Chorizo

IIngeniera Bioqumica, Microbiologa, Proyecto, 2013, 1-25

Proyecto de Evaluacin microbiolgica y sanitaria de un embutido fresco: Chorizo deres regional"

Hernndez Barrera, Jess Ricardo

Instituto Tecnolgico de la PazLaboratorio de Bioqumica

Entrega: Abril del 2013La elaboracin de embutidos artesanales requiere adems de conocimientos gastronmicos, de una regulacinsanitaria que brinde la seguridad de consumirlo. Con el fin de comprobar el cumplimiento las normas sanitariasque rigen en Mxico para la elaboracin y manufactura de chorizo de res (en este caso regional), sedesarrollaron pruebas microbiolgicas para evaluar si el embutido antes mencionado cumpla con lasespecificaciones sanitarias requeridas. Los resultados obtenidos mostraron el desarrollo de microorganismospatgenos, que no son permitidos en las normas que rigen la comercializacin del producto. Se recomiendanmayores medidas de sanidad en la elaboracin del mismo, adems de una evaluacin sanitaria oficial quepermita comprobar o refutar los resultados aqu presentes, con el fin de evitar especulaciones.

Palabras clave: Embutidos, Chorizo, M.O., Bacilos, Cocos, Gram, Enterobacteriaceae

Introduccin y descripcin del proyecto adesarrollar:

Tanto a nivel nacional, como internacional,se produce una gran variedad de embutidos frescos(conocidos normalmente en castellano comochorizos, salchichas, longanizas, etc. Estosembutidos tienen gran importancia cultural(gastronmica) como econmica.1

Los embutidos frescos se elaboran con carne y grasade cerdo, aunque a veces se incluye en laformulacin carne de vacuno, aves de corral o,incluso, de animales exticos. Existe un sin nmerode variedades locales de embutidos frescos quedifieren entre s principalmente en la formulacin(especie animal, proporciones relativas de carne ygrasa, especias y condimentos utilizados) y en latcnica de elaboracin (grado de reduccin de

tamao de la carne y grasa, tipos de tripa empleada,tiempo de secado u oreo, posibilidad de ahumado).As, se elaboran embutidos frescos de diversosaromas, colores y calibres en las diferentes regionesde la comunidad Ibero-Americana. 1

Para elaborar chorizo artesanalmente, se utilizaprincipalmente carne y grasa del animal depreferencia (generalmente de cerdo), sal, pimentn,ajo y organo. Sin embargo como ya se menciono laformulacin y forma de elaboracin del embutidovara segn la regin donde sea desarrollado.Adems es importante mencionar que el chorizoforma parte de los embutidos crudos, es decir quees una mezcla de carne cruda con los demsingredientes anteriormente mencionados, y por lo

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tanto requiere adems de aditivos y productoscoadyuvantes (por ejemplo cido actico; vinagre)para su curado; pre-coccin, adems de un controlde pH en su produccin, un proceso de secado ymaduracin que eviten el desarrollo demicroorganismos patgenos no deseados y le denlas caractersticas deseadas al producto final. 1, 2

Con los antecedentes anteriores, y con la finalidadde evaluar y conocer la carga bacteriana quepudiese presentarse en un chorizo preparado deforma artesanal, se efectuaron diversas pruebasmicrobiolgicas y bioqumicas a un Chorizo deres preparado de forma casera, cuya compra seefectu en el establecimiento denominado:Carnicera Nez, con domicilio ubicado en laCalle Valentin Gomez Farias, casi esquina conCalle Jalisco, en la ciudad de La Paz, BajaCalifornia Sur, Mxico.En general y en la medida de lo posible, la bsquedade posibles microorganismos patgenos, se evalubasndose en las especificaciones sanitarias regidasen la Norma Oficial Mexicana: NOM-122-SSA1-1994. Bienes y servicios. Productos de la carne,productos crnicos curados y cocidos, y curadosemulsionados y cocidos.3 Evalundose segnindicaciones de ella, la presencia de los siguientesmicroorganismos: Organismos Mesoflicosaerbicos, Escherichia coli (Coliformes), Hongos,Levaduras, Staphylococcus aureus y Salmonella.3

A continuacin, se mencionaran algunascaractersticas de los microorganismos a evaluar einformacin acerca de las tcnicas para suanlisis.

Recuento de organismos mesoflicos aerobios.

Cuando se requiere de investigar el contenido demicroorganismos viables en un alimento, la tcnicams comnmente utilizada es el recuento en placa,en medios de cultivo con un soporte nutricionaladecuado y libre de agentes inhibidores.4

En realidad, esta tcnica no pretende poner enevidencia todos los microorganismos presentes enun asilamiento determinado, ya que la variedad deespecies y tipos diferenciables por sus necesidadesnutricionales, temperatura requerida para sucrecimiento, oxigeno disponible, etc., hacen que elnmero de colonias contadas constituyan una

estimacin de la cifra realmente presente. Noobstante, cuando se siguen fielmente lascondiciones que se sealan en la tcnica para sudesarrollo, puede llegar a proporcionar resultados losuficientemente reproducibles para darle significadoa la prueba.4, 5

Cuando la temperatura de incubacin ha sido entrelos 20C y 37C, que son los extremos de lastemperaturas a las cuales suele realizarte esterecuento, en condiciones de aerobiosis. En algunosalimentos, este grupo de microorganismos presentamximos recuentos, pero esto depender delpredominio de otros grupos como son lospsicroflicos, anaerbicos, etc.4

Dentro de la microbiota mesoflica aerobia tenemosbacilos, cocos, Gram positivos y Gram negativos,asilados o agrupados o en todas las variedades quenos son familiares.4

Desde el punto de vista fisiolgico y de supatogenicidad encontramos: cromgenos,lipolticos, sacarolticos, saprofticos, patgenos,etc.4

La utilidad de las bacterias mesoflicas aerobias enla microbiologa sanitaria se ha recomendado paralos siguientes objetivos5:

Como indicador de la posible presencia demicroorganismos patgenos.

Como indicador de las condicioneshiginicas en que se ha sido manejado elproducto.

Para seguir la eficiente de un proceso desaneamiento o de preservacin.

Para predecir la vida de anaquel de unalimento.

El recuento de mesoflicos aerobios presentalimitaciones que deben tenerse en cuenta5:

En alimentos desecados losmicroorganismos pierden viabilidad por lotanto no se puede referir su nmero almomento en que fue envasado en planta.

La presencia de inhibidores en el producto,impide la estimacin real del nmero demesoflicos aerobios en el alimento.

Solo una pequea porcin del alimento esanalizada y no puede tener representatividad

suficiente para tomar decisiones justas conrespecto a todo un lote de fabricacin.

La tcnica solo permite el recuento debacterias viables, por lo tanto, no pueden serpuestas de manifiesto serias violaciones enel manejo de los alimentos previas a untratamiento trmico o de otra forma dedestruir microorganismos.

Especificidad: El valor del mtodo dependedel uso adecuado que se le d. Si se definenlas condiciones de desarrollo de la tcnica(potencial Redox, adicin de sales, tiempode incubacin, temperatura, pH del medio,etc.) y el analista se sujeta rigurosamente aellas, los recuentos obtenidos adquieren unsignificado de gran utilidad para muchospropsitos.

El medio de cultivo utilizado para la identificacinde organismos mesoflicos aerobios es el Agar paramtodos estndar, el cual tiene es un medio decultivo rico en nutrientes y elaborado de acuerdo ala formulacin de la APHA. El medio esampliamente usado para el recuento microbiano dela leche y otros alimentos de importancia sanitaria.6

Recuento de organismos coliformes.

Los organismos coliformes constituyen un grupoheterogneo con hbitat primordialmente intestinalpara la mayora de las especies que involucra. A finde simplificar su manejo en el laboratorio, se ahestablecido una definicin sobre la base de lascaractersticas constantes que exhibe la especie tipodel grupo, Escherichia coli. Esta simplificacin sinembargo da lugar a que se incluyan en el grupobacterias de origen no estrictamente intestinal, comoson Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae,Klebsiella pneumoniae y Citrobacter, porquecomparten las caractersticas que la definicinimpone, por lo que no necesariamente guardan unarelacin directa con la contaminacin de origenfecal y en consecuencia, tampoco con la presenciade patgenos entricos.4

El uso de coliformes como indicador sanitariosignificativo, debe restringirse al agua y hielopotable, a los alimentos sometidos a procesostrmicos y a la evaluacin de la eficiencia deprcticas sanitarias e higienizacin del equipo.5

La definicin del grupo coliforme los describe comobacilos Gram negativos no esporulados, aerobios oanaerobios facultativos que fermentan la lactosa conproduccin de gas, dentro de las 48 horas deincubacin a una temperatura de 35C.4

Por diversas razones, entre otras para la facilidad deoperacin y economa, se ha introducido el mediode agar bilis rojo violeta para el recuento deorganismos coliformes, principalmente a partir dealimentos en los que se espera un nmero ms bienalto. En la identificacin de microorganismoscalificados de coliformes en las placas de agar bilisrojo violeta (RVBA) durante el anlisis de losalimentos hay que tomar en cuenta diversos hechosque conducen a falsos positivos, por ejemplo6, 8:

Si el alimento es un producto que contienemono o disacridos en concentracinimportante, pueden ser fermentados poralgunos microorganismos presentes,distintos a los coliformes, y generar por ellocolonias semejantes a las fermentadoras delactosa.

El sobrecalentamiento del medio da efectosen las condiciones de incubacin(especialmente incubaciones prolongadas)pueden facilitar el desarrollo de coloniasrojas por especies de cocos Gran positivos).

