Clase Rear Reg Los Final EC
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jueves 6 de mayo de 2010
Los rearreglos de DNA se entienden como el movimiento de secuencias de un lugar a otro que generan cambios en la estructura física del genoma.
Las secuencias que sufren un rearreglo son modificadas, amplificadas o eliminadas.
REARREGLOS DE DNA
- Modificaciones (Conversiones)
-Amplificaciones (Duplicaciones)
-Ganancia (Virus y “transgenes”)
-Pérdida (Física o Funcional)
jueves 6 de mayo de 2010
REARREGLOS DE DNA
Generalmente estos rearreglos suceden en las células somáticas, mientras que las germinales NO se alteran.
Estos rearreglos son usados para controlar la expresión genética: !! a) Creando nuevos genes.
! b) Cambiando el tipo de gen expresado.
jueves 6 de mayo de 2010
- Rearreglos físicos, cambiando la secuencia expresada:! “Mating type” de levadura.! Variación de antígenos de superficie de tripanosoma.
- Introducción de material genético: ! Sistema de transferencia de T-DNA de Agrobacterium ! ! tumefaciens.
- Amplificación de un gen endógeno por presión selectiva.
Revisaremos:
jueves 6 de mayo de 2010
“MATING TYPE” EN LEVADURA
jueves 6 de mayo de 2010
Reproducción en levaduraLas levaduras pueden propagarse como diploides o haploides.
jueves 6 de mayo de 2010
S. ceriviseae en estado haploide presenta dos tipos de apareamiento a y α determinados por el alelo presente en el LOCUS ACTIVO (MAT) del apareamiento.
“Mating type” en levaduraFenotipos de apareamiento
jueves 6 de mayo de 2010
“Mating type” en levaduraApareamiento
El apareamiento sólo ocurre entre células haploides de
diferente tipo.
jueves 6 de mayo de 2010
“Mating type” en levaduraInicio de la vía de señalización
Mutaciones en SCG1, STE4 o STE18
jueves 6 de mayo de 2010
/ a-factor
/ Ste3
“Mating type” en levaduraCascada de Cinasas
Modificado de Peisajovich et al., 2010. Science (328): 368-372
ARRESTO CELULAR, FUSION CELULAR
jueves 6 de mayo de 2010
“Mating type” en levaduraCambio de tipo de aparemiento
Dentro del mismo cromosoma existen copias silenciosas de los dos tipos de apareamiento, HML o HMR.
La levadura puede cambiar de tipo substituyendo la copia del locus activo por una silenciosa
MAT es el casette ACTIVO. El cambio de “mating” es no recíproco. La copia que estaba en MAT se pierde y se substituye por la de HML o HMR.
Las copias de HMR y HML nunca se pierden o cambian.
S iempre se copia de HMR o HML a MAT DIRECCIONAL.
Generalmente se cambia al tipo contrario de apareamiento.
jueves 6 de mayo de 2010
“Mating type” en levaduraOrganización y productos de los cassettes de “mating”
Los cassettes inactivos están bordeados por secuencias comunes y poseen una secuencia interna única (Yα o Ya).
Los genes del locus MAT (activos), se transcriben de un promotor que está dentro de la región Y específica
jueves 6 de mayo de 2010
“Mating type” en levaduraEl locus MAT
Mata
Mata HMRa
HMRa
a specific
a haploid
Los genes del locus MAT codifican para PROTEINAS REGULADORAS de la transcripción de los genes que especifican el tipo de mating. Su función es regular la expresión de la feromona y el receptor, entre otras.
jueves 6 de mayo de 2010
“Mating type” en levaduraPatrones de Expresión Alelo Específicos
jueves 6 de mayo de 2010
“Mating type” en levaduraSilenciamiento de los cassettes HMR y HML
A pesar de contener el promotor en la región Y la expresión de los genes está reprimida en los locus HML y HMR.
