CARACTERIZACIÓN DEL MUTANTE scs5 DE...

“CARACTERIZACIÓN DEL

MUTANTE scs5 DE Arabidopsis

thaliana Y SU IMPLICACIÓN EN

EL MECANISMO DE

RESISTENCIA A Pseudomonas

syringae DC3000”.

Trabajo de Fin de Máster

Realizado por:

Sofía Gabriela Moya Jiménez

Directores:

Pablo Vera y Beatriz González

Valencia, Enero del 2015

Pablo Vera, Profesor de Invetigaciòn del Consejo Superior de Investigaciones

Científicas

CERTIFICA

Que el presente trabajo titulado “Caracterización del mutante scs5 de Arabidopsis

thaliana y su implicación en el mecanismo de resistencia a Pseudomonas

syringae DC3000” ha sido realizado por Sofía Gabriela Moya Jiménez, bajo mi

dirección en el Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (UPV-CSIC) y

autorizo la presentación del Trabajo de Fin de Máster el cual se adecua a los

requisitos formales, metodológicos y de contenido, de acuerdo con la normativa

publicada por la Comisión Académica del Máster de Biotecnología Molecular y Celular

de Plantas de la Universidad Politécnica de Valencia.

Y para que conste a los efectos oportunos lo firmo en Valencia a 23 de Enero del

2015.

Director del TFM

A mis padres, por su amor y apoyo incondicional, por ser mis guías y mi

soporte en cada momento y por darme el mejor modelo de justicia y verdad que

he podido tener. A mis hermanos, Marqui, Eli y Enano por estar siempre a mi

lado y llenar de alegría mi vida.

Sofía Moya

AGRADECIMIENTO

Principalmente a Dios quien ha llenado mi vida de muchas bendiciones y

lecciones importantes que me han permitido crecer y ser mejor.

A mis padres por darme su amor y apoyo incondicional en cada paso de mi

vida, por darme el mejor ejemplo, enseñándome que las cosas grandes se

construyen con pasos pequeños.

A la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia y Tecnología del Ecuador

(SENESCYT), por brindarme ésta experiencia maravillosa la cual, me ha permitido

crecer tanto personalmente como progresar en mi formación profesional.

A Pablo Vera y su equipo de trabajo. Gracias por hacerme sentir parte

importante de esa gran familiar que es. Gracias por dejarme aprender de

ustedes, por compartir su conocimiento, por llenar el laboratorio de risas y

felicidad. Y sobre todo por ser unos verdaderos amigos. Pero, especialmente a

Vicente y Bea por su ayuda incondicional, su paciencia y consejos. Vicente fue

la persona que con carisma me ayudó a integrarme en el laboratorio y

encabezó esta investigación. Bea por su parte fue el motor de este trabajo y

sin duda alguna no hubiera conseguido llegar a su fin sin su interés, sus

ánimos, sus consejos, y sus enseñanzas. Nunca podré agradecerles por el

tiempo y el trabajo que invirtieron sin esperanzas de una retribución.

CONTENIDO

1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 1

1.1 Sistema de defensa en las plantas .......................................................................... 1

1.1.1 Interacción planta-patógeno ................................................................................... 2

1.1.2 Respuestas de defensa en la planta .................................................................... 8

1.2 Antecedentes del trabajo ............................................................................................. 12

1.2.1 P69C, un gen marcador de la respuesta de defensa en las plantas ............ 12

1.2.2 csb3, un mutante alterado en la resistencia frente a patógenos biotrofos .... 13

1.2.3 scs5, un mutante supresor de la mutación csb3 ............................................... 16

3 MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................................... 19

3.1 Material vegetal y condiciones de crecimiento. ....................................................... 19

3.2 Detección de la actividad de la β-D-glucuronidasa ................................................. 21

3.3 Análisis de susceptibilidad/resistencia. ..................................................................... 21

3.3.1 Inoculación por spray de las plantas con la bacteria fitopatógena

Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst. DC3000). .................................... 22

3.3.2 Curva de crecimiento bacteriano de Pseudomonas syringae pv. tomato

DC3000 (Pst. DC3000) en plantas mutantes csb3scs5 ............................................ 22

3.4 Mapeo genético de la mutación scs5 ......................................................................... 23

3.4.1 Generación de una población F2 recombinante ............................................... 23

3.4.2 Extracción de ADN genómico .............................................................................. 24

3.4.3 Selección de marcadores moleculares para el mapeo ..................................... 24

3.4.4 PCR .......................................................................................................................... 28

3.4.5 Electroforesis en gel de agarosa .......................................................................... 28

3.4.6 Determinación de la frecuencia de recombinación ........................................... 30

4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................................... 31

4.1 Caracterización fenotípica de mutantes scs .............................................................. 32

4.2 Caracterización fenotípica del mutante csb3scs5 .................................................... 35

4.2.1. Características morfológicas ............................................................................... 35

4.2.2 Actividad del transgen P69C::GUS..................................................................... 35

4.3 Mapeo genético de la mutación scs5 ....................................................................... 38

4.3.1 Generación de una población recombinante .................................................... 39

4.3.2 Extracción de ADN genómico ............................................................................... 40

4.3.3 Análisis de las frecuencias de recombinación ................................................... 40

5 CONCLUSIONES ................................................................................................................ 47

6 BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................... 48

RESUMEN

En el presente trabajo se utilizó un abordaje genético con el fin de entender en

profundidad la ruta de señalización patogénica controlada por el gen CSB3 y

descrita anteriormente en plantas de Arabidopsis thaliana. En base a un

escrutinio genético sobre el fondo mutante csb3, se buscaron revertientes del

fenotipo asociado a ésta mutación. Dicha estrategia permitió la identificación de

un selecto grupo de supresores que fueron denominados como “supressors of

csb3” (scs) De estos mutantes se seleccionó a scs5. El mutante scs5, además

de suprimir el fenotipo de csb3 y la resistencia incrementada frente a la bacteria

patógena Pseudomonas syringae DC3000, lleva asociadas alteración

morfológicas consistente principalmente en una clorosis en la zona

meristemática de la roseta, y particularmente intensa en los haces vasculares.

Al analizar la susceptibilidad por parte de las plantas csb3scs5 se determinó

que estas plantas son hipersusceptibles a la infección por Pseudomonas

Syringae DC3000 en comparación con plantas silvestres y a plantas csb3. Se

deduce, por lo tanto, que al ser CSB3 un regulador negativo de la resistencia,

SCS5 tiene una función positiva de la misma. A través de la identificación de la

mutación scs5 se aporta un nuevo componente para el mejor entendimiento de

los elementos que se requieren para la correcta activación de mecanismo de

inmunidad en plantas. La localización del locus SCS5 se acotó mediante el

mapeo posicional a través de la utilización de marcadores moleculares SSLPs

y se determinó que este locus está próximo al marcador CTR1.2,

concretamente, en proximidad con la posición 979764bp del cromosoma 5 de

Arabidopsis cercana a la región telomérica del brazo pequeño de dicho

cromosoma. Ésta localización servirá de punto de partida para el cartografiado

de alta resolución y la eventual identificación y clonación del gen SCS5 en

futuras aproximaciones.

ABSTRACT

A genetic approach was used to understand the pathogenic signaling pathway

controlled by CSB3 and which was described previously in Arabidopsis thaliana.

Based on a second-side genetic screening on a csb3 mutant background, we

identified a select group of suppressors that were named as "supressors of

csb3" (scs). Of these mutants we selected scs5. scs5 mutant suppress csb3

phenotype and its increased resistance to the bacterial pathogen Pseudomonas

syringae DC3000. Inn additional scs5 has associated morphological alterations

consisting mainly of meristematic chlorosis rosette area, and particularly strong

in the vascular bundles. By analyzing the susceptibility of csb3scs5 plants we

observed determined that these plants are hypersusceptible to infection by

Pseudomonas syringae DC3000 compared with wild type and csb3 plants. We

can conclude that CSB3 is a negative regulator of resistance, while SCS5 has a

positive role. Through the identification of scs5, a new component for the better

understanding of the elements required for the successful activation of immunity

mechanism in plants is provided. SCS5 locus localization was narrowed by

positional mapping with SSLPs molecular markers in the proximity to marker

CTR1.2 at position 979764bp in Arabidopsis chromosome 5 close to the

telomeric region of the small arm of the chromosome. This location will serve as

a starting point for a high-resolution mapping and the eventual identification and

subsequent cloning of the SCS5 gene in future approaches.

1

1 INTRODUCCIÓN

1.1 Sistema de defensa en las plantas

Las plantas son organismos sésiles y por ello incapaces de moverse de un

lugar a otro cuando se ven expuestas a condiciones medioambientales poco

favorables para su desarrollo. Destacan dentro de estas condiciones

estresantes las que hacen referencia a la sequía, la salinidad, las inundaciones,

las limitaciones de nutrientes o las derivadas como consecuencia del ataque de

microorganismos patógenos e insectos (De Vos, 2006).

Concretamente, se pueden clasificar dos tipos de estreses que pueden alterar

el correcto desarrollo de las plantas. Por un lado el estrés abiótico, el cual,

dependiendo de la naturaleza del agente causal, puede ser de tipo físico,

como sería el estrés hídrico, temperatura o irradiación; o de tipo químico, tal y

como puede ser la derivada de un crecimiento en lugares con una salinidad

elevada, el desbalance nutricional, la presencia de metales pesados, la

aplicación de pesticidas, o incluso variaciones de pH en el suelo. Por otra lado,

se encuentra el estrés biótico, el cual es causado por la presencia de agentes

fitopatógenos tales como virus, bacterias, hongos, nematodos, o incluso por el

ataque de insectos (Dodds y Rathjen, 2010).

Por esta razón, las plantas han desarrollado mecanismos de defensa

sofisticados que le permiten responder y sobrevivir a estas situaciones de

estrés. Ello, a través del desarrollo de estrategias de adaptación que conllevan

a la superación de dicho estrés, y que están fundamentadas en la activación de

programas moleculares controlados a nivel genético (Hückelhoven, 2007). En lo

que respecta a la interacción planta-patógeno, y en particular a aquello que

llamamos como procesos defensivos o antipatogénicos, cabe destacar el

desarrollo de estrategias preinvasivas, que se corresponden generalmente con

el desarrollo de estructuras que actúan a modo de barreras físicas y que están

establecidas antes de la llegada de los agentes patogénicos o del inicio del

proceso infectivo. Además de este tipo de mecanismos de defensa estructural,

y toda vez que un patógeno consigue sortear las barreras preexistentes e

iniciar el proceso infectivo propiamente dicho, se generan diferentes señales y

respuestas moleculares por parte de la planta a la que llamaremos defensa

postinvasiva. Tanto las defensas preinvasivas como las postinvasivas tienen la

función de impedir la entrada y desarrollo del patógeno y por ello son

consideradas fundamentales para el entendimiento de los mecanismos de

resistencia de las plantas a plagas y enfermedades (De Vos, 2006).

2

1.1.1 Interacción planta-patógeno

Los microorganismos patógenos han desarrollado diferentes estrategias de

infección desplegando distintos estilos de vida que son fundamentales para

infectar y colonizar su planta huésped (León-Reyes, 2009). De acuerdo a los

diferentes estilos de vida y estrategias de infección se pueden clasificar a los

microorganismos patógenos de plantas, de forma grosera, en dos grandes

grupos: patógenos necrotrofos y patógenos biotrofos/hemibiotrofos. (Pieterse,

et al., 2009). Los agentes necrotrofos destruyen la célula huésped y se

alimentan de los detritos celulares, de ahí su nombre (Fig. 1). Dentro de este

grupo, y por su importancia en la agricultura, se puede encontrar a los hongos

causantes de podredumbres tales como Botrytis cinerea y Alternaria

brassicicola, entre otros muchos (De Vos, 2005). Por el contrario los patógenos

biotrofos obtienen los nutrientes exclusivamente de tejidos vivos del huésped a

través del establecimiento de diferentes estructuras especializadas que

permiten el contacto directo con el interior de la célula vegetal y con ello el

aprovisionamiento de nutrientes (Fig. 1). Ejemplos de este grupo de

microorganismos patogénicos son los hongos biotrofos Peronospora parasítica

y Erysiphe oronti, o la bacteria hemibiotrofa Pseudomonas syringae (Anderson

et al., 2004).

Figura 1. Hojas de Arabidopsis thaliana infectadas con diferente clase de patógenos.

Representación en hoja adulta del efecto producido en la planta tras la infección por dos

patógenos con diferente estilo de vida: necrotrofo (Botrytis cinerea) y hemibiotrofo

(Pseudomonas syringae). Fuente: Pieterse et al., 2009.

3

1.1.1.1 Defensa preinvasiva

En el curso de la evolución, y como consecuencia de su permanente

interacción con los microorganismos patógenos, las plantas han conseguido

desarrollar una serie de barreras estructurales, así como la síntesis de un

conjunto de compuestos antimicrobianos que eventualmente permiten prevenir

o atenuar la invasión por un gran número de patógenos. Todo ello constituye la

defensa preinvasiva o también llamada defensa constitutiva, siendo ésta la

primera barrera de las plantas para evitar el paso de los microorganismos. Esta

defensa consta tanto de estrategias físicas, tales como la aparición de barreras

estructurales (e.g., cutícula), como químicas, tales como la síntesis de

metabolitos secundarios de naturaleza antimicrobiana (e.g., camalexina)

(Hückelhoven, 2007). La defensa constitutiva se considera propia de cada

especie y se caracteriza por no involucrar una respuesta activa del huésped

ante la presencia del patógeno. La defensa preinvasiva tiene lugar previamente

al reconocimiento del patógeno y sirve como obstáculo para evitar la entrada

de parásitos de tipo inespecífico (Van der Ent et al., 2009). De esta forma, para

que el patógeno pueda llegar a invadir la planta debe penetrar primeramente a

través de las aperturas naturales (estomas) o heridas existentes en la cutícula

protectora que se encuentra sobre las células de la epidermis de las hojas o

raíces. Posteriormente, deberá conseguir disolver o dañar la pared celular, la

misma que a su vez también contiene gran cantidad de componentes o

subestructuras moleculares que a su vez generan resistencia (e.g., lignina,

pectina, callosa) (Agrios, 2005). Los patógenos por su lado también han

desarrollado herramientas que les facilita el acceso a la célula vegetal y a sus

nutrientes. Dentro de estas herramientas cabe destacar la secreción de

enzimas hidrolíticas tipo cutinasas y pectinasas que tiene como el objetivo de

degradar las estructuras protectoras de la planta, y también enzimas

detoxificadoras de determinados metabolitos producidos por la planta como

defensa a estos agentes patogénicos (Dodds y Rathjen, 2010). Una vez

superadas estas barreras, se activa un complejo mecanismo de comunicación

y de interacción célula-célula y que incluye la síntesis de sustancias tóxicas o

efectores que actúan de manera hormonal para así manipular el metabolismo

celular y poder alimentarse de las células de la planta (Van Hulten, 2009).

