OBJETIVO Mediante diferentes métodos de extracción se obtendrán colorantes naturales de

origen vegetal y se identificaran mediante el espectrofotómetro de UV-VIS

OBJETIVOS PARTICULARES

EXTRACCIÓN DE COLORANTES NATURALES: BIXINA EXTRACCION DE COLORANTE NATURAL DE LA ESPINACA EXTRACCIÓN DE LOS COLORANTES NATURALES PRESENTES EN EL CÁLIZ DE Hibiscus

sabdariffa L. (rosa de jamaica)” EXTRACCIÓN DEL LICOPENO EN JITOMATES CON MADURACIÓN EN ETAPA ROJO EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS NATURALES A PARTIR DE MORTIÑO (Vaccinium

myttillus L.) Y MORA DE CASTILLA (Rubus glaucus) COMO ALTERNATIVA DE COLORANTE NATURAL

IDENTIFICACION DE LOS COLORANTES MEDIANTE EL UV-VIS

INTRODUCCIÓN

Conocidos son los efectos carcinogénicos y embriotóxicos causados por los colorantes artificiales, sin embargo su uso sigue siendo sin duda de gran importancia en ciertos productos, ya que gracias al color se perciben sensaciones agradables a la vista, además de ser un factor estético.En los últimos tiempos, las industrias cosmética, alimenticia y farmacéutica, se han preocupado por brindar al consumidor productos de alta calidad que sean seguros, es decir que posean los menores efectos secundarios y que a la vez proporcionen vitaminas, minerales y todos aquellos elementos capaces de mejorar la salud de la población.Los colorantes naturales se han utilizado desde tiempos antiguos, pero es hoy en día cuando nuevamente han retomado un papel de gran importancia en dichas industrias, esto debido a la gran exigencia de la población por consumir productos seguros, eficaces y de calidad.Es indudable que en un producto destinado al consumo, sea cual fuere su naturaleza, los caracteres organolépticos tienen una importancia capital para su aceptación; uno de estos es el color. No basta con que un producto posea sabor y olor agradable, debe ser apetitoso por su aspecto para conseguir la plena aceptación del consumidor.

Gran número de productos alimenticios están desprovistos originalmente de color, como sucede con muchos productos elaborados, y otros los pierden con el tiempo, como es el caso de las conservas.

El uso de los colorantes alimenticios obedece a tres motivos fundamentales:

Tipo técnico; subsanar pérdidas o deficiencias del color natural. Tipo estético o de presentación; de carácter comercial, y

Tipo psicológico; en donde los caracteres organolépticos pueden producir en el público motivos de consumo.

Peligros de la tinción

Los abusos a que podría conducir la libre coloración de las sustancias destinadas al consumo han sido prevenidos por las autoridades sanitarias de los distintos países, y el uso de las materias colorantes sintéticas se ha venido regulando mediante disposiciones basadas en ensayos biológicos de toxicidad (2).

Regulación de los colorantes artificiales

Con el transcurso de los años se logró aumentar la eficiencia y garantizar la seguridad de los colorantes. Hoy en día, este tipo de aditivos que se incorporan a los alimentos están regulados mucho más estrictamente. La base de la legislación moderna es la Ley Federal de Alimentos, Drogas y Cosméticos (FD&C) de 1938 que otorga a la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) la autoridad legal sobre los alimentos, sus ingredientes y define los requisitos que se deben cumplir en las etiquetas.Las reacciones adversas que pueden ocasionar están desde una simple intoxicación aguda o subaguda, hasta casos de carcinogenicidad sin ser menos importantes las alergias; por lo que en general, las disposiciones legislativas han consistido en listas en las que se especifican los colorantes utilizables y sus exigencias de pureza.

COLORANTES NATURALES

Se les denomina así a todos aquellos compuestos que poseen coloraciones y que provienen de fuentes naturales como plantas superiores, algas, hongos y líquenes, así como de algunos organismos invertebrados.Son muchas las plantas superiores que producen colorantes; a pesar de su universalidad no están lo suficientemente concentrados para permitir una rápida y económica extracción, y en consecuencia son relativamente escasas las que tienen gran importancia comercial como fuente de colorantes.Las algas deben su color a las ficobilinas, las que se clasifican en ficocianinas y ficoeritrinas, de color azulado con fluorescencia roja y de color rojizo con fluorescencia naranja brillante, respectivamente.Los hongos, particularmente la parte correspondiente al “cuerpo fructífero”, están fuertemente pigmentados. El número de pigmentos diferentes probablemente excede los 1000; aunque muchos de ellos son de naturaleza común a las plantas superiores, como por ejemplo betalaínas, carotenos y quinonas, muchos de ellos no han sido encontrados en algún otro organismo biológico.Los líquenes han sido ampliamente utilizados, por poseer compuestos coloreados como las quinonas, xantonas, depsidos y desdidonas, carotenoides y xantofilas, así como

fenoxazinas.Dentro de los organismos marinos invertebrados, los crustáceos y moluscos quizás son los que proveen las más diversas fuentes de colorantes.De los insectos se puede destacar la cochinilla por su contenido de ácido carmínico, así como el kermes que produce ácido kermésico, ambos de naturaleza antraquinónica.

CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES SEGÚN SU ESTRUCTURA QUÍMICA

Colorantes Sintéticos

Colorantes nitroso Colorantes nitro Colorantes azoicos

Colorantes difenilmetánicos Colorantes trifenilmetánicos Colorantes xanténicos Colorantes quinónicos

Colorantes quinoleínicos Colorantes indigoides

Colorantes Naturales Carotenoide Flavonoides Antocianinas Betalaínas Quinonas

Materiales y reactivos generales

MATERIALES Y METODOS:

80g de semilla de achiote Balanza analítica Estufa Centrífuga Cocina Olla NaOH al 1% (100 mL) HCl 1.5N (20 mL) Agua destilada Ácido Clorhídrico 25 %

Etanol 95% Metanol Solución buffer pH 4 Solución buffer pH 5 Solución buffer pH 6 n-Butanol Cloroformo Ácido acético Fruta de mortiño (Vaccinium myttillus L.) Fruta de mora de castilla (Rubus glaucus) Etanol 90° Ácido cítrico a una concentración de 0,03% Cloruro de potasio 0,025 M Acetato de Sodio 0,4 M. Agua destilada Espectrofotómetro Baño María Estufa Refrigerador Pipetas Celdas de cuarzo de un centímetro Mortero Espátula Cuchillo Papel aluminio Agitador de vidrio Embudo Vasos de precipitación Erlenmeyer Agua destilada

Probetas Balanza analítica Papel filtro whatman No.1. Tubos de ensayos

EXTRACCIÓN DE COLORANTES NATURALES: BIXINA

La bixina es el principal pigmento del achiote, es un carotenoide natural soluble en aceite que se forma naturalmente en la superficie de la semilla de Bixa Orellana L. seed.

Este pigmento natural se puede obtener mediante separación por métodos de cromatografía. Su punto de ebullición es de 198 C. Es soluble en acetona, cloroformo y soluciones acuosas alcalinas, es insoluble en agua, ligeramente soluble en alcohol etílico, propilenglicol, etc. La bixina es muy estable entre 60 – 80 C e inestable por encima de 80 C. El colorante crudo es de color rojo – anaranjado y posee un sabor amargo.

Existen preparaciones de bixina, los extractos solubles en agua, la norbixina es muy soluble en agua. La elaboración de soluciones (0.5 – 4% de norbixina) por hidrólisis alcalina es una práctica comercial usual y es frecuentemente llamado annato de simple poder. Tales productos son usados para dar color al queso, pasteles, sopas y otros productos de bajo contenido de grasas y se obtiene usando soluciones de hidróxido de potasio como diluyente.

El método de extracción del pigmento denominado solución de hidróxido de potasio, se realiza a través de una reacción química, donde un átomo de hidrogeno del grupo carboxílico del compuesto bixina es reemplazado por un átomo de sodio del hidróxido de sodio, formándose una sal llamada bixinato de sodio. Luego se acidifica la solución de bixina de sodio con acido clorhídrico 1.5 N para lograr precipitar un colorante constituido por bixina.

La norbixina es un pigmento carotenoide soluble en agua formado de bixina mediante hidrólisis alcalina.

Diagrama de flujo para la extracción de la Bixina

Descripción del diagrama de flujo para la extracción de la bixina Selección: se eliminaron las semillas negras, húmedas y fermentadas o con rasgos

de enfermedad Extracción 1: Se realiza la primera extracción del pigmento utilizando 40 ml de

agua y 1 ml de NaOH al 50% para solubilizar fácilmente el principio colorante del achiote, agitar constantemente a temperatura ambiente durante 10 minutos hasta agotar la semilla.

Extracción 2: A los sólidos insolubles (semillas desgastadas) se le realiza la segunda extracción del pigmento utilizando 30 ml de agua y 0.5 ml de NaOH al 50% para solubilizar fácilmente el principio colorante del achiote, agitar constantemente a temperatura ambiente durante 10 minutos hasta agotar la semilla.

