CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA...
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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyN-INTI
Materia de Articulación CEBI_A4Química Biológica
Docente a cargo:Marta Blanca Mazzetti
CEBI_A4_3 : Enzimas
Enzimas
Un poco de historia…
Se reconocen catalizadores biológicos al estudiar la degradación de carnes por secreciones estomacales
Se observa conversión de almidón a azúcar
1700s
1800s Se observa conversión de almidón a azúcar por saliva y extractos vegetales
La fermentación de azúcar a alcohol por levaduras es catalizada por fermentos que son inseparables de las células vivas de levadura
1800s
1850s
Un poco de historia…
Buchner: extractos de levaduras pueden fermentar azúcar a alcohol
Sumner: aísla y cristaliza ureasa ⇒ todas las
1897
1926
ENZIMAS (Gk enzymos = levado)Kühne
Sumner: aísla y cristaliza ureasa ⇒ todas las enzimas son proteínas
Pepsina, tripsina y otras enzimas digestivas se aíslan y cristalizan y son proteínas
1926
1930s
1930s Haldane: interacciones débiles entre enzima y sustrato podrían usarse para catalizar reacción
Los Protagonistas…
¿ Qué sabemos hoy de las enzimas ?
� Exceptuando las ribozimas, son todas proteínas
� Actividad catalítica requiere proteína nativa
� Tamaño muy variable: PM entre 104 - 106
� Algunas requieren componente químico adicional para su actividad
COFACTOR o COENZIMA
Algunos cofactores son iones metálicos…
…Otros son moléculas orgánicas complejas
Coenzimas que transfieren Coenzimas que
COENZIMAS
Coenzimas que transfieren grupos de átomos
Coenzimas que transfieren electrones
Coenzimas que transfieren electrones
Coenzimas que transfieren grupos de átomos
Muchas coenzimas son metabolitos de las vitaminas
¿ Qué son las vitaminas ?
� Compuestos que son esenciales para la salud y que no pueden ser sintetizados por el
organismo
� Deben ser incorporados en la dieta� Deben ser incorporados en la dieta
� Su deficiencia genera enfermedades por carencia
� Se dividen en dos grupos de acuerdo con su solubilidad
Vitaminas Liposolubles
Vitaminas Hidrosolubles
Vitaminas HidrosolublesVitaminas Hidrosolubles
Volvamos a nuestras enzimas…Volvamos a nuestras enzimas…
Clasificación de enzimas…
E.C.w.x.y.z.
Un ejemplo…la hexoquinasa
ATP + D-glucosa → ADP + D-glucosa-6-fosfato
E.C.2.7.1.1.E.C.2.7.1.1.
transferasa
fosfotransferasa
P-transferasa con HO como aceptor
D-glucosa como aceptor del P
Las enzimas son catalizadores extraordinarios
� Condiciones de funcionamiento
� Especificidad
� Magnitud de la aceleración de la velocidad de reacción
¿ Cómo funcionan las enzimas ?¿ Cómo funcionan las enzimas ?
S
ST
Energía Libre (G)
En
erg
ía re
qu
erid
a S
P
Dirección de Reacción
En
erg
ía re
qu
erid
a
T = Estado de transición
Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166
E S+ P+SE E
¿Qué pasa en presencia de una enzima?
E S+ P+SE E
La enzima estabiliza el Estado de Transición
EST
ST
Cambio en Energía
En
erg
ía re
qu
erid
a (n
o ca
tálisis)
En
erg
ía d
ismin
uye
(catá
lisis)
S
P
ES
ES
EP
Dirección de Reacción
En
erg
ía re
qu
erid
a (n
o ca
tálisis)
En
erg
ía d
ismin
uye
(catá
lisis)
Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166
¿ Cómo lo logra ?
Sitio activo
El sitio activo…El sitio activo…
�� Proporciona una superficie catalíticaProporciona una superficie catalítica
�� EEstabiliza estado de transiciónstabiliza estado de transición
�� Transforma el estado de transición en productoTransforma el estado de transición en producto
B
BA Superficie catalítica
A
Juang RH (2004) BCbasics
¿ Cómo estabiliza el sitio activo el estado de transición ?
