Aplicacin de mtodos de comparaciones mltiples en BiotecnologaVegetal

Gladys Casas Cardoso1*, Novisel Veita2 * Autor para correspondencia

1Laboratorio de Bioinformtica, Facultad de Matemtica, Fsica y Computacin, Universidad Central Marta Abreu deLas Villas. Carretera a Camajuan km 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830 e-mail: gladita@uclv.edu.cu

2Instituto de Biotecnologa de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuankm 5.5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830

RESUMENLos procedimientos de comparaciones mltiples permiten detectar diferencias entre las medias de lostratamientos. El objetivo de muchos experimentos en Biotecnologa Vegetal es detectar relaciones significativasentre diferentes tratamientos. En este trabajo se presentan varias tcnicas de comparaciones mltiples y seexponen sus ventajas y limitaciones. Adems, se ofrecen algunas recomendaciones para su correctaaplicacin.

Palabras clave: ANOVA, comparaciones por pares

ABSTRACTMultiple comparison procedures enable to detecte differences among treatment means. Many plant biotechnologicalexperiments are aimed to detect significant relationships among different treatments. Several multiple comparisonstechniques are presented in the current work. Besides, advantages and limitations are exposed. Somerecommendations about the correct application are also provided.

Key words: ANOVA, pairwise comparisons

ContenidoINTRODUCCINEL ANALISIS DE VARIANZA Comparaciones a posteriori Asumiendo varianzas homogneas - Mtodo de la mnima diferencia significativa - Mtodo de Bonferroni - Mtodo de Sidak - Mtodo R-E-G-W F : mtodo de Ryan (1960), Einot-Gabriel (1975) y Welsch (1977) - Mtodo de Student-Neuwman-Keuls: (Newman, 1939; Keuls, 1952) - Mtodo de Tukey - Mtodo de Tukey-b - Mtodo de Scheff - Mtodo de Duncan Asumiendo varianzas diferentes - Mtodo T2 de Tamhane - Mtodo T3 de Dunnett - Mtodo de Games-Howell- Mtodo C de Dunnett

INTRODUCCIN

El tratamiento estadstico de los resultadosexperimentales representa una poderosa herramientapara la interpretacin de los datos en cualquierciencia. En particular, la aplicacin de la estadsticaen las ciencias agrcolas no es un tributo a lamodernidad sino una larga tradicin que se originaen los trabajos de Sir Ronald Fisher, matemticobritnico (1890 - 1962). Los proyectos de Fisher, seutil izaron primeramente en biologa, perorpidamente cobraron importancia y se aplicaron a

problemas agronmicos, sentando as las bases deaplicacin de la estadstica a la experimentacinagrcola y biotecnolgica.

En este contexto, uno de los problemas, al que se lepresta especial atencin, es a la comparacin de variosgrupos o tratamientos. Especficamente, se habla decomparar una variable continua que pudiera ser elrendimiento, o la altura del tallo, con respecto a variascategoras de una variable discreta. Cada una de estascategoras representa un grupo o tratamiento diferente.A esta variable categrica se le denomina factor.

Resea Cientfica Biotecnologa Vegetal Vol. 8, No. 2: 67 - 71, abril - junio, 2008ISSN 1609-1841

Si el factor tiene solamente dos valores posibles elproblema es muy sencillo de resolver desde el puntode vista estadstico. Para este caso, las pruebasclsicas de Student y de Fisher (Milton, 1999) parala comparacin de medias y varianzas suponiendodistribuciones normales pueden utilizarse confacilidad y se encuentran implementados en cualquierpaquete de software estadstico (Meulman y Heiser,2004). Si la normalidad de la variable continua paraalguna de las categoras del factor falla, entonces,deben utilizarse mtodos no paramtricos quetambin se hallan en la literatura especializada(Siegel, 1987; Glantz, 2002) y en paquetes desoftware con cierta facilidad (Meulman y Heiser,2004).