Extracción 3: A los sólidos insolubles (semillas desgastadas) se le realiza la segunda extracción del pigmento utilizando 30 ml de agua y 0.5 ml de NaOH al 50% para solubilizar fácilmente el principio colorante del achiote, agitar constantemente a temperatura ambiente durante 10 minutos hasta agotar la semilla.

Separación: luego se procedió a separar la solución de extracto llamada solución de bixinato de sodio de las semillas agotadas y se lavó con 50mL de agua destilada (4veces), con la finalidad de arrastrar los restos de colorante adheridos a la semilla.

Filtrado: se filtró al vacío, se lavó con agua destilada o se clarificó para eliminar los restos de sales que contengan la bixina.

Secado: se secó el sólido a temperatura de 70ºC por 30 minutos.

CARACTERIZACIÓN, EXTRACCIÓN DE LOS COLORANTES NATURALES PRESENTES EN EL CÁLIZ DE Hibiscus sabdariffa L. (rosa de jamaica)”

Las pruebas estadísticas determinaron que existe diferencia significativa en la concentración de rosa de jamaica versus Rojo No.40; siendo la rosa de jamaica la que tiende a tener menor concentración y mayor variabilidad. Así mismo se concluyó que existe diferencia significativa entre las temperaturas, siendo la temperatura de 30°C en donde se obtiene mayor concentración que a 50°C. Con respecto a las variables de pH, se determinó que el pH 6 es en donde la concentración es significativamente menor comparado con los otros dos. También se analizaron las combinaciones de los factores muestra-temperatura, muestra-pH, y muestra-temperatura-pH, de lo cual se concluyó que las combinaciones presentan diferencias significativas o interacciones, con excepción de la combinación temperatura-pH que no presenta interacción. Por último, el modelo estadístico indicó que las condiciones óptimas de estabilidad para el colorante artificial Rojo No. 40 son a 30°C a cualquier pH y para la rosa de jamaica es a 30°C y pH 5.

Entonces, se puede decir que los colorantes presentes en la rosa de jamaica presentan una estabilidad similar a la que tiene el colorante artificial Rojo No. 40, por lo que puede ser utilizada como alternativa de consumo tanto en la industria farmacéutica, cosmética y/o alimenticia, siendo estos seguros. Al mismo tiempo, se espera fortalecer la agricultura, ya que éste podría llegar a ser un recurso económico de gran valor para nuestro país y que en algún momento se extendería a niveles internacionales.

EXTRACCION DEL COLORANTE EN LA MUESTRA

Colecta y secado de las muestras

Observar las plantas de interés para determinar si pueden obtenerse suficientes muestras de ellas y que estén sanas.

Con la ayuda de tijeras de podar o machete obtener al menos 5 ejemplares, para su determinación taxonómica y la cantidad necesaria para llevar a cabo la parte experimental.

Realizar una selección cuidadosa del material vegetal, desechando las partes decoloradas, manchadas, enfermas o deterioradas por insectos y hongos. Hacer el lavado con agua potable en una canasta calada de modo que el agua penetre. Lavar y escurrir para eliminar el exceso de agua, esto debe hacerse por lo menos dos veces y una lavada de desinfección con 10 ppm de hipoclorito de calcio.

Colocar el material vegetal en bandejas con papel kraft, mover eventualmente, secar evitando que el material vegetal reciba sol directo. Para el almacenamiento el material vegetal debe contener un porcentaje de humedad no mayor al 10%.

Al menos 3 muestras deben ser herborizadas y sometidas a cuarentena, para su posterior determinación taxonómica.

Preparación del extracto

Pulverizar 1 gramo de muestra y extraer con 6 mL de una mezcla de metanol/ácido clorhídrico al 25 % (9:1), agitar por 15 minutos. Filtrar y utilizar 25 μL para llevar a cabo la cromatografía.

Soluciones de referencia

Azul de metileno: Disolver 5 mg en 10 mL de metanol; y aplicar 10 μL.

Amarillo naftol/Rojo Sudán: Disolver 5 mg de amarillo naftol en 5 mL de metanol y 5 mg de rojo Sudán en 5 mL de cloroformo, mezclar y aplicar 5 μL en la cromatoplaca.

Fase estacionaria

Cromatofolios de aluminio de sílica gel 60F254

Fase móviln-butanol - ácido acético glacial – agua (40:10:20)

PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN DE LOS PIGMENTOS ANTOCIÁNICOS Descongelar aproximadamente 200 g de la muestra, de los cuales se deben pesar 100 g de cálices. Macerar éstos utilizando 100 mL de solvente extractor (etanol 95%, ácido clorhídrico 0.1 N en proporción 85:15).

