Clase transfecciones
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Enriquecimiento de transfectantes
• Cell sorting
Cotransfectando con vectores de expresión para GFP o proteínas de membrana que sean reconocidas por Ac-fluorescentes
Transfección estable
• Por integración• Por recombinación homóloga• Como episoma
• Requiere de un marcador de selección en el vector
• Util para estudios que impliquen inducción de la expresión
Marcadores de selección eucariontes
• Agent Action Marker Gene
• Blasticidin S Inhiben síntesis BlasticidinS deaminase• Hygromycin B proteica Gen hyg o hph • Puromycin• G-418 Neomycin phosphotransferase• Zeocina Intercalante del DNA gen Sh ble, se une • MTX Inhibits DNA syn. Dihydrofolate reductase
Marcadores de selección
• G418 (Geneticina)– Bloquea la traducción– La resistencia es la neomicina fosfotransferasa ( Neor )– Para células de mamífero, plantas y levaduras
• Zeocina - Antibiótico de la familia bleomicina - Cliva el DNA - El producto del gen ble se une e impide el pegado al DNA. -de amplio espectro (mamíferos, levaduras y bacterias)
Sistema de recombinación homóloga
• Flp-in Invitrogen: Recombinación sitio específica de Saccharomyces cerevisiae
• Sitio FRT (Flp recombination target)• Recombinasa Flp
Disminuir expresión de un gen-Ribozimas
aaaaa--------auucg--------ccguuua--------uaagc-- ggcaaau----
cDNA
ribozima
Clivado del mRNA blanco
-Antisentido
aaaaa----------------caaucggccccuucguuua----gttagccggggaagcaaat
1-Oligonucleótido pequeño simple cadena (15 -25 bases)
Degradación por RNAsa del híbrido RNA/DNA
Disminuir expresión de un gen
cDNA
aaaaaa5’ 3’a b c
2- Síntesis de un RNA antisentido complementario al gen blanco.
a’ b’ c’
mRNA
Degradación por RNAsa del híbrido RNA/RNA
Síntesis in vitro• Síntesis química• Transcripción in vitro• Digestión de los dsRNA por RNase
III/DICERExpression in vivo• Plásmidos• Templados para PCR (cassette de expresión
siRNA)• Vectores virales
-RNAi (siRNA)
Clivado del mRNA blanco
aaaaa----------------caaucggccccuucguuua----
guuagccggggaagcaaau auuugcuuccccggcuaacRNAi(30 a 50 nucleotidos)
mRNA
a) Síntesis
b) cDNA
Degradación por RNAsa
Procesados por la maquinaria celular (dicer…)
Expresión de siRNA in vivo
Promotor/Enhancer• • Pol III (U6, H1)• • Pol II (CMV)
Secuencia de terminación• Pol III: string of 3-5T’s)Señal de poly(A) SV40
siRNA TempladoTemplado para cadenas sense , hairpin y antisense del siRNA
Vectores Plasmídicos
Expresión transiente• No se trabaja con RNA• Produce gran cantidad de vector• Enriquecimiento de células transfectadas por sorting o
selección
Expresión Estable (marcadores de selección)• Produce líneas estables• Animales transgénicos