El problema que se abordar en el presente trabajosurge cuando la cantidad de valores del factor es almenos tres. Cuando este es el caso, pudierapensarse en la realizacin de tantas comparacionespor pares como fuera necesario con ayuda de laprueba clsica de Student.

Si se imagina una situacin particular en la que setienen tres grupos y se quieren detectar lasdiferencias entre ellos deben realizarse trescomparaciones por pares: el grupo 1 con el 2, el 1con el 3 y finalmente el 2 con el 3. Si se supone quecada una de esas comparaciones usa unaprobabilidad de 0.05 para rechazar hiptesis nulascorrectas, (esta probabilidad se conoce como errorde tipo I. (Glantz, 2002). Asumiendo que lascomparaciones son independientes, la probabilidadgeneral de no cometer un error de tipo I se calculade la forma: ( ) 857.095.0 3 = . Luego la probabilidadde cometerlo ser: ( ) 143.095.01 3 = . Ntese queen estas comparaciones grupales la probabilidad derechazar hiptesis nulas correctas se increment deun 5.0% a un 14.3%, considerando solamente tresgrupos. Si los tratamientos a comparar fueran cincoentonces ( ) 226.095.01 5 = y si fueran ocho

( ) 336.095.01 8 = (Field, 2003). Como puedeapreciarse en la medida en que se incrementa elnmero de grupos a considerar aumenta de maneranotable la probabilidad de cometer un error de tipo I.

El problema presentado tiene solucin desde el puntode vista estadstico, slo que esta no es trivial. Almtodo general de comparacin de tres o msgrupos o tratamientos de manera conjunta se ledenomina anlisis de varianza (Milton, 1999;Montgomery, 2004; Hall, 2004). Es por ello, que elpresente trabajo tuvo como objetivo analizar variastcnicas de comparacin mltiples as como realizarrecomendaciones acerca de cuando resultaadecuado utilizarlas.

EL ANLISIS DE VARIANZA

Para la solucin de un problema de investigacin oen el campo de la mejora gentica con el empleo de

las tcnicas de cultivo de tejidos de plantas, surgela necesidad de realizar alguna comparacin detratamientos. Esto permitira elegir la mejor alternativade las varias que existen, o por lo menos para teneruna mejor comprensin del comportamiento de lavariable de inters en cada uno de los distintostratamientos. Por ejemplo, la comparacin de cuatroconcentraciones de reguladores del crecimiento (Ej.6-bencilaminopurina) en la regeneracin in vitro debrotes de Phaseolus vulgaris L., lo cual se hace conel fin de determinar con cul de las concentracionesse logr la regeneracin de plantas en dos genotiposde frijol (Delgado-Snchez et al., 2006).

El propsito fundamental de un anlisis devarianzas (ANOVA) es comparar los grupos otratamientos entre s (Milton 1999; Field, 2003;Mongomery, 2004; Hall, 2004). La hiptesis nulao fundamental puede enunciarse en los trminos:no existen diferencias significativas entre lasmedias poblacionales de todos los tratamientos.Si se cumpliera tal hiptesis entonces se puedeafirmar que los grupos no se diferencian entre s yque el factor es independiente de la variableanalizada. La hiptesis alternativa por su parteenuncia que existen diferencias significativas entrelos tratamientos, es decir que al menos dos delos grupos difieren.

Para probar la hiptesis de igualdad de medias secalcula un estadstico F de Fisher, que refleja elgrado de parecido existente entre las medias que seestn comparando (Milton 1996; Field, 2003;Mongomery, 2004; Hall, 2004). Si no existendiferencias significativas entre las mediaspoblacionales, las medias muestrales sernparecidas, existiendo entre ellas tan slo diferenciasatribuibles al azar (Field, 2003).

El estadstico F del ANOVA se basa en elcumplimiento de dos supuestos fundamentales:normalidad y homocedasticidad. Algunos autorescoinciden en afirmar que pueden confiarse en losresultados an si las variables se alejan un poco dela distribucin normal y tienen varianzasmoderadamente diferentes (Aron y Aron, 2002).