Cuando el recuento de organismos coliformes serealiza en medios de cultivo lquidos (Tcnica delNumero Ms Probable, NMP) se lleva a cabo laprueba presuntiva con caldo Lactosado, en donde seconsidera la utilizacin de la lactosa con produccinde gas.8

Para la prueba confirmativa se utiliza el caldo verdebrillante bilis al 2%, que inhibe el desarrollo demicroorganismo Gram positivos, donde tambin seobserva la produccin de gas a partir de la lactosa.6,8

Si se llega a tener la necesidad de diferenciar a losorganismos coliformes contenidos en la pruebaconfirmativa de la tcnica de NMP o bien de losencontrados en las placas de RVBA con el fin dedemostrar la presencia de Escherichia coli. Paraesto se tiene la alternativa de resembrar en un mediode pruebas bioqumicas (IMVIC).6, 8

Con el propsito de simplificar la investigacin seah introducido el termino de coliformes fecales a un

grupo de microorganismos ms especficos que elde los coliformes y con mayor identidad aEscherichia Coli. El recuento de este grupo debacterias, cuya conceptualizacin es de ordenfuncional, se fundamente en la capacidad delmicroorganismo para producir Indol y fermentar lalactosa a temperaturas elevadas Bajo estascondiciones de excluyen cepas de coliformes deasiento no intestinal, lo que da mayor especificad alestudio.8

Identificacin de hongos filamentosos ylevaduras en alimentos.

La importancia de los hongos filamentosos en losalimentos puede considerarse desde diferentespuntos de vista4, 5:

Producen alteraciones diversas en losalimentos (Rhizopus nigrican en el pan).

Generan toxinas con notables efectos en losanimales y el hombre (Aspergillus flavusproduce aflatoxinas en los cereales).

En algunos alimentos su nmero se asociageneralmente a deficientes prcticashiginicas de fabricacin y almacenamiento.

El mtodo de conteo de hongos y levaduras, usadoen general para conocer el nmero demicroorganismos presentes en nuestra muestraanalizar, sigue la tcnica de vaciado en placa,usando pera ello el medio, tiempo y temperatura deincubacin adecuada.5

En general, simultneamente con el recuento dehongos puede realizarse el de las levaduras, ya queel medio de cultivo les proporciona tambin buenascondiciones para su multiplicacin. Sin embargo,cuando se presenta un desarrollo excesivo dehongos, difcilmente puede efectuarse el recuento delas colonias de levaduras. Si tal es el caso, y existela necesidad de practicar su recuento, lorecomendable es preparar doble serie de dilucionesa incubar a 35C durante 48 horas, lo que permitedesarrollar a las levaduras cuando los hongos aunno cubren las placas, las colonias de levaduraspueden aparecer sobre la superficie o en el seno delmedio de cultivo. En el primero caso son circularesy de dimetro mayor; en el seno del medio suelenaparecer estrellas y algo ms pequeas.10

El Agar Dextrosa y Papa es un medio utilizado parael cultivo de hongos y levaduras a partir de muestras

de alimentos, derivados de leche y productoscosmticos. La infusin de papa promueve uncrecimiento abundante de los hongos y levaduras yel agar es adicionado como agente solidificante.9

El procedimiento seguido en el proceso deidentificacin seala bajar el pH del medio a 3.5 0.1 con cido tartrico al 10 %, para inhibir elcrecimiento bacteriano. 9

Como resultado del proceso de identificacin seespera que las levaduras sean observadas comocolonias de color crema o blanco. Los hongoscrecen como colonias difusas y de varios colores. 9

Recuento de Staphylococcus aureus en alimentos.

Las clulas de Staphylococcus aureus son Grampositivas, no mviles, esfricas y generalmentedispuestas en racimos irregulares. Staphylococcusaureus es catalasa positiva, anaerobio facultativo yforma colonias pequeas, circulares y convexassobre placas de agar.12

Staphylococcus aureus generalmente produce laenzima coagulasa, fermenta el manitol y otrosazcares formando cido pero no gas. Crece en unintervalo amplio de temperatura que va de 6.5 a 50C, con un ptimo entre 30 y 40 C, dependiendo delas condiciones de crecimiento. As mismo puedecrecer en un intervalo amplio de pH, de 4.2 a 9.3con un crecimiento ptimo entre pH de 7.0 a 7.5.Puede crecer en presencia de 10 % de cloruro desodio, siendo relativamente resistente a ladesecacin y al calor.12, 14

El crecimiento de Staphylococcus aureus esacompaado por la produccin de algunoscompuestos extracelulares tales como hemolisinas,nucleasas, coagulasas, lipasas y enterotoxinas. Estasenterotoxinas pueden causar intoxicacionesalimentarias y son producidas por casi una terceraparte de las cepas de Staphylococcus aureuscoagulasa positivas.11, 13La intoxicacin estafiloccica se caracteriza pornuseas, vmito, fuertes calambres abdominales yocasionalmente diarrea sin la presencia de fiebreque ocurre de 30 minutos a 8 horas despus de laingestin de los alimentos que contienen las EE,aunque comnmente el periodo de incubacin deesta enfermedad es de 2 a 4 horas.13

La mayora de los brotes resultan de lacontaminacin con Staphylococcus aureus delalimento frecuentemente manipulado encondiciones no higinicas y la conservacin delmismo a temperaturas inadecuadas que permiten elcrecimiento del microorganismo y la sntesis de lasenterotoxinas. Es importante sealar que losalimentos que contienen EE tienen apariencia, olory sabor normal.13

En nuestro pas el control sanitario de los alimentosen relacin con Staphylococcus aureus se realizadeterminando el contenido de estafilococospresentes en el alimento, ya que un nmero elevadode estos (105-106 UFC/g) nos indica el riesgopotencial del alimento de contener enterotoxina, yrealizando las pruebas de coagulasa ytermonucleasa las cuales se han relacionado con lacapacidad de las cepas de producir enterotoxina, sinembargo, se sabe que existen cepas termonucleasa ycoagulasa negativas productoras de enterotoxinas.1,10

Pueden encontrarse en la literatura numerososinformes sobre el diseo y evaluacin de medios decultivo a los que se han incorporado una variedad deagentes selectivos, la mayora de ellos recurren alempleo del telurito de potasio o a la incorporacinde cloruro de sodio hasta 7.5 y 10 %. Los medios deStaphylococcus 110 y Chapman tan utilizados en laBacteriologa Medica, tienen escaso valor en losalimentos debido a la abundante y variada floracompetitiva que suele encontrarse en estos ltimos.Sin embargo, esto ltimo puede revertirse si seincorporan al medio algunas substancias o seaumenta su concentracin como ocurre con la yemade huevo, el manitol y el extracto de levadura.14

El medio Baird Parker es el recomendado por laNorma Oficial Mexicana NOM-115-SSA1-1994 yaque posee una gran capacidad para impedir eldesarrollo de la flora asociada e incluso de cepascoagulasa negativa de Staphylococcus aureus,algunos enterococos, micrococos y corinebacteriasllegan a desarrollar y formar colonias negras peroninguno clarifica la yema de huevo: las levaduras ylos bacilos Gram positivos que llegan a crecerforman colonias grises.3, 9, 10

El Agar Staphylococcus 110 es utilizado para elaislamiento y diferenciacin de estafilococos en

base a la fermentacin de manitol, la formacin depigmento y la hidrlisis de gelatina. Para Observarla fermentacin del Manitol, se adicionan unasgotas del indicador de azul de bromo timol en ellugar donde previamente se ha tomado una colonia.9

Identificacin de la presencia de Salmonella enalimentos.

En general los alimentos involucrados en eldesarrollo de la Salmonella son: productos crnicos,lcteos, pescados y verduras. Las tcnicas para elaislamiento de Salmonella a partir de los alimentosconstituyen un ejemplo muy ilustrativo de laflexibilidad fisiolgica de las bacterias, de lasinfluencia que sobre sta tienen los diferentestratamientos con los que la industria procesa losalimentos y la variedad de diseos que elmicrobilogo puede llevar a efecto en las tcnicasde laboratorio para poner de manifiestocontaminaciones aun mnimas por microorganismosy que con frecuencia se han visto seriamentelesionados en su viabilidad. Diversas variables hansido sealadas como factores que influyen en lastcnicas de anlisis, ellas son4,5:

El tamao del inoculo en la muestra. El tipo de medio de pre-enriquecimiento y

de enriquecimiento. La composicin qumica del alimento. Tipo de densidad de la flora bacteriana

asociada a Salmonella. La temperatura y el tiempo de incubacin de

los medios de enriquecimiento. El numero de salmonellas presentes en el

alimento y an mejor en la alcuotaexaminanda.

Los serotipos de Salmonella involucrados.

En la tcnica de cultivo la metodologa generalincluye 5 procesos o etapas elementales, que son:Pre-enriquecimiento o enriquecimiento no selectivo,Enriquecimiento en medios selectivos, Aislamientoen medios diferenciales, Identificacin presuntivapor pruebas bioqumicas e Identificacinserolgica.6, 10

El propsito del pre-enriquecimiento consiste enfacilitar a las salmonellas presentes unarecuperacin del estado en el que se encuentrencomo resultado de la exposicin a condiciones

traumatizantes durante la elaboracin de algunosalimentos (como leche en polvo, harina de pescado,jamn, etc.). Los medios de cultivo que se utilizanpara el pre-enriquecimiento no contienen engeneral sustancias inhibidoras, por lo que la floraasociada no se ve impedida para proliferar. De ahque el pre-enriquecimiento deba manejarsecautelosamente para obtener sus beneficios en larecuperacin de las salmonellas y evitar un sobre-desarrollo de la flora competitiva que enmascararasu asilamiento. En los alimentos crudos y en lossuaves procesados (carnes crudas, chorizos, etc.), elempleo del pre-enriquecimiento no esrecomendable. Es necesario tomar en consideracinque las salmonellas en los productos procesadospueden encontrarse no solo mermadas en suvitalidad, sino generalmente en escaso nmero.4, 6

Dos grupos de medios de enriquecimientoselectivos han sido utilizados con mayor profusin:El grupo del Tetrationato (caldo Tetrationato-bilis-verde brillante o medio de Kauffmann, caldoTetrationato verde brillante, caldo Tetrationato-sulfatiazol-bilis-verde brillante y caldo Tetrationatonovobiocina) y el grupo del selenito (caldo selenitoF, caldo selenito-cistina, caldo selenito-verdebrillante y caldo selenito-sulfa-verde brillante).6, 8, 9

