COMUNICACIÓN INFORMÁTICA SISTEMAS TESIS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y

PARASITOLOGÍA

“Efecto de Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii sobre larvas de

Heliothis virescens en condiciones de laboratorio.”

TESIS

PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE

BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO

Br. LIZETH NOHELY TORO CARRANZA

TRUJILLO – PERU

2014

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.

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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE

BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO

Dr. Orlando Velásquez Benítez

RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Dra. Vilma Julia Méndez Gil

VICE-RECTORA ACADÉMICA

Dra. Flor Marlene Luna Victoria Mori

VICE-RECTOR ADMINISTRATIVO

Dr. Santiago Antonio Uceda Duclos

SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

TRUJILLO



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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE

BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO

Dr. José Mostacero León

DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dr. William Zelada Estraver

SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dra. Bertha Soriano Bernilla

DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

Dr. Juan José Guevara Gonzáles

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y

PARASITOLOGÍA



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DEL ASESOR

El que suscribe : Ms. C. Juan Hector Wilson Krugg, asesor de la presente tesis

titulada: “Efecto de Beuaveria bassiana y Lecanicillium lecanii sobre larvas de Heliothis

virescens en condiciones de laboratorio”.

CERTIFICA:

Que ésta ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la

Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en

conformidad con su correspondiente proyecto y que el informe ha sido redactado

acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.

Por lo tanto, autorizo a Lizeth Nohely Toro Carranza, continuar con el trámite

del reglamento correspondiente.

Trujillo, Julio del 2014

Ms.C. Juan Héctor Wilson Krugg

Profesor Asociado del Departamento Académico

de Microbiología y Parasitología

Código 4527



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PRESENTACIÓN

Cumpliendo con las disposiciones establecidas por el Reglamento de Grados y

Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, presento a su consideración y

elevado criterio la presente Tesis titulada: “Efecto de Beauveria bassiana y

Lecanicillium lecanii sobre larvas de Heliothis virescens en condiciones de

laboratorio”. Con el cual pretendo obtener el título profesional de Biólogo-

Microbiólogo.

Trujillo, Julio del 2014

Br. Lizeth Nohely Toro Carranza



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MIEMBROS DEL JURADO

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Dra. Manuela Lujan Velásquez

PRESIDENTE

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Ms. C. Juan Héctor Wilson Krugg

SECRETARIO

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Ms. C. Eduardo Muñoz Ganoza

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APROBACIÓN

Los profesores que suscriben, Miembros del Jurado Dictaminador, declaran que

la presente tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo

aprobada por UNANIMIDAD.

--------------------------------------------

Dra. Manuela Lujan Velásquez

PRESIDENTE

--------------------------------------------

Ms. C. Juan Héctor Wilson Krugg

SECRETARIO

------------------------------------------------

Ms. C. Eduardo Muñoz Ganoza

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DEDICATORIA

A Dios por darme la voluntad y fuerza para no dejarme

vencer por las adversidades, permitiéndome cumplir un

objetivo más en mi vida.

A mis padres José Toro y Lourdes Carranza, por ser los

mejores padres, quienes me han ayudado a crecer como

persona y como profesional; con mucho amor les dedico

todo mi esfuerzo, trabajo y todos mis logros, pues ellos han

sido mi apoyo en todo momento velando por mi bienestar,

integridad y educación. Ambos me enseñaron que todo es

posible con trabajo y esfuerzo.



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AGRADECIMIENTOS

Mi más profundo agradecimiento a mi asesor Ms. C. Juan Héctor Wilson Krugg por

brindarme su asesoramiento, apoyo y sus consejos en base a su amplia experiencia para

la realización de este proyecto.

A David Malque, Katherine Chacón, Karen Avalos, Yuseff Rojas, Melissa Santa Cruz y

Nadiezdha Burgos, por la información y apoyo brindado en la realización de este

trabajo.



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INDICE

Pág.

Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo ........................................................ ii

Asesor ...............................................................................................................................iv

Presentación ....................................................................................................................... v

Miembros del Jurado ........................................................................................................vi

Aprobación ..................................................................................................................... vii

Dedicatoria..................................................................................................................... viii

Agradecimientos ...............................................................................................................ix

Resumen .........................................................................................................................xiv

INTRODUCCION ............................................................................................................. 1

MATERIAL Y METODO................................................................................................. 6

1. Material de estudio .............................................................................................. 6

2. Procedimiento ...................................................................................................... 6

2.1 Recolección, crianza de adultos y obtención de larvas de

Heliothis virescens ........................................................................................... 6

2.2 Obtención de cultivo joven de Beauveria bassiana y Lecanicillium

Lecanii………………………………………………………………………….…….7

2.3 Propagación y Estandarización del Inóculo .................................................... 7



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2.4 Inoculación ..................................................................................................... 8

2.5 Evaluación de la actividad entomopatógena de Beauveria bassiana

y Lecanicillium lecanii ................................................................................... 9

2.6 Recuperación e identificación de Beauveria bassiana y

Lecanicillium lecanii ....................................................................................... 9

2.7 Análisis de Datos ............................................................................................ 9

RESULTADOS .............................................................................................................. .11

En la tabla 1 observamos los síntomas y signos presentados por las larvas

de H. virescens inoculadas con B. bassiana y L. lecanii ........................................... 12

Figura 1.Larva de Heliothis virescens con síntomas y/o signos luego de ser

inoculadas con B. bassiana: A. Sin inocular (control) B. Presentando

melanización (se observa el oscurecimiento en comparación al control)

