Tema II: Generalidades y clasificaciTema II: Generalidades y clasificacióón de n de las fermentaciones.las fermentaciones.

SubtemaSubtema 2.6: Cin2.6: Cinéética de Crecimiento y tica de Crecimiento y Muerte de un microorganismo.Muerte de un microorganismo.

FACTORES QUE AFECTAN AL CRECIMIENTO FACTORES QUE AFECTAN AL CRECIMIENTO BACTERIANOBACTERIANO

Algunas de las figuras usadas en esta presentación fueron tamadas de las siguientes fuentes:•Madigan M.T., J.M. Martinko and J. Parker, Brock - Biology of Microorganisms, 10th Edition, Prentice Hall, 2003•Curso ECODIM 2003

•La distribución y funcionamiento de la poblaciones microbianas están fuertemente influidas por factores abióticos•La limitación de nutrientes y la tolerancia ambiental regulan o excluyen la existencia de microorganismos en diferentes ambientes•Los microorganismos poseen limites inferiores y superiores de tolerancia, así como óptimos para los diferentes factores abióticos

Las actividades de los microorganismos se ven afectadas por las condiciones físicas y químicas del medio

Ley del Mínimo de Liebig

La producción de biomasa total de cualquier organismo esta determinado por el nutriente cuya concentración sea mínima, en relación con lo que requiere el organismo

S.V.

Nutriente

EnergíaBiosíntesis

Un incremento en la concentración de determinado nutriente limitante permite el crecimiento o reproducción de la población afectada, hasta que queda limitada por la escasez de otro factor

CRECIMIENTO BACTERIANO (CELULAR

UNA BACTERIA AL CRECER DEBE:

PRODUCIR O SINTETIZAR:

REGULAR ESTA SINTESIS:

DIVIDIRSE EN DOS CÉLULAS

Material celular a partirde sustancias nutritivas

Síntesis ordenada de loscomponentes estructurales

FISIÓN BINARIA BACTERIANA

DIVISIÓN CELULAR DE LAS BACTERIAS

PROCESO DE DIVISIÓN ES MUY RÁPIDO: DE 20 A 40 MINUTOS

Crecimiento de la población celular

Es el incremento en el número de células en una población, también se puede cuantificar como un incremento en lamasa bacteriana

Velocidad de CrecimientoVelocidad de Crecimiento

• Cambio en el número de células o biomasa por unidad de tiempo

Tiempo de GeneraciónTiempo de Generación

• Tiempo requerido para que a partir de una célula se formen dos células (tiempo de duplicación)

El ritmo de crecimiento depende de la especie, del medio de cultivo, de la temperatura.

Crecimiento exponencialCrecimiento exponencial

Modelo de incremento de la población que el número de células se dobla cada cierto periodo de tiempo

Td 2Td 3Td 4Td

8

4

2

1

Ln B

iom

asa

Tiempo de Duplicación

N = No 2n

g = t / nTiempo de Tiempo de GeneraciónGeneración

Numero de Numero de Generaciones Generaciones

N= Log N – Log No0.301

CRECIMIENTO BACTERIANO

= FASE DE REPOSO =

DESPUÉS DE LA INOCULACIÓN, LA POBLACIÓNPERMANECE SIN VARIACIONES.LAS CÉLULAS CRECEN EN VOLUMEN Y SE SINTETIZAN ENZIMAS, PROTEÍNAS, RNA;

ADEMÁS, OCURRE UN AUMENTO DE LA ACTIVIDAD METABÓLICA

CRECIMIENTO CELULAR

= FASE EXPONENCIAL =

EN ESTA FASE LAS BACTERIAS SE DIVIDEN PORFISIÓN BINARIA.CRECEN EN NÚMERO DE FORMA EXPONENCIAL.LAS BACTERIAS SE DIVIDEN A RITMO CONSTANTE.LA VELOCIDAD DE CRECIMIENTO SE LLAMA:

= TIEMPO DE GENERACIÓN =

CRECIMIENTO BACTERIANO

= FASE ESTACIONARIA =

EL CRECIMIENTO EXPONENCIAL SE DETIENE.EL CRECIMIENTO DE LA POBLACIóN ESTÁ LIMITADO POR:

LA FALTA DE NUTRIENTES.LA ACUMULACION DE METABOLITOS INHIBITORIOS.LA FALTA DE ESPACIO.

