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CARACTERIZACION FISIOLÓGICA Y MOLECULAR DE LÍNEAS DE TRIGO QUE
EXPRESAN EL TRANSGEN SARK::IPT BAJO ESTRÉS HÍDRICO.
Bases ecofisiológicas y genéticas para mejorar el rendimiento y
la calidad en trigo y cebadaIV Workshop Internacional
28 -29 de Agosto 2013
EEA Balcarce-INTA
Ing. Agr. Antonio Díaz Paleo
EEA Pergamino INTA
Observaciones: Los estreses hídrico y salino aceleran la senescencia de plantas, modificando las relaciones fuente/destino.
Hipótesis: Es posible aumentar la tolerancia de las plantas al estrés abióticoretrasando la senescencia inducida por estrés, aumentando la adaptación de las fuentes y mejorando la relacionesfuente/destino.
Estrategia: Expresión de IPT que pueda mantener niveles óptimos de citoquininas durante el estrés, retrasando la senescencia inducida por estrés y fortaleciendo los destinos.
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IPTPromotor inducible pormaduración y estrés
Senescencia citoquininas
mRNA
(isopentenyl transferase)
estrésT. Hajouj, R. Michelis, S. Gepstein. Cloning andcharacterization of a receptor-like protein kinase associatedwith senescence. Plant Physiol. 124: 1305 (2000)
Plantas de tabaco WT y transgénicas que expresan PSARK::IPT después de 15 días de déficit hídrico seguido de 7 días sin
déficit
Control (WT) PSARK::IPT
Rivero et al., PNAS 104, 49, 19631–19636 (2007)
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Seedlin
g stage
Ear ly til
lering
Tiller in
g
Late til le
r ing
Booting
2 weeks p
ost flower i
ng
Grain fill in
g
Grains maturation
2-( ∆
∆∆∆ ∆∆∆
∆CT
)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
aa
bb
ccdc
Vegetativo Reproductivo
Comienzo Macollaje
Macollaje
Final Macollaje
Emergencia Panoja
2 semanas post floración
Llenado de Granos
Maduración granos• 3 días de déficit hídrico
Expresión de IPT en arroz bajo promotor
SARK
Peleg et al., (2011) Plant Biotechnol. J.
Plántula
PSARK::IPT
BS 1DS 2DS 3DS 4DS ReW
2-( ∆
∆∆∆ ∆∆∆
∆CT
)
0
20
40
60
80
100
120
1405T-WW
8T-WW
5T-WS
8T-WS
a ab bc
aa
aa
aa
aa
ba
a
aab b b b b b
Recup.PSPanicle
Peduncle
Flag lea
f
Second lea
f
Third lea
f
Fourth lea
fRoot
s
2-( ∆
∆∆∆ ∆∆∆
∆CT
)
0
200
400
600
800
1000
1200
14005T-WW
8T-WW
5T-WS
8T-WS
aa aa
a
aa
aa
b
b
bbbbb
ccaaa abbbb bb
Pedúnculo
Hoja Bandera
Tercera hoja
Cuarta hoja Raíz
Segunda hoja Panoja
Riego Pre Antesis Post AntesisControl Estrés Estrés
Mat
eria
Sec
a
R
endi
mie
nto
gran
o
g pl
anta
-1g
plan
ta-1
Rendimiento arroz SARK- ipt bajo estrés
Peleg et al., (2011) Plant Biotechnol. J
Pre-antesis: reducción en la fertilidad de espiguillas y expansión de la panojaPost-antesis: reducción en tamaño/peso de granos y calidad
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WT 3
B
A
WT 3
Rendimiento Maní SARK ipt
Qin et al., (2011) Plant Cell Physiol.
Porcentaje de vainas con 4 semillas
Porcentaje de vainas con 3 semillas
(%)
(%)
Qin et al., (2011) Plant Cell Physiol.
A. 2009 Ensayo en secano
38% 37%
57%70%
53%57%
B. 2010 Ensayo en secano
B. 2010 Ensayo bajo riego
Ren
dim
ient
o g/
plan
ta
Ren
dim
ient
o g/
plan
ta
Ren
dim
ient
o g/
plan
ta
Rendimiento ManíSARK ipt
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Trigo – Objetivos
• Estudiar los efectos de la expresión heteróloga en trigo de la secuencia SARK::ipt sobre la senescencia y la tolerancia al estrés hídrico.
• Objetivos específicos
� Obtener plantas transgénicas de trigo expresando la secuencia SARK::ipt a
través del método balístico.
�Ensayos de desafío bajo condiciones óptimas y limitadas de riego: caracterización fisiológica y genética de las plantas transgénicas portadoras de SARK::ipt y los controles no transgénicos.
Metodología
�Se transformaron escutelos inmaduros de trigo de la variedad ProINTA Federal (PIF) con el vector pBSIPT mediante un acelerador de microproyectiles tipo Particle Inflow Gun.
�Se obtuvieron 6 eventos de transformación independientes.
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Caracterización de los eventos obtenidos
Planta T0 PCR ipt PCR bar Resistencia
a PPT
1 + + +
2 + + -
3 + + +
4 + + +
5 + + -
6 + + +
Caracterización de los eventos obtenidos
a ba b
Progenies TProgenies T11 SARK::SARK::iptipt al final del ensayo al final del ensayo a) riego normal, b) con da) riego normal, b) con dééficit hficit híídricodrico
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Evaluación de las progenies bajo déficit hídrico
Progenies T1 al final del período de DH derivadas de los eventos A) 1 B) 2 C) 4
A B C
� por PCR y Southern blots de las progenies de las plantas T1 obtenidas en @ (plantas T2 )y cruzamiento por PIF (retrocruzas) se identificaron plantas T1 homocigotas para los IS del transgen de interés.
