Compuestos Fenolicos Con IR

7/25/2019 Compuestos Fenolicos Con IR

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A n a l . I n s t . Bot. Cavanil les 32 (1): 215-267 (1975)

C O M P U E S T O S F E N O L I C O S

EN PYRUS PYR STER

B U R G S D .

por

E. FUERTES-LASALA, M. F E R N A N D E Z , L. M A RTN EZ,

M. C. GARCTA-MINA y F. A. VEGA

I. I N T RO D U CCI N

Los polifenoles y en especial los flavono ides, e stn siendo inve sti

gados in tensamente en las p l a n t a s ; se han consegu ido resu l t ados muy

p ro me t ed o re s en los l t imos aos , t an to en la solucin de p ro b l emas

qu imio taxonmicos como en la relacin de los diferentes t ipos de flavo

noides con la evolucin f i logent ica en el reino vegetal .

Es tas sus tanc ias

se

encue n t ran amp l iamente represen tadas

en las

p lan

tas vascu lares , es t ando comple tamente ausen tes

en las

C r i p t g a m a s

;

tan slo

se han

identificado unos pocos flavonoides

en las

Briofi tas ,

q ue se consideran primit ivos segn

H A R B O R N E

(1067), basndose en

los conocimientos actuales sobre su biosntesis y dis t r ibucin en el re ino

vegeta l .

Los pol i fenoles se pueden identificar con relativa facilidad por m

todos c romatogrf i cos y espec t ro fo tomt r i cos , a par t i r de pequeas

mu es t r a s de mater ial f resco e incluso de p lan tas conservadas en her

barios

(HARBORNE, 1072; P A R I S , 1971).

El es tudio

de los

polifenoles

en los

frutos t iene gra n in ters debido

a que estas sustancias influyen en sus carac te res o rgano lp t i co s : co lo r ,

s ab o r y t e r s u ra ( C R U E S , 1948: B A T E - S M I T H , 1954; S W A I N , 1962).

T amb i n se han relacionado es tas sus tancias con la res is tencia a las

infecciones ( H U L M E y E D N E Y , 1960).

CH A L L I CE y W E S T W O O D (1972), examinando las ho jas y cor tezas de

dist intas especies de

Pyrus,

frente a infecciones de h o n g o s y bac ter i as ,

af i rman que no hay cone xin en tre com pone ntes fenl icos y resistencia

a infecciones , aunque en a lgunos casos la presencia de c ie r to componen-


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24 ) SALES DEL INSTITUTO BOTNICO A. J. C A V A N I LLES . TO M O X X X I I , VOL. I

te co inc ide aparentemente con la resistencia a la infeccin. Segn esto,

en c ier tas c ircunstancias la presenc ia de de te rminados compues tos fen-

l icos puede servir para diferenciar individuos resis tentes e individuos

sensibles

y

hacer predicciones respecto

a la

resistencia

a a

infeccin.

Por todas es tas razones nos parec i in te resante el es tudio de los

compues tos fenl icos en

Pyrus pyraster,

c on t inua ndo los trabajos real i

z a d o s

en

e s t e De pa r t a m e n to

en

diferentes var iedades cult ivadas

de

Pyrus

communis

L.

Pyrus pyraster

B u r g s d . es una especie muy res is ten te a

las infecciones de h o n g o s y bac te r ias y se uti l iza para pie de injer tos

de peras cultivadas en N a v a r r a (*).

El es tudio compara t ivo ent re las var iedades cult ivadas y

Pyrus pyras

ter nos hizo apreciar a lgunas diferencias cuanti ta t ivas y cuali ta t ivas

e n t r e

los

diferentes compuestos fenlicos.

Se han hecho numerosas inves t igac iones en las hojas del g ne r o

Pyrus

( W I L L I A M S ,

1964) ;

CH A L L I CE

y

W I L L I A M S ,

1968, 1968a). Los com

pone n te s del epica rpo es tn menos es tudiados . Son no ta b le s los t r a ba

j o s de JO SL Y N y P E T E R S O N (1956), DUGGAN (1969), N O R T J E y K O E P -

P EN (1905) y H E RM A N N (1970).