Posee grupos reactivos+Evita influencia del agua
-
Juang RH (2004) BCbasics
Optimiza interacción con S
La enzima no es perfectamente complementaria al sustrato sino al
estado de transición(Linus Pauling, 1946)
X
Ajuste inducido
(Koshland, 1958)
Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252
Hexoquinasa
D-glucosa
El sitio activo…El sitio activo…
�� Proporciona una superficie catalítica
�� Estabiliza estado de transición
�� Transforma el estado de transición en producto
B
BA Superficie catalítica
A
Juang RH (2004) BCbasics
Cinética EnzimáticaCinética Enzimática
Orden 0VoV
[S]
Orden 1
ES
Otra vez un poco de historia…
Victor Henri: reacción E + S → ES etapa necesaria en catálisis enzimática
Michaelis y Menten: Teoría General de la Catálisis Enzimática
1903
1913
Las condiciones de M-M
E + S ESk1
k2
E + Pk3
k4
rápida lenta*
ESTADO ESTACIONARIO: producción y consumo del complejo ES proceden a la misma velocidad ⇒
se mantiene constante la concentración de ES
S P
Co
nce
ntra
ción
E
ES
Tiempo de reacción
Co
nce
ntra
ción
Juang RH (2004) BCbasics
ET
EE
Vo
VmVo = Vm
Vo = Vm [S]
[S]
½ Vm
Km
Vo = Vm [S]Km
Vo = Vm [S]Km + [S]
Y siguiendo con la hexoquinasa…
Glucosa + ATP → Glc-6-P + ADPGlucosa Alosa Manosa
CHO
H-C-OH
HO-C-H
CHO
H-C-OH
H-C-OH
CHO
HO-C-H
HO-C-H
Km = 8 8.000 5 mM
HO-C-H
H-C-OH
H-C-OH
H2-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H2-C-OH
HO-C-H
H-C-OH
H-C-OH
H2-C-OH
Juang RH (2004) BCbasics
Cinética MichaelianaCinética Michaeliana
Vo
VmVo = Vm
Vo = Vm [S]
[S]
½ Vm
Km
Vo = Vm [S]Km
Vo = Vm [S]Km + [S]
¿ Qué pasa con MM cuando la reacción catalizada tiene más de un sustrato ?
ATP + D-glucosa → ADP + D-glucosa-6-fosfato
Distintos mecanismos posibles…
¿Cómo hacemos en la práctica para obtener práctica para obtener
Vm y Km?
Recopilando…
1)1) Usar una cantidad definida de Enzima → E
2)2) Agregar sustrato en varias concentraciones → S
3)3) Determinar Producto a Tiempo Fijo (P/t) → vo
4)4) Estimar Vmax yKm
Vmax
Km S
vo
1/S
1vo
Doble recíproca
Gráfico Directo1
Vmax
- 1 Km
1/2
Jua
ng
RH
(2
00
4)
BC
ba
sics
¿Cómo medimos la cantidad de enzima?
UNIDAD ENZIMÁTICA
UNIDAD ENZIMÁTICA (UE)
Cantidad de enzima que cataliza formación de determinada cantidad de producto en la unidad de tiempo, en
condiciones de velocidad máxima
UEActividad
Específica =Proteína (mg)Específica =
¿Cómo puedo comparar la eficiencia de distintas eficiencia de distintas
enzimas?
E + S ES E + Pk2
k1 k
3
En condiciones saturantes Vm = k3 ETEn condiciones saturantes Vm = k3 ET
k catalíticaNúmero de recambio
Algunos ejemplos…
kcat / kmConstante de especificidad
Inhibición de la actividad enzimática
Algunos inhibidores son irreversibles…
Se unen covalentemente (o no) o destruyen grupo funcional clave para
catálisis
Inhibidores suicidas
Diseño racional de fármacos
Un ejemplo real…la Enfermedad del Sueño
Trypanosoma brucei
Inhibidor suicida de la Ornitín decarboxilasaprimera enzima en biosíntesis poliaminas
Difluorometilornitina
¡¡¡Y otros inhibidores son evidentemente reversibles!!!!!
Existen distintos tipos de inhibición reversible…
I
I
S
S
S IIII
IIII
IIII II
S
Competitiva No-competitiva Incompetitiva
E
E
Compite por
Sustrato
Dib
ujo
Gu
ía
E
I
S
ISSitio diferente
Compite por Sitio activoInhibidorD
ibu
jo G
uía
Ecuación y Descripción
[II] se une a [E] libre solo,y compite con [S];aumento de [S] eliminala Inhibición por [II].
[II] se une a [E] libre o [ES] complejo; aumento de [S] noelimina [II] inhibición.
[II] se une al [ES] complejo Solo; aumento [S] favorecela inhibición por [II].
E + S→ES →E + P+II
↓
EII
←
↑
E + S→ES →E + P+ +II II
↓ ↓
EII+S→EIIS
←
↑ ↑
E + S→ES →E + P+II
↓
EIIS
←
↑
I
Inhibición Reversible
IIII IICompetitiva No-competitiva Incompetitiva
Grá
fico
Dir
ect
o Vmax Vmax
vo
vo
II II
Vmax
IIVmax’Vmax’
Km
Grá
fico
Dir
ect
oD
ob
le R
ecí
pro
ca
Km Km’ [S], mM [S], mM Km [S], mMKm’
Vmax no cambiaKm aumenta
Vmax disminuyeKm no cambia Vmax & Km disminuyen
II
1/[S]1/Km
1/vo
1/Vmax
IIII1/v
o
1/Vmax
1/[S]1/Km 1/[S]1/Km
1/Vmax
1/vo
= Km’
Una aplicación clínica y curiosa de la inhibición competitiva…
¡ Emborrachar a los individuos intoxicados con metanol !