1.1.1.2 Defensa postinvasiva

Una vez que el patógeno ha superado estas primeras barreras, entra en

funcionamiento el verdadero reconocimiento de éste por parte de la célula

vegetal y se activan diferentes mecanismos de señalización que conllevan a la

activación de la respuesta defensiva inducible o también llamada defensa

postinvasiva. En tal caso, la interacción planta-patógeno puede ser del tipo

compatible o incompatible. Cuando es del tipo compatible, la planta permite el

paso del patógeno (Nurnberger y Brunner, 2002). El microorganismo se replica

4

y avanza hasta el sistema vascular para invadir toda la planta. Por otro lado,

cuando la planta posee los mecanismos necesarios para reconocer y

desencadenar las señales necesarias para evitar el avance del patógeno a los

tejidos vasculares y confinarlo en el sitio de infección se da una interacción

incompatible. El resultado final de esta interacción es alcanzar la resistencia

(Hückelhoven, 2007).

Dentro de este tipo de defensa, las plantas disponen de dos estrategias

sofisticadas para percibir y traducir la señal en una respuesta inmune efectiva.

La primera estrategia de defensa que tiene lugar es la denominada Inmunidad

activada por PAMPs, o PTI, del inglés PAMP- Triggered Immunity. Una vez el

patógeno ha superado esta barrera, se desarrolla la segunda estrategia

denominada Inmunidad activada por Efectores, o ETI, del inglés Effector

Triggered Immunity (Dodds y Rathjen, 2010).

- Inmunidad activada por PAMPs (PTI)

Los PAMPs son patrones moleculares conservados evolutivamente y

esenciales de los patógenos microbianos. Las flagelina, quitina, glicoproteínas,

y lipopolisacáridos son algunos ejemplos. Estas características comunes

permiten identificar patógenos de un mismo grupo, ya que comparte una

respuesta similar por parte de la planta. Los PAMPs son un subgrupo dentro de

los patrones moleculares asociados a microorganismos llamados MAMPs

(Microbe-Associated Molecular Patterns), donde se encuentran incluso

microrganismos no patogénicos (Hückelhoven, 2007). Los PAMPs son

reconocidos por las proteínas receptoras transmembrana de reconocimiento de

patrones (PRR, Pattern Recognition Receptors) caracterizadas por tener una

región rica en leucinas (LRR) localizada en la parte externa de la membrana

plasmática (Fig. 2). Este es el lugar de reconocimiento y unión entre los PAMPs

y los PRR. Estos receptores, dependiendo de la región o estructura existente

en el lado citoplasmático pueden ser de dos tipos. Un grupo son los LRR-RLK

que tienen un dominio serin/treonin quinasa intracelular, mientras que el otro

grupo, denominado LRR-RLP, carece de este dominio (Jones y Dangl, 2006). A

partir del momento en que la planta reconoce los PAMPs se desencadena una

serie eventos de señalización mediados por MAPK (Mitogen Activation Protein

Kinase) hasta permitir la activación de la defensa PTI (Verhage et al., 2010).

Este evento ocasiona la producción de especies reactivas de oxígeno y

compuestos antimicrobianos, reforzamiento de la pared celular mediante la

síntesis de callosa y lignina en los sitios de infección y la activación

transcripcional de genes de defensa con la finalidad de atenuar o impedir el

avance de la infección (Nurnberger y Brunner, 2002).

5

Con el fin de superar estos mecanismos de defensa los patógenos han

desarrollado singulares estrategias que pretenden evitar la activación de la

inmunidad activada por PAMPs. Un ejemplo de esto lo constituyen las

proteínas denominadas “efectoras” que son secretadas o inyectadas en el

citoplasma de la célula huésped mediante dos formas diferentes. Una ocurre a

través de los sistemas de secreción de tipo III (TTSS, TYPE III Secretion

System) en las bacterias, mientras que la otra manera se genera por la

producción de factores de virulencia activados por moléculas de RNA para

suprimir la PTI y promover la virulencia del patógeno. En el caso que el

patógeno logre superar la primera barrera, la planta activa el mecanismo ETI

definido anteriormente (y que desarrollaremos a continuación) logrando con ello

su supervivencia y permitiéndole superar la infección (Dodds & Rathjem, 2011).

- Inmunidad activada por efectores (ETI)

Durante los procesos co-evolutivos entre patógenos y la planta huésped, los

microorganismos han podido desarrollar moléculas efectoras que son patrones

propios de cada microorganismo. Éstas son transportadas a la célula huésped

para que ejerzan su función de suprimir la primera barrera (la PTI) y promover

la virulencia del patógeno. Esto puede dar como resultado la activación de una

segunda barrera que es la inmunidad activada por efectores (ETI). Esta barrera

es específica para la detección del agente infeccioso y tiene como finalidad

proveer a la planta de mecanismos de resistencia frente a patógenos

determinada por sus efectores. Además, estos patrones pueden modificar

proteínas o genes relacionados a la defensa de la célula huésped para su

beneficio (Chisholm et al., 2006). A partir del reconocimiento de los efectores

por parte de proteínas de resistencia, proteínas R (Fig. 2), puede ocurrir que la

planta no sea capaz de reconocer los efectores y activar esta barrera

defensiva, por lo tanto, se producirá la infección y la susceptibilidad activada

por efectores (ETS, Effector-Triggered Susceptibility) (Jones y Dangl, 2006).

El resultado final en esta batalla depende del equilibrio entre la capacidad del

patógeno para suprimir el sistema inmune de la planta y la capacidad de ésta

para reconocer al patógeno y activar de formar eficaz los diferentes

mecanismos de defensa.

6

Figura 2. Representación esquemática del sistema inmune de las plantas. Fuente:

Pieterse et al., 2009. A) A partir del ataque del patógeno, los PAMPs son reconocidos por los

receptores PRRs. En la planta se genera la cascada de señalización para activar la PTI. B) El

patógeno virulento posee efectores para suprimir la PTI, dando como resultado la activación de

la ETS. C) La panta posee proteínas de resistencia adquirida (R) que reconocen a los efectores

de los patógenos, dando como resultado ETI.

Profundizando en lo anterior, el mecanismo de reconocimiento que tiene lugar

en la ETI, también conocido como el modelo de “Interacción gen a gen”, es el

que mejor explica estos eventos. En esta interacción, las proteínas R

codificadas por los genes R por parte de la célula huésped reconocen las

proteínas de avirulencia (Avr) de los patógenos, para desencadenar un

cascada de señalización y alcanzar una respuesta inmunitaria de la planta,

llamada también Respuesta de Hipersensibilidad (HR) (Dangl, et al., 1996 y

Van der Ent, 2009). La Respuesta de Hipersensibilidad (HR) conlleva,

generalmente, activación de muerte celular mediada por la producción de

especies reactivas de oxígeno (ROS), e impide el avance de la infección al

resto de la planta (Pieterse et al., 1999). Por lo tanto, cuando el patógeno

supera la primera barrera de defensa PTI, la planta impide el avance de la

infección a través de la HR y genera resistencia, dándose lugar una interacción

planta-patógeno incompatible. Además, se generan moléculas de carácter

defensivo con la finalidad de proteger a la planta de futuros ataques del mismo

patógeno. Por el contrario, una interacción compatible tendrá lugar cuando no

haya reconocimiento entre los genes R y Avr. Por lo tanto, no se desarrolla la

ETI y la infección se expande por toda la planta produciéndose la enfermedad.

Es decir, la planta será susceptible y el patógeno habrá ganado la batalla

dentro de la interacción planta-patógeno (Verhage et al., 2010).

7

Una vez establecido este modelo y basándose en el estudio de la interacción

entre P. syringae y Arabidopsis, Bienzen y Jones en 1998 propusieron la

“hipótesis del gen guardián”. Este modelo explica como la planta puede

responder a una gran variedad de efectores, es decir, genes Avr, con un

número determinado de genes R, sin necesidad de una interacción física entre

ellos. Las proteínas R están asociadas a otras proteínas de la planta, de las

cuales el patógeno se beneficia para generar la infección. El patógeno utiliza

los efectores para generar modificaciones en estas proteínas asociadas a las

proteínas R, pero estas últimas se encuentran monitoreando constantemente

las modificaciones que se puedan generar. Una vez que se da el

reconocimiento de estas modificaciones por parte de las proteínas R se

desencadena una serie de señales de defensa que tienen como finalidad

detener al patógeno. Explicando así como las plantas pueden reconocer a

miles de patógenos diferentes usando solo una cantidad menor de genes R

(Dangl y Jones, 2001).

Este sistema de inmunidad inducida que se ha descrito anteriormente se

resume en el modelo zig-zag (Fig.3) establecido por Jones y Dangl en el 2006.

Este modelo consiste en cuatro fases. La primera fase ocurre cuando los

PAMPs son reconocidos por los PRR, lo que resulta en un respuesta defensiva

del tipo PTI que impide el avance del patógeno por toda la planta. En la

segunda fase, si el patógeno supera la primera fase, produce efectores

específicos para promover la infección y por lo tanto, hace a la planta

susceptible, es decir se produce una respuesta de tipo ETS. En la tercera fase,

los efectores son reconocidos por las proteínas R dándose una interacción

específica según la hipótesis de la interacción gen a gen o indirecta según la

teoría del gen guardián, lo que desencadena la resistencia a través de la

respuesta de hipersensibilidad (HR). En la última fase, los mecanismos de

adaptación y procesos evolutivos intervienen, haciendo que algunos patógenos

pierdan el efector reconocido y que puedan ganar nuevos efectores,

permitiendo así superar la ETI. Pero, la selección natural también favorece a

las plantas mediante la producción de nuevas proteínas R que puedan

reconocer a los efectores, lo que resulta en la activación nuevamente de la ETI

(Koornneef y Pieterse, 2008).

8

Figura 3. Esquema de la teoría del zig-zag. Fuente: Jones y Dangl, 2006.

1.1.2 Respuestas de defensa en la planta

Una vez que la respuesta defensiva está activa en el sitio de infección, una

respuesta defensiva sistémica se dispara también en las partes distales para

proteger el tejido que no ha sido dañado y conferir resistencia a la planta contra

la invasión del patógeno. Además estos mecanismos tienen también como

objetivo preparar a la planta, manteniendo activas determinadas moléculas

señalizadoras, para futuras infecciones que le permitan reaccionar con mayor

rapidez y/o efectividad y evitar así la enfermedad en la planta. Este fenómeno

constituye la esencia de la resistencia sistémica adquirida, denominada SAR, y

en sí constituye la base de la resistencia inducida o IR. Por lo tanto, en las

plantas hay dos tipos de respuesta: una del tipo local relacionada con la

respuesta de hipersensibilidad (HR). Y otra respuesta, que se produce de

forma sistémica, y que tiene lugar en zonas distales que no han sido infectadas

directamente (Jones y Dangl, 2006).

1.1.2.1 Respuesta local

La respuesta local por parte de la planta al ataque del patógeno ocurre

inicialmente en el sitio de infección después del reconocimiento por parte del

gen de resistencia (R) de la planta al gen de avirulencia (Avr) del patógeno. En

este evento primero se altera el flujo de iones y se activan las vías de

señalización producidas principalmente por proteínas quinasas como las

MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinase). También, se dan cambios en la

regulación transcripcional de genes del hospedador, se refuerza la pared

9

celular, se generan especies reactivas de oxígeno (ROS) y se produce óxido

nítrico (NO). Todo ello como mecanismos de respuestas defensivas. Estos

fenómenos provocan la respuesta de hipersensibilidad (HR) y por ende la

muerte celular del tejido infectado con el objeto de limitar e impedir el avance

del patógeno (Van der Ent et al., 2009).

Las MAPKs (tras fosforilaciones progresivas) permiten la activación

postraduccional de factores de transcripción específicos para promover la

consecuente activación de la expresión de genes relacionados con la defensa.

Por su parte, los procesos oxidativos producidos en la célula infectada se

caracterizan por la producción y acumulación de especies reactivas de oxígeno

como el superóxido (O2) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) (De Vos et al.,

2005). La forma de acción de los ROS dependen de la concentración de éstos,

actuando como moléculas señal a bajas dosis o, alternativamente, si sus

niveles son elevados, conducen a la activación de un mecanismo de muerte

celular programada (HR) de tipo apoptótico en las células infectadas. Existe

una relación directa entre el aumento de ROS y NO debido a que este último

tiene la capacidad de inhibir la función de las catalasas y peroxidasas

encargadas de la detoxificación de los ROS (De Wit, 1997).

1.1.2.2 Señalización hormonal

Gracias a estudios bioquímicos, genéticos y moleculares utilizando como

modelo a especies de Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum se demostró

que las hormonas juegan un papel importante en la regulación del desarrollo y

vías de señalización como respuesta a un amplio rango de situaciones de

estrés (Krouk et al., 2011). La regulación de los mecanismos de defensa

encargados de traducir los eventos de señalización en la planta después del

ataque de un patógeno dependen de la acción de las hormonas. Por lo tanto, la

infección del patógeno estimula a la planta a sintetizar una o varias señales

hormonales dependiendo del tipo de atacante. De los estudios antes

mencionados, se evidenció que los patógenos biotrofos como Pseudomona

syringae y Hyaloperonospera parasítica son generalmente sensibles a la

respuesta defensiva que está regulada por la síntesis y acumulación de Ácido

Salicílico (SA). Sin embargo, los patógenos necrotrofos como Botrytis cinerea y

Alternaria brassicicola están comúnmente controlados por el Ácido Jásmónico

(JA) y el etileno (ET). Además, la respuesta a una herida producida por

insectos herbívoros también está regulada por la ruta de señalización del JA

(Glazebrook, 2005 y De Vos et al., 2005).