Los medios del grupo Tetrationato, contienen unafuente de nitrgeno orgnico a base de peptona,triptona, extracto de carne o extracto de levadura,adicionado, segn el caso, de sales biliares onovobiocina para inhibir a bacterias Gram positivas;el verde brillante puede inhibir adems de estasbacterias a los coliformes, el carbonato de calcio espara regular el pH neutralizando el cido que se vagenerando y el tiosulfato de sodio que parcialmentepasa a Tetrationato de sodio (cuando se adiciona elyodo al inocular la muestra) tienen un efecto txicocuando actan en combinacin, segn se cree porreaccin con los grupos sulfhdrilo de las entintasinvolucradas en la sntesis de la membrana y paredcelular de las bacterias sensibles.6, 8 , 9

Otros caldos de enriquecimiento que tambin seutilizan con cierta preferencia son el medio deRappaport en el cual los coliformes son inhibidospor el verde de malaquita cuyo efecto nocivo sobrelas salmonellas se contrarresta por la adicin delcloruro de magnesio; el caldo GN de Hajna, concitrato y desoxicolato de sodio corno inhibidores decoliformes y bacterias Gram positivas y laincorporacin de manitol para favorecer el

desarrollo de Salmonella sobre Proteus. En laprctica, la recomendacin general consiste en elempleo de dos medios de enriquecimiento para cadamuestra de alimento.8, 9

Como consecuencia del empleo de los medios deenriquecimiento se obtiene, despus de laincubacin, una flora mixta en los caldos y a partirde ello se procede al aislamiento de las salmonellas,lo cual se realiza en medios slidos los quemantienen un efecto inhibitorio sobre la floraasociada, estimulando la formacin de colonias deSalmonella y finalmente comunican a stas,caractersticas diferenciales respecto a las coloniasde otros microorganismos. En atencin a su fuerzaselectiva, se pueden constituir tres grupos:ligeramente selectivos (Agar Eosina y Azul deMetileno y al Agar MacConkey); moderadamenteselectivos (Agar Entrico de Hektoen, y Agar

o sea Agar Xilosa lisina desoxicolato) yfuertemente selectivos (Agar verde brillante y Agarsulfito de bismuto).6, 8

Entre las caractersticas generales de las coloniasque se desarrollan en los medios utilizados en estametodologa se encuentran las siguientes; segn elmedio de cultivo6, 8, 9:

Agar de Eosina Azul de Metileno (EMB):Colonias de Salmonella y Shigella sonligeramente elevadas, de 1 a 2 mm dedimetro y transparentes (desde incolorashasta ambarinas).

Medio de MacConkey: Las colonias son de1 a 2 mm de dimetro, incoloros ytransparentes.

Agar Entrico de Hektoen: Las coloniasson de 2 a 3 mm de dimetro, transparentes,de color verde-azul, algunas con centronegro y bordes claros. Los coliformes seobservan de color salmn o anaranjados.

Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD):Las colonias son de 0.5 a 1.5 mm dedimetro, transparentes u opacas, incoloras oligeramente rojizas.

Agar verde brillante: Las colonias son de0.5 a 1.5 mm de dimetro, transparentes uopacas, incoloras, rosas o ligeramenterojizas.

Agar Sulfito de Bismuto: Las colonias sonde 1 a 2 mm de dimetro, opacas o de colorcaf, grisceas o negras con brillo metlico.

Por ltimo se describirn ;brevemente, unaserie de pruebas bioqumicas que sirven parala identificacin ms precisa de diferentes tiposde bacterias, segn su respuesta a diferentesmedios de cultivo y reactivos qumicos.9, 15, 16

Prueba de hemolisis. Sembrado en medio deAgar Sangre.

Es un medio diferencial, ya que permite comprobarsi la bacteria es capaz de hemolizar los eritrocitosdel medio de cultivo. Si la hemlisis que se producees total, se denomina -hemlisis; si es parcial -hemlisis, y cuando no existe, se habla de hemlisistipo gamma.

Prueba de fermentacin de lactosa. Inoculacindel Agar MacConkey.

Es tambin un medio diferencial, porque contienelactosa y un indicador de pH. Las bacterias capacesde fermentar este azcar producirn un cambio en elpH del medio por la liberacin de productos cidos.Como consecuencia sus colonias aparecern decolor violeta, contrastando con la coloracinamarillenta de las colonias de bacterias incapaces defermentar la lactosa.

Prueba de la Catalasa.

Las bacterias que viven en ambientes aerobiosnecesitan un equipo enzimtico capaz de neutralizarestas formas txicas. Entre estas enzimas seencuentra la catalasa, que convierte el perxido dehidrgeno en agua y oxgeno molecular. La pruebade la catalasa es positiva cuando se ponen encontacto una bacteria con actividad catalasa conperxido de hidrgeno al 3% y se producenburbujas de oxgeno. Esta prueba se emplea paradiferenciar el gnero Staphylococcus (catalasapositivo) del gnero Streptococcus (catalasanegativo).Prueba de la fermentacin de manitol. Sembradoen medio de Agar de Sal y Manitol.

La produccin de cidos proveniente de lafermentacin del manitol es detectada por un virajedel indicador de pH presente en el medio (rojo defenol) a amarillo. St. aureus, fermentador del

manitol, crecer en el medio dando lugar a coloniasgrandes rodeadas de un halo amarillo, mientras queStaphylococcus epidermis, que no fermenta elmanitol, dar lugar a colonias pequeas rodeadas deun halo prpura (a veces permite el desarrollo deEnterococcus faecalis, pero con un crecimiento muypobre).Prueba de la Citocromo C Oxidasa enportaobjetos.La prueba de la citocromo c oxidasa detecta lapresencia de citocromo c en la bacteria. Se basa enla capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamonio de oxidarse al ceder electrones alcitocromo c. Este colorante es incoloro en estadoreducido y puede oxidarse rpidamente en presenciadel citocromo c, produciendo formas coloreadas(azul). Esta prueba permite diferenciar el grupoEnterobacteriaceae (que carecen del citocromo c)del gnero Pseudomonas (que posee citocromo c).

Prueba de Citrato. Sembrado en medio de AgarCitrato de Simmons.

nicamente las bacterias capaces de metabolizar elcitrato podrn multiplicarse en este medio y, alhacerlo, utilizarn los fosfatos presentes liberandoiones amonio. Esta liberacin de iones bsicos,junto con la eliminacin del citrato (cido), generaruna fuerte basificacin del medio que ser aparentepor un cambio de color del indicador de pH, deverde a azul prusia.

Prueba de la hidrlisis de fenilalanina.Sembrado en medio de Agar de fenilalanina.

Es empleado para determinar la presencia de laenzima fenilalanina desaminasa en las bacterias. Laaccin de esta enzima se evidencia por la aparicinen el medio del producto resultante (cidofenilpirvico), que se detecta mediante la adicin decloruro frrico, resultando un compuesto decoloracin verde oscuro.

Prueba del Indol. Inoculacin de un medio SIM.

El SIM es un medio semislido usadorutinariamente en la diferenciacin e identificacinde cultivos puros de enterobacterias, que detecta laproduccin de sulfuros, Indol y movilidad de lasmismas. La produccin de Indol se revela por medio

de los reactivos de Ehrlich o de Kovacs que dan unacoloracin rojo prpura si es positiva.

Prueba de la fermentacin. Inoculacin de caldoMR-VP.

Las enterobacterias son anaerobios facultativos queutilizarn la glucosa en dos fases: primero lametabolizarn aerobiamente (respiracinoxibintica) consumiendo rpidamente el oxgenodel medio, para, en segundo lugar, continuarmetabolizndola por va anaerobia (fermentacin).Esta fermentacin puede ser de dos tipos:

a) Fermentacin cido-mixta. Los productosfinales son cidos orgnicos (frmico,actico, lctico y succnico) y etanol. Pruebapositiva: Color Rojo

b) Fermentacin butiln-gliclica. Losproductos finales son compuestos neutroscomo el butanodiol y el etanol,producindose acetona como intermediario.Prueba positiva: Color Rojo-Salmon.

Prueba de la fermentacin de glucosa. Sembradoen medio de Agar de hierro de Kliger.

Este medio se puede ser muy til, ya que demuestravarias caractersticas enzimticas de la bacteria.

a) Fermentacin de la glucosa. Viraje a coloramarillo en el fondo del slant . Si la bacteriafermenta solo la glucosa, en la superficie delslant la utilizar por va respiratoria, y,donde la tensin de oxgeno disminuya losuficiente, emplear una pequea proporcinpor va fermentativa. Esto generar unapequea cantidad de cidos que sernneutralizados por las aminas derivadas de ladescarboxilacin oxidativa de las protenas(proceso que depende del oxgeno). Comoresultado, el medio mantendr su color rojoen la superficie, al no haber cambio de pH.Por el contrario, las bacterias crecidas en laprofundidad del slant emplearn desde elprimer momento la glucosa por vafermentativa, generando cidos que no sernneutralizados, provocndose un descenso delpH y el color del medio en el fondo del tubocambiar a amarillo.

b) Fermentacin de la lactosa. Viraje a coloramarillo en la superficie del slant. Si labacteria, adems, fermenta la lactosa, loscidos producidos modifican tambin el pHde la superficie del medio. En este caso lasaminas no son capaces de neutralizar lacantidad de cidos producidos en estafermentacin, ya que la lactosa se encuentraen el medio a mayor concentracin que laglucosa. Como consecuencia, el color delmedio en la superficie cambiar a marillo.

c) No fermentacin de los azcares. El slantno cambia de color. Si la bacteria es aerobiaestricta (no fermentadora), como, porejemplo, el gnero Pseudomonas, el mediopermanecer de color rojo. En este caso, losazcares son respirados, degradndosecompletamente hasta CO2, que se elimina yno modifica el pH.

d) Produccin de gas en la fermentacin.Aparicin de burbujas, rotura o elevacindel agar del fondo del tubo.

e) Produccin de H2S. Aparicin de unprecipitado de color negro en el fondo deltubo. Algunas bacterias respiradorasanoxibinticas son capaces de emplear eltiosulfato sdico como aceptor final deelectrones en la cadena transportadora.Como consecuencia, este compuesto sereduce a cido sulfhdrico, que, a su vez,reacciona con el hierro (Fe2+) presente en elmedio formando un precipitado negro desulfuro de hierro. Los iones Fe2+ proceden delos iones Fe3+ del citrato frrico y aparecendebido a los cambios en los potencialesRedox producidos al someter al autoclave elmedio de cultivo.