La razn F en un anlisis de varianza solo muestrainformacin acerca de si la varianza contenida enlos datos se debe a la casualidad o a la influencia defactores externos. Un resultado estadsticamentesignificativo no ofrece informacin acerca de dndeestn tales diferencias. Es por ello que, comocomplemento del anlisis de varianza, se debenrealizar otras pruebas estadsticas que ayuden alinvestigador a encontrar cules grupos difieren(Milton 1996; Glantz, 2003; Field, 2003).

Una va para lograr este objetivo es realizar mltiplescomparaciones entre todos los grupos. A ellas seles llama comparaciones a posteriori.

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Comparaciones a posteriori

Existe una gran cantidad de mtodos de comparacinmltiple. Resulta indiscutible que algunos sonmejores que otros y tambin que algunos han sidomucho ms util izados que otros. Entre losnumerosos resultados publicados en cultivo detejidos, fisiologa vegetal y ramas afines, se nota uncierto abuso de algunas de estas tcnicas y muypoco uso de otras que pudieran conducir aconclusiones mucho ms certeras.

Como ya se haba enunciado, uno de losprerrequisitos del anlisis de varianza es lahomocedasticidad. Varias pruebas decomparaciones mltiples son sensibles a la igualdado no de los varianzas, es por ello que se realizar unanlisis dividido a partir de ahora (Meulemn y Heiser,2004; SPSS, 2005).

Asumiendo varianzas homogneas

- Mtodo de la mnima diferencia significativa:Se basa en la distribucin t de Student. Fuepropuesto por Fisher en 1935. No ejerce ningncontrol sobre la tasa de error, es decir, cadacomparacin se lleva a cabo utilizando el nivel designificacin establecido (generalmente 0.05), por loque la tasa de error para el conjunto decomparaciones puede llegar a , siendoel nivel de significacin y el nmero decomparaciones realizadas. Los pares de medias quese comparan (utilizando el estadstico t de Student)son aquellos que han sido planeados antes deejecutar el experimento, por eso se dice que es unaprueba para comparaciones planeadas. Esta pruebapuede dar resultados falsamente significativos si elexperimentador se dedica a hacer comparacionesentre tratamientos de resultados extremos (Dean yVoss, 1999; Atil y Unver, 2001), por lo que no serecomienda su uso. Esta prueba suele encontrarseen la literatura estadstica con su nombre en ingls:LSD = Least Significant Difference.

- Mtodo de Bonferroni: Se basa en la distribucint de Student y en la desigualdad de Bonferroni. Estemtodo intenta resolver el problema que tiene laaplicacin de numerosas pruebas de Studentreduciendo la probabilidad de cometer un error detipo I en cada comparacin. Controla la tasa de errordividiendo el nivel de significacin entre el nmerode comparaciones realizadas. Cada comparacinse evala utilizando un nivel de significacin .Este procedimiento trabaja raz onablemente biencuando se tiene un nmero pequeo de grupos(Glantz, 2003). Si la cantidad de tratamientos seincrementa a ocho o a diez, el valor de t requeridopara detectar una diferencia ser demasiado grande,(el valor de ser demasiado pequeo), de maneraque en la prctica el mtodo se vuelve incapaz dedetectarlas. En tales casos no se recomienda su

( )k 11 k

k

kB =

B

utilizacin. Esta tcnica tambin se conoce con elnombre de Dunn Bonferroni y se public por primeravez en 1961.

- Mtodo de Sidak: Se basa en la distribucin t deStudent, pero controla la tasa de error evaluandocada comparacin con un nivel de significacin . Esta solucin es algo menosconservadora que la de Bonferroni, es decir, rechazala hiptesis fundamental en ms ocasiones que elmtodo de Bonferroni, pero de manera general estambin un mtodo recomendable. Se public porprimera vez en 1967.

