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CITOMETRIA DE
FLUJO
Y
LMA
José Ángel Díaz Arias
C.H.U.S.
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INTRODUCCIÓN
– ¿Qué es la citometría de flujo (CMF)?
Es una tecnología para caracterización y el análisis
de células que mide y analiza simultáneamente
múltiples características físicas de partículas que se
mueven en un fluido a traves de un haz de luz
Un citómetro tiene 3 partes fundamentales:
– Fluídica
– Óptica
– Electrónica
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INTRODUCCIÓN
– Puede analizar partículas de 0.2 a 50 micras
– Nos indica el tamaño relativo, complejidad interna
(granularidad) e intensidad de fluorescencia
– De forma general un número conocido de células
(generalmente 2 x 10e6) se incuba con los
monoclonales elegidos tras lo cual se somete a un
proceso de lisado de hematies y posterior lavado
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INTRODUCCIÓN
¿Para que sirve la CMF? Se ha convertido en una herramienta indispensable
para el diagnostico, clasificación, estadiaje y
monitorización de neoplasias hematológicas
– Identifica células de diferentes líneas, así como su
maduración
– Detecta células “anormales”
– Nos indica el fenotipo de las células “anormales”, sobre lo
que podemos emitir una diagnostico/sospecha diagnostica
– Identificación pronostica
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¿Existe una población “atípica”?
Una vez recibida una muestra con sospecha de LA se
realiza un panel de screening para:
– Determinar si existen células “atípicas”
– Saber si estas células son inmaduras
– Identificar la línea celular (mieloide, linfoide, bifenotipica, bilineal)
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MARCADORES A ESTUDIAR
EGIL: Screening y posterior panel orientado
Marcadores en screening:
– CD34, CD33, CD13, CD10, CD19, CD45, CD7, CD14,
MPOcito, CD3cito, CD3s, HLA DR
Posteriormente para serie mieloide,
monocitica,megacariocítica y eritroide:
– CD15, CD11b, CD16, CD10, CD33, CD13, CD56, CD64,
CD65, CD117, CD19, Tdt, CD2, CD7, CD3, CD4, CD14,
CD61, CD41a, CD42b, CD71, CD36, Glicoforina A, CD45
Woods. Cytometry Part B (Clinical Cytometry)
72B:S14–S22 (2007)
Sumeet Gujral Indian J Pathol Microbiol 2008
Ortuño J, Orafo A. Medicina Clinica 2002, 118(11)
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J.J.M. van Dongen. Euroflow consortium
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LINFOCITOS +
ERITROBLASTOS
MONOCITOS
SERIE
GRANULOCÍTICA
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CD45
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¿Como sabemos que es mieloide?
EGIL
EGIL, Catovsky et al
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Definición de línea
Se precisa una puntuación >2 en esa línea según
EGIL. Para definir una L.A. Bifenotípica (BAL) se
precisan más de 2 puntos en 2 lineas diferente.
Esto es útil para diferenciar las aberrancias de
línea y no confundirlas con BAL
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Definición de línea
En la nueva clasificación OMS las BAL se han
“renombrado” y se ha hecho una definición más
estricta:– “Leucemias agudas de fenotipo mixto”
– Linea mieloide: MPO, o en diferenciación monocítica al menos dos
de los siguientes CD11c, CD14, CD64, lisozima, o bien esterasas inespecificas (citología)
– Línea linfoide T: CD3 citoplásmico o de superficie (más raro)
– Línea linfoide B: requiere de varios marcadores.
Si CD19 es fuerte uno de los siguientes CD79a, CD22, CD10
Si CD19 es débil se precisan 2 de los anteriormente mencionados
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MADURACIÓN
Loken MR. Et al Leukemia Research 32 (2008) 5-17
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MADURACIÓN
Kussick SJ Arch Pathol Lab Med 127, 2003
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Brent W. Methos in Cell Biology Vol 75. 2004
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Brent W. Methos in Cell Biology Vol 75. 2004
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Brent W. Methos in Cell Biology Vol 75. 2004
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CFM-FAB
Ortuño J, Orafo A. Medicina Clinica 2002, 118(11)
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GENOTIPO-FENOTIPO
Ortuño J, Orafo A. Medicina Clinica 2002, 118(11)
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GENOTIPO-FENOTIPO
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M3 – t(15;17)
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M4/M5 -MLL
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EMR
La detección de EMR por CMF presenta algunas dificultadas debido a
la heterogeneidad de los fenotipos leucémicos.
Para su detección se precisa la localización previa de LAP (fenotipos
asociados a leucemia) en los blastos al diagnóstico.
Estos LAP sólo se pueden detectar en un 50-80% de las LAM y se basan
en:
– Asincronismos antigénicos
– Infidelidad de línea
– Sobreexpresión de antígenos
– Ausencia de antígenos específicos de línea
– Alteraciones evidentes en FSC/SSC
La sensibilidad alcanzable habitualmente es de 10e-3 / 10e-4 y hasta
10-6
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EMR
Diversos estudios han mostrado que la detección de EMR, así como
su cuantía se asocia a distintos riesgos de recaída
San Miguel et al Post inducción 0.5% (recaida 67% vs 20%), Postintensificación 0.2% (69% vs 32%)
Venditti et al Postconsolidación 0.035% (77% vs 17%)
Al Mawali et al 0.15% postinducción
San Miguel et al 2001 4 categorias:– 1)Muy bajo riesgo recaida: <10-4
– 2)Bajo riesgo 10-4 a 10-3
– 3)Riesgo intermedio 10-3 a 10-2
– 4)Alto Riesgo >10-2
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FENOTIPOS LEUCEMICOS(LAP)
Al-Mawali et al Am J Clin Pathol
2009;131:16-26
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San Miguel et al 2002
Best Practice &
Research Clinical
Hematology 105-118
Vol 15 No 1
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CITOMETRIA DE
FLUJO
Y
LMA
José Ángel Díaz Arias
C.H.U.S.
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POBLACIONES NORMALES