Metodologa:

Preparacin y esterilizacin delmaterial a utilizar.

Pipetas.

Se seleccionaron 10 pipetas graduadas de 10 mL, 10pipetas graduadas de 5mL y 10 pipetas graduadasde 1 mL. Posteriormente las 30 pipetas se lavaron,enjuagaron y secaron perfectamente y se le coloco acada una de ellas un filtro de algodn. Luego secolocaron con sumo cuidado en un cilindro de aceroinoxidable, el cual fue sellado con cinta testigopara esterilizacin. El material fue esterilizado enun horno (THERMO-70 LINDBERG/BLUE M) a170C durante aproximadamente 2 horas.Cajas de Petri.Se tomaron 10 cajas de Petri de cristal, se lavaron,enjugaron y secaron perfectamente y se form unatorre con las 10 cajas de Petri, cuidando que la tapade cada una de ellas estuviese en posicin haciaabajo. Luego el grupo de 10 cajas de Petri fuecolocado con sumo cuidado en un cilindro de aceroinoxidable, el cual fue sellado con cinta testigopara esterilizacin. El material fue esterilizado enun horno (THERMO-70 LINDBERG/BLUE M) a170C durante aproximadamente 2 horas.Solo se prepar esa cantidad de cajas de Petri, puesen general se usaron cajas de Petri plsticas yaestriles.

Material en general.

Material de cristalera y porcelana en general, fuelavado, enjuagado y secado perfectamente.Enseguida fue envuelto en papel de estraza ycolocado en bolsas plsticas y fue esterilizado conla ayuda de la autoclave, a una temperatura de121C durante 15 minutos.

Determinacin de diversosmicroorganismos contenidos en unamuestra de chorizo de resregional.

Nota: Todo el material usado para el manejo ypreparacin de todas las soluciones y mediosindicados a continuacin, fueron esterilizadospreviamente, apegados en la medida de lo posible ala NOM-109-SSA1-1994: Procedimientos para latoma, manejo y transporte de muestras dealimentos para su anlisis microbiolgico y laNOM-110-SSA1-1994: Preparacin y dilucin demuestras de alimentos para su anlisismicrobiolgico.3

Preparacin de la muestra a analizar paraposteriores pruebas microbiolgicas.

De la manera ms asptica posible; dentro de lasposibilidades del laboratorio de bioqumica, sepesaron 10 g de chorizo de res regional en unabscula analtica. Posteriormente se coloc lamuestra pesada en un mortero de porcelana, y seaadieron 90 ml de Buffer de fosfatos, pHaproximado a 7.2; previamente esterilizado enautoclave a una temperatura de 121C durante 15minutos, y se homogenizo la muestra con ayuda deun pistilo. Luego se tomaron 4 tubos de ensaye conrosca que contenan cada uno 9 mL de Buffer defosfatos, pH aproximado a 7.2; estos tubos con sucontenido fueron previamente esterilizados enautoclave a una temperatura de 121C durante 15minutos, y se procedi a realizar dilucionesseriadas, tomando inicialmente 1 mL de la muestra10-1; que correspondi a la muestra homogenizadaobtenida anteriormente, hasta obtener una dilucinde 10-5.

El procedimiento anterior se realizo en una zonaestril, previamente esterilizando con alcohol al70% la mesa de trabajo y por la presencia de dosmecheros de Fisher encendidos en todo el momentode la preparacin.

Recuento de microorganismos mesoflicosaerbicos en alimentos.

De las diluciones 10-2, 10-3 y 10-5; de muestraproblema anteriormente realizadas, se tom 1 mLde cada una de ellas para inocular 3 respectivascajas de de Petri estriles previamente rotuladas.

Luego a cada una de ellas se le adicionoaproximadamente 15 mL de Agar para MtodosEstndar; previamente preparado y/o esterilizadosegn indicaciones del envase del medio,mantenindolo a 45C en bao de agua. Enseguidase procedi a homogenizar el inoculo en el mediode cultivo de cada una de las cajas de Petri y sedejaron solidificar. Las cajas de Petri inoculadasfueron incubadas en posicin invertida a unatemperatura de 35C durante aproximadamente 48horas.

El procedimiento anterior se realizo en una zonaestril, previamente esterilizando con alcohol al70% la mesa de trabajo y por la presencia de dosmecheros de Fisher encendidos en todo el momentode la realizacin.

Recuento de microorganismos coliformes enplaca.

De las diluciones 10-1, 10-3 y 10-5; de muestraproblema anteriormente realizadas, se tom 1 mLde cada una de ellas para inocular 3 respectivascajas de de Petri estriles previamente rotuladas.Luego a cada una de ellas se le adicionoaproximadamente 15 mL de Agar Bilis RojoVioleta; previamente preparado y/o esterilizadosegn indicaciones del envase del medio,mantenindolo a 45C en bao de agua. Sehomogenizo lo mejor posible el medio con elinoculo y se dejo solidificar sobre la mesa detrabajo. Enseguida se agregaron otros 5 mL delmismo medio a cada una de las 3 placas de Petri;extendindolo para cubrir completamente lasuperficie de cada una de ellas. Nuevamente lascajas de Petri se dejaron solidificar y fueronincubadas en posicin invertida a una temperaturade 35C durante aproximadamente 24 horas.El procedimiento anterior se realizo en una zonaestril, previamente esterilizando con alcohol al70% la mesa de trabajo y por la presencia de dosmecheros de Fisher encendidos en todo el momentode la realizacin.

Recuento de microorganismos coliformes, por latcnica del NMP (Numero Ms Probable).

Prueba presuntiva

Se prepararon 6 tubos de ensaye con una campanade fermentacin; previamente rotulados, quecontenan cada uno 10 mL de caldo Lactosado (ensustitucin del caldo lauril sulfato triptosa), segnindicaciones de preparacin y/o esterilizacin delenvase del caldo. Luego los tubos anteriores fueronseparados en tres grupos de dos tubos cada uno, ycada grupo fue inoculado con 1mL; por cada tubo,de las diluciones seriadas con muestra problema. Elprimer grupo te tubos con caldo Lactosado, fueinoculado con una dilucin de 10-1, el segundogrupo fue inoculado con una dilucin de 10-2 y eltercer grupo fue inoculado con una dilucin de 10-3.Despus de lo anterior los 6 tubos se incubaron auna temperatura de 35C durante aproximadamente48 horas. Se observ la presencia o ausencia de gasen las campanas de fermentacin.

Prueba confirmativa.Se prepararon 3 tubos de ensaye con una campanade fermentacin; previamente rotulados, quecontenan cada uno 10 mL de caldo bilis verdebrillante, segn indicaciones de preparacin y/oesterilizacin del envase del caldo. Luego seselecciono un tubo de ensaye con caldo Lactosadocon resultado positivo, de cada uno de los 3 gruposde la anterior prueba presuntiva y se transfiri decada uno de ellos de 4 a 5 asadas a un respectivotubo de ensaye con caldo bilis verde brillante.Terminando lo anterior, los 3 tubos de ensaye concaldo bilis verde brillante inoculados fueronincubados a una temperatura de 35C duranteaproximadamente 48 horas. Se observ la presenciao ausencia de gas en las campanas de fermentacin.

Los procedimientos anteriores se realizaron en unazona estril, previamente esterilizando con alcoholal 70% la mesa de trabajo y por la presencia de dosmecheros de Fisher encendidos en todo el momentode la realizacin.

Recuento de Hongos filamentosos y levaduras enalimentos.

Hongos.

De las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3; de muestraproblema anteriormente realizadas, se tom 1 mLde cada una de ellas para inocular 3 respectivascajas de de Petri estriles previamente rotuladas.Luego a cada una de ellas se le adicionoaproximadamente 15 mL de Agar papa dextrosaacidificado con cido tartrico al 10% con un pHaproximado a 3; previamente preparado y/oesterilizado segn indicaciones del envase delmedio, mantenindolo a 45C en bao de agua. Sehomogenizo lo mejor posible el medio con elinoculo y se dejo solidificar sobre la mesa detrabajo. Las cajas de Petri inoculadas fueronincubadas en posicin invertida a una temperaturaaproximada de 25C durante aproximadamente 5das.

Levaduras.

De las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3; de muestraproblema anteriormente realizadas, se tom 1 mLde cada una de ellas para inocular 3 respectivascajas de de Petri estriles previamente rotuladas.Luego a cada una de ellas se le adicionoaproximadamente 15 mL de Agar papa dextrosaacidificado con cido tartrico al 10% con un pHaproximado a 3; previamente preparado y/oesterilizado segn indicaciones del envase delmedio, mantenindolo a 45C en bao de agua. Sehomogenizo lo mejor posible el medio con elinoculo y se dejo solidificar sobre la mesa detrabajo. Las cajas de Petri inoculadas fueronincubadas en posicin invertida a una temperaturaaproximada de 35C durante aproximadamente 48horas.


Recuento de Staphylococcus aureus en alimentos.

Prueba en Agar Baird Parker (Dispersin convarilla).Se tomaron 3 cajas de Petri estriles previamenterotuladas y se realizo un vaciado de 15 mL de AgarBaird Parker; previamente preparado y/oesterilizado segn indicaciones del envase delmedio, en cada una de ellas. Se espero a quesolidificaran y se procedi a realizar la inoculacinde cada una de ellas tomando 0.1 mL de lasdiluciones 10-1, 10-2 y 10-3; respectivamente, demuestra problema anteriormente realizadas.Enseguida se procedi a distribuir el inoculo decada una de las tres placas sobre la superficie delagar con ayuda de una varilla de vidrio estril(esterilizada con alcohol de 90 y por flameado enmechero de Fisher) doblada en ngulo recto. Seespero a que el inoculo fuese absorbido totalmentepor el agar para que luego las cajas de Petriinoculadas fueran incubadas en posicin invertida auna temperatura de 35C durante aproximadamente48 horas.