EN ESTA FASE SE PUEDEN SINTETIZAR ALGUNOS METABOLITOSCOMO LOS ANTIBIÓTICOS

Temperatura

Para cada mo. existe una temperatura mínima por debajo de la cual no es posible el crecimiento, una temperatura optima a la que se produce el crecimiento más rápido, y una temperatura máxima por encima de la cuál no es posible el crecimiento

Temperaturas Cardinales

Organismos mesófilosPoseen mecanismos de control que interrumpen la síntesis de proteínas si la temperatura baja por debajo delos 5 ºCPsicrófilosPresentan una mayor proporción de lípidos insaturados y/o de cadenas cortas, que mantienen flexibles las membranas a bajas temperaturas

Crecimiento microbiano a temperaturas elevadas• Gran proporción de lípidos saturados en las

membranas.• Producción de enzimas que no se desnaturalizan a

temperaruras elevadas “presencia de secuencias de aminoácidos poco frecuentes que estabilizan dichas

proteínas a temperaturas elevadas”.

A medida que la temperatura se incrementa, los ácidos grasos de la membrana celular aumentan la longitud de la cadena y el grado de insaturación disminuye.

Aplicaciones biotecnológicas

Las enzimas de los termofilos son capaces de catalizar reacciones a temperaturas elevadas, son mas estables, la vida media de estas preparaciones enzimáticos es más prolongada.

pH y Crecimiento microbiano

En general los mo no pueden tolerar valores extremos de pH, en condiciones alcalinas o ácidas se hidrolizan algunos componentes microbianos o se desnaturalizan algunas enzimas.

• Cada organismo tiene un rango de pH dentro del cual es posible el crecimiento, y posee un pH óptimo.

• La mayoría crece en un margen de variación de 2 a 3 unidades de pH.

• El pH del medio afecta directamente a los mo y a las enzimas, afectando la disociación y la solubilidad de muchas moléculas que ejercen algún efecto sobre los mo.

pH interno Controlado por un mecanismo sensorial desconocido y por la fuerza motriz (protones)

• El pH optimo representa el pH del medio extracelular

• pH intracelular permanece cercano a la neutralidad

Rango de pH• Neutrófilos

• Acidófilos

• Alcalófidos

Efectos del pH en la célula bacteriana• Se afecta la envoltura celular por disociación/protonación de

sus macromoléculas: LPS, proteínas de la superficie celular, membrana citoplasmática, ocurre una distribución de cargas locales en forma diferente.

• Cambios en la morfología celular, incorrecta división celular,, cambios en la adhesión, floculación, etc.

1.0

0.75

0.50

0.25

1.0

0.75

0.50

0.25

1.0

0.75

0.50

0.25

Actividad de Agua y Presión Osmótica

• Para los mo. el factor crítico es la disponibilidad de agua líquida más que la cantidad total de agua presente en el ambient.e

• El total de agua realmente disponible para uso microbiano se expresa como la actividad de agua (aw)

• Los solutos presentes en el medio compiten por el agua y la “fijan”, disminuyendo la cantidad disponible para los mo.

• El agua difunde desde una región con alta concentración de agua (baja concentración de solutos) hasta una región de menor concentración de agua (alta concentración de solutos): Osmosis

• Los mo que tienen una dependencia del ion Na (sodio) se denominan Halofitos o Halófilos.

• Los organismos halotolerantes son capaces de soportar una reducción en el valor de aw

¿Cómo crecen los moen condiciones de baja

actividad de agua?

