CARACTERIZACION DE LAS PROTEINAS: PESO MOLECULAR ... · pequeños con múltiple carga) con...
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CARACTERIZACION DE
LAS PROTEINAS:
PESO MOLECULAR.
DETERMINACION DE LA
ESTRUCTURA PRIMARIA.
ELECTROFORESIS.
V = E z / f v: velocidad de migración de la molécula en
un campo eléctrico. E: intensidad de campo eléctrico, z:
carga neta de la proteína. f = 6phr es el coeficiente fr iccional.
h (eta) es la viscosidad del medio y r es el radio de la partícula.
Electroforesis en gel de poliacrilamida: en condiciones nativas
(PAGE) o en presencia de SDS (SDS-PAGE).
Isoelectroenfocado (IEF): Separación por punto isoeléctr ico
(pI) .
Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D -
PAGE): IEF en una primera dimensión, SDS-PAGE en la
segunda.
ISOELECTROENFOCADO: Separación por pI.
Las proteínas se corren en un gradiente de pH preformado, que se obtiene
sometiendo a electroforesis previa una mezcla de polianfolitos (polímeros
pequeños con múltiple carga) con diferentes valores de pI. En A se carga
la muestra y se aplica el voltaje, con lo cual las proteínas migrarán hasta
llegar al valor de su pI, donde, al no tener carga neta, quedarán
enfocadas, lo que se observa en B.
DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE LAS PROTEINAS.
M r = masa molecular relativa (por ejemplo, 50,000)
Masa molecular: Por ejemplo 50,000 daltons (50 kDa) .
A) Proteína nativa:
1) Ultracentrifugación.
2) Filtración por gel.
3) Espectrometría de masa.
B) Subunidad:
1) Electroforesis en gel de poliacrilamida en
presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE).
ULTRACENTRIFUGACION.
Fc= fuerza centrífuga. r =
radio del rotor.
w = velocidad angular. w2r = campo centrífugo. = volumen específicoparcial ( inversa de la densidad de la proteína) .
m’ (masa efectiva) es menor que m (masa real) porque el flúido
desplazado ejerce una fuerza opuesta (1– r) .
f= coeficiente fr iccional de la partícula = 6phr , donde h es laviscosidad del medio y r el radio de la partícula.
v = Fc / f = m(1– r) w2r / f
s = coeficiente de sedimentación (unidades 10 -13 seg = 1 Svedberg) .
s = v / w2r = m (1 – r) / f
La velocidad de sedimentación (v) depende en parte de la masa de la
partícula; tambien depende de su forma (una partícula compacta
tiene un valor de f menor que el de una alargada); una partícula
densa se mueve mas rápido que una menos densa porque su valor
de (1– r) es menor; y depende tambien de la densidad de la solución
(r) : si r es < 1, se hunde; si es > 1, flota y si es = 1 no se desplaza.
Ultracentrifugación zonal (en gradiente)
La solución de proteína se corre en un gradiente de densidad (por ejemplo,
sacarosa), con proteínas de s conocido como marcadoras.
Peso molecular
de subunidad:
Determinacion
por SDS-PAGE
ESPECTROMETRIA DE
MASA: SUS APLICACIONES
EN LA DETERMINACION DE
PESOS MOLECULARES DE
PROTEINAS Y EN LA
SECUENCIACION DE
PEPTIDOS.
Espectrometría de Masa
• La Espectrometría de Masa es una tecnica quepermite determinar la masa de moléculas pormedio de la medida de la relacion masa/carga (m/z).
• La medida de masas moleculares involucra laproduccion, separación y detección de ionesmoleculares en fase gaseosa.
•Cada molécula puede originar iones moleculares
con distinto número de cargas ( y distintas m/z).
Un espectrómetro de masa consiste de tres módulos:
1) Fuente de iones.
2) Analizador de masas.
3) Sistema de detección y adquisición de datos.