Prueba en Agar Staphylococcus 110 (Estracruzada).Se tomaron 2 cajas de Petri estriles previamenterotuladas y se realizo un vaciado en las mismas de15 mL de Agar Staphylococcus 110; previamentepreparado y/o esterilizado segn indicaciones delenvase del medio, en cada una de ellas. Se espero aque solidificaran y se procedi a realizar lainoculacin de cada una de ellas por medio de laaplicacin de la tcnica de estra cruzada, tomandouna asada (una gota); con ayuda de un asa deacero inoxidable para inoculacin, de la dilucin 10-1, de muestra problema anteriormente preparada. Se

realizaron aproximadamente de 2 a 3 series deestras efectivas en cada una de las placas, cuidandoen todo momento de esterilizar perfectamente el asapara inoculacin mediante un flameado de la mismacon ayuda de un mechero de Fisher, en cadainoculacin. Despus de lo anterior las cajas dePetri inoculadas fueran incubadas en posicin

invertida a una temperatura de 35C duranteaproximadamente 48 horas.


Presencia de Salmonella en alimentos.

Enriquecimiento.

Se prepararon 2 tubos de ensaye con rosca;previamente rotulados, vertiendo en el primero 10mL de caldo de Tetrationato, adicionando en elmismo 0.2 mL de iodo-yodurado y en el segundo 10mL de caldo de Rappaport-Vassiliadis (ensustitucin del caldo de Selenito-Cistina); amboscaldos se prepararon segn indicaciones depreparacin y/o esterilizacin del envase del mediocorrespondiente. Enseguida; tanto al tubo con caldode Tetrationato con iodo-yodurado, como al tubocon caldo de Rappaport-Vassiliadis, se les agrego 1mL de la dilucin 10-1, de muestra problemaanteriormente preparada, y se incubaron a unatemperatura aproximada de 35C durante 24 horas.Aislamiento.

Se tomaron 8 cajas de Petri estriles previamenterotuladas y se realizo inicialmente un vaciado porduplicado (en dos placas) de 15 mL de Agar deEosina y azul de metileno; EMB, luego se realizootro vaciado por duplicado de 15 mL de AgarEntrico de Hektoen, enseguida se realizo un tercervaciado por duplicado de 15 mL de AgarMacConkey y por ltimo se realizo con las dosplacas de Petri restantes un vaciado por duplicadode 15 mL de Agar Verde Brillante. Se espero a quesolidificaran los medios de las 8 cajas de Petri y seprocedi a realizar la inoculacin de cada una deellas en dos series; una serie de 4 cajas de Petri condiferente medio de cultivo y otra serie de 4 cajas depetri con diferente medio de cultivo (esta fue larazn de haber preparado por duplicado el vaciadode las placas), por medio de la aplicacin de la

tcnica de estra cruzada, tomando una asada (unagota); con ayuda de un asa de acero inoxidable parainoculacin. La primera serie de cajas de Petri seinoculo con la dilucin de enriquecimiento formadaen el caldo de Tetrationato y la segunda serie seinoculo con la dilucin de enriquecimiento formadaen el caldo de Rappaport-Vassiliadis, anteriormentepreparados. Se realizaron aproximadamente de 2 a 3series de estras efectivas en cada una de las placas,cuidando en todo momento de esterilizarperfectamente el asa para inoculacin mediante unflameado de la misma con ayuda de un mechero deFisher, en cada inoculacin. Despus de lo anteriorlas cajas de Petri inoculadas fueran incubadas enposicin invertida a una temperatura de 35Cdurante aproximadamente 24 horas.


Determinacin de la morfologamacroscpica de colonias en mediosde cultivo.

Se determino con cierto grado de precisin, lascaractersticas morfolgicas de las coloniasbacterianas de estos tres distintos medios decultivos inoculados previamente: Agar Bilis RojoVioleta, Agar Baird Parker, Agar Entrico deHektoen. Las caractersticas que se encontraron,evaluaron y describieron las siguientes: Morfologacolonial (tamao, color, forma y pigmentacin almedio), Elevacin al medio (plana, elevada,convexa, acuminada o umbonada), Superficie (lisa,rugosa o filamentosa), Consistencia (suave,mucoide o dura). Esto mediante la ayuda de un asade acero inoxidable para inoculacin y observacinvisual.

El procedimiento anterior se realizo en una zonaestril, previamente esterilizando con alcohol al70% la mesa de trabajo y por la presencia de dos

mecheros de Fisher encendidos en todo el momentode la realizacin.

Fijacin bacteriana en unportaobjetos, tincin simple ytincin Gram.

Preparacin de un frotis bacteriano.

Se coloco una pequea gota de agua destilada en 2portaobjetos; previamente lavados, enjuagados ysecados perfectamente. Enseguida con ayuda de unasa de acero inoxidable para inoculacin;esterilizada mediante su flameado en un mechero deFisher, se transfiri una pequea cantidad de cultivobacteriano en medio slido; en este caso prctico seusaron los medios de Agar Baird Parker y AgarBilis Rojo Violeta previamente inoculados, a lapequea gota de agua colocada con anterioridad encada portaobjetos respectivamente, para formar unamezcla homognea, que se extendi con ayuda conla ayuda de un portaobjetos limpio. Se espero hastaque la fina pelcula de lquido que sobr seevaporase a temperatura ambiente.

Fijacin:La fijacin de las bacterias en el vidrio delportaobjetos despus de realizar el frotis, consistien pasar tres veces el portaobjetos por la llama deun mechero de Fisher rpidamente, dejando enfriarel portaobjetos entre cada pase (en este caso slo serealizaron fijaciones de bacterias procedentes demedios slidos).

Tincin simple.

Despus de haber realizado el frotis y fijacinbacteriana de los dos portaobjetos anteriormentemencionados; realizados con los cultivos de losmedios bacterianos de Agar Baird Parker y AgarBilis Rojo Violeta, se procedi a cubrir a losmismos con un colorante especfico; el primero concristal violeta y el segundo con safranina, dejandoactuar a los colorantes durante 2 minutos. Pasado eltiempo anterior se descarto el exceso de colorantecon un lavado superficial con agua destilada de los

dos portaobjetos, cuidando de eliminar de igualforma el exceso de agua en los mismos,golpendolos por su canto con sumo cuidado contrala superficie del vertedero de la mesa de trabajo. Seespero a que a temperatura ambiente el lquidorestante se evaporase y por ltimo los portaobjetosfueron observados en un microscopio compuestocon el objetivo de inmersin en aceite (a 100x).Tincin Gram.

Se prepararon dos frotis y fijaciones bacterianassiguiendo el procedimiento anteriormentemencionado, usando los siguientes mediosbacterianos de Agar Entrico de Hektoen y AgarBilis Rojo Violeta previamente inoculados.Enseguida los dos portaobjetos ya fijados con surespectivo inoculo, se tieron con cristal violeta,dejndose actuar a este ultimo durante 1 minuto.Pasado el lapso de tiempo anterior se procedi alavar ambos portaobjetos con abundante aguadestilada para eliminar el exceso de colorante ypoder proceder terminado lo anterior a cubrir ambosportaobjetos con solucin de lugol, dejando actuaresta solucin durante 1 minuto. Una vez terminadoel lapso anterior de tiempo, nuevamente se lavaronambos portaobjetos con abundante agua destiladapara eliminar el exceso de colorante y se procedi adecolorar los portaobjetos con solucin de alcohol-acetona durante aproximadamente 30 segundos.Nuevamente, una vez terminado el proceso anterior,se lavaron ambos portaobjetos con agua destiladapara eliminar residuos del disolvente utilizado.Luego de lo anterior, los portaobjetos se tieron consolucin de safranina, dejando actuar en ellos lasolucin durante 1 minuto. Por ltimo se realizonuevamente un lavado de los portaobjetos con aguadestilada para eliminar residuos del colorante decontraste anteriormente usado, cuidando de eliminarde igual forma el exceso de agua en los mismos,golpendolos por su canto con sumo cuidado contrala superficie del vertedero de la mesa de trabajo ydejando. Se espero a que a temperatura ambiente ellquido restante se evaporase y por ltimo losportaobjetos fueron observados en un microscopio

compuesto con el objetivo de inmersin en aceite (a100x).

Los procedimientos anteriores se realizaron en unazona estril, previamente esterilizando con alcoholal 70% la mesa de trabajo y por la presencia de dosmecheros de Fisher encendidos en el momento de larealizacin de inoculaciones y/o en aberturas deplacas de petri inoculadas.

Aislamiento e identificacinbacteriana.

Identificacin de bacterias Gram positivo oGram negativo.

Mediante las anteriores Tinciones Gram, secomprob que en los medios seleccionados; pormedio de la observacin en el microscopio, existala presencia de microorganismos con morfologa debacilos Gram negativos.

Prueba de hemolisis. Sembrado en medio de AgarSangre.

Se tomo 1 caja de Petri estril previamente rotuladay se realizo un vaciado en la misma de 15 mL deAgar Sangre; previamente preparado y/oesterilizado segn indicaciones del envase delmedio (este medio se preparo sin usar sangre). Seespero a que solidificara y se procedi a realizar lainoculacin del mismo por medio de la aplicacinde la tcnica de estra cruzada, tomando una asadade una colonia bacteriana formada en el Agar deEntrico de Hektoen, anteriormente inoculado; conayuda de un asa de acero inoxidable parainoculacin. Se realizaron aproximadamente de 2 a3 series de estras efectivas en la placa, cuidando entodo momento de esterilizar perfectamente el asapara inoculacin mediante un flameado de la mismacon ayuda de un mechero de Fisher, en cadainoculacin. Despus de lo anterior la caja de Petriinoculada fue incubada en posicin invertida a unatemperatura aproximada de 37C duranteaproximadamente 24 horas.