Incrementando su concentración interna

Solutos Compatibles: Glicina-betaína, sacarosa, trehalosa, glicerol, manitol

Oxígeno y crecimiento bacteriano

Fermentación o respiración anaerobia

Dañino o letalEstrictos

Anaerobios

Respiración aerobia, anaerobia, fermentación

No necesario, pero crecen mejor con O2

Facultativos

Aerobios

FermentaciónNo necesario, ni crecen mejor con O2

Aerotolerantes

Respiración aerobiaNecesario pero a bajas tensiones

Microaerófilos

Respiración aerobiaNecesarioEstrictos

Tipo de MetabolismoRelación con el O2Grupo

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2 5

Fe++ por las reductasas de la membrana citoplasmática, luego interviene un sistema de baja afinidad para su incorporación a las células con hierro, pero cuando hay una deficiencia limitante del crecimiento actúa otro sistema de captación de alta afinidad. La levadura también tiene dos sistemas de captación para la incorporación de manganeso. Por otra parte, en algunas bacterias patógenas la virulencia depende de la capacidad del microorganismo para obtener iones metálicos del hospedador. El conocimiento de los genes que generan los sistemas de captación de iones metálicos de los microorganismos permite obtener vegetales transgénicos que aprovechan mejor los nutrientes del suelo o secuestran metales tóxicos como, por ejemplo unas plantas donde se había expresado un gen que les posibilitó convertir el Hg++ en Hgo (11).

2.5. Factores ambientales

El suelo, o material de la superficie terrestre en el que se sustenta la vida vegetal, es uno de los sitios más dinámicos en interacciones biológicas de la naturaleza. Comprende organismos vivos, minerales disgregados, agua, aire y materia orgánica muerta. El agua y el aire representan aproximadamente la mitad del volumen del suelo (12).

2.5.1. Agua y presión osmótica La disponibilidad de agua en el ambien te se expresa indirectamente en términos de actividad del agua (aw), la que se define como la razón entre la presión de vapor de agua del substrato o solución (p ) y la presión de vapor del agua pura (po) a la misma temperatura, es decir, aw = p/po Este concepto se asocia al de humedad relativa de la atmósfera en equilibrio con el sistema, de la siguiente manera HRE = aw . 100 La mayor parte de las bacterias no crecen a una aw por debajo de 0,91 mientras que los mohos pueden desarrollarse con cifras de 0,80. Los valores más bajos obtenidos para arqueobacterias halófilas son del orden de 0,75 mientras que los mohos xerófilos (amantes de la sequedad) y las levaduras osmófilas (que prefieren presiones osmóticas elevadas) se multiplican muy lentamente aún con valores de 0,65 y 0,60 respectivamente. Los límites de aw dentro de los cuales hay crecimiento, son más amplios a la temperatura óptima de multiplicación. La capacidad de los organismos para crecer a una temperatura dada, disminuye a medida que se reduce la aw. La presencia de ciertos elementos nutritivos amplía los límites de aw dentro de los cuales los organismos pueden sobrevivir (3). La presión osmótica (θ) está relacionada con la actividad del agua a través una expresión θ = -RT.ln aw/v que comprende a la constante de los gases (R), la temperatura absoluta (T), el logaritmo natural de la actividad del agua (aw) y el volumen molar parcial del agua (v ) (3). El potencial agua de un suelo ψ es la suma de los potenciales osmótico, matricial (o capilar) y gravitacional. La humedad relativa de la fase vapor en equilibrio con el suelo es también una medida indirecta del potencial agua. El potencial osmótico de la solución del suelo (π ) puede expresarse mediante la ecuación π = -RT ρ υ m φ /109 donde ρ es la densidad del agua, υ los iones por molécula de soluto, m la molalidad, φ el coeficiente osmótico a la molalidad m y la temperatura T°K. El potencial matricial (τ) está dado por la ecuación τ = (RT ρ ln p/po) /106 M donde M es el peso molecular del agua.