II.

M A T E RI A L

Y

MTODOS

1.

Material estudiado

Los epica rpos de

Pyrus pyraster

B ur gsd .

F r u t o de 1,3-3,5 x 1,8-3,5 cm., g loboso o tu r b ina do , de color ama

r i l lo , mar rn o negro , pedice lo de lgado de 1-5,5 cm. de longitud, c l iz

pers is ten te (F lora Europaea , 1968) . Madurac in en la pr imera quincena

de octubre. Se recolect en la local idad de Azpil icueta , Valle del Baz tn

(Navarra) .

2.

Mtodos

e

extraccin

y

purificacin

a ) Extraccin

Los e x t r a c tos se rea l iza ron a par t i r de los epica rpos , to ta 'mente

e x e n t o s de pulpa , con e tanol85 por 100. P ara ev i ta r oxidac iones d urante

(*)

Datos suministrados

por la

Excma. Diputacin Foral

de

Navarra.


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COMPUE ST OS FE NL ICOS E N FYRU S PYRASTE R B URG SD. 2 4 7

1 pr oc eso , se aad i bisulfi to sdico al 1 po r 100 (VUATAZ et al., 1059),

al rededor de 2 mi . por cada 100 g . de mater ial f resco. Los extractos

e tan l i cos se concen t ra ron en ro tavapor

( B C H I ,

mod. R) a pequeo

volumen .

h) Purificacin y fraccionamiento

Se el iminaron ceras y clorofi las t ratando el ext racto con ter de

pe t r leo , segu idamente e l ex t rac to acuoso se ex t ra jo con ace ta to de

t i lo .

Es te ex t rac to se concen t r en ro tavapor has ta pequeo vo lumen

y se conserv seco sobre pentxido de fsforo.

La reaccin acuosa contena gran cant idad de pol meros de azca-

x e s ;

se el iminaron por precipi tacin con concentraciones crecientes de

etanol. Para recuperar los polifenoles del precipitado se uti l iz la fi l

t racin rpida por pol iamidas . Las pol iamidas (Ul t ramid Pulver

B . A. S. F . , Ludw igshafe n) se t ra tar on prev iam ente, para el iminar los

monmeros solubles , con metanol cal iente durante quince minutos , lavn-

-dolas despus con metanol hasta conseguir que el l quido de lavado

pa sara t ra ns pa re nt e; despus se lavaron con metan ol 20 y 50 por 100

y agua. En algunos casos se emple la mezcla dimet i l - formamidacin-

c i d o ac t i co -ag u a -e t an o l (5 : 1 0 : 3 0 : 2 0 , v / v )

( E N D R E S

y

H R M A N N ,

1963).

El precipi tado de pol meros , l levado a un grado de pur, se mezcl con

las pol iamidas en la proporcin de 10:1 , se lav con agua des t i lada y por

lt imo se extrajo con metanol. Se repit i la operacin con el agua para

asegurar la recuperacin de los pol i fenoles

( S I O U D

y

L U C H ,

1966). El

extracto metanl ico se concentr y reuni con la fraccin acuosa solu

ble en etanol . A es te conjunto se le denominaba extracto acuoso.

3.

Mtodos cromato grficos

a ) Cromatografa de papel

Se ut i l iz la cromatografa preparat iva en papel para separacin de

polifenoles, segn la tcnica de

W I L L I A M S

et al. (1952). Los extractos

disuel tos en etanol o metanol se apl icaron a pl iegos de papel What-

m an t nm. 1 y 3 M M . L os c rom atog ram as se desar ro l l a ron en fo rma

descenden te , en cmaras Shandbn (Pang las Chromato tank SAA, 2195)


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ANALES DEL INSTIT UTO BOTNICO A. J . CAVANILLES. TOMO X X X I I , VOL. I

con los disolventes AW, BAW y PhW. Las bandas sealadas a la luz uv

se cortaron y eluyeron en etanol 70 por 100.