- Mtodo R-E-G-W F : mtodo de Ryan (1960),Einot-Gabriel (1975) y Welsch (1977): Se basa enla distribucin . Es un mtodo por pasos. Comienzaordenando de forma ascendente los grupos por eltamao de sus medias, se efectan todas lascomparaciones posibles entre pares de mediasteniendo en cuenta el nmero de escalones ( )r quelas separan. Con p medias, la media ms pequeay la ms grande estn separadas escalones;la media ms pequea y la segunda ms grandeestn separadas escalones; la media mspequea y la tercera ms grande estn separadas escalones y as sucesivamente. Despusde ordenadas, dos medias adyacentes estnseparadas por dos escalones. El nmero deescalones existente entre las medias comparadascondiciona el nivel de significacin de cadacomparacin, siendo ste mayor cuanto msalejadas se encuentran las medias ordenadas. Enel mtodo R-E-G-W F , cada comparacin se evalautilizando un estadstico F y un nivel de significacin . Es un mtodo mucho ms potenteque el de Duncan y el de Student-Newman-Keuls(ver ms abajo), pero no es apropiado cuando losgrupos tienen tamaos distintos (Meuleman y Heiser,2004).

- Mtodo de Student -Neuwman-Keuls:(Newman, 1939; Keuls, 1952): Se basa en ladistribucin del rango estudentizado. Al igual que elmtodos R-E-G-W , parte de ordenar las mediaspor su tamao. Pero a diferencia de l, aqu el nivelde significacin para cada conjunto de mediasseparadas r pasos es siempre .. Cuantos ms pasosexisten entre dos medias, mayor es la diferenciamnima necesaria para considerar que esas mediasdifieren significativamente (Atil y Uver, 2001).

- Mtodo de Tukey: Se le conoce como mtodo dela diferencia honestamente significativa de Tukey.Equivale a utilizar el mtodo de Student-Newman-Keuls con , por tanto, todas las comparacionesse refieren a una misma diferencia mnima, o seautiliza un slo valor con el cual se comparan todoslos posibles pares de medias. Numerosos autorescoinciden en afirmar que la prueba es apropiada pararealizar comparaciones por pares, por lo que tiene

( ) kS 111 =

Fp

1= pr2= pr

( ) prR = 11

F

pr=

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pr =

una gran aceptacin (Atil y Uver, 2001). Se publicpor primera vez en 1953.

- Mtodo de Tukey-b: Es una modificacin delanterior. Consiste en considerar como diferenciamnima el valor medio entre la diferenciahonestamente significativa de Tukey y la diferenciamnima obtenida con el mtodo de Student-Newman-Keuls para el caso de 2=r . Se public por primeravez en 1953 (Dean y Voss, 1999).

- Mtodo de Scheff: Se basa en la distribucin de Fisher. Permite controlar la tasa de error parael conjunto total de comparaciones que es posibledisear con p medias. Utilizado para efectuar slocomparaciones por pares, es un procedimientoconservador: tiende a considerar significativas menosdiferencias de las que debera. Para ser consecuentecon este problema, Scheff recomienda utilizar (Scheff, 1959). La prueba se equivocamuy poco en las diferencias que detecta, por lo quesu uso es ampliamente recomendado (Atil y Uver,2001). Si el nmero de rplicas es diferente en lostratamientos o grupos a comparar, el mtodo deScheff resulta ser ms apropiado que el de Tukey.Se public por primera vez en 1953.

- Mtodo de Duncan: Es conocido como la pruebade los rangos mltiples de Duncan. Es un mtodode comparacin por pasos. Controla la tasa de errorutilizando, para el conjunto de medias separadas pasos, un nivel de significacin .Mientras ms pasos existan entre dos medias, mayores la diferencia mnima con la que se va a considerarque esas medias difieren significativamente. Elmtodo es ms potente que el de Student-Neuwman-Keuls, pero no protege adecuadamente el error de tipoI. Tampoco resulta confiable su aplicacin cuando elnmero de rplicas no es igual en los tratamientos quese comparan, por lo que de manera general no serecomienda su uso. Se public por primera vez en 1955.