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2 6

El término capacidad de campo se refiere al contenido en agua de un suelo, drenado después de la saturación, cuando la velocidad de la pérdida de agua debida a la gravedad es pequeña. No es una medida precisa (12). Las bacterias mantienen siempre su osmolaridad muy por encima de la del medio, y están protegidas por una pared celular capaz de resistir una considerable presión osmótica interna (1). En contraposición a la diversidad de concentraciones de potasio y sodio en los distintos ambientes, los organismos vivos contienen potasio a una concentración más elevada que la del medio externo. Además de neutralizar las cargas negativas de la célula y de regular la función enzimática, el potasio actúa como un soluto implicado en la regulación osmótica de algunos organismos Algunos organismos halófilos que viven en ambientes de alta salinidad sódica, por ejemplo Halobacterium, son la excepción a esta regla (10). Los organismos que son capaces de crecer a elevadas concentraciones de azúcar se denominan osmófilos. Basados en sus respuestas, o tolerancia, a la sequedad los microorganismos se pueden distribuir entre tres grupos definidos por el potencial agua (ψ) óptimo y mínimo para el crecimiento: grupo 1. óptimo –0.1 MPa, mínimo alrededor de –2MPa; contiene algunos hongos y una variedad de bacterias Gram-negativas; grupo 2. óptimo alrededor de –1 MPa, mínimo alrededor –5MPa; contiene principalmente zigomicetos, bacterias Gram-negativas y actinomicetos; grupo 3. óptimo alrededor de –1MPa, mínimo –10 a –15 MPa; contiene una variedad de ascomicetos y basidiomicetos y bacterias Gram-positivas (12).

2.5.2. Tensión superficial La tensión superficial de los medios de cultivo afecta al desarrollo de un microorganismo. Por ejemplo BaciIIus subtilis tiende a crecer en la superficie a modo de película o velo en los medios corrientes con una tensión superficial entre 57 y 63 dinas, pero si se disminuye a menos de 40 dinas por el agregado de un detergente crece en forma difusa (13). La humectabilidad es función de la tensión superficial. Las soluciones de detergentes pueden penetrar en grietas y espacios muy pequeños e incluso hasta el centro de los agregados de bacterias, donde el agua quedaría por encima sin mostrar penetración alguna.

2.5.3. pH El pH del medio puede influir sobre la expresión de genes y regular el transporte de protones, la degradación de los aminoácidos, la adaptación a condiciones acídicas o básicas y aún la virulencia. Las células perciben los cambios del pH ambiente a través de diferentes mecanismos. La protonacíón y desprotonación de los aminoácidos inducida por el pH, puede alterar la estructura proteínica secundaria y por lo tanto la función que señala el cambio. La célula puede responder sólo a una de las formas de las moléculas de señal. Por ejemplo, los ácidos orgánicos atraviesan la membrana citoplasmática solamente en la forma protonada y un aumento de la concentración intracelular indicaría un incremento en la acidez ambiental. El gradiente de protones a través de la membrana puede servir, por sí mismo, como un sensor para ajustar los procesos dependientes de la energía (8). El pH intracelular puede ser mantenido sobre un valor crítico en el cual las proteínas internas se desnaturalizan irreversiblemente. En Salmonella typhimurium hay tres mecanismos para mantener el pH interno compatible con la vida: la respuesta homeostática, la respuesta de tolerancia al ácido y la síntesis de proteínas de ‘shock’ acídico (14). A pH ambiental mayor que 6,0 las células bacterianas ajustan su pH interno a través de la respuesta homeostática modulando la actividad de las bombas de protones,

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antiportes y simportes, para aumentar la velocidad a la cual los protones son expelidos del citoplasma. El mecanismo homeostático es constitutivo y funciona en presencia de inhibidores de la síntesis proteica. La respuesta de tolerancia al ácido es iniciada por un pH externo de 5,5 a 6,0. Este mecanismo es sensible a los inhibidores de la síntesis proteica y puede mantener el pH interno por sobre 5,0 teniendo el pH externo valores tan bajos como 4,0. La pérdida de la actividad ATPasa, causada por las mutaciones que desorganizan genes o los inhibidores metabólicos, anula la respuesta de tolerancia al ácido pero no el mecanismo homeostático. Esta respuesta también puede conferir protección cruzada frente a otros agentes ambientales de estrés. La síntesis de proteínas de ‘shock’ acídico es la tercera vía por la que la célula regula el pH interno. Esta síntesis es generada por un pH ambiental de 3,0 a 5,0 proveyendo un conjunto de proteínas reguladoras distintas de las proteínas de la respuesta de tolerancia al ácido.