�
Alcoholdeshidrogenasa
metanol Formaldehído �deshidrogenasa
etanol es inhibidor competitivo
Infusión lenta y continuada de etanol ☺
Otra aplicación clínica importante de la inhibición competitva: las sulfamidas
-COOHH2N-
PrecursorAcidofólico
Acido p-aminobenzoico (PABA)
Bacterias necesitan
PABA para
-SONH2H2N-
Precursor fólico
Sulfanilamida
biosíntesis de ácido
fólico
Estructura similar al PABA, inhibe el crecimiento bacteriano.
Adapted from Bohinski (1987) Modern Concepts in Biochemistry (5e) p.197
Cinética Michaeliana: Resumen
vo= Vmax [S]
Km+ [S]
&
1er orden
Orden cero
Directo
kcat
Número de
recambio
kcat/K
m
Significa:
Km
Vmax &
Competitiva
No-competitiva
Incompetitiva
Doble recíprocaAfinidad consubstrato
VelocidadMáxima In
hib
ición
k3[Et]
UE
1 µmolmin
Juang RH (2004) BCbasics
Grupos específicos en el sitio activo contribuyen a la catálisis a través de distintos mecanismos
� Catálisis covalente
� Catálisis con ión metálico� Catálisis con ión metálico
� Catálisis ácido-base
Catálisis ácido-base
Asp102
His57
Ser195
Tríada CatalíticaTríada Catalítica
HH
Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A1
NC[HOOC] C C [NH ]
O
N
C
C
N
[HOOC]H
O
C
C
N
C
C
[NH2]
Chequear especificidad de sustrato
Asp102
His57
Ser195HH
Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A2
O
Primer Estado de Transición
HH
Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A3
O
Intermediario Acil-Enzima
H
Mecanismo Catalítico de Quimotripsina D1
O
Intermediario Acil-Enzima Agua
H
Mecanismo Catalítico de Quimotripsina D2
O
O
Segundo Estado de Transición
OH
H
Mecanismo de Catálisis de Quimotripsina D3
O
OOH
Des-acilación
Carga en el Sitio A
ctivo
Ser195
His 57
Asp 102
H–O–CH2
OC–O -=
H–N N
C C
C
H
H
CH2
Ad
ap
ted
fro
m A
lbe
rts
et
al (
20
02
) M
ole
cula
r B
iolo
gy o
f th
e C
ell
(4e
) p
.15
8
Ser Activa
Ser195
His 57
Asp 102
-O–CH2
OC–O–H
=
N N–H
C C
C
H
H
CH2
Ad
ap
ted
fro
m A
lbe
rts
et
al (
20
02
) M
ole
cula
r B
iolo
gy o
f th
e C
ell
(4e
) p
.15
8
Catálisis Acido-Base
(20
00
) L
eh
nin
ger
Prin
cip
les
of
Bio
che
mis
try
(3e
) p
.25
2
Induce el estado de transición
ONH
+
CatálisisAcido-base Catálisis
Acida
Ad
ap
ted
fro
m A
lbe
rts
et
al (
20
02
) M
ole
cula
r B
iolo
gy o
f th
e C
ell
(4e
) p
.16
7
NH
+
Especificidad
HO
H
Ad
ap
ted
fro
m N
els
on
& C
ox
(20
00
) L
eh
nin
ger
Prin
cip
les
of
Bio
che
mis
try
(3e
) p
.25
2
CO
=
NH
HCH
NH
C- OOH
OH
-δ
+δ
HO
H
CO
=
NH
HCH
CO
=
NH
HCH
CO
=
NH
HCH
Lenta Rápida Rápida Muy rápida
Catálisis
Básica
Ambas
Ad
ap
ted
fro
m A
lbe
rts
et
al (
20
02
) M
ole
cula
r B
iolo
gy o
f th
e C
ell
(4e
) p
.16
7
NH
C- OO
HO
H
Mecanismo Concertado de Catálisis
3 4
O-
H
+ H
COO-
(270)Glu
(248)Tyr
O-
H
Carboxipeptidasa A
SITIO
ACTIVO
SITIO
ACTIVO
Sitio para
especificidad
Bolsillodel SitioActivo
NC
1
2
5
O
His(196)
His (69)
Glu(72)
+Arg (145)C-terminal
Chequear porC-terminal
Cadenapeptidica del
Sustrato
RNCN C
COO-
O-
C
2+Zn
Jua
ng
RH
(2
00
4)
BC
ba
sics
O ON–C–C–N–C–C N–C–C–N–C–C
R H R’
Quimotripsina Tiene Un Sitio de Especificidad
O -
CCSer
Sitio ActivoSitio Activo
Sitio de
Especificidad
Sitio de
Especificidad Sitio Catalítico
Juang RH (2004) BCbasics
Especificidad de la Familia de Ser-Proteasas