El SA es una señal primordial en la defensa sistémica inducida (SAR) como

respuesta al ataque de patógenos. Sin embargo, existen otras hormonas como

las auxinas, o el ácido ascórbico que trabajan de forma conjunta en la compleja

red de interacción que permitirá a la planta tener una adecuada respuesta

10

frente a la presencia de diferentes agentes patogénicos (Chen et al., 2009, y

Pieterse et al., 2009).

Concretamente, el ácido salicílico tiene un papel importante en la fotosíntesis y

la transpiración entre otros procesos fisiológicos necesarios para el óptimo

desarrollo de las plantas. Pero además, el SA tiene un rol esencial en la

respuesta defensiva. La concentración de SA aumenta en el tejido local así

como en el distal después del ataque del patógeno (Koornneef y Pieterse,

2008). Por lo tanto, el SA interviene directamente en la activación de la

resistencia sistémica adquirida (SAR). La ruta dependiente del SA participa en

la expresión de proteínas relacionada a la patogénesis (PR, Pathogenesis

Related) como los genes PR-1 y PR-2. Varios estudios realizados en el

mutante npr1 (nonexpressor of PR genes) en Arabidopsis indican que NPR1 es

un regulador clave en la resistencia sistémica adquirida (SAR) dependiente de

SA. Como respuesta a una infección, se incrementan los niveles de SA en el

citosol y por lo tanto se incrementa la inducción de NPR1, el cual gracias a un

cambio en el potencial redox se reduce de su forma de olígomérica a su forma

monomérica, permitiendo así su paso al núcleo donde finalmente, NPR1

monomérico actúa como factor de transcripción permitiendo la activación del

gen PR-1 (Wu et al., 2012).

El ácido jasmónico está relacionado con la expresión de genes de respuesta a

JA como es PDF1.2 de las siglas en inglés PLANT DEFENSIN 1.2 o LOX2 por

LIPOXIGENASE 2. Al trabajar con el mutante insensible a JA, coi1, se

estableció que el JA-Ile se une al receptor COI1 (Coronatine Insensitive1), que

codifica para una proteína F-box con actividad E3 ubiquitina ligasa de tipo

SKP1-CUL1-F-box (SCF). Este complejo interacciona con proteínas con

dominio-ZIM (JAZ), las cuales son ubiquitinadas permitiendo su degradación

vía proteosoma 26S. Puesto que los JAZ actúan como represores de la

respuesta a jasmónico, al degradarse se liberan los factores de transcripción

tipo MYC y se activa la respuesta a daños mecánicos. Además se activan los

factores de transcripción ERF-1 y ORA59 que regulan la respuesta a

patógenos necrotrofos (Howe, 2004 y De Vos, 2006).

Otra hormona implicada en los mecanismos de defensa es el etileno el cual

actúa de forma sinérgica con el JA, ya que puede inducir genes de respuesta a

JA. La interacción de estas dos hormonas permite la activación de la respuesta

sistémica inducida (ISR) (Van Hulten, 2009).

Las tres hormonas actúan de forma sinérgica o antagónica, permitiendo a la

planta tener una eficiente capacidad reguladora. Por lo tanto, la señalización de

la defensa es específica para patógenos biotrofos o necrotrofos lo que lleva a

la activación de la expresión de los diferentes tipos de genes de defensa.

11

1.1.2.3 Respuesta Sistémica

Una vez que se ha desarrollado la respuesta de defensa local de la planta

después del ataque del patógeno, se produce una serie de respuestas

defensivas sistémicas activadas por señalización hormonal localizadas en

partes distales de la planta para proteger el tejido no dañado de la invasión

subsecuente del patógeno, así como de futuras infecciones (Sticher et al.,

1997). Esta resistencia puede ser de larga duración y de amplio espectro y es

conocida como Resistencia Sistémica Adquirida (SAR). Mientras que, la

resistencia inducida por microorganismos del suelo que establecen una

relación de mutualismo con la planta como las rizobacterias es llamada

Resistencia Sistémica Inducida (ISR) (Van Loon, 1997).

- SAR

SAR es la respuesta sistémica activada en las células no infectadas, por ello

distales al sitio donde ocurrió el ataque del patógeno, y confiere resistencia y

protección de larga duración. La activación de SAR puede ser provocada

durante la interacción planta-patógeno, tanto en la PTI como en la ETI. Gracias

al estudio de mutantes y plantas transgénicas que tienen alterada la

señalización de SA, incapaces de desarrollar SAR y que no muestran activos

los genes PR se determinó que la activación de SAR está generalmente

asociado con el incremento de los niveles del SA, de forma local en el sitio de

la infección y también en el tejido distal (Durrant y Dong, 2004). Y que además,

SAR se caracteriza por la activación coordinada por genes de defensa

pertenecientes de forma mayoritaria a los que codifican proteínas PR. Los

genes PR (Pathogenesis-Related) codifican para una gran cantidad de

proteínas efectivas en la inhibición del crecimiento, multiplicación y propagación

de infecciones y se expresan tanto de forma local como distal. (Van Loon,

1997).

- ISR

Estudios realizados con la rizobacteria no patógena Pseudomons fluorescens

WCS417 y la planta modelo Arabidopsis thaliana permitieron identificar una

nueva forma de resistencia denominada respuesta sistémica inducida o ISR. La

misma se basa en que la colonización vía radicular por esta bacteria induce

resistencia frente a posibles infecciones posteriores. En contraste con la

dependencia de SAR por el ácido salicílico (SA) y el gen regulador NPR1, el

ISR es activada por microoganismos no patogénicos que viven en estado de

mutualismo con la planta, y está regulada por las vías de señalización

dependientes al JA y el ET (Kunkel y Brooks, 2002). Mientras que el SAR es

efectivo frente al ataque de patógenos biotrofos que son sensibles a la defensa

dependientes de SA, el ISR es efectivo frente a patógenos e insectos sensibles

a la defensa dependiente de JA y ET (Van Oosten et al., 2008).

12

1.2 Antecedentes del trabajo

Como se ha dicho anteriormente, la respuesta defensiva de las plantas al

ataque de patógenos implica cambios en la transcripción de numerosos genes.

Y entre ellos se encuentra P69C.

1.2.1 P69C, un gen marcador de la respuesta de defensa en las plantas

Como se describe en Zhao et al., 2000 las proteasas tiene una función

importante en varios procesos celulares incluyendo la diferenciación celular, la

adaptación a diferentes factores ambientales y la misma activación de

mecanismos de defensa. Un ejemplo de proteasas involucradas en la defensa

lo constituyen las subtilasas, en particular las correspondientes al grupo de

proteínas denominadas P69 (Meichtry et al., 1999). Dichas subtilasas son

glicoproteínas que se secretan a la matriz extracelular donde se acumulan y

realizan las funciones, supuestamente, de reconocimiento y procesamiento de

sustratos pericelulares (Matarasso et al., 2005). De los seis miembros de P69

caracterizados en detalle hasta el momento, y que están fuertemente regulados

por factores ambientales y de desarrollo, cuatro (i.e., P69A, P69D, P69E y

P69F) no parecen participar en la respuesta inmune. A pesar de esto, no se

descarta que participen en la primera línea de defensa. Los otros dos

miembros, i.e., P69B y P69C, han sido relacionados con mecanismos de

defensa (Tornero et al., 1996, Jordá et al., 2009, Ramírez et al., 2013). Con el

propósito de profundizar en el entendimiento del control transcripcional que

modula la expresión de genes de defensa en el laboratorio se seleccionó al gen

P69C como un buen candidato para realizar desarrollos de genética reversa y

directa. Para tal fin, en trabajos anteriores en nuestro laboratorio se generaron

plantas transgénicas de Arabidopsis que tenían el gen marcador GUS bajo el

control de la región promotora del gen P69C (Jordá y Vera, 2000). Al realizar

un estudio comparativo de la expresión de la actividad GUS en las plantas

P69C::GUS mediante tinción histoquímica con el sustrato X-Gluc se observó

una activación transcripcional cuando las plantas se inoculan tanto con la

bacteria virulenta Pseudomonas syringae DC3000 (Pst. DC3000) como con la

estirpe avirulenta Pst. DC3000 (avrRpm1). La expresión de GUS dirigida por el

promotor P69C se induce después de la infección y se observa este patrón de

expresión en forma de punteaduras en toda la superficie foliar y no alrededor

de la zona de infección. La expresión acontecía tanto en hojas inoculadas

como en hojas distales al punto de inoculación (Gil, 2005) (Fig. 4).

13

Figura 4: Patrón de expresión del gen marcador GUS bajo el control del promotor de

P69C después de un estímulo patogénico por Pst. DC3000, a nivel local y distal. Fuente:

Gil, 2005.

1.2.2 csb3, un mutante alterado en la resistencia frente a patógenos

biotrofos

Para un mejor entendimiento de la regulación y modo de acción de P69C se

desarrolló una estrategia genética con el fin de identificar genes implicados en

las rutas de señalización de la respuesta defensiva basada en la identificación

de mutantes en base al patrón de expresión de P69C::GUS. Uno de los

criterios de selección aplicado al escrutinio de mutantes estaba basado en la

identificación de plantas en las que, de forma constitutiva y sin la existencia de

ningún estímulo externo, se encontrara activada la expresión del gen GUS

dirigida por el promotor de P69C. De un primer rastreo de 200.000 plantas M2

se seleccionaron 13 individuos que tenían expresión constitutiva del gen

marcador GUS. Más tarde, se comprobó la expresión del gen GUS en estos

individuos en la generación M3 y M4 y, finalmente, se seleccionaron los

mutantes csb1, csb2 y csb3, los cuales llevan este nombre por sus siglas en

inglés constitutive subtilisin (Gil, 2005). En los ensayos histoquímicos de la

expresión del gen marcador GUS, los tres mutantes tienen expresión

constitutiva de GUS. Sin embargo, csb2 y csb3 tienen un patrón de expresión

del gen marcador similar al de la línea parental P69C::GUS, la cual ha sido

infectada previamente con Pst. DC3000 (Fig. 5). Estos datos sugieren que las

plantas csb2 y csb3 tienen alterado alguno de los componentes que participan

en la regulación patogénica del gen P69C. Los análisis genéticos de los

mutantes csb revelan que los tres exhiben una mutación nuclear monogénica

de carácter recesivo con expresión constitutiva de la actividad GUS (Ramírez et

al., 2013). Finalmente, el análisis de la expresión de genes de la ruta de

señalización dependiente al SA, tales como PR-1 y PR-2 y GST6, se observó

14

en el mutante csb3 una mayor expresión de los mismos en ausencia de

estímulo patogénico. Además, este mutante mostró resistencia incrementada a

Pst. DC3000, lo que concuerda con el hecho de que se observe una activación

de estos marcadores de la respuesta defensiva (Fig. 5). Estas características

permitieron seleccionar a csb3 para realizar futuros estudios por su relación

con el sistema de defensa de las plantas (Gil, 2005).

Figura 5 Caracterización del mutante csb3, Fuente (Gil, 2004).

A) Aspecto morfológico de las plantas silvestres y plantas csb3 de cuatro semanas) Tinción

histoquímica de la actividad GUS dirigida por el promotor P69C en plantas silvestres y en

plantas csb3 tras 10 días de crecimiento in vitro. C) Detección de la actividad GUS en hojas de

plantas silvestres y plantas csb3 de cuatro semanas. D) Actividad de la los genes PR-1, PR-2,

GST y PDF1.2 en plantas silvestres y csb3 E) Estudio comparativo del crecimiento bacteriano

en plantas inoculadas a los 3 y 5 días después de la infección con Pst. DC3000.

Con la finalidad de ampliar y corroborar la relación de la resistencia mostrada

por el mutante csb3 con la activación de genes de defensa, se realizaron

análisis transcriptómicos que demostraran este fenómeno. De los 21000 genes

analizados en un chip de Affymetrix AT1 se identificaron 3843 genes que se

sobreexpresan y 2626 genes se reprimen en plantas csb3 en comparación con

el control. Los genes más representativos están ligados al estrés biótico (Gil,

2005). Un ejemplo de genes ligados al estrés biótico encontrados en plantas

15

csb3 mediante el análisis transcriptómico son los genes R involucrados en el

reconocimiento de los genes de avirulencia del patógeno. También, está PAD4

y EDS1 que participan en las primeras etapas de la ruta de transducción de la

señalización mediada por SA. Otro grupo representativo son los pertenecientes

a la síntesis de SA involucrados en la biosíntesis de los fenilpropanoides (Spoel

et al., 2003) así como de la ruta de biosíntesis de SA a partir de isocorismato

en el cloroplasto (ICS1 y EDS5) (Chen et al., 2009 y Dempsey et al., 2011).

Una vez caracterizado fenotípica y molecularmente, tras su clonación por

posición en mapa y paseo cromosómico se estableció que la mutación csb3 es

una pérdida parcial de la función del gen CSB3. Una mutación de pérdida total

en la función del gen CSB3 resulta en letalidad debido a que, según la

descripción de Xiao et al. (2012), CSB3 interviene en la síntesis de

isoprenoides, moléculas estas de cardinal importancia para el desarrollo y

crecimiento de las plantas. CSB3 es un gen de copia única y codifica la enzima

1-hidroxi-2-metil-2-butenil 4-difosfato [HMBPP] sintasa (HDS) de localización

cloroplástica (Fig. 6). Esta enzima cataliza la formación de HMBPP a partir de

2-C-metil-Deritritol 2,4-ciclodifosfato (ME-CPP) y además controla una de las

etapas finales de la síntesis de isopentenil difosfato (IPP) y su isómero

dimetilalil difosfato (DMAPP) a través de la ruta de síntesis de isoprenoides

independiente de mevalonato o ruta llamada MEP (nombre derivado del 2-C-

metil-D-eritritol-4-fosfato) y que se encuentra en el cloroplasto. Tanto la ruta

MEP como la ruta citosólica dependiente de mevalonato (MVA) sintetizan los

precursores de los isoprenoides (Xiao et al., 2012).

16

Figura 6: Ruta de MEP para la biosíntesis de isoprenoides. Fuente: Xiao et al., 2012.

1.2.3 scs5, un mutante supresor de la mutación csb3

La identificación de genes que participan en la ruta de señalización y

resistencia a patógenos biotrofos en la que participa el gen CSB3 es una

estrategia utilizada para comprender el por qué este gen es un regulador

negativo de la resistencia de las plantas. Para llevar a cabo esto, se necesita

identificar mutantes supresores del fenotipo determinado por la mutación csb3.