Para el control de las separaciones, as como para identificaciones-,

comparacin con productos de referencia, valores de Rf en distintos

disolventes, separacin de los productos de las degradaciones e iden

tificaciones de los mismos^ se realiz la cro matog rafa tridimensional

ascendente en papel Whatmant nm. 1 en diferentes disolventes, los

cuales se dan, junto con sus caractersticas, en la tabla 1.

T A B L A

1

Disolventes utilizados en el desarrollo de los cromato gramas

A br e v i a tu r a s D i so lve n t e s

AW 4c . ac t ico-a gua

BA W n- bu t a no l - a c t i c o - a gua

SBA se c - bu t a no l - a c t i c o - a gua

B P W n - b u t a n o l - p i r i d i n a - a g u a

B B z P W n - b u t a n o l - b e n c e n o - p i r i d i n a - a g u a

PhW f e no l - a gua

M isoBCFW me t i l i sobu t i l c e tona - f r mic o- a gua

WE tM CA C a gua - e t a no l - me t i l e t i l c e tona - a c e t i l a c e tona

CfMtMC c loroformo-metanol -met i le t i l - ce tona

Proporcin

2:98

15:85

4:1:5

70:2:28

14:3:3

5:1:3:3:3

70:30

14:3:2

65:15:15:5

60.26:14

Capa *

m

m

c. s.

c. s.

m

m

m

c. s.

m

m

m, mezc la ; c . s . , capa super ior .

b) Crom atografa en capa delgada

Se emplearon mezclas de celulosa/poliamidas (2:1) en capas de 0,5-

0,8 mm. de espesor. La mezcla de 12 g. de celulosa Mn 300 G (Machery,

Nagel & Co., Duren) y 6 g. de poliamidas (Woelm), se suspendi

en 30 mi. de metanol y 60 mi. de agua.

Tambin se han utilizado poliamidas acetiladas Mn-Poliamid-DC-GAC


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C O M P U ES TO S F EX O U C O S EN P Y R U S P Y R A S TER BU R G S D . 249-

(Machery, Nagel & Co., Duren); 15 g. de poliamidas acetiladas se

suspendieron en 60 mi. de agua. Estas mezclas se agitaron en agitador

mecnico (Gallenkamp SD 110) durante diez minutos; se extendieron-

sobre placas de vidrio con el extensor regulable Shandon.

Los desarrollos cromatogrficos se efectuaron en cmaras Shandon

multiplaca Rf. 2845 para desarrollos de 20 x 20 cm. y Shandon de

desarrollo mltiple Rf. 3005 para placas de 40 x 20.

Los disolventes WEtMCAC y CfMtMC (tabla 1) fueron los ms

utilizados. El control de las operaciones as como la comprobacin de

la pureza de las sustancias se realiz por cromatografa bidimensional

con poamidas/celulosa (90:30), con espesor de capa de 0,3 mm.

c)

Reacciones de color

Para la pulverizacin de los cromatogramas se emplearon los siguien

tes reactivos:

difenil-(2-aminoetoxi)-borano al 1 por 100 en metanol (NETJ, 1957)

acetato bsico de plomo, disolucin saturada

(GAGE et al.,

1951)

azul de bromofenol al 0,005 por 100 en etanol

(BUCH et al,

1952)

cido p-toluensulfnico al 3 por 100 en etanol. Calentar el cromato-

grama a 100 cinco minutos (Roux, 1957)

p-nitroanilina d iazo tada : 5 mi. de p-nitroanilina al 0,5 po r 100'

en HC1 2 N aadiendo 0,5 mi. de nitrato sdico al 0,5 por 100 y 15 mi. de

acetato sdico al 20 por 100 inmediatamente antes de su uso; una vez

seco el crom atogra ma pulverizar con carbona to sdico al 20 po r 100'

