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CITOMETRCITOMETRÍÍA DE FLUJOA DE FLUJO
Estudio de suspensiones celulares u otras partículas
biológicas.
Analiza en forma rápida y eficiente, células
individuales que fluyen a gran velocidad en un medio
líquido y atraviesan una luz monocromática láser.
Cada célula es evaluada según diversas
características: forma, tamaño, complejidad
citoplasmática, composición antigénica y bioquímica.
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¿Cómo funciona un¿Cómo funciona un citómetrocitómetro??• Sistema de flujo
• Dispersión de la luz
• Detector de fluorescencia
• Separación y detección de la luz
• Amplificación de la señal obtenida
• Corrección de errores: solapamiento espectral
• Digitalización y almacenamiento de la información
• Análisis de datos mediante el empleo de un software apropiado.
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CitómetroCitómetro de de flujoflujo
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Rayo láser
Flujo de líquido
Muestra
Sistema de fSistema de flujo de célulaslujo de células
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Espejo dicroico Muestra
Fuente de rayo láser
Dispersadordel rayo
Filtro óptico 525nm
Filtro óptico 670nm
Filtro óptico 580nm
Detector de luz verde
Detector de luz naranja
Detector de luz roja
Detector de luz dispersada a
90º
Detector de luz incidente
frontal
Componentes de un Componentes de un citómetrocitómetro de flujode flujo
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Dispersión frontal de la luzDispersión frontal de la luz
Dispersión de Dispersión de la luz en la luz en forma forma
frontalfrontal::Forward Forward
scatterscatter (FS(FSCC))
Láser
Tamaño celularTamaño celular
Linfocitos < Linfocitos < MonocitosMonocitos < < PolimorfonuclearesPolimorfonucleares
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Dispersión de la luz a 90ºCDispersión de la luz a 90ºC
Láser
Dispersión de la luz Dispersión de la luz a 90ºa 90º : : Side Side scatterscatter (SS(SSCC))
ComplejidadComplejidadcitoplasmática y citoplasmática y
gránulosgránulos
Linfocitos < Monocitos < Polimorfonucleares
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Detectores de FluorescenciaDetectores de Fluorescencia
Detectores de Detectores de fluorescencia:fluorescencia:
VerdeVerde (FL1)(FL1), naranja, naranja(FL2)(FL2) y rojoy rojo (FL3)(FL3)
Láser
AgsAgs expresados en expresados en la superficie celular la superficie celular o intracelulares: o intracelulares:
fenotipo y fenotipo y funcionalidad.funcionalidad.
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DETECCIÓN DE FLUORESCENCIADETECCIÓN DE FLUORESCENCIA
TCTCTCTCPerCPPerCPPerCPPerCPQRQRQRQR
Cy5Cy5Cy5Cy5APCAPCAPCAPC
FL-1 FL-2 FL-3 FL-4DetectoresDetectores
FluorocromosFluorocromos
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DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIDE INFORMACIÓÓNN
NN
1122334455667788......
1000010000
FSCFSC
2222334433442222......
SSCSSC
1111222211223388......
FLFL--11
1111334411112211......
FLFL--22
1122331122331122......
FLFL--33
1133334411113344......
FLFL--44
2222333355551122......
TIEMPOTIEMPO
1111111122222222......
Los pulsos de“Voltaje”detectados (señales analógicas) son transformadas en señales digitales y almacenadas en un
soporte informático
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RepresentaciRepresentacióón n monoparammonoparaméétricatrica de datos.de datos.Histogramas:Histogramas: Se representa en cada valor de x Se representa en cada valor de x
(intensidad de fluorescencia) el n(intensidad de fluorescencia) el núúmero de cmero de céélulas (eventos) lulas (eventos) que emiten esa intensidad.que emiten esa intensidad.
M1
Intensidad de Fluorescencia
Nº
de e
vent
os
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HistogramasHistogramas
SSCSSC
FSCFSC
FLFL--11
FLFL--22
FLFL--33
GranularidadGranularidad
Fluorescencia Fluorescencia verdeverde
TamañoTamaño
Fluorescencia Fluorescencia naranjanaranja
Fluorescencia Fluorescencia rojaroja
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RepresentaciRepresentacióón n biparambiparaméétricatrica en 2Den 2DDiagrama de puntos / Diagrama de puntos / dotdot plotplot
++
++----
RepresentaciRepresentacióón n simultsimultáánea de dos nea de dos parparáámetrosmetros XX e e YY..