Transferir cuantitativamente 50 mL y hacer lavados del recipiente utilizando aproximadamente 50 mL de solvente extractor. Recibir el extracto en un beacker y medir; cubrir el beacker con parafilm y guardar durante toda la noche a 4°C, posteriormente se debe filtrar utilizando papel Whatman No.1, usando embudo Büchner.

Lavar, tanto el beacker y el papel filtro repetidamente con el solvente extractor, hasta obtener aproximadamente 450 mL de extracto. Transferir a un balón aforado de 500 mL y enrazar con el disolvente extractor, esta será la solución

Extracción del licopeno en jitomates con maduración en etapa rojo

El licopeno fue extraído a partir de 10 g de homogeneizado de jitomatesescaldados o no escaldados, el cual se colocó en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y se adicionaron 100 mL del sistema de disolventes hexano:acetona:etanol en una relación de 50:25:25; se cubrió con papel aluminio para evitar la fotooxidación y se sometió a agitación en un agitador por 15 minutos a una temperatura de 20°C. Para estudiar el efecto de los antioxidantes en la retención de licopeno, se adicionaron a la mitad delas muestras.Posteriormente se adicionaron 15 mL de agua para separar la capa de hexano (anaranjado) de la capa inferior (agua:etanol) y se agitó por 5 minutos a 20°C. Después la capa superior de licopeno(aproximadamente 50 mL) se separó con una pipeta y se colectó en un matraz Erlenmeyer ámbar de 250 mL. El licopeno residual en la capa agua:etanol fue separado utilizando el mismo procedimiento (100 mL del sistema de disolventes y 15 mL de agua). La capa de hexano se separó con una pipeta, se colectó con la primera extracción y se agitó. El pigmento en hexano se concentró a vacío a un volumen final de 10 mL en un rotavapor a una temperatura de 35°C y posteriormente se llevó a un volumen de250 mL con hexano. Esta disolución fue la que se utilizó para las pruebas deestabilidad del licopeno. Todos los procedimientos se realizaron rápidamente y bajo luz reducida.

Diagrama de flujo para la extracción, separación y purificación del licopeno de jitomates escaldados y no escaldados.

EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS NATURALES A PARTIR DE MORTIÑO (Vaccinium myttillus L.) Y MORA DE CASTILLA (Rubus glaucus)

MÉTODO PARA LA EXTRACCIÓN DE LOS PIGMENTOS.

Los métodos convencionales empleados para la extracción de antocianinas implican el uso de solventes ácidos, Menéndez (2008) sugiere por ejemplo: HCl en Metanol, HCl en Etanol, Cloroformo con Acetona, Etanol con Acido Acético, Metanol con Acido Acético, Etanol con Acido Cítrico. Se debe tomar en cuenta que el concentrado final será de grado alimenticio, por este motivo las soluciones como el Metanol y el cloroformo podrían provocar daños irreversibles para la salud o podrían dejar un olor residual como el caso del Acido Acético y Acetona. (Menéndez ,2008). Para este estudio, en la extracción de los colorantes antociánicos de cada una de las frutas, se utilizo una solución de etanol al 90° de pureza con una concentración de acido cítrico del 0,03% (protocolo sugerido por Menéndez, 2008). Se realizaron pruebas previas de extracción, con diferentes cantidades de fruta (10g, 20g, 30g, 40g, 50g) a las cuales se agregó 100 ml de la solución alcohólica a cada una, a diferentes temperaturas (25°C, 50°C, 60°C, 70°C), después de la extracción, determinamos la absorbancia para determinar el mejor método de extracción de antocianinas, y por consiguientes los parámetros de trabajo. La mejor temperatura fue a 60°C para las tres frutas mientras que en la cantidad de materia prima para la mora y tomate la mejor fue de 50g y para el mortiño fue de 10g con estas cantidades obtuvimos un buen rendimiento y una disminución en el desperdicio de la fruta.