Progenies TProgenies T22 SARK::SARK::iptipt
Obtención de líneas homocigotasLínea IS
TR 1 5
TR 2 2
TR 3 1
TR 4 5
TR 5 4
TR 6 1
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� TR 1, TR 2, TR 3, TR 4, TR 5 , TR 6 y ProINTA Federal (PIF )
� Dos condiciones de riego
� n=8 plantas por combinación de GxR
� N=112 plantas
EVALUACIÓN BAJO DÉFICIT HÍDRICO DE LAS LÍNEAS
Deficit hídrico y estados fenológicos
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40: comienzo del estrés hídrico
64: Antesis. Finalización del estrés.
120: Finalización del llenado de grano. Madurez.
135: Supresión del riego.0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
Capa
cida
d de
cam
po (%
)
Días
Deficit hídrico y estados fenológicos
Comienzo de antesis
0
3
6
9
12
15
18
21
24
0
5
10
15
20
25
30
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
Horas luz
Tem
pera
tura
(°C
)
DíasTemperatura Horas luz
Efecto del déficit hídricoEn todos los genotipos hubo efectos
significativos del déficit hídrico en las siguientes variables
� chl a, chl b y carotenos
�Peso de planta
�Número de espigas
�Fecha de antesis
�Número de espiguillas por espiga
�Número de granos por espiga
�Número de granos por espiguillas en las 4 espigas principales
�Número de granos totales
�Peso de granos por espiga
�Peso de granos por planta
� Índice de cosecha
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Número de granos por planta
Con Estrés
Riego normal
TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6PIF
Genotipos
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250 Con Estrés
Riego normal
ab
aa
bcc c c
Peso de granos por planta
0
1
2
3
5
6
7
8
TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6PIF
Genotipos
Con Estrés
Riego normal
Disminución de
51% 30%
a
bbb
ccc
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Indice de cosecha Con estrés
Riego normal
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6PIF
Genotipos
Con Estrés
Riego normal
Disminución de
45% 16%
0
3
6
9
12
15
18
21
24 Asimilación de CO2 (µmol CO2.m-2.s-1)
Periodo anterior al estrés
Con estrés
PI F
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35 Conductancia estomática (mmol H2O.m-2.s-1)
Con estrés
Riego Normal
Riego Normal
Condición:
Genotipos: TR 1
Periodo de estrés
Periodo de recuperación
Variables Fotosintéticas
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CE RN CE RN CE RN CE RN CE RN CE RN
TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6Genotipo y condición
Expresión relativa transcriptos ipt –Final del período de estrés
CE: con estrésRN: riego normal
Normalizado sobretranscripto TaRP15
(Stephenson et al. 2007)
CE RN CE RN CE RN CE RN
0d. e. 10d. e. 24d.e. Recup.Momento y condición
TR1: expresión relativa de transcriptos ipta través del tiempo
CE: con estrésRN: riego normal
Normalizado sobretranscripto TaRP15
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CE: con estrésRN: riego normal
Normalizado sobretranscripto TaRP15
CE RN CE RN CE RN CE RN
0d. e. 10d. e. 24d.e. Recup.Momento y condición
TR4: expresión relativa de transcriptos ipt a través del tiempo
CE: con estrésRN: riego normal
Normalizado sobretranscripto TaRP15
CE RN CE RN TR1 TR4
Expresión relativa de transcriptos iptPeríodo de Recuperación
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Conclusiones
La expresion de IPT bajo el control transcripcional del promotor SARK demostróaumentar la tolerancia a déficit hídrico inducido bajo condiciones controladas en trigo. El mayor rendimiento de TR1 con respecto a ProINTA FederaI se debería a una capacidad incrementada del ritmo de fotosíntesis bajo condiciones limitantes y a mayor protección de la maquinaria fotosintética que permite mejores eficiencias fotosintéticas una vez superado el estrés. Estos resultados coinciden con otros obtenidos en arroz y tabaco ya publicados.
No se pudo terminar de asociar las variaciones en la expresión cuantitativa de IPT como respuestas de adaptación a variaciones en el ciclo de estrés. Sin embargo se hallaron niveles elevados hacia el final del ciclo en respuesta muy posiblemente a senescencia. Estos “picos” de expresión subrayan la potencialidad del promotor para dirigir de forma autoregulada los aumentos de la transcripción frente a los estímulos del ambiente.
Nuevos Ensayos en Invernáculo TR1, TR4
y ProINTA Federal
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Participantes
Ailin Beznec (beca CONICET) Irene Baroli (CONICET-INTA) Paula Faccio (INTA) Gabriela Soto (CONICET-INTA) Berta Llorente (UNLu)Elba Pagano (INTA) Coordinadora PPTCristina Gomez (INTA)Cecilia Decima (INTA)Dalia Lewi (INTA)Eduardo Blumwald (UC – Davis) Antonio Díaz Paleo (INTA) Coord PE233251Sara Ameijeiras (Apoyo técnico Lab)Laura Lima (Apoyo técnico Lab)
Financiamiento
PE AEGR 3425 (2006/9)PE AERG 233251 (2009/12)PN BIO 113024 (2013)
Lugar de Trabajo
Instituto de Genética “E.A. Favret”CICVyA, INTA Castelar