Técnicas actuales para trabajo biológico:
1) MALDI-ToF MS (desorción/ionización por laser asistida por
matriz, combinada con análisis de masas por tiempo de vuelo)
2) ES/MS (ionización por electrospray combinada con análisis de
masas por cuadrupolo)
La solución a analizar se pasa a través de una
aguja hipodérmica mantenida a un alto
potencial. Se forma un cono de gotitas muy
finas, altamente cargadas, que irradian de la
punta de la aguja. Se evaporan rápidamente,
pasando las moléculas a analizar a la fase
gaseosa. Si son moléculas grandes se
producen iones con cargas múltiples.
ES/MSGENERACION DE IONES MOLECULARESIONIZACION POR ELECTROSPRAY
(ESI MS)
Aqueous
solution
This ionization method arises in the attempt to couple the LC to MS
The effect of vacuum, temperature and curtain gas causes the formation of
increasingly smaller drops until the molecule is fully desolvated in vacuum.
Sir Geoffrey Taylor (1964). "Disintegration of Water Droplets in an Electric Field". Proc. Roy. Soc. London. Ser. A 280 (1382): 383.
dripping,
burst,
pulsating,
cone-jet
1914, John Zeleny
What is the ionization mechanism in ESI?
No tolerant to the presence of salts, surfactants, inorganic acids, TFA no so
good for sensitivity, (regularly desalting steps are required, acetic and formic
acids are used in the mobile phase).
Lord Rayleigh, 1882
ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES
MOLECULARES.
ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES
MOLECULARES
Los iones se dirigen al vacío del espectrómetro de
masa de cuadrupolo a través de un orificio o capilar
calentado. El cuadrupolo consta de cuatro barras
metálicas paralelas que generan un campo eléctrico
oscilatorio. Los iones se separan en este campo:
sólo los de una determinada m/z se dejan pasar a
una determinada amplitud y frecuencia de
oscilación de los potenciales eléctricos aplicados a
las barras, y llegan al detector.
Quadrupole Mass Analyzer
From: http://www.chem.vt.edu/chem-ed/ms/quadrupo.html
Ion transmitted along the quadrupole in
an stable trajectory
Ions do not have an stable trajectory
and is ejected from the quadrupole
•Limited mass range (4 000 Da).
•Were the first mass analyzer to
be coupled to ESI.
radiofrequency
DC: Direct current
(Corriente continua)
RF: Radio frequency
GENERACION DE IONES MOLECULARES
Pseudocristales mixtos de una matriz (p.ej.: ácido 3,5-
dimetoxi-4-hidroxicinámico). Se los irradia con un pulso
de laser. La sublimación rápida de los cristales lleva a la
formación de iones moleculares protonados en fase gaseosa.
MALDI-ToF MS
ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES MOLECULARES.Se aceleran a una energía cinética de aprox. 25 KeV y se los
deja volar a través de una distancia fija sin campo eléctrico.
Teniendo energía cinética idéntica, los iones chicos se
mueven más rápido que los grandes y llegan antes al
detector. M/z se determina a partir del tiempo de vuelo,
comparando con standards.
(desorción/ionización por laser asistida por matriz, combinada con
análisis de masas por tiempo de vuelo)
Camera
Laser
Sample
plate
Pumping Pumping
Beam guide
Timed ion selector Reflector
Linear
detectorExtraction
gridsReflector
detector
ESQUEMA GENERAL DE UN ESPECTROMETRO DE MASA
MALDI-TOF
Espectrometro
de masa,
MALDI-ToF
MALDI es una fuente de ionización pulsada
• La muestra se mezcla con un matriz
que absorbe fuertemente en el UV.
• La matriz absorbe energía del laser
llevando a que se volatilicen tanto la
matriz como la muestra.
• Las moléculas ionizadas de la matriz
transfieren un protón a la muestra.
• Los iones de la muestra son entonces
acelerados recorriendo el tubo de vuelo
para analizar su masa (TOF MS).
MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization.
Matrix : Analyte
1000:1 – 10000:1
Excess of
MatrixEasy Sample
prep:
•Dried droplet
•Layered method
Nd:YAG (355nm)
N2 laser (337 nm)
Ionization by
laser (pulses
1-5nsec
but….high
potency: kW
MW).