- Mtodo de Dunnett: Es una prueba pararealizar comparaciones planeadas. Se utilizafundamentalmente para comparar cada grupo conun grupo control. Este procedimiento permitedetectar todos los tratamientos que son tan buenoscomo el control o mejores que l. Un ejemplo de suaplicacin puede ser en estudios toxicolgicos enlos que el investigador quiere determinar la dosis msbaja en la que an existe una respuesta observable(Atil y Uver, 2001). Se supone que todos lostratamientos tengan el mismo nmero de casos ycontrola la tasa de error para comparaciones.Se public por primera vez en 1955.

Asumiendo varianzas diferentes

En el caso en que las varianzas poblacionales seandiferentes deber utilizarse uno de las siguientesmtodos para realizar las comparaciones mltiples:

- Mtodo T2 de Tamhane: es un mtodo basadoen la distribucin del mdulo mximo estudentizado.Se public por primera vez en 1977.

- Mtodo T3 de Dunnett: este mtodo es unamodificacin propuesta por Dunnett al estadstico T2de Tamhane. Se basa tambin en la distribucin delmdulo mximo estudentizado y fue publicado en1980.

- Mtodo de Games-Howell: es un mtodo muysimilar al de Tukey. Se basa en la distribucin delrango estudentizado y en un estadstico t en el que,tras estimar las varianzas poblacionales suponiendoque son distintas, se corrigen los grados de libertadmediante la ecuacin de Welch. En trminosgenerales, de los cuatro mtodos de este apartado,el de Games-Howell es el que mejor controla la tasade error en diferentes situaciones. Fue publicado en1976.

- Mtodo C de Dunnett: mtodo idntico al deGames-Howell excepto en la forma de corregir losgrados de libertad de la distribucin del rangoestudentizado. Esta solucin es ms conservadoraque la de Games-Howell. Se public en 1980.

Existe una gran cantidad de mtodos para comparartratamientos. Es tarea del investigador seleccionarel o los adecuados, aunque no siempre esta es unatarea sencilla.

Varios autores coinciden en afirmar que la prueba deScheff puede aplicarse en cualquier situacin, sinembargo, cuando la cantidad de rplicas en lostratamientos es similar, se ha demostrado que elmtodo de Bonferroni es ms potente (Atil y Uver,2001). Otros autores afirman que es la prueba deTukey la que ofrece resultados ms confiables conmayor frecuencia y por tanto, esta es la que debeusarse cuando el investigador se encuentratotalmente desorientado.

En una comparacin entre varios mtodos se lleg ala conclusin de que si el nmero de rplicas esdiferente en cada grupo, la prueba de Scheff esmejor que la de Tukey, pero si el diseo esequilibrado, es mejor utilizar la prueba de Tukey envez del de Scheff (Atil y Uver, 2001).

La prueba de Duncan por su parte es un mtodode uso muy comn, al igual que la prueba de lamnima diferencia significativa, debido a lasimplicidad de sus clculos. Existen paquetesestadsticos profesionales que tienen estastcnicas implementadas, luego la dificultad en losclculos ya no es un problema real. Ambosmtodos incrementan de manera notable el errorde tipo I, por lo que no se recomienda su uso enninguna situacin (Aron y Aron, 2002; Dean yVoss, 1999; Atil y Uver, 2001).

F

10.0=

r ( ) 111 = rD

1k

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Como puede apreciarse no existe un nico mtodoque ofrezca siempre resultados correctos. La eleccindel mtodo de comparacin adecuado es una tareadifcil que debe resolver el investigador, endependencia de las caractersticas de suexperimento y de los objetivos de su investigacin.En este trabajo se presentan algunasrecomendaciones que deben tenerse en cuanta a lahora de seleccionar el mtodo apropiado.

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