Esto se debe a los SILENCIADORES E e I, secuencias que bordean a estos locus, del lado izquierdo y derecho, respectivamente.
A estas secuencias se unen proteínas que se requieren para el silenciamiento:
- Complejo de reconocimiento del origen de replicación (ORC), que se une a ars.- SIR (“silent information regulators”), que actuan remodelando la cromatina, formando heterocromatina.-RAP1 se usa para mantener estado de heterocromatina- Histona H4, interactúan con las proteínas SIR.
REMODELACION PARA FORMAR HETEROCROMATINA
jueves 6 de mayo de 2010
“Mating type” en levaduraTransposición unidireccional
Después del corte hay un apareamiento con locus donador. Toda la región Y que es diferente se degrada hasta llegar a una región homóloga. La región Y se substituye por el nuevo templado de HMR o HML.Este cambio lo inicia MAT, el locus reemplazado.El sitio donador NO se ALTERA semejante a Tn replicativa.El sitio receptor sufre una sustitución pero no hay ganacia de información, diferente a Tn.
jueves 6 de mayo de 2010
“Mating type” en levaduraControl por HO
jueves 6 de mayo de 2010
Variaciones en los Antígenos de Superficie (VGS) en
Trypanosoma sp.
jueves 6 de mayo de 2010
VSG en Trypanosoma
Enfermedad del sueño
+
jueves 6 de mayo de 2010
Variable Surface Glycoproteins:
- Principal componente de la cubierta.
- Monocapa 5-10 x 106 moléculas de la misma VSG.
- Sólo se expresa uno a la vez.
- VSG son reemplazadas cada 1-2 semanas.
VSG en TrypanosomaCiclo de transmisión
jueves 6 de mayo de 2010
jueves 6 de mayo de 2010
La VSG es una proteína de membrana de ~500 a.a
Presenta un región variable que es el determinante antigénico una región C-terminal conservada.
Se une a la membrana por fosfoglicolípidos.
VSG en TrypanosomaEstructura de las VGS
jueves 6 de mayo de 2010
Genoma de Tripanosoma sp:
- # de Cromosomas ?.
- ~100 minicromosomas (50-150 Kb).
- ~1000 VSG genes dispersos en cromosomas y minicromosomas:
- Teloméricos (>200 sí 1/T)
- Internos
- Homología variable (isogenes/misma respuesta inmune).
-Sólo un VSG es expresado (ELC*) en un momento dado
*Expression-Linked Copy
VSG en Trypanosoma Variación antigénica
jueves 6 de mayo de 2010
VSG en TrypanosomaRecambio de las VGS, generación de nuevos ELC
jueves 6 de mayo de 2010
VSG en TrypanosomaRecambio de las VGS, generación de nuevos ELC
Mecanismos:
- Transferencia por duplicación*
- Activación (genes teloméricos)
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Trasncripción por RNAPol I(Expression Site Body)
VSG en TrypanosomaEstructura de los genes de la VGS
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TRANSFERENCIA INTERESPECIFICA DE GENES
T-DNA de Agrobacterium tumefaciens
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Agrobacterium tumefaciens
Transferencia IneterspecíficaAgrobacterium tumefaciens, patógeno de plantas
Agalla de la Corona
A g r o b a c t e r i u m rhizogenes
jueves 6 de mayo de 2010
Recombinación Ilegítima
Transferencia IneterspecíficaAgrobacterium tumefaciens, patógeno de plantas
jueves 6 de mayo de 2010
T-DNA~ 23 Kpb
El plasmido Ti contiene genes que participan en el reconocimiento, la infección, la transformación y biosínteis y degradación de opinas
Hay diferentes tipos de plasmidos dependiendo de sus opinas:1) NOPALINA; induce teratomas contiene hormonas vegetales.2) OCTOPINA.3) AGROPINA.4) PLASMIDO Ri tiene agropina y se diferencia a raíces.