Prueba de fermentacin de lactosa. Inoculacindel Agar MacConkey.

Se tomo 1 caja de Petri estril previamente rotuladay se realizo un vaciado en la misma de 15 mL deAgar MacConkey; previamente preparado y/oesterilizado segn indicaciones del envase delmedio. Se espero a que solidificara y se procedi arealizar la inoculacin del mismo por medio de laaplicacin de la tcnica de estra cruzada, tomandouna asada de una colonia bacteriana formada en elAgar Bilis Rojo Violeta, anteriormente inoculado;con ayuda de un asa de acero inoxidable parainoculacin. Se realizaron aproximadamente de 2 a3 series de estras efectivas en la placa, cuidando entodo momento de esterilizar perfectamente el asapara inoculacin mediante un flameado de la mismacon ayuda de un mechero de Fisher, en cadainoculacin. Despus de lo anterior la caja de Petriinoculada fue incubada en posicin invertida a unatemperatura aproximada de 37C duranteaproximadamente 24 horas. Se observ lacoloracin formada en el medio.

Identificacin de bacterias Gram positivo.

Prueba de la Catalasa.

En un portaobjetos, previamente lavado, enjuagadoy secado perfectamente, se coloc una gota deperxido de hidrogeno y se aadi una asada deuna colonia bacteriana formada en el Agar ST-110,anteriormente inoculado; con ayuda de un asa deacero inoxidable para inoculacin, cuidando en todomomento de esterilizar perfectamente el asa parainoculacin mediante un flameado de la misma conayuda de un mechero de Fisher. Se observ si existela presencia de burbujas o no.Prueba de la fermentacin de manitol. Sembradoen medio de Agar de Sal y Manitol.

Se tomaron 2 tubos de ensaye con rosca,previamente rotulados y se realizo un vaciado en losmismos de aproximadamente 3 mL de Agar de Sal yManitol; previamente preparado y/o esterilizadosegn indicaciones del envase del medio, en cada

uno de ellos. Se colocaron de forma inclinada paraformar un menisco y se espero a que solidificaran,enseguida se procedi a realizar la inoculacin decada uno de los tubos de ensaye por medio de laaplicacin de la tcnica de estra cruzada, con unaasada de una colonia bacteriana formada en elAgar ST 110, anteriormente inoculado; con ayudade un asa de acero inoxidable para inoculacin,cuidando en todo momento de esterilizarperfectamente el asa en cada inoculacin, medianteun flameado de la misma con ayuda de un mecherode Fisher. Despus de lo anterior los tubos deensaye inoculados fueron incubados a unatemperatura aproximada de 37C durante 24 horas.Se observ la coloracin formada en el medio.

Identificacin de bacterias Gram positivo.

Prueba de la Citocromo C Oxidasa enportaobjetos.En un portaobjetos, previamente lavado, enjuagadoy secado perfectamente, se coloc una gota delcolorante tetrametil-p-fenilendiamonio y se aadiuna asada de una colonia bacteriana formada en elAgar Sangre, anteriormente inoculado; con ayudade un asa de acero inoxidable para inoculacin,cuidando en todo momento de esterilizarperfectamente el asa para inoculacin mediante unflameado de la misma con ayuda de un mechero deFisher. Se observ la coloracin formada en elmedio.

Prueba de Citrato. Sembrado en medio de AgarCitrato de Simmons.

Se tomaron 2 tubos de ensaye con rosca,previamente rotulados y se realiz un vaciado en losmismos de aproximadamente 3 mL de Agar de Sal yManitol; previamente preparado y/o esterilizadosegn indicaciones del envase del medio, en cadauno de ellos. Se colocaron de forma inclinada paraformar un menisco y se espero a que solidificaran,enseguida se procedi a realizar la inoculacin decada uno de los tubos de ensaye por medio de laaplicacin de la tcnica de estra cruzada. Elprimero se inoculo con una asada de una colonia

bacteriana formada en el Agar Bilis Rojo Violeta,anteriormente inoculado, el segundo se inoculo conuna asada de una colonia bacteriana formada en elAgar Entrico de Hektoen, anteriormente inoculado;ambas inoculaciones se realizaron con ayuda de unasa de acero inoxidable para inoculacin, cuidandoen todo momento de esterilizar perfectamente el asaen cada inoculacin, mediante un flameado de lamisma con ayuda de un mechero de Fisher. Despusde lo anterior los tubos de ensaye inoculados fueronincubados a una temperatura aproximada de 37Cdurante 24 horas. Se observ la coloracin formadaen el medio.

Prueba de la hidrlisis de fenilalanina. Sembradoen medio de Agar de fenilalanina.Se tomaron 2 tubos de ensaye con rosca,previamente rotulados y se realiz un vaciado en losmismos de aproximadamente 3 mL de AgarFenilalanina; previamente preparado y/oesterilizado segn indicaciones del envase delmedio, en cada uno de ellos. Se colocaron de formainclinada para formar un menisco y se espero a quesolidificaran, enseguida se procedi a realizar lainoculacin de cada uno de los tubos de ensaye pormedio de la aplicacin de la tcnica de estracruzada. El primero se inoculo con una asada deuna colonia bacteriana formada en el Agar Entricode Hektoen, anteriormente inoculado, el segundo seinoculo con una asada de una colonia bacterianaformada en el Agar Bilis Rojo Violeta,anteriormente inoculado; ambas inoculaciones serealizaron con ayuda de un asa de acero inoxidablepara inoculacin, cuidando en todo momento deesterilizar perfectamente el asa en cada inoculacin,mediante un flameado de la misma con ayuda de unmechero de Fisher. Despus de lo anterior los tubosde ensaye inoculados fueron incubados a unatemperatura aproximada de 37C durante 24 horas.Pasado el lapso anterior de tiempo, se anexaron acada tubo inoculado, 5 gotas de cloruro de hierro(FeCl3) y se dejaron reaccionar durante 5 minutos.Se observ la coloracin formada en el medio.

Prueba del Indol. Inoculacin de un medio SIM.

Se tomaron 2 tubos de ensaye con rosca,previamente rotulados y se realiz un vaciado en losmismos de aproximadamente 5 mL de medio SIM;previamente preparado y/o esterilizado segnindicaciones del envase del medio, en cada uno deellos. El primero se inoculo con una asada de unacolonia bacteriana formada en el Agar Bilis RojoVioleta, anteriormente inoculado, el segundo seinoculo con una asada de una colonia bacterianaformada en el Agar Entrico de Hektoen,anteriormente inoculado; ambas inoculaciones serealizaron con ayuda de un asa de acero inoxidablepara inoculacin, cuidando en todo momento deesterilizar perfectamente el asa en cada inoculacin,mediante un flameado de la misma con ayuda de unmechero de Fisher. Despus de lo anterior los tubosde ensaye inoculados fueron incubados a unatemperatura aproximada de 37C durante 24 horas.Pasado el lapso anterior de tiempo, se anexaron acada tubo inoculado, 3 gotas de reactivo de Kovacsy se dejaron reaccionar durante aproximadamente 3minutos. Se observ la coloracin de la superficiedel medio.

Prueba de la fermentacin acido-mixta.Inoculacin de caldo MR-VP.

Se tom un tubo de ensaye con rosca, previamenterotulado y se realizo un vaciado en el mismos deaproximadamente 5 mL de Caldo de MR-VP;previamente preparado y/o esterilizado segnindicaciones del envase del medio. Enseguida seprocedi a realizar la inoculacin del tubo deensaye, con una asada de una colonia bacterianaformada en el Agar Entrico de Hektoen,anteriormente inoculado; con ayuda de un asa deacero inoxidable para inoculacin, cuidando en todomomento de esterilizar perfectamente el asa en cadainoculacin, mediante un flameado de la misma conayuda de un mechero de Fisher. Despus de loanterior el tubo de ensaye inoculado fue incubado auna temperatura aproximada de 37C durante 24horas. Pasado el lapso anterior de tiempo, seanexaron en el tubo inoculado, 3 gotas de rojo demetilo al 1%, se agito suevamente y se dejo

reaccionar durante 3 minutos. Se observ lacoloracin de la superficie del medio.

Prueba de la fermentacin butiln-gliclica.Inoculacin de caldo MR-VP.

Se tom un tubo de ensaye con rosca, previamenterotulado y se realizo un vaciado en el mismos deaproximadamente 5 mL de Caldo de MR-VP;previamente preparado y/o esterilizado segnindicaciones del envase del medio. Enseguida seprocedi a realizar la inoculacin del tubo deensaye, con una asada de una colonia bacterianaformada en el Agar Entrico de Hektoen,anteriormente inoculado; con ayuda de un asa deacero inoxidable para inoculacin, cuidando en todomomento de esterilizar perfectamente el asa en cadainoculacin, mediante un flameado de la misma conayuda de un mechero de Fisher. Despus de loanterior el tubo de ensaye inoculado fue incubado auna temperatura aproximada de 37C durante 24horas. Pasado el lapso anterior de tiempo, seanexaron en el tubo inoculado, 0.6 mL de -naftolal 5% y 0.2 mL de hidrxido de potasio (KOH) al40%, se agito suavemente y se dejo reaccionardurante 15 minutos. Se observ la coloracin de lasuperficie del medio.

Prueba de la fermentacin de glucosa. Sembradoen medio de Agar de hierro de Kliger.