Compatible
with TOF
analyzers
Highly efficient
ionization
method
Matrices absorb strongly l of the laser irradiation
cold matrix
hot matrix
La relación masa a carga de un ion es proporcional al cuadrado
de su tiempo de vuelo.
t = Tiempo de vuelo
L = Longitud recorrida por los iones
dentro del analizador
m = Masa
K = Energía cinética del ion
z = Número de cargas en el ion
2
22
L
Kt
z
m
MALDI-MS
1. Los espectros de MALDI-MS son muy simples, en general sólo
se observan iones con una sola carga: (M+H)+ o (M-H)-.
2. Es un método de ionización muy eficiente, y tiene alta
sensibilidad para el análisis de biomoléculas y biopolímeros.
3. Es ideal para el análisis de mezclas de péptidos trípticos para la
identificación de proteínas por PMF, peptide mass fingerprinting.
4. Es un análisis de high throughput (permite el análisis de un
número grande de muestras en corto tiempo).
5. Es compatible con el analizador de masa de tiempo de vuelo.
6. La intensided del laser puede inducir fragmentaciones que
permiten obtener información estructural (secuencia).
SECUENCIACION
DE PEPTIDOS Y
PROTEINAS
¿Cuales son lo objetivos de la secuenciación de péptidos?
• Comparar estructuras primarias de diferentes proteínas paraestablecer relaciones evolutivas (actualmente, se hace mayormenteusando secuencias traducidas de secuencias de nucleótidos).
• Obtener una secuencia de péptido de una proteína desconocidaproveniente de un organismo cuyo genoma no está secuenciado; estopermitirá la síntesis de oligonuclótidos degenerados para identificary clonar el gen que la codifica.
•Confirmar la identidad de una proteína sospechada a partir de unexperimento de PMF.
•Identificar modificaciones post-traduccionales.
.
SECUENCIACION DE PROTEINAS Y PEPTIDOS.
Para secuenciar una proteína siempre se debe partir de la proteína
purificada. La purificación puede consistir en obtener la proteína
pura en un tubo, a través de los métodos de purificación ya
mencionados, o, aún si no está completamente homogénea, como
una banda discreta en un gel de SDS-PAGE.
Para secuenciar una proteína siempre se la debe fragmentar para
obtener péptidos de menor tamaño, secuenciables por distintos
procedimientos.
Tanto para secuenciar por el método de Edman como por
espectrometría de masa, debe comenzarse con estos tres pasos:
1) Desnaturalizar, con urea por ejemplo, y reducir los puentes
disulfuro.
2) Bloquear los grupos –SH, con iodoacetamida por ejemplo.
3) Fragmentar la proteína en péptidos mas pequeños, usando dos
métodos diferentes (por ejemplo, digestiones con tripsina y BrCN)
SECUENCIACION DE PROTEINAS Y
PEPTIDOS.
1) Método de Edman:
Previa separación de los péptidos por
HPLC en fase reversa, secuenciarlos
químicamente por reacción con el reactivo
de Edman (isotiocianato de fenilo), en un
secuenciador automático.
Pasos a seguir para secuenciar una proteína pura
por el método de Edman.
1) Desnaturalizar, con urea por ejemplo, y reducir los puentes disulfuro.
2) Bloquear los grupos –SH, con iodoacetamida por ejemplo.
3) Fragmentar la proteína en péptidos mas pequeños, usando dos
métodos diferentes (por ejemplo, digestiones con tripsina y BrCN)
4) Separar los péptidos obtenidos por el primer método por HPLC en fase
reversa (RP-HPLC).
5) Tratar cada péptido purificado con el reactivo de Edman, isotiocianato
de fenilo, en un secuenciador automático.
6) Identificar los residuos de aminoácidos por RP-HPLC de los derivados
de feniltiohidantoína (PTH-aminoácido) on line en el secuenciador.
7) Hacer lo mismo con los péptidos obtenidos por el segundo método de
ruptura de la proteína.
8) Armar la secuencia por superposición de los péptidos obtenidos por
ambos métodos.
MDH-1
MDH-2
LAS MALATO DEHIDROGENASAS DE
TRYPANOSOMA CRUZI
La reacción del PITC con el amino terminal se hace en un medio básico,
dando un feniltiocarbamil-péptido (PTC-derivado). Este se separa por
acidificación con ácido trifluoroacético (TFA) como un derivado cíclico de
aminotiazolinona (ATZ-aminoácido) el cual se extrae con acetato de etilo y se
convierte en el PTH aminoácido con TFA 25 % en agua. Este es transferido on
line a la columna de RP-HPLC, que lo identifica.