(SWAIN, 1953)

reactivo de Roux (1952): 2 g. de sacarosa p. a., 10 mi. de HC1 con

centrado y 90 mi. de etanol absoluto; calentar el cromatograma un

minuto a 95

peryodato potsico-cido barbitrico: reactivo I, solucin de pota

sa al 2 por 100 en agua; reactivo II, disolver a saturacin peryodato

potsico en cido actico al 25 por 100 en agua; reactivo III, disolucin-

de 0,1 g. de cido barbitrico en 1 mi. de piridina, 2 mi. de agua y

10 mi. de metanol. A los treinta minutos de pulverizar el cromatogra

ma con el reactivo I, se pulveriza con el II y a los quince minutos con-

el reactivo I II . Calentar el cromatog rama a 100 cinco minutos ( M I

CH AUD, 1965).


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2 5 0 ANALES DEL INSTITU TO BOTNICO A. J . CAVANILLES. TOMO X X X II , VOL. I

4. Identificaciones

Para las ident i f icaciones se real izaron las degradaciones qumicas

adecuadas y se ut i l izaron mtodos cromatogrficos y espect rofotom-

t r icos.

a) Degradaciones qumicas

Hidrl is is acida. La hidrl is is acida se real iz generalmente para los

O-gl icosl idos , en el HC1 2 N-e tanol 70 po r 100 (1:1 ) a ref lu jo du ran te


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C O M P U ES TO S F EN O LIC O S EN P Y R U S P Y R A S TER BU R G S D .

251

b)

Mtod os espectrofotomtricos

Lo s espec t ros se rea l iza ron en un espec t rofo tm etro Ze iss P M Q I I

con cubetas de cuarzo. Para la observacin de los desplazamientos de

los mximos de absorc in se u t i l iza ron los reac t ivos s iguientes :

t r ic loruro de a luminio : 0 ,5 por 100 en e tanol absolu to Merck

( H O

ROWITZ, 1957)

eti la to sdico: 2,5 g. de sodio metal en 100 mi. de e tanol absoluto

M e r c k

( M A N S F I E L D

et al.,

1 9 5 3 ;

J U R D

y

H O R O W I T Z ,

1957)

ace ta to sdico: d iso luc in sa turada en e tanol absolu to Merck

(JURD

y

H O R O W I T Z , 1 95 7)

brico-aceta to sdico: cido br ico 0,15 M se sa tura con aceta to

sdico

( JU RD ,

1956).

Tambin se h ic ie ron espec t ros con t r ic loruro de a luminio en meta

nol y t r ic loruro de a luminio-cido c lorhdr ico

( M A B R Y

et al., 1970).

La espec t roscopia i r se rea l iz en un espec t rofo tmetro Pe rk in-

Elmer , mod. 257, con pas t i l la s de bromuro pots ico (0 ,5 mg. de com

pues to 250 de de bromuro pots ico) .

5.

Estimacion es cuantitativas

Los ext rac tos pa ra la s va lorac iones cuant i ta t ivas se rea l iza ron a pa r

t i r de e tanol 85 por 100. Se e l iminaron ceras y pigmentos con ter de

petrleo. A la f raccin acuosa se le precipi taron los polmeros de az

ca res con e tanol absolu to . Al prec ip i tado se le recupera ron los pol i fe -

noles re ten idos por t r a tamiento con pol iamidas , s iguiendo e l mismo

mtodo que hemos ya indicado en la prepara t iva .

Pa ra la va lorac in de an toc ianinas y leucoantoc ianinas . se prepar

un extracto diferente . Los picarpos exentos de pulpa

r

e ex t ra je ron

con metanol 80 por 100, aforando directamente , s in ninguna otra ope

rac in de f racc ionamiento ( S C H M I D , 1966).