Para este paso, se mutagenizaron semillas csb3 con EMS siguiendo el mismo

procedimiento realizado para la obtención de los mutantes csb3. Para la

identificación de los mutantes se tuvieron en cuenta dos criterios principales:

reversión del fenotipo característico del mutante csb3 (planta enana con hojas

aserradas) y la supresión de la expresión constitutiva del transgen P69C::GUS.

Tras aplicar el primer criterio de selección se identificaron 35 individuos, a los

cuales posteriormente se les aplicó la prueba histoquímica GUS para

determinar la supresión de la expresión del gen marcador GUS. Gracias a este

ensayo, se descartaron 23 individuos que finalmente resultaron en 11 mutantes

con comportamiento estable tras analizar en M3 y M4. A estos mutantes se les

llamó scs (suppressor of csb3).

17

Dependiendo de la respuesta fenotípica de los supresores scs a Pst. DC3000

se establecieron tres categorías de mutantes scs: mutantes scs que se

comportan como la línea parental csb3 manteniendo la misma respuesta frente

a Pst. DC3000; mutantes scs que revierten la resistencia de csb3 a niveles

comparables a los detectados para plantas silvestres (wt); y mutantes scs que

muestran hipersusceptibilidad a la bacteria (Gil & Vera, 2009). Uno de los

mutantes scs, en los que se basará nuestro trabajo es csb3scs5.

La finalidad de este trabajo consiste en caracterizar al mutante scs5 y

determinar la función reguladora del gen SCS5 en base a la respuesta del

mutante de este gen frente a Pst. DC3000 y la realización de un mapeo

genético grosero para sentar las bases de su futura clonación.

18

2 OBJETIVOS

Las plantas han desarrollado sistemas de defensa complejos con el objetivo de

interactuar y superar el ataque de diversos patógenos. Estos sistemas de

defensa son altamente sofisticados y van dirigidos a reconocer y activar

respuestas frente a las diferentes estrategias de infección. Con las ventajas

que proporciona trabajar con Arabidopsis thaliana, se puede elucidar y

entender de una manera más rápida y sencilla cómo funciona la interacción

planta-patógeno y la compleja regulación que ocurre dentro de las plantas con

el fin de sobrevivir a diferentes tipos de estrés.

Un ejemplo de este tipo de investigaciones relacionada con la interacción

planta-patógeno, lo constituye el estudio de la función de CSB3, el cual posee

un papel de regulación negativa importante en el mecanismo de defensa frente

a patógeno biotrofos mediante la vía de señalización dependiente del SA. Por

lo tanto, en trabajos anteriores en nuestro laboratorio se ha desarrollado una

colección de mutantes con alteraciones en la susceptibilidad y resistencia al

patógeno Pseudomonas syringae DC3000. De estos mutantes, se estudiará

uno en particular. Por ello, para dicha investigación se han planteado los

siguientes objetivos:

- Caracterización del mutante scs5, mutante supresor de la mutación

csb3, en la defensa frente a Pst. DC3000.

- Establecer un rango de la localización de la mutación scs5 mediante

mapeo posicional.

19

3 MATERIAL Y MÉTODOS

3.1 Material vegetal y condiciones de crecimiento.

Arabidopsis thaliana ha sido considerada mundialmente como un organismo

modelo (Pieterse et al., 2009), debido a su corto ciclo de reproducción, tamaño

pequeño, alta producción de semillas viables y por su genoma que además de

ser pequeño se encuentra secuenciado y disponible en bases de datos de

acceso libre (De Vos, 2006). Arabidopsis, como el resto de la plantas, se

encuentra afectada por varios tipos de estreses tanto bióticos como abióticos.

Por lo tanto, la utilización de esta planta en nuestra investigación, será una

base para entender los mecanismos de desarrollo y los procesos moleculares

que están implicados en la defensa. De esta forma, la información obtenida

partir de esta investigación se podrá aplicar para futuros planes de

fitomejoramiento de otras especies vegetales de importancia agronómica y

comercial, garantizando producciones de alta calidad a bajos costos.

Para la caracterización y mapeo de las plantas csb3scs5, mutante objeto de

estudio en este trabajo, se emplearon como controles las plantas silvestres

(WT) de Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), del ecotipo Columbia-0 (Col-0) y

Landsberg erecta (Ler). También se utilizó la línea mutante csb3, la cual

proviene de una mutación de semillas de la línea transgénica P69C::GUS.

Esta línea contiene una construcción génica formada por el promotor P69C,

cuyo gen codifica una subtilisina inducible por Pseudomonas syringae

perteneciente a la familia de las P69 de tomate, y el gen reportero GUS. La

utilización de dicha línea para este estudio se basaba en resultados previos

obtenidos en nuestro laboratorio que revelaban una singularidad en el patrón

de expresión de dicho gen tras la infección patogénica en plantas de

Arabidopsis thaliana (Jordá y Vera, 2000), como se ha mencionado en la

introducción. Gracias al trabajo de María José Gil (2005) y de otros

colaboradores del laboratorio se caracterizó tanto física como molecularmente

a csb3. Las plantas csb3 de forma constitutiva y sin la existencia de ningún

estímulo externo, tienen activada la expresión del gen GUS dirigida por el

promotor de P69C. Además, estas plantas se caracterizan por exhibir una

elevada resistencia frente a patógenos biotrofos como P. syringae y H.

parasitica, mientras que, la susceptibilidad frente a patógenos necrotrofos

permanece inalterada.

La línea transgénica de A. thaliana que se pretende caracterizar en este trabajo

es el doble mutante csb3scs5, el cual proviene de un conjunto de 11 mutantes

denominados scs (suppressor of csb3) a partir de semillas csb3. Esta

mutagénesis se realizó con la finalidad de encontrar un supresor del fenotipo

conferido por csb3 que permita identificar genes que participen en la resistencia

20

a patógenos biotrofos mediado por el gen CSB3. Por lo tanto, la relación que

puede tener uno de estos mutantes, debido a su procedencia, con los

mecanismos de resistencia o susceptibilidad de las plantas es lo

suficientemente evidente como para poner de manifiesto la importancia del

objeto de este estudio.

Las semillas de Col-0, Ler, csb3, csb3scs9 y csb3scs5 se obtuvieron de líneas

ya establecidas en el laboratorio. Estas semillas fueron sembradas en macetas

de 12 cm de diámetro con Jiffy-7 (Clause-Tesier Ibérica) de 44 cm de

diámetro. Las semillas fueron sembradas, después de seguir un procedimiento

de estratificación de 3 a 5 días a 4 °C en oscuridad y en humedad con la

finalidad de romper la dormancia de las semillas. Se sembró en macetas

individuales para facilitar el análisis y recogida de material de los ensayos de

susceptibilidad, prueba histoquímica GUS, selección de recombinantes para el

mapeo grosero y recogida de semilla.

Cada bandeja de macetas sembradas se mantuvo cubierta con film

transparente durante 4-5 días para mantener la humedad necesaria para la

germinación y aparición de los cotiledones. Éste se fue retirando gradualmente

durante 4-5 días más para evitar una condensación excesiva de agua y

favorecer la aclimatación. El aporte nutricional se realizó con el riego de las

plantas con una solución nutritiva dos veces por semana. Las plantas

permanecieron de 4 a 5 semanas en cámaras de cultivo, para los ensayos

realizados en este trabajo. Estos fitotrones proporcionan el ambiente adecuado

para este óptimo desarrollo de las plantas en condiciones de 23-25°C con un

fotoperíodo de 8 horas de luz y 16 horas de oscuridad (día corto), intensidad

lumínica de 200 µE m2 seg -1 y humedad relativa del 60%.

Otra parte de la población de plantas obtenidas fue destinada para disponer de

un stock de semillas adecuado. Por tal motivo, las plantas se pasaron a

cámaras de cultivo con día largo para favorecer la floración y maduración de

las plantas. Una vez las silicuas maduraron, las plantas fueron embolsadas y

una vez secas, se limpiaron con coladores de malla fina hasta obtener semillas

libres de impurezas y eliminar los desechos del material vegetal. Las semillas

fueron almacenadas en tubos de microcentrífuga con gel de sílice naranja (T3Q

química) para mantener condiciones adecuadas de ambiente seco que no

perjudique la germinación de las mismas.

21

3.2 Detección de la actividad de la β-D-glucuronidasa

Dentro de las características de reversión del fenotipo de csb3 por parte de los

supresores es que reviertan la expresión constitutiva del gen GUS. Por lo tanto

se comprobó este hecho con la detección de la actividad del gen GUS en las

plantas de csb3scs5. La prueba histoquímica β-D-glucuronidasa (GUS) es un

sistema que permite evaluar los diferentes niveles de expresión de un

determinado gen tras analizar la actividad del gen GUS bajo el control del

promotor del gen de estudio en plantas transgénicas con dicha construcción. La

proteína GUS es una enzima cuya función es catalizar el β-glucorónido, un

producto disponible comercialmente en forma de sustrato. El más utilizado para

esta tinción histoquímica es el X-Gluc y es el que se utilizó en estos ensayos

(5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-glucurónido sodio sal; Duchefa Biochemie B.V.;

disuelto previamente en DMSO). Tras la catálisis de este sustrato por parte de

la enzima, se produce un precipitado azul en el sitio en el que se presenta la

actividad enzimática, lo que permite detectar in situ el punto donde se expresa

la enzima GUS y por tanto el gen de estudio (Jefferson et al., 1987). Para

realizar este ensayo, se seleccionaron 3-4 hojas de cada planta Col-0, csb3,

csb3csc5 y csb3scs9 y se infiltraron en tubos de cultivo con la solución de

tinción (Tabla 1), la cual cubría completamente todas las hojas. Para conseguir

una entrada adecuada del compuesto X-Gluc en todos los tejidos de las hojas,

la infiltración se realizó con vacío durante 20 min, el cual se fue rompiendo con

intervalos de 1 minuto aproximadamente. Posteriormente, las hojas infiltradas

con la solución se incubaron a 37°C en oscuridad durante 24 horas para

terminar de mejorar la entrada del sustrato. Finalmente, el revelado de la

tinción se realizó con varios lavados con etanol al 70% (v/v) y observado a las

24 horas.

Tabla 1. Solución de tinción para medir la actividad GUS.

COMPONENTE CONCENTRACIÓN

Tampón fosfato p H 7.2 100 mM

K3Fe(Cn)6 0.5 mM

K4Fe(Cn)6 0.5 mM

EDTA 10 mM

Tritón X-100 0.1% (v/v)

Metanol 0.1% (v/v)

x-Gluc 1 mM

3.3 Análisis de susceptibilidad/resistencia.

Dentro de la caracterización del mutante csb3scs5 y por su relación con el

sistema de defensa de las plantas (mencionado en la introducción) es

importante estudiar la respuesta de este mutante a determinados fitopatógenos

biotrofos. Por ellos, se analizó la respuesta de csb3scs5, supresor de la

22

mutación csb3, frente a la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000

(Pst. DC3000) que nos permitirá tener una idea del comportamiento del gen

SCS5 en el mecanismo defensivo contra agentes biotrofos.

3.3.1 Inoculación por spray de las plantas con la bacteria fitopatógena

Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst. DC3000).

El inóculo utilizado proviene de un glicerinado de Pseudomonas syringae pv.

tomato DC3000 (Pst. DC3000) almacenado a -80°C. Este inóculo fue

sembrado en placas de 14 cm de diámetro de King’s B (KB: extracto de carne,

glicerol, 10mL de una solución al 10% de K2HPO4 y 10mL de 10% de MgSO4),

en presencia del antibiótico rifampicina (0.5µl/mL), con ayuda de un asa de

siembra para cubrir todo el área de la placa. Después, ésta fue incubada a

temperatura ambiente durante 48 horas. El manto de colonias crecido en estas

placas fue diluido en una solución de 35mL de sulfato de magnesio (MgSO4) a

10 mM. Posteriormente se midió la Densidad Óptica (DO) de la solución en un

espectofotómetro Eppendorf Biophotometer y se hizo la dilución necesaria para

alcanzar una DO final de 0.1 en 500mL de MgSO4 con 0.02% (v/v) de Silwet.

Una vez preparado el inóculo las plantas fueron inoculadas por spray siguiendo

el método de Kim et al. (2005) en plantas de 4-5 semanas. Las plantas ya

inoculadas permanecieron tapadas con film transparente durante 4-5 horas

para crear el ambiente de humedad y temperatura necesario para garantizar la

entrada del patógeno a la planta.

3.3.2 Curva de crecimiento bacteriano de Pseudomonas syringae pv.

tomato DC3000 (Pst. DC3000) en plantas mutantes csb3scs5

La curva de crecimiento bacteriano fue realizada a los 3 y 5 días post

inoculación. Para ello se usó el extracto crudo por planta de 4 discos de hojas

de 7-9 mm de diámetro, obtenidos con la ayuda de un sacabocados, inmersos

en 600µL de MgSO4 (10 mM). Para cada día de curva se analizaron un total de

12 plantas por genotipo. Una vez los discos fueron triturados en el tampón para

extraer la bacteria, se prosiguió a hacer 6 diluciones seriadas 1:5 en placas de

96 pocillos a partir del extracto crudo inicial. Con ayuda de un replicador, se

cultivaron 5µL de estas diluciones, así como del extracto inicial en placas KB

suplementadas con rifampicina durante 24 horas a temperatura ambiente en

oscuridad. Para el análisis comparativo de la sintomatología se observó cómo

el proceso de infección se desarrolla a los 3 y 5 días después de ser inoculadas

las plantas con la bacteria. Para el estudio del crecimiento bacteriano en la

planta, se analizó el número de unidades formadoras de colonias (ufc)

presentes en el extracto inicial, tomando en cuenta para ello la dilución de

conteo de las ufc, el número de discos utilizados y el número de colonias

contadas. Finalmente, las ufc obtenidas a partir de este cálculo se relacionan a

23

la superficie de hoja que se utilizó, reflejando la media y la desviación estándar

del log de u.f.c/cm2 (unidades formadoras de colonias/cm2). Para la parte

estadística, primero se analizó la existencia de valores aberrantes que se

alejan de una distribución normal. Y finalmente, se realizó una ANOVA estudiar

las diferencias -significativas entre las muestras de los diferentes genotipos

Col-0, csb3, csb3scs5 y csb3scs9.