Tripsina Quimotripsina Elastasacorta en Lys, Arg corta en Trp, Phe, Tyr corta en Ala, Gly
Bo
lsill
o P
rofu
nd
o y
Ca
rga
do
O O–C–N–C–C–N–
C
C
O O–C–N–C–C–N–
C
O O–C–N–C–C–N–
CH3
COO-
C
Asp
COO-
C
Asp
Sitio Activo
Bolsillo No-polar
Bo
lsill
o P
rofu
nd
o y
Ca
rga
do
Ne
ga
tiva
me
nte
Bolsillo Poco Profundoy
no-polar
C
C
C
NH3+
CH3
Jua
ng
RH
(2
00
4)
BC
ba
sics
Especificidad Espacial
D
A
sp3
BC
DB
C
DBC
Estos dos triángulos no son idénticos
La estructura tetrahédricade los orbitales del carbonotiene una tensión estéricaque conforma la unidadbase de la conformaciónproteica
Juang RH (2004) BCbasics
Superficie Enzima
Enzimas Regulatorias
Retroalimentación negativa
Enzimas Alostéricas
Gk: allos = otros
steros = forma
Enzimas Alostéricas
�Proteínas multiméricas y complejas
�Modulador y S se unen a distintas subunidades
�Unión modulador produce cambio conformacional que altera
�Modulador puede ser positivo o negativo
�Un sitio específico para cada modulador
actividad enzimática
�Modulador puede ser el mismo S (homotrópico) o no (heterotrópico)
Un ejemplo real: aspartato transcarbamilasa
12 cadenas polipeptídicas2 clusters catalíticos con 3 cadenas
3 clusters regulatorios con 2 cadenas
Enzima Alostérica Aspártico transcarbamilasa
+
Forma Activa relajada
ATCasa
COO-
CH2
HN-C-COO-
H H-
---
O
H2N-C-O-PO32-
=
O
H2N-C-
=
COO-
CH2
N-C-COO-
H H
---
-
AspartatoCarbamilfosfato
Carbamil aspartato
Forma tensa Inactiva
ATCasaH H H H
ATP
CTP
MetabolismoNucleicos
Feedback
inhibiciónCTP
CTP
CTP
CTP
CTP
CTP
Juang RH (2004) BCbasics
Cinética alostérica
Cooperatividad
Dos modelos para explicar este comportamiento…
Concertado(Monod)
Ajuste inducido(Koshland)
2 formas R y T en equilibrio que se desplaza a un lado u otro según presencia modulador
1 forma única que va ajustando su actividad de acuerdo con entrada
modulador
S y modulador + sólo se unen a R
Modulador – sólo se une a T
El modulador puede afectar K0.5…
El modulador puede afectar Vm…
Volvamos a la ATC…
Efe
cto C
urva
Sig
moid
ea
Efector positivo (ATP)lleva curva sigmoidea a hiperbólica
Efector Negativo (CTP) mantiene
CTPATP
v
vo
Si exageramos la curva sigmoideaVemos el puntoOn/Off claramente
Una enzima alostérica puede “detectar” la concentración en el ambiente y ajustar suactividad
vo
[Sustrato]Off On
Juang RH (2004) BCbasics
Enzimas reguladas por clivaje proteolítico
�Proteólisis expone sitio activo
�Regulación irreversible
�Se necesita otro mecanismo para inactivar
Inhibidor que se une fuertemente a sitio activo
Enzimas reguladas por modificación covalente
Grupos de átomos unidos o removidos generalmente por otras enzimas
Fosforilaciones catalizadas por proteín quinasas específicas
Fosforilación tiene que ser reversible
Fosfo proteín fosfatasas
Un ejemplo: la glucógeno fosforilasa
(glucosa)n + Pi → (glucosa)n-1 + glucosa-1-P
A veces una misma enzima tiene varios sitios de fosforilación
(glucosa)n + Pi (glucosa)n-1 + glucosa-1-P
GP
(glucosa)n + Pi (glucosa)n-1 + glucosa-1-P
GS
Rápida Respuesta a Concentración Azúcar en Sangre
Glucógeno fosforilasa Glucógeno sintasaA
ctiv
ida
d E
nzi
má
tica
Act
ivid
ad
En
zim
átic
a
0 2 4 6 8Tiempo (min)
Glucosa
Adapted from Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.597