La valoracin de polifenoles tota les se real iz por e l mtodo de

HORAK

(1956) por color imetr a con e l react ivo cido sulfanl ico diazo

tado , modif icado por FU E RT E S- L A SA L A (1973). A 5 mi. del problema

disuelto en etanol 96 por 100 se le aadi 5 mi. de amonaco al 10

-por 100, seguido de 2,5 mi. de cido sulfanl ico recin preparado. Las


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2 5 2 ANALES DEL INSTITUTO BOTNICO A. T. CAVANILLES. TOMO XX XI I, VOL. I

lec turas se hic ieron a los veinte minutos despus de aadir e l react ivo-

de c ido su l fan l ico , en un color metro Bauch & Lomb a 510 nm. La

recta de cal ibrado se construy con soluciones e tanlicas de querci tr i -

na : de 5 a 20 mcg/ml .

Reactivo: 1 g. de cido sulfanl ico, a l que se le aadi 1 mi. de

cido c lorhdr ico a l 37 por 100, se afor a 1 l i t ro de agua dest i lada

A 100 mi. de esta disolucin se aadi inmediatamente antes de uso 1 g.

de ni tr i to sdico.

Los g l ics idos de f lavonol se va lora ron por e l mismo mtodo ante

r ior , pero en medio cido

( H O R A K ,

1957) . Los extractos se desarrol la

ron en pape l con A W ; las man chas de g l ics idos de f lavonol obse rva

das a la luz uv se recor taron y e luyeron en 5 mi. de amonaco a l 0,5-

po r 100. A los t re int a m inuto s se adic ion 1 mi. de cido sulfanl ico

diazo tado y a los c inco min utos se aa diero n 2 mi. de HC1 1 N ; las

lecturas se hic ieron a 410 nm frente a un blanco preparado de la misma

manera . La rec ta de ca l ibrado se t r az c romatogra f iando cant idades

crecientes de una solucin e tanlica de querci tr ina de 5 mg/10 mi. y

despus de desa r ro l la r e l c romatograma en AW, se procedi como en

los ex t rac tos .

En la valoracin de los cidos fenlicos se han ensayado los s iguien

tes mtodos : co lor imetr a con c ido su l fan l ico d iazotado; e spec t ro-

fotometra uv. en medio rjcuoso ( P A E C H y R U C K E N D O R F , 1.055) y espec-

trofotometr a en medio a lcal ino. Con ninguno de e l los hemos obtenido-

resultados sa t isfactor ios, por lo que se hizo una est imacin cromato-

grf ica segn e l tamao e intensidad de las manchas en los cromato-

g r a m a s (FUERTES-LASALA, 1973).

Las an toc ianinas se va lora ron por e l m todo de S C H M I D (1966). Se

toman 3 4 mi. de extracto de metanol 80 por 100 y se lee la extincin-

a 530 nm. en e l co lor metro Bausch & Lomb, an tes y despus de aadi r

un 1 por 100 de HC1 conc. Los clculos se hacen ut i l izando e l coef ic iente

de extincin molar del c ianidn 3-galactsido, 3,43 x 10* (SIEGELMAN y

H E N D R I C K S , 1958) . La valoracin de las leucoantocianinas se real iz

por e l m todo de SCHMID (1966): 25 mi. del extracto de metanol 80 '

por 100 se mezclaron con 0,3 g. de poliamidas, t ra tadas previamente

como se ha descr i to en la preparat iva . La mezcla se concentr a seque

dad en evaporador rota tor io en vaco para e l iminar e l metanol , despus-

se lav con agua y se filtr. El f iltrado se volvi a mezclar con otros-

0,3 g. de poliamidas y de nuevo se f i l t r.


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COMPUESTOS FENLICOS EN PYR US P YRASTER B URGSD. 253

Las pol iamidas

con las

leucoan toc ian inas adsorb idas

se

mezclaron

c o n 20 mi. debu tano l -c ido c lo rh d r i co (5 :1 ,v/v) quecontenan 0,6 mg.

de Fe *

1

com o sulfato . La mezcla se calent a bao mar ia duran te ve in te

mi n u t o s .