3.4 Mapeo genético de la mutación scs5

Arabidopsis es una especie modelo para el desarrollo de mapas genéticos

primero porque tiene un tiempo generacional muy corto y produce gran

cantidad de semillas viables, lo que permite tener grandes poblaciones F1, F2 o

F3 y segundo porque existe una cantidad enorme de líneas genéticamente

definidas, además de miles de mutaciones y un gran número de

reordenaciones cromosómicas, información disponibles en grandes bases de

datos. Por otra parte, scs5 es un importante regulador de la defensa estudiado

en Arabidopsis por lo tanto aprovechando las ventajas de trabajar con esta

planta se procedió a hacer un mapeo grosero de la mutación.

3.4.1 Generación de una población F2 recombinante

Una vez que se conoce la respuesta fenotípica morfológica que tienen las

plantas mutantes csb3scs5, se prosiguió a realizar el mapeo de la mutación

mediante un mapa de ligamiento (linkage maps) (Kucuktas et al., 2009). Este

mapa es conocido también como mapa meiótico, ya que durante la meiosis, los

loci de diferentes cromosomas se separan al azar en los gametos. Mientras

que, los loci que están en un mismo cromosoma tienden a cosegregar, al

menos que se produzcan eventos de recombinación que rompan esta

asociación procedente del parental y hayan entrecruzamientos (crossing-over)

entre diferentes partes de los cromosomas (Azofeifa-Delgado, 2006). De esta

forma, la ligación entre dos loci se mide por su frecuencia de recombinación. Por

tanto, se dice que están ligados cuando ésta es menor del 50%. Si esta frecuencia

es de 0, el ligamiento es completo. Teniendo en cuenta la frecuencia de

recombinación entre genes se puede determinar la distancia aproximada que

separa a esos genes en los cromosomas y generar mapas de ligamiento.

Aplicando esta misma premisa para la distancia entre un gen y un marcador

polimórfico de posición conocida en el genoma, se podría determinar con este tipo

de mapeo un posible rango de localización de la mutación scs5. Por lo tanto, para

desarrollar este mapeo hace falta en primer lugar realizar el cruzamiento entre

plantas csb3scs5 con un ecotipo diferente al parental (Col-0). En este caso fue

utilizado el ecotipo Landsberg erecta (Ler) para asegurar plantas con regiones

con alelos de diferente fondo con respecto al parental y determinar las regiones

en las que se habían producido eventos de recombinación. Resultante de la

24

autofecundación de la F1 de este cruce, se obtuvo una población F2. De ésta,

se sembraron 200 plantas, de las cuales fueron seleccionados un conjunto de

recombinantes, en base a seguir mostrando el fenotipo característico de la

mutación scs5.

3.4.2 Extracción de ADN genómico

El ADN genómico de los parentales utilizados (Col-0 y Ler) y de las plantas

recombinantes seleccionadas fue extraído por el método de Rogers y Bendich

(1988), basado en una rápida lisis celular con un tampón de extracción (Tabla

2) (compuesto principalmente por sales y detergente primordial SDS), una

posterior precipitación del ADN mediante isopropanol y la disolución final en

agua.

Tabla 2. Componentes del tampón de extracción de ADN genómico

COMPONENTE CONCENTRACIÓN

Tris HCl, pH 7,8 1M

EDTA 0,5M

SDS 20%

NaCl 5M

Por último, se cuantificó la concentración de ADN extraído mediante un equipo

Nanodrop ND-100.

3.4.3 Selección de marcadores moleculares para el mapeo

Para proceder a mapear genéticamente y obtener una aproximación inicial de

localización cromosómica en el que se encuentra la mutación csb3scs5 primero

se seleccionar los marcadores moleculares a usar. De acuerdo a la naturaleza

del marcador se pueden clasificar en marcadores de proteínas o de ADN. Los

marcadores proteicos determinan variaciones en las cargas eléctricas de

algunas proteínas que comporten el mismo sustrato. Mientras que los

marcadores de ADN son secuencias no codificantes y por lo tanto muy

variables, usados para la construcción de mapas de ligamiento. Existen varias

técnicas para identificar marcadores de ADN, como es por PCR. Dentro de la

categoría que emplea PCR están los microsatélites de tipo SSLPs (“Single

Sequence Length Polymorphism”) que es el tipo de marcador que usamos en

este trabajo. Este tipo de marcadores son polimorfismos de ADN se basan en

tener diferente número de repeticiones en tándem de dos o más nucleótidos

que en general son (CA)n y (GA)n. Los marcadores moleculares utilizados

(Tabla 3) para analizar en los recombinantes escogidos fueron seleccionados a

partir de una base de datos disponibles en el INRA (Institut National de la

25

Recherche Agronomique, París, Francia) según la posición que tienen el

genoma (para que sean equidistantes dentro de cada cromosoma) y en base

también a trabajos previos realizados en el laboratorio. Finalmente, se

seleccionaron 25 marcadores en total (5 marcadores por cromosoma) con la

finalidad de abarcar toda la longitud del mismo y se analizaron para todos los

recombinantes seleccionados. Para acotar más la posible región donde se

encontraba la mutación, se analizaron sobre los recombinantes 3 marcadores

más, cercanos a esa zona determinada.

Tabla 3. Marcadores polimórficos SSLPs utilizados para el mapeo genético de la mutación scs5

CROMOSOMA

MARCADOR

POSICIÓN

PATRÓN DE

SECUENCIA Col-0 Ler DIFERENCIA

DE PB

OLIGO DIRECTO

OLIGO REVERSO

1

F21B7 923923 TAC 205 195 10 CACGATATGATCAAGCTTTAACG TGACTACATGGAGATTATGGCC

F21M12 3212189 GAAA 201 150 51 GGCTTTCTCGAAATCTGTCC TTACTTTTTGCCTCTTGTCATTG

ATHS0392 10860075 AAG 142 156 14 TTTGGAGTTAGACACGGATCTG GTTGATCGCAGCTTGATAAGC

CIW1 18363881 TA 159 135 16 ACATTTTCTCAATCCTTACTC GAGAGCTTCTTTATTTGTGAT

ATHATPASE 28533837 AG 85 69 10 GTTCACAGAGAGACTCATAAACCA CTGGGAACGGTTCGATTCGAGC

2

MSAT2.26 1945453 AT 353 300 53 TCTCCGATTGAGCCCCAAAG CGGGGAAAGATGGGTTTTGA

MSAT2.18 2799644 AT 205 180 25 TAGTCTCTTTTGGTGCGCATA AGCCTCTCCAAGCTTAGGTCT

MSAT2.36 8685521 AG 158 200 42 GATCTGCCTCTTGATCAGC CCAAGAACTCAAAACCGTT

NGA361 13222414 GA 114 130 16 ACATATCAATATATTAAAGTAGC AAAGAGATGAGAATTTGGAC

MSAT2.22 19632943 AT 248 230 18 CGATCCAATCGGTCTCTCT TGGTAACATCCCGAACTTC

3

NGA172 786296 AG 166 140 26 CATCCGAATGCCATTGTTC AGCTGCTTCCTTATAGCGTCC

NT204 5570076 TA 150 130 20 TGGAAGCTCTAGAAACGATCG ACCACCTAAACCGAGAATTGG

MSAT3.32 11208231 AT 173 150 23 GCACTTGCAGCTTAACTT CGTGACTGTCAAACCG

F24M12-TGF 19057377 TA 151 140 11 GTTCTCTGCATTCCACACATACTCT CTTGGGTATTCTGAAGAGCATAAAT

NGA6 23031050 GA 143 123 20 ATGGAGAAGCTTACACTGATC TGGATTTCTTCCTCTCTTCAC

4

MSAT4.39 89498 AT 161 135 26 GTTATCACATTAAAATCACC CCAATTGTAATATATGAACA

MSAT4.8 407010 AG 202 190 12 GTTGGGTTTAGTTGGTAACA CGGGTAAAGACAGAGCAT

NGA8 5628813 AG 157 200 43 TGGCTTTCGTTTATAAACATCC GAGGGCAAATCTTTATTTCGG

MSAT4.15 9362588 AG 174 150 24 TTTCTTGTCTTTCCCCTGAA GACGAAGAAGGAGACGAAAA

MSAT4.31 18573159 AG 238 160 78 AGGGATATGGATTGAGA GCCGTATAACTATTGGTT

CROMOSOMA

MARCADOR

POSICIÓN

PATRÓN DE

SECUENCIA Col-0 Ler DIFERENCIA

DE PB

OLIGO DIRECTO

OLIGO REVERSO

5

CTR1.2 979764 CT 159 143 16 CCACTTGTTTCTCTCTCTAG TATCAACAGAAACGCACCGAG

MED24D 1002257 T 302 287 11 GGGGGACCTTTTTCTTGATTACC GCAGAGTCTCACTCTCATCTCC

NGA249 2270216 AG 125 115

10 TACCGTCAATTTCATCGCC GGATCCCTAACTGTAAAATCCC

NGA106 5397351 GA 157 123

34 GTTATGGAGTTTCTAGGGCACG TGCCCCATTTTGTTCTTCTC

MSAT5.14 7498509 AT 221 210 11 AACAACCCTATCTTCTTCTG TGTGACCCCTTACTCAATA

MSAT5.25 13722916 At 162 180 18 GCTTAATTTGGGTTAAAT GCACGCAAGTGACT

CIW9 17044001 TA 165 145 20 CAGACGTATCAAATGACAAATG GACTACTGCTCAAACTATTCGG

MSAT5.19 25924795 AT 208 190 18 AACGCATTTGCTGTTTCCCA ATGGTTATCTCATCTGGTCT

28

3.4.4 PCR

Continuando con el proceso de mapeo, se realizaron PCRs para determinar la

longitud de cada marcador SSLPs y evaluar la región perteneciente a los

recombinantes homocigotos de Col-0 y/o de Ler. Las reacciones de PCR

fueron realizadas en un volumen final de 20µL donde se añadían los

componentes necesarios como son: el par de oligos (directo y reverso) con una

concentración cada uno de 0,4µM para flanquear la región que será

amplificada, tampón 1x para mantener el pH y permitir el normal

funcionamiento de la Taq polimerasa, 100ng/µL del ADN de la muestra

aproximadamente, 0,2mM de un mix de nucleótidos libres y 1unidad/µL de Taq

polimerasa. El programa utilizado para cada PCR (Tabla 4) fue optimizado para

cada marcador, teniendo en cuenta la temperatura media de fusión del par de

oligos utilizado (Tabla 5). adecuada que permite la unión de los oligos a las

cadenas de ADN. Además se optimizó el número de ciclos de la PCR, con la

finalidad de saturar más el ADN amplificado y tener bandas definidas en la

electroforesis. El programa de PCR a excepción de estos dos parámetros

siguió con los siguientes ciclos:

Tabla 4. Programa de PCR

FASE TEMPERATURA TIEMPO

Inicio 95°C 5 min

Desnaturalización 95°C 30 seg

Alineamiento 45-60°C 20 seg

Extensión 72°C 30 seg

Enlongación 72°C 10 min

Con el objetivo de resuspender el producto de PCR y poderlo visualizar se

realizó una electroforesis en gel de agarosa

3.4.5 Electroforesis en gel de agarosa

Después de la realización de la electroforesis para separar los productos de la

PCR en base a la diferencia de tamaño de los polimorfismos determinados por

la longitud de los marcadores determinado para las regiones con alelos

diferentes al parental (Ler) o regiones de recombinación (Col-0). La

concentración de agarosa en el gel se estableció entre 2 y 4% para tener

mayor o menor resolución dependiendo de la diferencia de pares de bases en

la longitud de los microsatélites analizados entre los dos diferentes fondos

genéticos (Col-0 y Ler) (Tabla 5). Las plantas csb3scs5 son de fondo Col-0, el

29

cual, corresponde a uno de los controles utilizados. Las muestras fueron

cargadas en el gel, con un volumen de 15 µL aproximadamente, así como se

utilizaron 6 µL del marcador de 100 pares de bases para poder diferenciar el

tamaño del producto de la PCR en base a los datos teóricos dados por los

marcadores SSLPs para cada ecotipo. Para la electroforesis se aplicó una

corriente de 80 voltios durante una hora aproximadamente para permitir la

correcta diferenciación de las bandas y, comparando con las de los controles,

determinar si los recombinantes eran homocigotos (ya sea Col-0 o Ler) o

heterocigotos para cada marcador. Para la detección de bandas en el gel de

agarosa, se utilizó bromuro de etidio al 6% y el revelado se realizó en un

transiluminador tras exposición con luz UV.

Tabla 5. Programa de PCR y electroforesis para el mapeo de la mutación scs5

CROMOSOMA MARCADOR CAMBIOS EN LAS CONDICIONES DE

PCR % GEL DE AGAROSA

F21B7 Tm 55'' 40ciclos 4

F21M12 Tm 60'' 40ciclos 2

1 ATHS0392 Tm 55'' 40ciclos 4

CIW1 Tm 50'' 40ciclos 4

ATHATPASE Tm 55'' 40ciclos 4

MSAT2.26 Tm 55'' 40ciclos 2


2 MSAT2.36 Tm 55'' 40ciclos 2

NGA361 Tm 60'' 40ciclos 4



NT204 Tm 55'' 40ciclos 3


F24M12-TGF Tm 60'' 40ciclos 4


4






CTR1.2 Tm 55'' 55ciclos 4

MED24D Tm 55'' 55ciclos 4





CIW9 Tm 55'' 60ciclos 3


30

3.4.6 Determinación de la frecuencia de recombinación

Finalmente, para cada marcador analizado, se cuantificó el número de plantas

recombinantes que eran homocigotos Col-0 (C), homocigotos Ler (L) o

heterocigotos (H). Con el número total de eventos de recombinación

producidos (determinado por la presencia de L y H y el total de recombinantes

analizados (T) se obtiene el porcentaje de recombinación dado por la siguiente

fórmula:

% 𝑑𝑒 𝑅𝑒𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = (𝐿 + 𝐻

𝑇) ∗ 100

Con el cálculo de este porcentaje de recombinación, se podrá determinar la

distancia entre el marcador analizado y la mutación. De forma, que cuanto

menor sea este porcentaje, menor es la distancia entre ambos ya que ya que la

probabilidad de recombinación es menor. Así, como se ha explicado en el

apartado anterior (3.4.1) por el mapeo por ligamiento, se podrá establecer una

región posible donde se encuentra la mutación.

