaceae) mediante SSR.

La cantidad de fragmentos am-plificados por la utilización de inicia-dores RAPDs varía de acuerdo a la es-pecie a estudiar. La posibilidad de ob-tener marcadores moleculares para lacaracterización de árboles aumenta al

methodology to study 68 individuals ofC. sanguinolentum with 11 initiators(OPE-02, OPE-05, OPE-07, OPY-04,OPY-06, OPY-07, OPY-10, OPY-13,OPY-14, OPY -15 and OPY-16) onlyobtained polymorphic fragments.However, Smedmark and Anderberg(2007) obtained 308 polymorphicfragments in N. polynesicum(Sapotaceae) using SSR.

The quantity of amplifiedfragments by the usage of RAPDsinitiators varies according to the specieto study. The possibility of obtainingmolecular markers for characterizingthe trees increases when using ahigher quantity of RAPDs initiators inthe researches.

The information generated on themolecular characterization of zapotemamey is one of the firstcharacteristics references of DNA fortrees with outstanding characteristicsthat might be useful to initiate theregistration process of this fruit’svarieties in Mexico.

Conclusions

The molecular characterizationof zapote mamey trees located inCoatlán del Río and Telecala de la Re-forma is appeared using 10 RAPDsindicators, which generated a highpercentage of polymorphic fragments,obtaining the molecularcharacterization of more than 60% ofthe studied trees. The selectedinitiators allowed characterizingmolecularly only 10 to 15 studied trees,and the ones that generated thehighest quantity of markers wereOPB-09, OPB-10, lOPB-17 and SAP-04. RAPDs were useful for the

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usar mayor cantidad de iniciadoresRAPDs en las investigaciones.

La información generada sobre lacaracterización molecular del zapotemamey es una de las primeras refe-rencias de características de ADN,para árboles con caracteres de frutossobresalientes, que pueden ser de uti-lidad para iniciar el proceso de regis-tro de variedades de esta especie fru-tal en México.

Conclusiones

La caracterización molecular delos árboles de zapote mamey ubicadosen Coatlán del Río y Tetecala de laReforma se evidenció con la utilizaciónde 10 iniciadores de RAPDs los cualesgeneraron un alto porcentaje de frag-mentos polimórficos, lográndose la ca-racterización molecular de más del 60%de los árboles estudiados. Los inicia-dores seleccionados sirvieron para ca-racterizar molecularmente sólo a 10 delos 15 árboles estudiados, los que ge-neraron mayor cantidad de marcado-res fueron el OPB-09, el OPB-10, elOPB-17 y el SAP-04. Los RAPDs fue-ron de utilidad para la caracterizaciónde 10 árboles de zapote mamey. El ár-bol C11 presentó un patrón de bandeodiferente, lo que indicó que tuvo dis-tinta procedencia.

Agradecimientos

Se agradece el apoyo de PROMEPa través del proyecto 103.5/05/1901Caracterización morfológica ymolecular de selecciones de tres espe-cies de sapotáceas en el estado deMorelos y al SNI (Exp. 34643). A losproductores de zapote mamey del es-

characterization of 10 zapote mameytrees. Tree C11, presented a differentbanding pattern, which indicated thatit had a different precedence.

Acknowledgment

The authors acknowledge thesupport given by PROMED with theProject 103.5/05/1901 Morphologicaland molecular characterization of threeSapotaceae species in estado de Morelosand to SNI (Exp. 34643). The producersof zapote mamey producers of estadode Morelos by allowing the access toorchards and share experiences, timeand cohabitation.

tado de Morelos por permitir el accesoa sus huertas y compartir experien-cias, tiempo y convivencia.

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