Las funciones codificadas en el Ti dependen del tipo de plasmidos e incluyen genes para la biosíntesis y degradación de opinas
Transferencia IneterspecíficaEstructura de los plásmidos Ti
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Genes del plásmido Ti
Transferencia Ineterspecífica
T-DNA~ 23 Kpb
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Se requiere de 3 tipos de funciones:A) Unión y reconocimiento. Genes chvA, chvB y pscA producen polisacáridos por la union inicial de la bacteria a la planta.B) Genes de virulencia (Vir) cortar y transferir el T-DNAC) T-DNA, mide 23 KB
Los genes virA y virG son reguladores que pertenecen a un sitema de dos componentes
jueves 6 de mayo de 2010
Transferencia Ineterspecífica
Estructura de los bordes del T-DNA
Generación de la hebra “T”
jueves 6 de mayo de 2010
Célula hospedera
Núcleo
Citoplasma
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Célula hospedera
Núcleo
Citoplasma
VirA-VirG
Agrobacteriumjueves 6 de mayo de 2010
Célula hospedera
Núcleo
Citoplasma
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Agrobacterium
TiTiRegión vir
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Complejo-T
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Complejo-T
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VirD1-VirD2
Complejo-T
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VirE2, Vir E1
VirD4
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VirE2, Vir E1
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Núcleo
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Núcleo
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Núcleo
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VirA-VirG
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CypA,RocA
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Núcleo
CypA,RocA
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VirA-VirG
Agrobacterium
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Región vir
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VirE2, Vir E1
VirD4
Núcleo
CypA,RocA
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VirA-VirG
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TiTi
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VirA-VirG
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VirE2, Vir E1
VirD4
Núcleo
CypA,RocA
VirF
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Célula hospedera
Citoplasma
VirA-VirG
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Región vir
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VirE2, Vir E1
VirD4
Núcleo
CypA,RocA
VirF
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Citoplasma
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Región vir
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VirA-VirG
Agrobacterium
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VirE2, Vir E1
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Citoplasma
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Agrobacterium
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Célula hospedera
Citoplasma
VirA-VirG
Agrobacterium
TiTi
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VirE2, Vir E1
VirD4
Núcleo
CypA,RocA
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Agrobacterium
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Agrobacterium
TiTi
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VirE2, Vir E1
VirD4
Núcleo
CypA,RocA
VirF
jueves 6 de mayo de 2010
Se parece a la conjugación en bacterias (homología entre los genes vir y los genes tra).
Transferencia IneterspecíficaMecanismo de transferencia del T-DNA
jueves 6 de mayo de 2010
Transferencia IneterspecíficaMecanismo de integración del T-DNA
Se desconose gran parte del proceso de integración al cromosoma de la célula vegetal.El sitio de integración tiene preferencia por secuencias ricas en AT.
jueves 6 de mayo de 2010
PRIMERAS APLICACIONES:MANIPULACIONES RELATIVAMENTE DIRECTAS DE UN SOLO GEN, POR EJEMPLO:
•Transferencia a algodón y maíz de material genético de la bacteria Bacillus thuringensis (Bt) la cual produce una proteína insecticida, (Cry-proteína).
•Transferencia a soya, maíz, algodón, betabel y canola de una gen que confiere resistencia al herbicida gliofosfato (Roundup).
jueves 6 de mayo de 2010
Amplificación de DNASecuencias genómicas pueden ser amplificadas en tandem a partir de una secuencia existente. Copias de una unidad los genes contenidos en esta amplificación pueden no ser expresados pero en general aumenta el nivel de expresión.
•Estas copias pueden estar en forma: - extracromosomal, inestables, se pierden-integradas, son estables
• Provocadas por presión selectiva (drogas) metotrexato. Se aumenta la enzima DHFR por amplificación, ocurre frecuentemente 10-4 - 10-6
Las células resistentes aparecen paulatinamente, en relación a la amplificación. (Copias de 40-400).