31

4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En los últimos años, y más en el ámbito de la investigación básica, se ha

generado un notable interés en la comprensión de los mecanismos moleculares

implicados en las rutas de señalización que controlan la activación de los

sistemas de respuestas defensivas de las plantas frente al ataque de los

patógenos. Todo ello, con el fin de conocer en profundidad los procesos de la

inmunidad vegetal y de esta forma mejorar la capacidad de las plantas para

defenderse de este tipo de estrés biótico (Glazebrook, 2001). Una de las

formas de abordar este problema es utilizar Arabidopis thaliana ya que, como

sistema modelo, facilitará la realización de estos estudios por las ventajas que

conlleva el uso de la misma. De esta forma, podremos identificar nuevos genes

implicados en las rutas de señalización que regulan el sistema de defensa de

las plantas.

Dentro de este contexto, se trabajó en nuestro laboratorio con el mutante csb3,

alterado en la expresión del gen P69C. Las plantas csb3 muestran expresión

constitutiva del transgen P69C::GUS, y tienen la capacidad de conferir

resistencia frente a la bacteria fitopatógena Pseudomonas syringae DC3000.

Además, estas plantas tienen un marcador morfológico (son plantas enanas

con hojas aserradas) (Fig. 6), que facilita su reconocimiento y utilización en

posteriores estudios (Jordá y Vera, 2000). Por lo tanto, una forma de

profundizar e identificar los genes que participan en la ruta de señalización

mediada por el gen CSB3 y el mecanismo de acción frente a agentes

biotróficos, es a través de la identificación de mutantes supresores del fenotipo

dado por la mutación csb3.

Tras llevar a cabo esta estrategia genética de identificación de supresores de

un fenotipo mutante, se identificaron los mutantes scs (suppressor of csb3).

Estos mutantes revierten la morfología y la resistencia asociada a la mutación

csb3 a niveles de plantas silvestres. Dentro de este conjunto, se escogió para

este trabajo el mutante csb3scs5, con el fin de caracterizarlo y establecer una

localización aproximada del locus responsable de dicha mutación. Estos

estudios permitirán entonces conocer más acerca de los mecanismos

implicados en la defensa de las plantas frente a patógenos biotrofos.

Existen varios trabajos que han seguido esta misma estrategia de búsqueda y

estudio de supresores de un fenotipo. Un ejemplo es la identificación de genes

que intervienen en la señalización de NPR1. Este gen es un co-regulador

transcripcional importante para la activación de los genes dependientes de SA

y por lo tanto relacionado con la defensa frente a agentes biotrofos (Wu, et al.,

2012). Tras estos estudios se identificó el mutante ssi2, supresor de npr1,

afectado en la señalización de la ruta de defensa dependiente a NPR1 (Shah et

32

al., 2001). Con la finalidad entender mejor este mecanismo, se buscaron

supresores de este supresor. Así se identificó el mutante sfd que suprime el

fenotipo de ssi2 (enanismo), la expresión de NPR1 y la resistencia a

Pseudomonas syringae. Gracias a este abordaje genético que permitió

identificar al mutante sfd2, (el gen SFD codifica enzimas involucradas en la

biosíntesis de lípidos), se demostró que los lípidos son mediadores importantes

en la activación de SAR, además de tener importancia en procesos de

desarrollo y crecimiento en Arabiodpsis (Nandi et al., 2003). Estos trabajos

demuestran las ventajas que conlleva desarrollar este tipo de abordajes y

además, generan gran cantidad de información relevante acerca del

funcionamiento de los mecanismos de defensa.

4.1 Caracterización fenotípica de mutantes scs

De la identificación de los mutantes scs, que se llevó a cabo en trabajos previos

de este laboratorio, en base a los dos criterios mencionados: reversión del

fenotipo morfológico y la supresión de la expresión constitutiva del transgen

P69C::GUS características de csb3. En este trabajo se utilizaron 7 de ellos

para realizar una previa caracterización fenotípica, siendo éstos los mutantes

csb3scs2, csb3scs5, csb3scs6, csb3scs7, csb3scs9, csb3scs11 y csb3scs12.

Estos mutantes fueron los de mayor relevancia debido a sus características

morfológicas y diferentes grados de susceptibilidad frente a Pst. DC3000. En

esa caracterización morfológica de los mutantes (Fig. 7) se observó que los

mutantes scs revierten el fenotipo de csb3 en relación a tamaño y forma de las

hojas en diferentes grados. Por ejemplo los mutantes csb3scs2, csb3sc7,

csb3scs11 y csb3scs12 se asemejan más a plantas Col-0. Estos mutantes

antes mencionados tienen las hojas de mayor tamaño y además no son

aserradas como csb3. Los mutantes csb3scs5 y csb3scs9 además de revertir

el fenotipo característico de csb3 tienen otros aspectos adicionales asociados,

tal y como puede ser el presentar una clorosis tenue en el centro de la roseta

de la planta.

33

Figura 7. Caracterización de 7 mutantes scs, supresores del mutante csb3.

Continuando con la caracterización de estos mutantes, se analizó la respuesta

de las plantas frente a la infección con la bacteria compatible Pst. DC3000.

Para ello, se inocularon por spray los mutantes scs, plantas silvestres (Col-0) y

el mutante csb3 (ambos como controles de infección y resistencia,

respectivamente). Finalmente, en estos ensayos, se observó la sintomatología

de las plantas a los 3, 5 y 7 días post inoculación (Fig. 8). Como es sabido, los

síntomas característicos de la infección con Pst. DC3000 en las hojas de

Arabidopsis corresponden a manchas cloróticas de pequeño tamaño que

pueden observarse a los dos o tres días después de la infección. Las lesiones

se expanden y a menudo éstas áreas se necrosan y adquieren un color

castaño claro a blanco en una semana (Cao et al., 1997 y Katagiria et al.,

2002).

Según la sintomatología observada, los mutantes scs se pudieron dividir en dos

categorías. La primera categoría englobaba a los mutantes csb3scs2,

csb3scs6, csb3scs7, csb3scs11 y csb3scs12 que corresponde a los mutantes

que adquierieron un nivel similar a plantas silvestres, sin muchos síntomas de

infección. Y en la segunda categoría encontramos los mutantes csb3scs5 y

csb3scs9, que corresponde a aquellos que mostraron una elevada

sintomatología (manchas cloróticas) en las hojas tras la infección (3 y 5 días

después de la infección), la cual aumenta con el tiempo a lo largo de las hojas.

Además, los síntomas de csb3 scs5 y csb3 scs9 son comparables a las plantas

mutantes npr1, eds, pad4. Éstos mutantes se ven afectados en la activación de

34

las respuestas defensivas durante la interacción compatible por lo que

muestran elevada susceptibilidad a la infección P. syringae (Glazebrook, 2001).

En trabajos que se estaban llevando a cabo en este grupo, se había estudiado

ya en el mutante csb3scs9 el nivel de crecimiento de la bacteria tras este tipo

de inoculación y se observó que las plantas eran hipersusceptibles con

respecto a Col-0. Por lo tanto, dada la similitud en la sintomatología con

respecto al mutante csb3scs5, era interesante estudiar el fenotipo que se

obtendría en este mutante, ya que podría también estar relacionado con la

susceptibilidad a Pst DC3000. Además, csb3scs9 podría ser utilizado como un

buen control positivo de susceptibilidad para los ensayos de estudio de

crecimiento de la bacteria.

Figura 8. Sintomatología de los mutantes csb3scs2, csb3scs5, csb3scs6, csb3scs7,

csb3scs9, csb3scs11, csb3scs12, csb3 y en plantas silvestres (Col-0) a los 3, 5 y 7 días

post inoculación (dpi) con Pst. DC3000.

Por lo tanto, como resultado de esta caracterización previa de los mutantes

aquí mostrados, se seleccionó el mutante csb3scs5 para llevar a cabo en este

trabajo su caracterización y mapeo grosero. Debido a las características

mostradas de clorosis y una mayor sintomatología tras la infección con la

bacteria. Todo ello, daba a entender que posiblemente se trataba de una

mutación relacionada con el establecimiento de los sistemas de defensa de la

35

planta. Con lo que se justificaría el interés del estudio presentado en este

trabajo.

4.2 Caracterización fenotípica del mutante csb3scs5

4.2.1. Características morfológicas

Este mutante revirtió el fenotipo morfológico de la mutación csb3 y además

mostró una característica morfológica particular como es la clorosis en la zona

meristemática de la roseta, a diferencia de la mutación scs9 que la desarrolla

por toda la zona foliar (Fig. 9). Esta característica de la mutación scs5 es

bastante singular y única, lo que podrá ser utilizado como un marcador

morfológico y permitirá la identificación de este mutante de una manera sencilla

y rápida en los futuros ensayos. El fenotipo de las plantas dado por la mutación

scs5 se caracterizó, además, en que las hojas eran globulares y con contorno

liso, y no aserrado como ocurre en las plantas csb3. Las plantas csb3scs5

también difirieron de csb3 en el tamaño de la planta, ya que revertía el fenotipo

enano de éste y se asemejaba más a las plantas silvestres (Col-0).

4.2.2 Actividad del transgen P69C::GUS

Además de analizar la supresión del fenotipo morfológico de csb3, se

caracterizó también la capacidad del mutante scs5 para suprimir la expresión

constitutiva del transgen que contiene (debida a la acción de csb3 sobre el

transgen P69C::GUS). Para ello se realizó una tinción histoquímica para

determinar la actividad GUS en hojas de roseta procedentes de plantas

P69C::GUS, csb3, csb3scs9 y csb3scs5 (Fig. 9). Ésta es una forma fácil y

rápida de evaluar los diferentes niveles de expresión de un gen determinado

(Jefferson, et al., 1987). Tras este ensayo se pudo observar que la mutación

scs5 consiguió reprimir la expresión constitutiva del transgen P69C::GUS que

muestra el mutante csb3, con respecto a línea parental. Sin embargo, esta

supresión no fue totalmente nula como sí ocurrió para la mutación scs9. Por lo

tanto, las plantas csb3scs5 fueron capaces de revertir estas dos características

fenotípicas ligadas a la mutación csb3.

36

Figura 9. Características fenotípicas de plantas de 4 semanas de Col-0, csb3, csb3scs9 y

csb3scs5. Panel superior: aspectos morfológicos. Panel inferior: tinción histoquímica de una

hoja representativa de cada fenotipo.

4.2.3 Respuesta a Pst. DC3000

Es importante recordar que además de la reversión de estas características

fenotípicas ligadas a csb3, las plantas csb3scs5 pertenecen al grupo de los scs

que presentaron mayores signos de infección a Pst. DC3000, indicando que

SCS5 es clave para el establecimiento de la resistencia a esta bacteria. Por lo

que se vio necesario comprobar y cuantificar la susceptibilidad de las plantas

csb3scs5 a Pst. DC3000, ya que una de las características más relevantes de

las plantas csb3 es la resistencia a patógenos biotrofos, debido a la mutación

del locus CSB3 (Gil. 2005). En un estudio previo por parte del laboratorio se vio

que plantas csb3 muestran un crecimiento de Pst DC3000 de 30 a 60 veces

menor en comparación con las plantas silvestres (Gil, et al., 2005). Para

corroborar lo anteriormente mencionado se analizó la curva de crecimiento

bacteriano en plantas de csb3 de 5 semanas inoculadas por spray con Pst.

DC3000 con una OD de 0.1. Como resultado se obtuvo que el crecimiento

bacteriano es aproximadamente 10 veces menor que las plantas silvestres

como se observa en la Fig. 10, confirmando así lo esperado y demostrando una

vez más la resistencia incrementada de las plantas csb3 a Pst. DC3000.

El resultado de la curva de crecimiento bacteriano realizada a los 3 y 5 días

después de la infección (dpi) en plantas de la mutación estudiada en este

trabajo, csb3scs5, el crecimiento de la bacteria es 20 veces más en

comparación de las plantas csb3 y 10 veces mayor que en plantas silvestres

(Fig. 10). Está es una manera de cuantificar la sintomatología observada en

estas plantas después de la infección. Ensayos anteriores se habían realizado

en el laboratorio con otro miembro del conjunto de scs (csb3scs9). Al realizar

la curva bacteriana en condiciones similares se observó el carácter de

hipersusceptible de las plantas csb3scs9 a Pst. DC3000. Al comparar los

resultados de susceptibilidad después de analizar la curva bacteriana en

plantas csb3scs5 con las plantas csb3scs9 se observa que estos dos mutantes

37

resultan tener mayor grado de susceptibilidad que las plantas silvestres Sin

embargo, scs5 resulta ser ligeramente menos susceptible que scs9 (Fig. 10).

Aun así, después de hacer el análisis estadístico para comprobar si existe

diferencia significativa, se observó que csb3scs5 y csb3scs9 son

estadísticamente iguales en la respuesta a la bacteria pero difieren de csb3 y

Col-0. Este co s

Figura 10. Curva de crecimiento de Pst. DC3000 en plantas Col-0, csb3, csb3scs9, y

csb3scs5 a los 3 y a los 5 días después de la infección (dpi).

Este comportamiento de infección y de respuesta hipersusceptible se vio en los

mutantes npr1, eth9 eds1 y pad4. Donde se comprobó que los genes EDS y

PAD4 contribuyen en general a la resistencia contra P. syringae y P. parasítica

a través de la dependencia de la ruta de señalización del SA. Mientras que el

gen NPR1 y DTH9 reducen la acumulación de SA durante el ataque del

patógeno. La proteína NPR1 parece ser el traductor de la señal aguas abajo de

SA. El SA es la hormona más importante responsable de generar resistencia a

patógenos biotrofos y activar la resistencia sistémica adquirida (SAR) (Katagiri

et al., 2002).

Estos datos de la curva se evidencian en la Fig. 11 donde se observan los

síntomas y el proceso de la infección a los 3 y 5 días después de la inoculación

con Pst. DC3000 en plantas mutantes csb3, csb3scs5 y csb3scs9 y las plantas

silvestres (Col-0). La sintomatología de la infección bacteriana se observa en la

aparición de manchas cloróticas que se van expandiendo por todas las hojas

con el paso de los días hasta expandirse a toda la planta (Katagiri et al., 2002)

como ocurre en las plantas csb3scs9 donde es más severa la infección al ser

plantas hipersuceptibles. Algo semejante sucede con las plantas csb3scs5

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Katagiri%20F%5Bauth%5D

38

aunque resulta ser ligeramente menos susceptible que csb3scs9 y presentar

menos síntomas. Sin embargo, la mutación scs5 difiere de la mutación scs9 en

que la primera desarrolló la aparición de los síntomas principalmente en los

haces vasculares, mismo lugar donde comenzaba la clorosis característica de

la mutación, mientras que scs9 mostraba la sintomatología más distribuida por

toda la hoja. Como era de esperar, estas dos plantas mutantes, csb3scs9 y

csb3scs5 tienen mayor sintomatología que las plantas csb3 y que las plantas

silvestres.