La

so luc in ro ja t ransparen te ,

una vez

fra,

se

afor

a 25 mi.

La ex t inc in

se

ley

a 550 nm.

frente

a un

b lanco p reparado exac ta

men t e i g u a l . Los clculos se hicieron uti l izando el coeficiente de ext in

c in molar del c lo ruro de cianidina, 2,45 x 10* (SIEGELMAN y HEN-

IJRICKS,

1957).

III. RESULTADOS

1. Examen cromato grfico e los extractos

Se hizo un con t ro l c rom atogrf i co b id imens ional en papel , a los

extractos acetato

de

etilo

y

acu o s o .

La

f igura

la

represen ta

el

cor res

| )ond ien te al ace t a t o de et i lo . El ex t rac to acuoso p resen t las mismas

m a n c h a s

de

flavono ides, uno s pocos cidos fenlicos

y

t r azas

de

pol

m e r o s de azcares que no se haban el iminado en las operac iones de

fraccionamiento

y

purificacin antes indicadas.

Por c romatograf a b id imens iona l

en

placa delgada

de

po l i amidas /

celulosa

(fig. IB),

aparec ie ron

en el

ex t r ac t o

de

ace ta to

de

etilo

7

sustancias

con

caracter s t icas

de

f lavonoide.

Por

pulverizacin

de los

c ro ma t o g ramas

con

acetato bs ico

de

p lomo

y

difenil-(2-aminoetoxi)-

borano, pudim os apreciar

dos

t ipos

de

ag l i conas .

Las

sustancias

1, 3,

4,

5 de

color naran ja f luorescente

y las

sustancias

2, 6 y 7 de

color

amar i l lo -verdoso f luorescen te

a la luz uv.

2. Aislamiento e los polifenoles

Po r d es a r ro l l o

en AW 2 por 100 se

separaron

la

may o r p a r t e

de los

cidos fenlicos (fraccin H) de los flavonoides (fraccin F). De la

fraccin

H se

ais laron

los

principales componentes

C y P

median te nue

vo desarrol lo en BAW.

La fraccin

F,

c ro ma t o g ra f i ad a

en AW 15 por 100, dio

l u g a r

a

t res

t a n d a s muy p r x i mas . Cad a una de ellos se purific de las o t r a s por

nuevos desar ro l los

en AW 15 por 100.

D e la b an d a F, se aislan las sustancias 3 y 6 con relativ a facilidad.

D e

la

fraccin

F

2

,

t ras nu me rosos ensayos ,

se

ob tuv ieron

las

sustan-


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2 5 4 ANALES DEL INSTITUT O BOTNICO A. J . CAVANILLES. TOMO X X X II , VOL. I

c ias 1 y 2 por c romatograf a p repara t iva en pape l , con BAW, pero

en pequea cant idad, ya que, dada la proximidad de las bandas , fue

necesario despreciar zonas de in terferencia y repet i r los desarrol los

numerosas veces .

Fig. 1. Crom atogramas de extracto de acetato de etilo ; A) en papel W hatmant nme

ro 1 (28,5 x 23), revelado con cido p-toluensulfnico. Disolventes: 1, BAW ; 2, AW

15 por 100. F, flavonoides ; L, leucoantocianinas ; C, clorognicos ; P, cidos p-cuma-

roilqunicos. B) En capa delgada de poliamidas/celulosa (20 x 20), revelados con difenil-

(2-aminoetoxi)-borano. Disolventes: 1, WEtMCAC ; 2, CfMtMC. Sustanc

:

as numeradas:

flavonoides ; sustancias sin num era r: cidos fenlicos.

La banda F

a

, cromatografiada en BAW, dio lugar a dos fracciones

de las cuales se obtuvieron por cromatografa preparat iva en papel ,

con PhW las sus tancias 4 y 5 , 7A y 7B.

Los di ferentes procesos real izados en el f raccionamiento y separa

cin de las sustancias en los extractos se indican en el esquema I.


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Compuestos Fenolicos Con IR

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