- Líneas estables cromosoma-Inestables se pueden ver los cromosomas double-minute. Se pierden frecuentemente.-El locus amplificado puede verse en los cromosomas región HSR.La amplificación se mantiene mientras este la presión selectiva
La secuencia que se amplifica es mayor que el gen DHFR (31 Kb) como de 500 kb.La secuencia original no se pierde solo al parecer se recombinan las copias extras.
jueves 6 de mayo de 2010
Duplicación “Extracromsomal”
Observado en líneas celulares resitentes al metotrexato por amplificación (10-4-10-6) del gen dhfr
La secuencia que se amplifica es mayor que el gen dhfr (31 Kb), ~500 kb.La secuencia original no se pierde.
Amplificación de DNA
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Amplificación de Secuencias Genómicas
- Duplicación de elementos genéticos pre-existentes.
- Adquisición de genes de otras especies (transferencia horizontal).
Genes Ribosomales(Evolución Concertada)
Genes Globinas
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Evolución por Duplicación
Cromosoma 14 Cromosoma 17 Cromosoma 22 Cromosoma 16 Cromosoma 11
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Evolución por Rearreglos Genómicos(Duplicación, Conversión, Inactivación
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Mecanismos de Duplicación
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Mecanismos de Conversión
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EL CAMBIO DE VSG SE GENERA POR UN CAMBIO DE GENESExisten como 1000 copias diferentes de VSG en los cromosomas o minicromosomas del parasitoUn parásito puede cambiar hasta 100 vecesTodas las copias existen en el genoma del parásitoLas copias pueden estar en los cromosomas y en los minicromosomas que son alrededor de 100 (50-150 Kb). Probablemente se generaron por duplicación entonces algunos se parecen entre ellos pero son suficientemente diferentes para evadir el sistema inmune
Existen genes en diferentes lugares:GENES TELOMERICOS Cerca del telómero (5-15 kb) se han visto como 200GENES INTERNOS Dentro de los cromosomasSolo una VSG esta ACTIVA y es transcrita y se le llama copia ligada a la expresión (ELC) y se localiza en el SITIO DE EXPRESIONELC siempre cerca del telómero-ELC puede ser siempre el mismo sitio (mas frecuente). A este sitio se la transfiere una VSG diferente.- Puede cambiar de sitio. En el mismo sitio para CAMBIAR de VSG una copia de un nuevo gen se transfiere al ELC. SUBSTITUCION DEL CASETTE
-***Cambiar de sitio ELC (raro). Solo genes cerca del telómero. El otro se apaga.-En casos muy raros nuevas VSgs se generan probablemente por rearreglos entre diferentes copias silenciosas aunque esto es raro
***
jueves 6 de mayo de 2010
La estructura de los genes para VSG es poco común
El fragmento que se transfiere es de 2500- 3500 pb un fragmento grande del 5ʼ del gen aparte de la ORF (1500). El extra esta en el 5ʼEl estudio de la transcripción ha sido dificil porque 35 pb se añaden por trans-splicing.La transcripción puede iniciar varias Kb arriba del gen para la VSG. Dos promotores han sido mapeados y se encuentran muy arriba 4 Kb y 60 kb. El transcrito del promotor distante contiene otros genes ademas de la VSG y posteriormente se procesa y se le añaden 35 pb del líder.VSG transcribe por PolI y no PolII y forma una estructura que se llama el cuerpo del sitio de expresión (ESB). Es parecido al nucleolo.No hay sitios para enzimas de restriccion cerca (barren region) es DNA repetido.No existe un orden para la expresión de las VSGsEl cambio de antígeno de superficie se da también en otros parásitos como Borrelia
La formacion del ELC es por conversion genica y requiere de RECOMBINACION. Semejante a maiting type. Hay alrededor de 20 sitios ELC potencialesEsto se ve mapeando los genes expresadosLa VSG expresada siempre es una COPIA
jueves 6 de mayo de 2010