Figura 11. Estudio comparativo del crecimiento de Pst. DC3000 en las líneas

transgénicas csb3, csb3scs9, y csb3scs5 y en plantas silvestres a los 3 y a los 5 días

después de la infección (dpi) con Pst. DC3000.

4.3 Mapeo genético de la mutación scs5

La investigación en el mundo vegetal utiliza la planta modelo Arabidopsis

thaliana por la serie de ventajas que aporta trabajar con esta planta.

Actualmente es el modelo genético, bioquímico y fisiológico ya que tiene un

ciclo de desarrollo corto, es fácil de manipular por su pequeño tamaño y

sobretodo porque su genoma está totalmente secuenciado desde el año 2000.

Realizar mapas genéticos con Arabidopsis, a diferencia de otras especie,

resulta muy sencillo y prácticamente rápido porque tiene un tiempo

generacional muy corto de 6 a 8 semanas y produce gran cantidad de semillas

39

viables, lo que permite tener grandes poblaciones en poco tiempo. En esta

especie se han desarrollado varias técnicas de mapeo, programas de

informátios y bases de datos completas y disponibles. Además, gracias a la

información que se ha obtenido acerca de esta planta se ha generado una gran

cantidad de líneas genéticamente definidas y un gran número de mutaciones.

Enfocándonos más en nuestro tema de estudio, en Arabidopsis se han descrito

la mayoría de mecanismos de respuesta frente a diferente tipos de estrés como

es el estrés ocasionado por agentes patogénicos (Jones y Takemoto, 2004).

Pero la mayor importancia de trabajar con Arabidopsis es que los resultados

se pueden aplicar en otras especies ya sean de interés comercial o agrícola.

(Glazebrook, et al, 1997).

4.3.1 Generación de una población recombinante

Una vez que se tiene una idea de la respuesta fenotípica por parte de la

mutación scs5 y la relación que tiene ésta en la defensa frente Pst. DC3000 se

prosiguió a realizar el mapeo genético para definir de forma aproximada la

posición cromosómica en la que se encuentra el gen SCS5. Para realizar el

mapeo genético era necesario primeramente obtener la población

recombinante mediante el cruzamiento entre las plantas csb3scs5 x Landsberg

erecta (Ler). Es importante recordar que las plantas csb3scs5 son el producto

de la mutagénesis de plantas csb3 y éstas a su vez son el producto de la

mutagénesis de las plantas transgénicas P69C::GUS generadas a partir de

plantas silvestres Col-0, Por lo tanto, las plantas scs5 tienen fijada la mutación

en el ecotipo Col-0. En este caso se utilizó el ecotipo Landsberg erecta (Ler)

por ser una línea diferente a la línea parental Col-0 y así asegurar que existan

regiones cromosómicas que tengan una combinación de alelos diferente al

parental. De esta manera se obtuvo una población F2 resultante de la

autofecundación de la F1. De la población F2 (200 plantas) fueron

seleccionadas las plantas recombinantes (37 en total) que mostraban el

fenotipo de la mutación scs5. Este número se ajusta a la proporción esperada

de ¼ de plantas con fenotipo mutante (scs5), en una F2 de 200 plantas para

un gen recesivo (Fig. 12). La selección de los recombinantes con fenotipo de la

mutación scs5 se realizó basándonos en las características singulares de estas

plantas. Como se explicó en apartados anteriores, las plantas scs5 tienen una

clorosis en la roseta particular que facilita su identificación.

40

Figura 12. Proceso de selección de plantas recombinantes procedentes de una F2 del

cruce de plantas csb3scs5xLer utilizado para el posterior mapeo de la mutación scs5. A

la izquierda está la representación esquemática del cruzamiento. En la parte derecha está una

imagen de un grupo de plantas F2 donde claramente se diferencia el fenotipo mutante scs5.

4.3.2 Extracción de ADN genómico

El ADN genómico de los ecotipos Col-0 y Ler y de las plantas recombinantes

seleccionadas fue extraído y cuantificado según el protocolo descrito en el

apartado 3.4.2. La concentración de cada muestra se encontró entre 100 a

300ng/µl. Esta concentración fue adecuada para proceder a realizar la PCR.

4.3.3 Análisis de las frecuencias de recombinación

Se analizaron por PCR los 25 marcadores SSLPs seleccionados en un primer

momento (descritos en 3.4.3) para todos los recombinantes identificados en la

población F2. Para asociar la posición de la mutación a alguno de estos

marcadores, se esperaba observar en el gel de agarosa que el mayor número

de recombinantes tuvieran el mismo tamaño de banda correspondiente al del

control Col-0, debido a que las plantas scs5 tienen fijada la mutación en este

ecotipo. Finalmente, tras el análisis de los 25 marcadores (Tabla 6), se observó

que el marcador MED24D del cromosoma 5 cosegrega con el fenotipo scs5,

41

debido al bajo número de eventos de recombinación observados. Este

resultado proviene del análisis de la frecuencia de recombinación donde se

cuantificó el número de recombinantes Col-0 (C), el número de recombinantes

Ler (L) y el número de recombinantes heterocigotos (H). El número total de

recombinantes analizados corresponde al total (T). Para el caso del marcador

MED24D tenemos 34 recombinantes Col-0, 1 recombinante Ler y 2

recombinantes heterocigotos, con un total de 37 individuos analizados (Fig. 13).

Al realizar el cálculo de la frecuencia de recombinación (tal y como se describe

en 3.4.6), se obtuvo que para este marcador era del 8% (Tabla 6). Por lo tanto,

según la posición del marcador MED24D, ésto nos indicaba que la mutación

scs5 estaba alrededor de la posición 1002257pb del cromosoma 5. Dado que el

porcentaje de recombinación se puede corresponder a la distancia entre el

marcador y la mutación. En este caso la mutación está más cerca del marcador

MED24D en el genoma ya que la probabilidad de recombinación es menor.

Figura 13. Gel de agarosa al 4% a partir de un PCR con el marcador molecular MED24D

para el mapeo genético de la mutación scs5

Ler

42

Tabla 6. Análisis de los marcadores SSLPs para el mapeo del mutante

csb3scs5. Número de recombinantes Col-0, Ler y heterocigotos y las

frecuencias de recombinación

CROMOSOMA

MARCADORES MOLECULARES

F21B7 F21M12 ATHS0392 CIW1 ATHATPASE

Col-0 14 8 13 9 7

Ler 8 13 7 16 13

1 HETEROCIGOTOS 15 16 17 12 17

TOTAL 37 37 37 37 37

FRECUENCIA DE

RECOMBINACION 62,16 78,38 64,86 75,68 81,08

MSAT2.26 MSAT2.18 MSAT2.36 NGA361 MSAT2.22

Col-0 10 9 8 11 9

Ler 15 8 9 9 11


TOTAL 37 37 37 37 37

FRECUENCIA DE

RECOMBINACION 72,97 75,68 78,38 70,27 75,67

NGA172 NT204 MSAT3.32 F24M2.TGF NGA6

Col-0 10 3 8 9 4

Ler 10 14 14 9 23


TOTAL 37 37 37 37 37

FRECUENCIA DE

RECOMBINACION 72,97 91,89 78,38 75,68 89,19

MSAT4.39 MSAT4.8 NGA8 MSAT4.15 MSAT4.31

Col-0 8 8 7 7 5

Ler 9 12 10 12 10


TOTAL 37 37 37 37 37

FRECUENCIA DE

RECOMBINACION 78,37 78,38 81,08 81,08 86,48

MED24D MSAT5.14 MSAT5,25 CIW9 MSAT5.19

Col-0 34 24 16 12 13

Ler 1 4 5 14 9


TOTAL 37 37 37 37 37

FRECUENCIA DE

RECOMBINACION 8,11 35,14 56,76 67,57 64,86

43

Con la finalidad de acotar más la localización de la mutación scs5 se

seleccionaron 3 nuevos marcadores SSLPs, que fueron CTR1.2, NGA249 Y

NGA106. Estos marcadores se encuentran en posiciones cercanas a la región

determinada por MED24D.

Tras el análisis realizado (Tabla 7), siguiendo la misma base que para los

anteriores marcadores, se observó que el primer marcador CTR1.2

determinaba un porcentaje de recombinación aproximado del 3%, el más bajo

de los 3 nuevos marcadores.

Tabla 7. Análisis de los nuevos marcadores SSLPs para el mapeo del

mutante csb3scs5. Número de recombinantes Col-0, Ler y heterocigotos y las

frecuencias de recombinación

CROMOSOMA MARCADORES MOLECULARES

5

CTR1.2 NGA249 NGA106

Col-0 29 27 22

Ler 0 0 2

HETEROCIGOTOS 1 3 6

TOTAL 30 30 30

FRECUENCIA DE

RECOMBINACION

3,33 10,00 26,67

Esto nos proporcionaba entonces una región grosera más próxima, que el

marcador MED24D, de la localización de la mutación scs5. Este resultado se

debe a que 29 individuos fueron recombinantes Col-0, ninguno Ler y un

recombinante en heterocigosis (Fig. 14). Por lo tanto, estos datos nos dieron

como resultado el porcentaje más bajo de recombinación y nos indican que el

gen SCS5 probablemente se encuentre más próximo a la posición 979764bp

en el cromosoma 5. Ya que la frecuencia de recombinación es la menor, tanto

el marcador con la mutación están más cerca en el genoma porque la

probabilidad de recombinación es menor cuanto menor distancia hay entre

ellos.

Figura 14. Gel de agarosa al 4% a partir de un PCR con el marcador molecular MED24D

para el mapeo genético de la mutación scs5

44

El mapa físico de los marcadores SSLPs utilizados para el mapeo de la

mutación scs5 queda definido como se indica en la Fig. 15. Este mapa nos

indica la posición relativa del gen SCS5 dado por el marcador CTR1.2 el cual

está a 979764bp en el cromosoma 5 de Arabidopsis.

Para acotar más la posición del locus responsable de la mutación scs5, sería

necesario aumentar la población de recombinantes a analizar en una F2 así

como el número de marcadores analizados en ella.

Figura 15. Mapa físico de los marcadores SSPLs utilizado para el mapeo de la mutación

scs5. A la izquierda de cada cromosoma se indica la posición del marcador en el genoma

(pares de bases) y a la derecha el nombre del marcador correspondiente. El marcador CTR1.2

está más próximo al gen SCS5.

Como discusión general de los resultados obtenidos en este trabajo decir que

la interacción planta patógeno es un tema que cada vez toma más fuerza y ha

generado interés en la comunidad científica, no solo con el objetivo de realizar

investigación y satisfacer la curiosidad científica sino a nivel económico. Al

entender cómo funcionan los mecanismos de defensa de los que disponen las

plantas se podrá mejorar mediantes técnicas biotecnológicas la calidad y la

producción de los cultivos y a su vez a la agricultura. A parte, se disminuirá el

uso de pesticidas y productos químicos en este sector, los cuales no solo

causan daños al medio ambiente sino a la salud de los seres humanos.

Enfocándonos en el ámbito de la investigación, que es el área que nos

corresponde, el entendimiento del complejo conjunto de rutas y mecanismos

que forman parte de la respuesta de defensa resulta un campo todavía incierto.

45

Por lo que resulta de gran interés conocer los genes y las moléculas implicadas

en estos mecanismos que sirvan de pistas para entender el modo de acción de

los mecanismos moleculares implicado en las rutas de señalización que

controla la activación de los sistemas de respuesta de defensa de las plantas.

Arabidopsis, como el resto de plantas se ve afectada por diferentes tipos de

estrés como es el estrés biótico (De Vos et al, 2005). Gracias a las facilidades

que brinda trabajar con esta planta modelo se podrá abordar estrategias

genéticas que nos permitan elucidar de una forma más rápida el

funcionamiento de la interacción planta-patógeno, para posteriormente

extrapolar estos resultados a otras especies.

La aproximación experimental realizada en este trabajo tiene como finalidad

identificar genes implicados en la regulación del gen CSB3 y por consiguiente

en la respuesta de defensa de las plantas. El abordaje genético que se aplicó

para este propósito consistió en el aislamiento de mutantes que reviertan el

fenotipo de plantas csb3 mediante la mutagénesis de semillas de esta línea con

EMS. Las plantas csb3 tienen también un fenotipo peculiar, ya que tienen un

tamaño reducido y sus hojas son aserradas. Este fenotipo refleja un gasto

energético enorme que realiza al mantener activa la ruta de señalización

defensiva mediada por SA frente a patógenos de vida biotrofos como es la

bacteria P. syringae (Gil, 2005).

Los criterios para la selección de los mutante scs se basaron en que debían

revertir el fenotipo morfológico de csb3 y suprimir la expresión constitutiva del

gen reportero GUS. Así es como se identificaron al conjunto de mutantes scs

de los cuales se escogió al mutante csb3scs5 para realizar este trabajo. Tras la

caracterización realizada, las plantas csb3scs5 tenían un marcador morfológico

importante, el mismo que las hace ideales para trabajar en esta clase de

investigaciones, el cual es una clorosis marcada en la zona meristemática de la

roseta, y al revertir el fenotipo de las plantas csb3 se puede observar que las

hojas son de forma oval semejantes a las de las plantas silvestres y que son de

mayor tamaño que las hojas de csb3. Como csb3scs5 es un supresor de csb3

se esperaría que fuera un regulador positivo de la defensa, al contrario de

csb3. Por ello, se cuantificaron los niveles de resistencia o susceptibilidad que

tenía csb3scs5 a la infección con Pst. DC3000. En estos ensayos se demostró

el carácter hipersusceptible de las plantas csb3scs5 y se confirmaron los

síntomas observados en plantas inoculadas a los 3 y 5 días después de ser

inoculadas. En estas plantas se ve como la infección se presentaba en forma

de manchas cloróticas en los haces vasculares que se expanden con el tiempo.