El Procise Protein Sequencing System de Applied Biosystems
Está compuesto por 4 módulos integrados: el Secuenciador propiamente dicho, el Microgradient Delivery
System, el detector de UV de longitud de onda variable, y la computadora equipada con Procise control
software y SequencePro software. El sistema controla la entrega precisa de hasta 12 solventes y reactivos
diferentes. Incluye el cartucho de reacción, donde se obtiene el primer derivado (feniltiocarbamato del
residuo N-terminal) y luego por acidificación el ATZ-derivado, el frasco de conversión donde se lo transforma
en el PTH-derivado, que luego se transfiere a la columna de HPLC en fase reversa, donde se separan por el
gradiente de solvente, se lo detecta en el detector UV/VIS por su absorbancia y se lo identifica por el tiempo
de retención en la columna. La calibración se hace en base a una corrida con los PTH derivados de los 20
aminoácidos proteicos, además en algún caso de un derivado correspondiente a una modificación post-
traduccional que se quiere detectar.
1er.Ciclo
2
3er.
DEGRADACI
ON DE
EDMANREACCION DEL
RESIDUO N-
TERMINAL CON
ISOTIOCIANATO
DE FENILO
1er. Ciclo
2o. Ciclo
3er. Ciclo
Secuenciación
automática por
el Método de
Edman
(N-terminal de
la cruzipaína)
2) Espectrometría de masa:
Puede utilizarse para secuenciar péptidos o para identificar
proteínas.
2a) Secuenciación: Seleccionar un péptido determinado por
MS y fragmentarlo, obteniendo su secuencia a partir de las
masas de los fragmentos resultantes (CID, fragmentación en
cámara de colisión, o PSD, decaimiento después de la fuente de
iones)
2b) Identificación: Sin separar los péptidos, determinar la
masa de cierto número de los mismos por MS e identificar a la
proteína en los bancos de datos, por comparación con las masas
de digeridos virtuales de todas las proteínas ya secuenciadas. Se
conoce como peptide mass fingerprinting (PMF). Es óptimo
cuando el genoma del organismo de origen está completamente
secuenciado.
FRAGMENTACION DE LOS PEPTIDOS
C
O
N
H
COOHNH2
y¨n z´nxnC-terminal ions
bnan c”n
N-terminal
ions
Roepstorff, P., and Fohlmann J. Biomed. Mass Spectrom. 11, 601 (1984)
Jhonson R. S., Martin S. A., Biemann K., Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes. 86, 137 (1988).
N C
N C
Un péptido cargado
puede ser fragmentado
en dos trozos de tres
maneras, que pueden
producir un par de iones
a y x, un par de iones b e
y, o un par de iones c y z.
Teóricamente la fragmentación puede tener lugar en cualquier
lugar de un péptido, y se espera un espectro que contenga todos
los posibles picos de iones.
En la práctica, debido a la fortaleza irregular de las ligaduras
en las diferentes posiciones, los diferentes iones aparecen con
distintas frecuencias.
Los mas abundantes son los iones y, los cuales a menudo
forman la serie completa en un espectro. Los siguientes en
frecuencia son los iones a y b, de los cuales muchos no se
observan. Los iones c, x y z se presentan mucho menos
frecuentemente. Adicionalmente, estos iones pueden formar
nuevos iones por pérdida de agua o de amonio.
SECUENCIACION POR ESPECTROMETRIA DE MASA
La ES/MS puede aplicarse directamente a la secuenciación de péptidos,
utilizando un ES MS/MS, es decir un espectrómetro de masa de electrospray en
tandem, que tiene dos analizadores de masa separados por una celda de
colisión, donde el péptido seleccionado se fragmenta y da iones “hijos” que se
separan en el segundo analizador y permiten determinar la secuencia.
Collision-induced dissociation (CID)
Es una técnica de fragmentación usada para obtener información
estructural. Se utiliza la colisión con las moléculas de un gas para obtener
la fragmentación de un ión seleccionado por su masa.