Se tomaron 2 tubos de ensaye con rosca,previamente rotulados y se realiz un vaciado en losmismos de aproximadamente 3 mL de Agar dehierro de Kliger; previamente preparado y/oesterilizado segn indicaciones del envase delmedio, en cada uno de ellos. Se colocaron de formainclinada para formar un menisco y se espero a quesolidificaran, enseguida se procedi a realizar lainoculacin de cada uno de los tubos de ensaye pormedio de una puncin en el centro hasta el fondo yla aplicacin de la tcnica de estra cruzada en lasuperficie de cada tubo. El primero se inoculo conuna asada de una colonia bacteriana formada en elAgar Entrico de Hektoen, anteriormente inoculado,el segundo se inoculo con una asada de una

colonia bacteriana formada en el Agar Bilis RojoVioleta, anteriormente inoculado; ambasinoculaciones se realizaron con ayuda de un asa deacero inoxidable para inoculacin, cuidando en todomomento de esterilizar perfectamente el asa en cadainoculacin, mediante un flameado de la misma conayuda de un mechero de Fisher. Despus de loanterior los tubos de ensaye inoculados fueronincubados a una temperatura aproximada de 37Cdurante 24 horas. Se observ la coloracin en elfondo y la superficie del medio.

Los procedimientos anteriores se realizaron en unazona estril, previamente esterilizando con alcohol

al 70% la mesa de trabajo y por la presencia de dosmecheros de Fisher encendidos en el momento de larealizacin de inoculaciones y/o en aberturas deplacas de petri inoculadas.

Resultados.

Despus de haber realizado los procedimientos correspondientes para la identificacin y recuento de algunosmicroorganismo en la muestra de chorizo regional analizada se obtuvieron los siguientes datos.

Tabla 1. Conteo de Unidades Formadoras de Colonias de microorganismos Mesoflicos aerbicos en lamuestra problema.

Medio: Dilucin de la muestraproblema:

UFC/g

Agar Cuenta Estndar10-2 Incontables10-3 Incontables10-5 Incontables

Caractersticas generales del medio inoculado: En las tres cajas de Petri inoculadas con diferentes concentraciones demuestra problema se formaron conglomerados circulares de color blanco a amarillo, pero ninguno permita laidentificacin o cuantificacin de colonias individuales.

Tabla 2. Conteo de Unidades Formadoras de Colonias de microorganismos Coliformes en la muestraproblema.


UFC/g

Agar Bilis Rojo Violeta10-1 Ms de 250 (incontables)10-3 Menos de 20

(insignificantes)10-5 0

Caractersticas generales del medio inoculado: De las tres cajas de Petri inoculadas con diferentes concentraciones demuestra problema, solo se formaron colonias en las dos de mayor concentracin, su forma fue circular y de color rosa arojo.

Tabla 3. Anlisis de microorganismos Coliformes por tcnica del NMP (presencia o ausencia delmicroorganismo) en la muestra problema.


Formacin de gas. (+ -)

Caldo Lactosado(Prueba presuntiva)

10-1 +10-2 +10-3 +

Caldo Bilis Verde Brillante(Prueba confirmativa)

10-1 +10-2 +10-3 +

Caractersticas generales de los medio inoculados: Tanto el caldo Lactosado; de la prueba presuntiva, como el caldoBilis Verde Brillante; de la prueba confirmativa, presentaron la formacin de gas en la cavidad de las campanas defermentacin.

Tabla 4. Conteo de Unidades Formadoras de Colonias de Hongos y Levaduras en la muestra problema.


UFC/g

Agar papa dextrosa(Hongos)

10-1 3 aglomerados (incontables)10-2 1 aglomerado (incontables)10-3 0

Agar papa dextrosa(Levaduras)

10-1 2 aglomerados (incontables)10-2 010-3 0

Caractersticas generales de los medios inoculados:

- Hongos: Los aglomerados formados en las diluciones de 10-1 y 10-2 contenan colonias circulares de color negro,de tamao muy pequeo.

- Levaduras: Los aglomerados formados en la dilucin 10-1, de diferentes caractersticas. El primero presentabaun color de blanco a gris, mientras que el segundo presento un color amarillo crema.

Tabla 5. Conteo de Unidades Formadoras de Colonias de Staphylococcus aureus en la muestra problema.


UFC/g

Agar Baird Parker10-1 Incontables10-2 Formacin de aglomerados10-3 Menos de 20.

Agar ST-110 10-1 Formacin de aglomeradosen estras.

Caractersticas generales de los medios inoculados:

- Agar Baird Parker: Los aglomerados formados en las diluciones en general eran de color amarillo claro atransparentes y circulares.

- Agar ST-110s: Se formaron aglomerados circulares en las estras, de color transparente y amarillo claro.

Tabla 6. Identificacin de la presencia de Salmonella en la muestra problema.

Medio: Caldo de enriquecimiento: Caractersticas fsicas decolonias formadas:

Agar EMBC. Tetrationato IncolorasC. Rappaport-Vassiliadis Incoloras

Agar Entrico de Hektoen

C. Tetrationato Colonias de color verde,presencia de una solacolonia de color salmn.

C. Rappaport-Vassiliadis Colonias de color verde.Agar MacConkey C. Tetrationato Colonias aglomeradas de

color rosa.C. Rappaport-Vassiliadis Colonias aglomeradas de

color rosa, con halo de colorrosa ms claro opaco.

Agar Verde Brillante C. Tetrationato Ningn crecimientoapreciable

C. Rappaport-Vassiliadis Ningn crecimientoapreciable

Con el fin de poder apreciar e identificar algunas caractersticas morfolgicas de colonias microbianas, se evaluarondiferentes medios de cultivos previamente inoculados, obtenindose una breve descripcin de sus caractersticasmacroscpicas que a continuacin se detallan.

Tabla 7. Caractersticas morfolgicas de colonias bacterianas presentes en Agar Bilis Rojo Violeta.Caractersticas:

Tamao en mm: 2 a 3 mmColor: RosaForma: PuntiformePigmentacin al medio: Color ladrilloElevacin al medio: ConvexaSuperficie: LisaConsistencia: Dura

Tabla 8. Caractersticas morfolgicas de colonias bacterianas presentes en Agar Baird Parker.

Caractersticas:Tamao en mm: 2 a 5 mmColor: Crema-amarilloForma: Circular, irregularPigmentacin al medio: Amarillo translucidoElevacin al medio: Elevada, formacin de crterSuperficie: filamentosaConsistencia: Mucoide

Tabla 9. Caractersticas morfolgicas de colonias bacterianas presentes en Agar Entrico de Hektoen.

Caractersticas:Tamao en mm: 1 a 3 mmColor: Verde obscuroForma: PuntiformePigmentacin al medio: Verde translucidoElevacin al medio: ConvexaSuperficie: LisaConsistencia: Suave

Se trabajo en la metodologa de la realizacin de una fijacin microbiolgica en un portaobjetos, mediante la tcnicade frotis y tincin bacteriana; usando tanto tincin simple como tincin Gram. Esto se llevo a cabo de manera prcticamediante el uso de tres diferentes medios de cultivo previamente inoculados.

Tabla 10. Tincin Simple. Caractersticas fsicas observadas en un microscopio con el objetivo de inmersinen aceite (a 100x).

Medio inoculado: Colorante usado: Observacin:Agar Baird Parker Cristal violeta Presencia de aglomerados

amorfos de color violeta, no sepuede identificar ningn tipode microorganismoindependiente.

Agar Bilis Rojo Violeta Safranina Presencia de aglomeradosamorfos de color rosado, no sepuede identificar ningn tipode microorganismoindependiente.

Tabla 11. Tincin Gram. Caractersticas fsicas observadas en un microscopio con el objetivo de inmersin enaceite (a 100x).

Medio inoculado: Observacin:Agar Entrico de Hektoen Presencia de mltiples estructuras en forma

de bastones alargado; de un tamao muypequeo de coloracin rojiza a rosada.

Agar Bilis Rojo Violeta Presencia de mltiples estructuras en formade bastones alargado muy bien definidos;de un tamao muy pequeo con unacoloracin rosa.

Con la finalidad de poder tener una mayor certeza de la presencia e identificacin de la carga bacteriana contenida enla muestra problema; chorizo regional, se realizaron a medios de cultivo seleccionados, una serie de pruebasbioqumicas, obtenindose los resultados mostrados a continuacin.

Tabla 12. Resultados de identificacin microbiana, tras la realizacin de diversas pruebas bioqumicas.

Prueba: Medio/inoculo: Observacin:Hemolisis Agar Sangre / Agar Bilis Rojo

VioletaColonias en estras de colorblanco a transparente.

Fermentacin de lactosa Agar MacConkey / AgarEntrico de Hektoen

Cambio en el color del medio,de rojizo a amarillo, colonias.amarillas.

Catalasa H2O2 / ST 110 Produccin de burbujas deoxigeno.

Fermentacin del Manitol Agar SyM / ST 110 Formacin de coloniasblancas, cambio en superficiedel medio a color rojizo.

Citocromo C oxidasa Tetrametil-p-fenilendiamonio/ Agar Sangre

Se presento una decoloracinde azul-violeta muy oscura adiluida.

Citrato Agar Citrato de Simmons /Agar Bilis Rojo Violeta

Sin cambios en la coloracindel medio; verde.

Citrato Agar Citrato de Simmons /Agar Entrico de Hektoen

Cambio de coloracin delmedio, torno de verde a colorazul en la superficie.

Hidrlisis de fenilalanina Agar de fenilalanina/ AgarEntrico de Hektoen

Presento una coloracinamarilla en superficie.

Hidrlisis de fenilalanina Agar de fenilalanina/ AgarBilis Rojo Violeta

Presento una coloracinamarilla en superficie.

Indol Medio SIM / Agar Bilis RojoVioleta

Sin cambios en la coloracinoriginal del medio.

Indol Medio SIM / Agar Entrico deHektoen

Sin cambios en la coloracinoriginal del medio.

Fermentacin acido-mixta Caldo MR-VP / Agar Entricode Hektoen

El color del medio viro a uncolor anaranjado.

Fermentacin butiln-gliclica Caldo MR-VP / Agar Entricode Hektoen

El color del medio viro a uncolor anaranjado.

Fermentacin de glucosa Agar de hierro de Kliger /Agar Entrico de Hektoen

Presencia de unas pocasburbujas en superficie delmedio, no hay viraje de color;ni en el fondo ni en superficiedel medio.