XX representa el representa el valor de la sevalor de la seññal de al de un parun paráámetrometro..
YY representa el valor representa el valor de la sede la seññal del otro.al del otro.
++++--
--
FLFL--11
FLFL-- 22
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Diagrama de Diagrama de dotdot plotplot densitdensityy
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RepresentaciRepresentacióón 3D n 3D CountourCountour plotplot / Diagramas de contornos/ Diagramas de contornos
X, Y mX, Y máás una tercera dimensis una tercera dimensióón. n.
Una superficie tridimensionalLa altura representa el número de células con una determinada combinación de ambos parámetros.
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Selección de subpoblaciones definidas en diagramas monoparamétricos
Sitúan los valores límite superior e inferior de un parámetro que definen a las células de interés.
SelecciSeleccióón de la informacin de la informacióónnGatesGates (Puertas) / ventanas ((Puertas) / ventanas (windowswindows))
M1
M2
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GatesGates biparambiparaméétricostricos..
R1
R2
R3
R4
Se pueden utilizar puertas biparamétricasdefinidas en base a la combinación de los valores de dos parámetros.Se emplean para estudiar las características de subpoblacionescelulares.
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0 256 512 768 1024
4C5144001 FSC-Height ->
GranulocitosGranulocitos MonocitosMonocitos
Linfocitos T y BLinfocitos T y B
AnAnáálisis de una poblacilisis de una poblacióón de sangre n de sangre perifperiféérica obtenida por buffer de lisisrica obtenida por buffer de lisis
FSS= TAMAÑO
SSC=
GRA
NULA
RIDAD
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Simple positivo: CD4+CD3-: Mn
10 3
104
101
102
01010
310
410
110
210
0
PE-C
D4
PerCP-CD8
Intensidad de fluorescencia verdeAnti CD3 FITC
Nº de eventos
Li T
10 3
104
101
102
01010
310
410
110
210
0
PE-C
D4
FITC-CD3
Simple positivo: CD4+
Simple positivo: CD8+
Doble positivo: CD4+CD3+: LiT CD4+
Doble negativo: CD4-CD3-: LiB,
CD y Ma.
Simple positivo: CD4-CD3+: LiT CD8+
CCélélulasulas de sangre de sangre perifperiféréricaica: : AntiAnti CD3 CD3
FITC, FITC, antianti CD4 PE y CD4 PE y antianti CD8 CD8 PerCPPerCP
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MicroscopMicroscopíaía vs Citometrvs Citometríaía de Flujode Flujo•Muestra fijada
•Cualitativo o semicuantitativo
•Sensibilidad depende del operador
•Reproductibidad media
•Patrones estructurales definidos
•Distribución espacial.
•Nº limitado de células
•Células en suspensión.
•Cuantitativo
•Alta sensibilidad y reproductibilidad
•Medida multiparamétrica en grandes nº de célulasindividuales.
•Patrones estructurales cualitativos
•No informa distribución espacial.
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Trabajo Trabajo PrPrácácticotico Nº 4Nº 4::
Estudio de las cEstudio de las célélulasulas del sistema inmunedel sistema inmune1- Obtención de células:
Rata de bioterionormal
•Sacrificio del animal
•Extracción de órganosBazo, Timo, Nódulo linfáticos y células de peritoneo
Disgregación de losórganos en malla metálica
2- Aislamiento de células: BAZO
•Buffer de lisis:
Lisis de GR Suspensióncelular
Buffer Hipotónico
Pellet de Células
SuspensiSuspensiónónde CMN y de CMN y
PMNPMN
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•Gradiente de densidad: Ficoll-Hypaque Aislamiento de CMN
SuspensiSuspensiónón de CMNde CMN
3-Ensayo de viabilidad: exclusión de azul de tripán: determinar el % de células viables.
4-Caracterización Morfológica