También se observó que la expresión del gen GUS en las plantas csb3scs5

estaba inactivo (Gil, 2005).

Futuros ensayos con este mutante permitirían aclarar de una mejor manera la

forma en la que actúa en los mecanismos de la planta contra agentes biotrofos,

46

ya que por el momento sólo se ha probado la susceptibilidad con la bacteria

Pst. DC3000 por lo que se podría tratar con otras especie como Hyalonospora

parasítica e inclusive se podría probar con patógenos de estilo de vida

necrotrofos como Botrytis cinerea o Alternaria brassicicola y así descartar una

relación con la ruta de señalización del JA. Además sería importante cuantificar

los niveles de SA o del conjugado glucosilado (SAG) ya que tenemos como

premisa que el SA es la hormona señalizadora de la defensa contra patógenos

biotrofos como es Pst. DC3000. Al encontrar alguna relación de la mutación

scs5 con el SA se debería profundizar y evaluar la expresión de genes

relacionados a la señalización de esta hormona como es el gen PR-1.

También, se podría probar ensayos en los que se infecte a las plantas scs5 con

Pst. DC3000 (avrRpm1) o analizar la respuesta a bacteria tras una aplicación

exógena con SA u otros análogos como BTH y determinar la inducción de

genes PR. Finalmente, una vez localizada una región cercana a la mutación

csb3scs5, esto cual servirá como primer paso para realizar un cartografiado y

clonaje posicional del gen SCS5 con la finalidad de definir la posición

cromosómica exacta del locus que define la mutación. Esto nos permitirá

conocer a que gen está relacionado y como está involucrado en la defensa de

las plantas y así entender de una mejor manera los mecanismos sofisticados y

complejos de la interacción planta patógeno.

47

5 CONCLUSIONES

- Se ha caracterizado a la mutación recesiva scs5 como un supresor

del fenotipo de resistencia asociado a la mutación csb3.

- El mutante scs5 parece tener un carácter pleitrópico ya que las

plantas portadoras de la mutación scs5 tienen un marcador

morfológico único el cual se caracteriza por tener clorosis en la zona

meristemática de la roseta, en el comienzo de los haces vasculares,

que será de gran utilidad para la identificación de la mutación en

futuros ensayos.

- Las plantas csb3scs5 se caracterizan por ser hipersusceptibles a la

infección por el patógenos biotrofo Pseudomonas Syringae DC3000

en comparación con plantas silvestres y plantas csb3. Ello demuestra

que esta mutación suprime al fenotipo de resistencia acusada de las

plantas csb3 frente a patógenos (hemi)biotrofos. Por ello, mientras

que CSB3 es un regulador negativo de la resistencia, SCS5

demuestra su papel como regulador positivo de la misma. A través

de la identificación de la mutación scs5 se aporta un nuevo regulador

para el mejor entendimiento de los componentes que se requieren

para la correcta activación de mecanismo de inmunidad en plantas.

- Mediante el mapeo posicional del locus SCS5, a través de la

utilización de marcadores moleculares SSLPs, se ha podido acotar la

posición cromosómica de dicho locus en proximidad con el marcador

CTR1.2 y con ello, concretamente, en proximidad con la posición

979764bp del cromosoma 5 de Arabidopsis cercana a la región

telomérica del brazo pequeño de dicho cromosoma. Dicha

localización servirá de punto de partida para el cartografiado de alta

resolución y la eventual identificación y clonación del gen SCS5 en

futuras aproximaciones.

48

6 BIBLIOGRAFIA

- Anderson, J., Badruzsaufari, E., Schenk, P., Manners J., Desmond, O.,

Ehlert C., Maclean, D., Eber, P. & Kazan, K. (2004). Antagonistic

Interaction between Abscisic Acid and Jasmonate-Ethylene Signaling

Pathways Modulates Defense Gene Expression and Disease Resistance

in Arabidopsis. The Plant Cell, 16: 3460–3479.

- Azofeifa-Delgado, A. (2006). Uso de marcadores moleculares en

plantas: aplicaciones en frutales del trópico. Agronomía Mesoamericana,

17(2): 221-242.

- Cao, H., Bowling, S., Gordon, A & Dong, X. (1997).Characterization of an

Arabidopsis Mutant That Is Nonresponsive to Inducers of Systemic

Acquired Resistance. Cell: 88, 57–63,

- Chen, Z., Zheng, Z., Huang, J., Lai, Z., & Fan, B. (2009). Biosynthesis of

salicylic acid in plants. Plant Signaling & Behavior, 4(6), 493–496.

- Chistiakov, D., Hellemans, B. & Volckaert, F. (2006). Microsatellites and

their genomic distribution, evolution, function and applications: A review

with special reference to fish genetics. Aquaculture, 255:1-4.

- Dangl, J.L., Dietrich, R.A., Richberg, M.H. (1996). Death Don‟t Have No

Mercy: Cell Death Programs in Plant-Microbe Interactions. Plant Cell, 8:

1793– 1807.

- De Vos, M., Van Oosten, v., Van Poecke, R., Van Pelt, J., Pozo, M.,

J. Mueller, M., Buchala, A., Métraux, J., Van Loon, J., Dicke, M.

& Pieterse, C. (2005). Signal Signature and Transcriptome Changes

of Arabidopsis During Pathogen and Insect Attack. Molecular Plant

Microbe Interactions (18) 9:923-937

- Dempsey, D. A., Vlot, A. C., Wildermuth, M. C., & Klessig, D. F. (2011).

Salicylic Acid Biosynthesis and Metabolism. The Arabidopsis Book /

American Society of Plant Biologists, 9, e0156. doi:10.1199/tab.0156

- Dodds, P.N. y Rathjen, J.P. (2010). Plant immunity: towards an

integrated view of plantpathogen interactions. Nature Reviews.

Gennetics, 11: 539-548

- Durrant, W. E., & Dong, X. (2004). Systemic Acquired Resistance.

Annual Review Phytopathology, 42: 185-209.

49

- Glazebrook, J.( 2001). Genes controlling expression of defense

responses in Arabidopsis status. Current Opinion in Plant Biology: 4,

301-308.

- Howe, G. (2004). Jasmonates as signals in the wound response. Journal

of Plant Growth Regulation 23(3):223-237.

- Hückelhoven, R. (2007). Cell Wall–Associated Mechanisms of Disease

Resistance and Susceptibility. Annual Review of Phytopathology, 45:

101–127.

- Jefferson, R., Kavanagh, T. & Bevan, M. (1987). GUS fusions: ß-

glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher

plants. EMBO Journal, 6:3901-3907.

- Jordá, L. & Vera, P. (2000). Local and Systemic Induction of Two

Defense-Related Subtilisin-Like Protease Promoters in Transgenic

Arabidopsis Plants. Luciferin Induction of PR Gene Expression. Plant

Physiology,124;124-156.

- Jordá, L., Coego, A., & Vera, P. (1999). A genomic cluster containing

four differentially regulated subtilisin-like processing protease genes is in

tomato plants. Journal Biological Chemistry, 274: 2360–2365.

- Katagiri, F., Thilmony, R., & Yang, S. (2002). The Arabidopsis Thaliana-

Pseudomonas Syringae Interaction. Arabidopsis Book. 2002; 1: e0039.

- Kinkema, M., Fan, W., & Dong, X. (2000). Nuclear localization of NPR1

is required for activation of PR gene expression. Plant Cell, 12: 2339-

2350.

- Koornneef, A. & Pieterse, C. (2008). Cross Talk in Defense Signaling.

Plant Physiology, 146 (3) 839-844.

- Krouk, G., Ruffel, S., Gutiérrez, R., Gojon, A., Crawford, N., Coruzzi, G.,

Lacombe B. (2011). A framework integrating plant growth with hormones

and nutrients. Trends Plant Sci 16: 178–182

- Kucuktas, H., Wang, S.,Li, P., He, C., Xu, P., Sha Y., Liu, H., Jiang, H.,

Baoprasertkul, P., Somridhivej, B.,Wang, Y., Abernathy, J., Guo, X., Liu,

L., Muir, M.& Liu, Z. (2009). Construction of Genetic Linkage Maps and

Comparative Genome Analysis of Catfish Using Gene-Associated

Markers. Genetics, 181: 1649–1660.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Katagiri%20F%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Thilmony%20R%5Bauth%5D

50

- Kunkel, B., y Brooks, D. (2002). Cross talk between signaling pathways

in pathogen defense. Plant Biology , 5:325–331.

- León-Reyes, A. (2009). Making sense out of signaling during plant

defense. Ph.D. Thesis Utrecht University, ISBN 978-90-393-509739.

- Matarasso, N., Schuster, S., & Avni. A. (2005). A Novel Plant Cysteine

Protease Has a Dual Function as a Regulator of 1-Aminocyclopropane-1-

Carboxylic Acid Synthase Gene Expression. The Plant Cell, 17; 1205–

1216.

- Meichtry, J., Amrhein, N., Schaller, A. (1999). Characterization of the

subtilase gene family in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Plant

Molecular Biology, 39: 749–760.

- Nandi, A., Krothapalli, K. Buseman, K., Li,. M., Welti, R., Enyedi, A.,

& Shah, J. (2003). Arabidopsis sfd Mutants Affect Plastidic Lipid

Composition and Suppress Dwarfing, Cell Death, and the Enhanced

Disease Resistance Phenotypes Resulting from the Deficiency of a Fatty

Acid Desaturase. The Plant Cell, 15(10): 2383-2398.

- Nurnberger, T. y Brunner, F. (2002). Innate immunity in plants and

animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors

and pathogenassociated molecular patterns. Plant Biology, 5: 318-324.

- Pieterse, C., Leon-Reyes., A., Van der Ent., S. and Van Wees. (2009).

Networking by small-molecule hormones in plant immunity. Nature

Chemistry Biology, 5; 308-316.

- Ramírez V, López A, Mauch-Mani B, Gil MJ, Vera P. 2013. An

Extracellular Subtilase Switch for Immune Priming in Arabidopsis. PLoS

Pathogens, 9(6):e1003445. doi:10.1371/journal.ppat.1003445.

- Shah, J., Kachroo, P., Nandi, A., & Klessig, D. (2001). A recessive

mutation in the Arabidopsis SSI2 gene confers SA- and NPR1-

independent expression of PR genes and resistance against bacterial

and oomycete pathogens. Plant Journal, 25(5):563-74.

- Spoel, S., Koornneef, A., Claessens, S., Korzelius, J., Van Pelt, J.,

Mueller, M., Buchala, A., Métraux, J., Brown, R., Kazan, K., Van Loon,

L., Dong, X., Pieterse, C. (2003). NPR1 Modulates Cross-Talk between

Salicylate- and Jasmonate-Dependent Defense Pathways through a

Novel Function in the Cytosol.The Plant Cell, 15: 760–770.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shah%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11309146

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kachroo%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11309146

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nandi%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11309146

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Klessig%20DF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11309146

51

- Sticher, L., Mauch-Mani, B., y Métraux, J.P. (1997). Systemic acquired

resistance. Annual Review Phytopathology, 35: 235-270.

- Stintzi, A., Heitz, T., Prasad, V., Wiedemann-Merdinoglu, S., Kauffmann,

S., Geoffroy, P., Legry, M., & Fritig, B. (1993). Plant 'pathogenesis-

related' proteins and their role in defense against pathogens.

Biochimiestry,75: 687-706.

- Tornero, P., Conejero, V., & Vera, P. (1996). Primary structure and

expression of a pathogen-induced protease (P69) in tomato plants:

Similarity of functional domains to subtilisin-like endoproteases.

Proceedings of the National Academy of Sciences, 93: 6332–6337.

- Van Der Biezen, E.A. y Jones, J.D.G., (1998). Plant disease-resistance

proteins and the gene-for-gene concept. Trends in Biochemical

Sciences, 23: 454–456.

- Van der Ent, S., Koornneef, A. & Pieterse, J. (2009). Induced

Resistance-Orchestrating defence mecanisms through rosstalk and

priming. Annual Plant Reviews 34: 334-370.

- Van Hulten, M. (2009). Costs and benefits of priming for defense in

Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science of The

United Stated of America, 103: 5602-5607.

- Van Lon, L.C. (1997). Induced resitance in plants and the role of

pathogenesi-related proteins. European Journal. Plant Pathology, 103:

753-765.

- Van Oosten, V., Bodenhausen, N., Reymond, F., Van Pelt, J., Van Loon,

L., Dicke, M., y Pieterse, C. (2008). Differential Effectiveness of

Microbially Induced Resistance Against Herbivorous Insects in

Arabidopsis. The American Phytopathological Society, 21(7): 919–930.

- Verhage, A.; van Wees, S. C. M.; Pieterse, C. M. J. (2010). Plant

Immunity: It’s the Hormones Talking, But What Do They Say? Plant

Physiology 154(2):536-540.

- Wu, Y., Zhang, D., Chu, J., Boyle, P., Wang, Y., Brindle, I., De Luca, V.,

& Després, C. (2012). The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the

plant defense hormone salicylic acid. Cell Reports 1(6):639-47.

- Xiao, Y., Savchenko,T., Baidoo, E.,Chehab, W., Hayden, D., Tolstikov,

V., Corwin, J. Kliebenstein, D., Keasling, J., & Dehesh, K. (2012).

https://www.google.es/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CCEQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.pnas.org%2F&ei=93WNVP23GYqxUcfKgcAN&usg=AFQjCNF8L8b8kaHKmCj0CPzwGkSLYL9tsA&sig2=KVyWDumumj7HOv-gvbz3qQ&bvm=bv.81828268,d.d24

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wu%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22813739

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22813739

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chu%20JY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22813739

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Boyle%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22813739

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22813739

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Brindle%20ID%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22813739

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=De%20Luca%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22813739

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Despr%C3%A9s%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22813739

52

Retrograde Signaling by the Plastidial Metabolite MEcPP Regulates

Expression of Nuclear Stress-Response Genes.Cell,149;1525’1535 doi

10.1016/j.cell.2012.04.038

- Zhao, C., Johnson, B.J., Kositsup, B., y Beers, E.P. (2000). Exploiting

secondary growth in Arabidopsis. Construction of xylem and bark cDNA

libraries and cloning of three xylem endopeptidases. Plant Physiology.

123, 1185-1196

CARACTERIZACIÓN DEL MUTANTE scs5 DE...

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