Fermentacin de glucosa Agar de hierro de Kliger /Agar Bilis Rojo Violeta

Presencia de algunas burbujasen superficie y fondo delmedio, se presenta viraje decoloracin en el medio; decolor naranja a color amarilla,rupturas superficiales en elmedio.

Discusin.

Evaluacin de resultados obtenidos en laidentificacin de Bacterias, a travs deprocedimientos microbiolgicos y pruebasconfirmatorias bioqumicas

Mesoflicos aerbicos

Los datos encontrados en la Tabla 1, nos muestra; apesar de que las colonias formadas fueronincontables, que efectivamente existe la presenciade microorganismos mesoflicos aerobios. Al tenereste resultado y podemos inferir; al hacer referenciaa la literatura, la posible existencia de bacilos,cocos, Gram positivos y Gram negativos, asilados oagrupados4, recordando que el medio de cultivo y latcnica usada para esta prueba no es unaconfirmacin especifica, pero si nos puede ayudar aindicar la posible precia de algn microorganismopatgeno que requiera de oxigeno para sumetabolismo.4, 5

Organismos coliformes.En datos de la Tabla 2, que corresponde al nmerode crecimiento de colonias en el medio usado, nosmuestra un crecimiento colonial significativo; almenos en los inoculos con diluciones de mayorconcentracin. A pesar de que el conteo de lasUFC/g no pudo ser llevado a cabo de formasignificativa (posiblemente por errores en eldesarrollo correcto de la tcnica de inoculacin), laindiscutible presencia de colonias de color rosado9,caractersticas en bacterias fermentadoras delactosa9, fue un claro resultado POSITIVO a lapresencia de organismos coliformes. Este resultadoadems fue confirmado de forma positiva, tanto enla prueba presuntiva; apreciable en los datos de laTabla 2, como en la prueba confirmatoria;apreciable en los datos de la Tabla 3. Dondenuevamente se observa que la bacteria esfermentadora de lactosa9, sobre todo en la pruebadonde se uso caldo Verde Bilis Brillante, puesto queeste ayuda a inhibir tanto a bacterias Gram positivo,como Gram negativo; a excepcin de coliformes,

donde la bacteria representativa es Escherichiacoli.9 ,16

Una forma en la que dio la afirmacin de lapresencia de Escherichia coli en la muestraproblema evaluada, fue mediante la confirmacin dela presencia de bacterias del generoEnterobacteriaceae u Gram negativo, mediante laprueba bioqumica de la Citocromo C oxidasa; losresultados estn en la Tabla 12, dando un resultadoPOSITIVO a la presencia de bacterias que carecende la enzima oxidasa.15

Por ltimo, con los datos mostrados en la Tabla 12,especficamente en la prueba bioqumica defermentacin de glucosa y las caractersticasmostradas en el medio inoculado con colonias delAgar RVB; que presumiblemente contienecoliformes, y contrastando esta informacin con laliteratura15, 16, puede afirmarse la presencia de labacteria Escherichia coli.

Hongos y Levaduras

Como puede apreciarse en los resultados plasmadosen la Tabla 4, se confirmo la formacin de colonias,tanto en el medio usado para crecimiento deHongos, como en el de Levaduras. Sin embargo nologro llevarse a cabo un conteo significativo deUFC/g en ninguno de los dos casos, pues laformacin colonial fue en aglomerados. Lascaractersticas morfolgicas; como son el color ysuperficie de los crecimientos encontrados en losagares inoculados para el desarrollo de hongos ylevaduras; mostradas en la parte inferior de la Tabla4, nos brindan datos presumibles de una formacinpositiva; segn datos de la literatura9, tanto dehongos como de levaduras. Sin embargo, esto nopuede confirmarse sin una subsecuente realizacinde pruebas bioqumicas.

Staphylococcus aureus

Los resultados reflejados en la Tabla 5, muestranque el conteo de UFC/g no logro llevarse de formasignificativa en ninguno de los dos medios decultivo (posiblemente por errores en el desarrollo

correcto de la tcnica de inoculacin). As mismo,las caractersticas morfolgicas de las coloniasformadas en el Agar Baird Parker; mostradas en laparte inferior de la Tabla 5 en contraste con laliteratura9, nos arrojan un resultado NEGATIVO ala presencia de algn tipo de Staphylococcus. Porotro lado las colonias formadas en el Agar ST-110,se sometieron a la prueba bioqumica de lafermentacin de manitol (prueba que nos ayuda aidentificar y diferenciar entre un Staphylococcusepidermis y un Staphylococcus aureus) 15; comopuede apreciarse en los datos de la Tabla 12,obtenindose un resultado POSITIVO aStaphylococcus epidermis al ser contrastado con laliteratura.9, 15, 16

Tambin a las colonias formadas en el medio decultivo inoculado de Agar ST-110, se le aplico laprueba bioqumica de la Catalasa; resultadosencontrados en la Tabla 12, obtenindose unresultado POSITIVO; para identificar el gneroStaphylococcus, que presenta la enzima catalasa queconvierte el perxido de hidrogeno en agua yoxigeno15

Salmonella

Con lo resultados mostrados en la Tabla 6, ycontrastando estos datos con la literatura9, 16, seencontr que los medios de Agar EMB y AgarEntrico de Hektoen mostraron un crecimientopresumible de estos dos tipos de bacterias: Shigellaflexneri y Salmonella typhimurium; basndonos enlas caractersticas morfolgicas del crecimientocolonial. Es importante mencionar tambin que enel Agar Entrico de Hektoen, inoculado con muestraproblema enriquecida de caldo de Tetrationato;como se aprecia en la Tabla 6, formo una colonia decolor salmn, que presumiblemente podra sercaracterstica de la bacteria Escherichia coli9, 16. Porotro lado, las dos cajas de Petri con AgarMacConkey inoculadas mostraron caractersticasmorfolgicas tpicas de crecimiento de la bacteriaEscherichia coli16 (Tabla 6). Las cajas de petri conAgar Verde Brillante, no mostraron signo decrecimiento colonial (Tabla 6), esta informacin en

contraste con la literatura9, 16, nos indica un posibledesarrollo bacteriano de las bacterias: Shigellaflexneri y Salmonella typhimurium, puesto queestas ltimas tienen un crecimiento inhibido en estemedio.9

En las pruebas bioqumicas realizadas, donde losresultados estn plasmados en la Tabla 12, secomprob mediante una prueba de fermentacin delactosa en Agar MacConkey la presencia debacterias Lac negativas que usan peptona en lugarde lactosa9, 15. Con lo anterior se reafirme a un msla presencia de colonias de la bacteria Shigellaflexneri y Salmonella typhimurium.9, 16

La prueba bioqumica que logro identificar concerteza, si el crecimiento microbiano corresponda aShigella flexneri o Salmonella typhimurium, fue laprueba de citrato; Tabla 12, ya que el resultado fuepositivo al inocular una colonia del medio decultivo de Agar Entrico de Hektoen, en el medio afin de esta prueba, la coloracin azul nos muestrapresumiblemente que corresponde a un crecimientode Salmonella typhimurium, bacteria que es capazde metabolizar el citrato.9, 15, 16

Evaluacin de la informacin obtenidatras una descripcin de las caractersticasmorfolgicas de colonias bacterianas y laimportancia de la realizacin detinciones; simple y de Gram.

Con los datos obtenidos y plasmados en las Tablas:7, 8 y 9: donde se describen caractersticas fsicasindividuales de diferentes tipos de crecimientocolonial bacteriano, se rescata su importancia a lahora de evaluar e identificar el tipo de bacteriadesarrollado en cierto medio de cultivo especifico,puesto que de ello depender; segn el manual deidentificacin utilizado y su informacin9, 16, en qutipo de bacteria clasificaremos el crecimientobacteriano desarrollado.

Por otra parte, los datos mostrados en la Tabla 10,nos brindan una idea de cmo el tipo de coloranteque usemos para la fijacin e identificacinbacteriana a travs de la observacin en un

microscopio de la misma, nos puede ayudar aclasificar e identificar a las bacterias. El cristalvioleta; vaya la redundancia, tie de color violeta ala muestra bacteriana en el portaobjetos, mientrasque la safranina nos tie de un color rosa lamuestra. Es importante recalcar que una tincinsimple no nos sirve para identificar en ningn caso,algn tipo de microorganismo especifico. 10

Con la informacin plasmada en la Tabla 11;resultados de realizar de una tincin Gram10, selogro observar que en las colonias desarrolladas enlos dos medios de prueba utilizados: Agar Entricode Hektoen y Agar Bilis Rojo Violeta, se dio laformacin de bacilos (bastoncillos alargados) decolor rosa; es decir bacilos Gram negativos10. Conello podemos aseverar la importancia de realizaruna Tincin Gram, que a diferencia de la tincinsimple, si nos brinda informacin precisa(morfolgica) sobre el tipo de bacteria con la queestamos tratando, clasificndose segn la coloracindel microorganismo en Gram positivo; coloracinvioleta, o Gram negativo; coloracin rosa.10

Conclusin.

Con los resultados obtenidos a travs de larealizacin de diversas pruebas microbiolgicas ybioqumicas en la muestra problema a evaluar;chorizo de res de manufactura regional, adems dela interpretacin y discusin de los resultados, esposible afirmar que en el producto antesmencionado existe la presencia de los siguientesmicroorganismos:

Escherichia coli. Staphylococcus epidermis Salmonella typhimurium

Adems cabe destacar que en las pruebasmicrobiolgicas desarrolladas, se incluyo un conteoe identificacin de Hongos y Levaduras, de loscuales su crecimiento fue afirmativo, sin embargono se puede afirmar ni identificar a los organismos

que desarrollan tal crecimiento, pues no serealizaron pruebas bioqumicas especificas a estefin.

Se considera que el producto evaluado, no cumplecon las NOMS sanitarias mnimas para sucomercializacin. Sin embargo, no puede darse talveredicto de forma oficial, pues no se cumplieron alpie de la letra las especificaciones de las NormasOficiales Mexicanas mencionadas en el presentetrabajo; aun cuando se hizo lo posible por apegarsea ellas, para la evolucin microbiolgica delalimento.

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