Rango de pH para el crecimiento (2) Bacterias límite inferior óptimo límite superior Thiobacillus thiooxidans 0,5 2,0-3,5 6,0 Azotobacter sp. 5,5 7,0-7,5 8,5 Erwinia carotovora 5,6 7,1 9,3 Clorobium limicola 6,0 6,8 7,0 Thermus aquaticus 6,0 7,5-7,8 9,5 Nitrobacter spp. 6,6 7,6-8,6 10,0 Hongos Aspergillus oryzae 1,6 9,3 Fusarium oxysporum 1,8 11,1 Penicillium italicum 1,9 9,3 Rhizoctonia solani 2,5 8,5 Botrytis cinerea <2,8 7,4 Aspergillus niger 2,8 8,8 Aunque para la mayoría de las bacterias el pH óptimo para el crecimiento se encuentra entre 8,5 y 7,5; pocas especies son acidófilas (Thiobacillus), algunas son ácido-tolerantes (lactobacilos), pero muchas crecen en condiciones alcalinas (nitriificadores, rizobios, actinomicetos y bacterias ureolíticas). Por su parte, los hongos prefieren valores bajos de pH, y predominan cuando se siembra una muestra de suelo en un medio de pH 5, pero no a pH 8 (15). Algunos organismos productores de ácidos no son ácido-tolerantes y si el medio no posee un regulador de pH se autoenvenenan, por ejemplo ciertas enterobacterias (2).

2.5.4. Oxígeno El metabolismo de los microorganismos está fuertemente influído por el oxígeno molecular. Los organismos que dependen de la respiración aeróbica, para los cuales el oxígeno es el aceptor final de electrones, se conocen como aeróbicos estrictos. Un ejemplo de éstos es la actinobacteria Streptomyces. Por el contrario para los organismos anaeróbicos estrictos el oxígeno es generalmente tóxico. Las células somáticas de las bacterias del género Clostridium son muy sensibles al oxígeno mientras que los endosporos están protegidos de su efecto letal. Un grupo intermedio de organismos, los anaeróbicos facultativos, pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno molecular, por ejemplo la levadura Saccharomyces cerevisiae que puede obtener su energía tanto de la fermentación como de la respiración. Por otro lado están los organismos que únicamente toleran al oxígeno, como algunas bacterias lácticas que

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obtienen su energía exclusivamente de la fermentación sin ser dañadas por el oxígeno. Ciertas bacterias aeróbicas se cultivan mejor en ambientes donde la concentración de oxígeno es reducida y se las denomina microaerofílicas (14).

2.5.5 Potencial de reducción El potencial de reducción de un substrato es aquel en que dicho substrato gana electrones con mayor facilidad. Cuando pasan electrones de un compuesto a otro, se crea una diferencia de potencial entre ambos, la que se expresa en milivoltios (mV). Cuanto más oxidada esté una substancia más positivo será su potencial eléctrico, y cuanto más reducida el potencial será más negativo. El potencial de reducción de un sistema se expresa con el símbolo Eo’. Los microorganismos aerobios crecen en ambientes con valores Eo’ positivos mientras que los anaeróbicos necesitan para su desarrollo un medio con Eo’ negativo. Entre las substancias que ayudan a mantener condiciones reductoras en el medio de cultivo se encuentran los aminoácidos con un grupo tiol (-SH) y los azúcares con un grupo aldehído libre (15).

2.5.6. Temperatura En muestras de agua recogidas en las proximidades inmediatas a las surgencias termales se han hallado hasta 108 - 109 células bacterianas por mL. Las bacterias adaptadas a elevadas presiones hidrostáticas (250–260 bares o sea 25-26 MPa) muestran además una notable adaptación a las altas temperaturas, por ejemplo unas bacterias metanogénicas tenían tiempos de duplicación entre 37 y 65 minutos a 100°C bajo tales presiones (16).