Una vez obtenidos los parámetros procedimos a trabajar de la siguiente manera. A cada una de las frutas se las peso y posteriormente la fruta del mortiño y la de mora respectivamente se las trituraron en el mortero, mientras que la fruta del tomate de árbol se procedió a extraer el mucílago que envuelve la semilla para luego ser pesada, una vez hecho eso se aplico la solución de etanol-acido cítrico a cada una de muestras y posteriormente llevamos a baño termostático a una temperatura de 60°C durante 24 horas. Luego se procedió a realizar una filtración con papel filtro whatman No.1 para obtener los extractos de cada una de las frutas. En el experimento base el extracto se obtuvo a partir de 100g de mora ya molida, 100g de mucílago del tomate de árbol y 20g de mortiño molido con 200ml de la solución etanol-acido cítrico respectivamente, lo que sirvió para saber la cantidad de pigmento de cada uno de las muestras ya en mayores cantidades, de esta manera al final utilizamos 1kg de mora y 1 kg del mucílago del tomate de árbol con 2lt de la solución alcohólica respectivamente y 800g de mortiño con 8lt de la solución alcohólica . Una vez filtrados y obtenidos los extractos, estas muestras se llevaron a la estufa a una temperatura de 60°C, para obtener en estado sólido a cada uno de los pigmentos.

METODOLOGÍA PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS Para la obtención de la concentración de la antocianina se utilizó el método del pH diferencial que permite la estimación alternativa del contenido de antocianinas totales (Giusti, citado por Leyva, 2009). El que se basa en determinar la absorbancia de la antocianina por medio de espectrofotometría en una longitud de onda de 400 – 700 nm. La antocianina experimenta una transformación reversible con los cambios de pH manifestado por un llamativo cambio en la absorbancia y permite una rápida y exacta medida de la antocianina total incluso en presencia de otros compuestos interferentes. La concentración de antocianinas se calculó de la siguiente manera:

A = Absorbancia; PM = peso molecular FD = Factor de dilución; ε = absortividad molar

La concentración final de antocianos (mg/L) se calcula en base al volumen de extracto y peso de muestra. Se expresa en cianidina 3-glucósido (PM: 449,2 y ε: 26900).

Donde: A = (Amax. vis – A700 nm)pH1,0 - (Amax vis – A700 nm)pH4,5

Siendo A λvismax la absorbancia máxima de la antocianina, A λ700nm es la lectura de la absorbancia en 700 nmSe utilizan dos sistemas tampón: cloruro de potasio de pH 1,0 (0,025 M) y acetato sódico de pH 4,5 (0,4 M).Se adicionaron 5ml del concentrado en 5ml de buffer pH 1, con diluciones para los concentrados de mora y mortiño de 0,05 y para el concentrado de tomate de 0,1. Luego se hizo un barrido espectroscópico en el Espectrofotómetro desde 400 hasta 700 nm. Así mismo, se realizó este procedimiento para la muestra con el buffer de pH. 4,5. Se debe tener en cuenta que al realizar la lectura en el espectrofotómetro en el rango de 400 nm – 700 nm se debe obtener una absorbancia menor a 0,8 UA para así cumplir con la Ley de Beer. Luego se tomó el valor de A λvismax para la muestra a los dos pH’s y el valor de A λ700nm . Para los cálculos se tomó en consideración que la antocianina mayoritaria es cianidina-3-glucósido (Van Buren, citado por Menéndez ,2008).

Extracción de pigmentos de las hojas de espinaca

El objetivo de esta experiencia es extraer los pigmentos de las hojas de una planta verde y separarlos sobre distintas superficies, papel y tiza. Para eso emplearán una técnica que se denomina cromatografía. Los pigmentos se separan a diferentes alturas según su afinidad al papel (o tiza) o al alcohol.

Procedimiento

1. Lavar las hojas de espinacas, cortarlas en pedacitos, y colocarlas en un mortero, junto con el alcohol. 2. Triturar la mezcla hasta que el disolvente adquiera un color verde intenso. 3. Filtrar con un embudo y papel de filtro. Se puede colocar esta solución a baño María durante unos minutos para concentrarla. A) Separación en tiza1. Colocar medio centímetro de altura del filtrado en una placa de Petri. 2. Sumergir dentro del extracto la base ancha de la tiza, y dejarla entre 3 y 5 minutos. 3. Pasado ese lapso, retirar la tiza, y colocarla en un vaso que contenga ½ centímetro de altura de alcohol. Atención: es importante que la línea de extracto en la tiza no quede sumergida en el alcohol.4. Dejar la tiza en el alcohol y observar qué sucede. B) Separación en papel de filtro

1. Cortar una tira de papel de filtro de unos 10 centímetros de alto. 2. Colocar con el gotero una gota del extracto, a un centímetro del borde. Dejarlo secar. Colocar luego sobre esa gota otra, y dejarla secar. Repetir esto, colcando entre 8 y 10 gotas de extracto. 3. Sumergir la tira de papel en un frasco con alcohol y esperar una hora.