Temperaturas cardinales en °C para microorganismos procarióticos (17) grupo mínima óptima máxima termófilos 40-45 55-75 60-90 mesófilos 5-15 30-45 35-47 psicrotrofos -5-+5 25-30 30-35 psicrófilos -5-+5 12-15 15-20 Los valores de las temperaturas cardinales (mínima, óptima, máxima) varían ampliamente entre las bacterias como se muestra en el cuadro siguiente, pero algunas tienen una amplitud mayor, como por ejemplo Clostridium perfringens que crece entre 12 y 50°C. Los organismos aislados de ambientes fríos crecen a temperaturas por debajo de 0°C si las altas concentraciones de solutos impiden la congelación del medio (1).

Temperaturas en °C para el crecimiento de bacterias (1) especie mínima óptima máxima Listeria monocytogenes 1 30-37 45 Pseudomonas maltophila 4 35 41 Escherichia coli 10 37 45 Clostridium kluyveri 19 35 37 Bacillus flavothermus 30 60 72 Thermus aquaticus 40 70-72 79 Sulfolobus acidocaldarius 70 75-85 90 Pyrobacterium brockii 80 102-105 115 Los mohos psicrotrofos pertenecen a los géneros Cladosporium, Fusarium, Penicillium, Trichothecium y las levaduras a Candida, Cryptococcus, Torulopsis, Rhodotorula (18).

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2 9

Temperaturas cardinales de algunos hongos (18,19)

temperatura °C grupo mínima óptima máxima Alternaria solani 2 27 45 Aspergillus fumigatus 12 35 55 Botrytis cinerea 0 20 30 Fusarium moniliforme <5 25 35 Rhizoctonia solani 2 25-30 35 Trichothecium roseum <10 30 35 La velocidad de crecimiento se ve afectada por los cambios de temperatura y en los rangos inferiores el tiempo de generación puede sobrepasar las cien horas. Los microorganismos eucarióticos, por ejemplo protozoos, son más sensibles a las bajas temperaturas que los procarióticos, y entre estos últimos los gram negativos son más afectados que los gram positivos (17).

2.6. Medios de cultivo El medio sirve de reservorio para los nutrientes. El componente dominante es casi siempre el agua. También en el caso en el que los microorganismos se hallen sobre un substrato sólido, por ejemplo cereales o forrajes, éste debe estar húmedo para permitir la acción microbiana o enzimática.

Medios complejos para el enriquecimiento de bacterias heterótrofas (21) base : extracto de levadura 1%, KH2PO4 0,1%, MgSO4 0,02% incubación : 30°C, en la obscuridad fuente condiciones agregado organismos suelo pH 7,0 - aerobiosis --- oxidantes de aminoácidos " pH 3,0 - anaerobiosis glucosa 2% Sarcina sp. suelo pasterizado pH 7,0 - aerobiosis --- Bacillus spp. " pH 7,0 - anaerobiosis --- Clostridium fermentadores

de aminoácidos " pH 8,0 - aerobiosis urea 5% Bacillus pasteurii " pH 7,0 - anaerobiosis glucosa 2%, Clostridium fermentadores

CaCO3 2% de azúcares vegetales, leche, pH 6,5 - anaerobiosis glucosa 2% bacterias lácticas frutas, cerveza pH 6,0 - aerobiosis etanol 4% bacterias acéticas suelo, agua pH 7,0 - anaerobiosis glucosa 2%, bacterias coliformes residual CaCO3 2% queso suizo pH 7,0 - anaerobiosis lactato Na 2% bacterias propiónicas Los microorganismos heterotróficos pueden utilizar azúcares, alcoholes y aminoácidos como fuente de energía. Algunos son capaces de emplear polisacáridos, como almidón y celulosa, al tener la posibilidad de hidrolizar estos compuestos hasta azúcares sencillos. Loa aminoácidos y nucleótidos suelen constituir la fuente primaria de nitrógeno y para obtenerlos, algunos organismos son capaces de degradar péptidos, proteínas y polinucleótidos. También las grasas son utilizadas como fuente de energía, aunque sólo un número relativamente pequeño de microorganismos las atacan (20). Además del carbono, los nutrientes primordiales son nitrógeno y fósforo que se incorporan como amonio o nitrato, y fosfato. Otros nutrientes, tales como vitaminas e iones metálicos, se requieren en pequeña cantidad (micronutrientes) y suelen estar, como contaminantes, en los componentes principales de los medios de cultivo e incluso