C. Cubierta con micelio (signo) ................................................................................. 13

Figura 2. Larva de Heliothis virescens con síntomas y/o signos luego de

ser inoculadas con L. lecanii: A.Sin inocular (control) B.Presentando

melanización (se observa el oscurecimiento en comparación al control)

C. Cubierta con micelio (signo) ................................................................................. 14

Figura 3. Porcentaje de mortandad de larvas de Heliothis virescens inoculadas

con una concentración de 106con/ml de Beauveria bassiana y Lecanicillium



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lecanii respectivamente ............................................................................................. 15

DISCUSION .................................................................................................................... 16

CONCLUSIONES ........................................................................................................... 20

RECOMENDACIÓN ...................................................................................................... 21

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ............................................................................ 22

ANEXOS

Anexo 1. Esquema de Ciclo biológico de Heliothis virescens

Anexo 2. (A) Instalación de la cámara de crianza de adultos y pupas de Heliothis

virescens (B) vista interior de la cámara de crianza (C) instalación del

sistema de crianza de larvas.

Anexo 3. (A)Cámara para cópula de Heliothis virescens, (B) vista interna de la

cámara para cópula.

Anexo 4. Observación microscópica del microcultivo de Beauveria bassiana

recuperada de larvas de Heliothis virescens.

Anexo5. Observación microscópica del microcultivo de Lecanicillium lecanii


Anexo6. Porcentaje de mortandad de larvas de Heliothis virescens producido por

una concentración de Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii en

condiciones de laboratorio.



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Anexo7. Análisis estadístico de las medias de los porcentajes de mortandad de

larvas de Heliothis virescens producidas por la aplicación de Beauveria

bassiana y Lecanicillium lecanii (a) ANOVA de un factor (Análisis de

varianza de un factor), (b) Prueba de Tukey y Duncan



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RESUMEN

Se determinó el efecto de la concentración de Beauveria bassiana y Lecanicillium

lecanii sobre larvas de Heliothis virescens en condiciones de laboratorio, además se

utilizó Tween 80 al 0.1% como control. Para esto se recolectaron 180 larvas de H.

virescens, los que fueron transportados al laboratorio de Fitopatología de la

Universidad Nacional de Trujillo para su crianza y obtención de nuevas larvas. La

evaluación se realizó colocando 2 grupos de 20 larvas, las cuales son ejemplares

problema y otro grupo de 20 larvas que son ejemplares testigo, haciendo de este

ensayo una suma de 3 repeticiones. Se inoculó por aspersión una concentración de

106 conidias/mL de B. bassiana y 106 conidias/mL de L. lecanii a cada uno de los

grupos problema, mientras que al control solo se le inoculo Tween 80 al 0.1%,

incubándose luego a temperatura ambiente. Se evaluó diariamente hasta los catorce

días después de la inoculación, anotándose los síntomas y signos observados:

lentitud en movimiento, pérdida de apetito, melanización, muerte y aparición de

micelio sobre las larvas muertas, las cuales fueron colocadas en cámara húmeda

para que el hongo culmine de realizar su colonización. Asimismo el mayor

porcentaje de mortandad de larvas se dio frente a B. bassiana 97.5% mientras que

el tratamiento con L. lecanii dio una mortandad de 87.5%, por lo que el análisis

estadístico encontró que existe diferencia significativa entre el porcentaje de

mortandad de la plaga frente a los dos hongos. Al analizar el efecto de los dos

tratamientos en cada aplicación se concluye que el mayor porcentaje de mortandad

de las larvas se obtuvo con B. bassiana mientras que frente al L. lecanii se encontró

menor mortandad.



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ABSTRACT

It was determined the effect of the concentration of Beauveria bassiana and

Lecanicillium lecanii on larvae of Heliothis virescens in laboratory conditions, also

use Tween 80 to 0.1 % as control. For this were collected 180 larvae of H. virescens,

which were transported to the laboratory of Phytopathology of the National University

of Trujillo for his breeding and obtain new larvae. The evaluation was carried out by

placing 2 groups of 20 larvae, which are exemplary problem and another group of 20

larvae that are exemplary witness, making this test a sum of 3 repetitions. The inoculum

by spraying a concentration of 106 conidia/mL of B. bassiana and 106 conidia/mL of L.

lecanii to each of the groups problem, while the control only was inoculated Tween 80

to 0.1 %, then simmer to ambient temperature. Was assessed daily up to fourteen days

after the inoculation, chalking up the symptoms and signs observed: slowness in

movement, loss of appetite, melanization, death and the appearance of mycelium on the

dead larvae, which were placed in humid camera for the fungus culminate to make its

colonization. Also the highest percentage of mortality of larvae was in front of B.

bassiana 97.5 % while the treatment with L. lecanii it gave a mortality of 87.5%, so

that the statistical analysis found that there is a significant difference bewtween the

mortality rate of the plague in front of the two fungus. In the analysis of the effect of the

two treatments in each application it was concluded that the highest percentage

mortality of the larvae were obtained with B. bassiana while in front of the L. lecanii is

found lower mortality.



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INTRODUCCION

La agricultura ha sufrido frecuentemente la devastación de las cosechas por los

ataques de las plagas. La lucha contra estas plagas constituye una de las principales

preocupaciones de la mayoría de los agricultores, no solo por las afectaciones y

pérdidas ocasionadas por estos organismos, sino por los costos de las medidas de

control y las limitaciones que se producen para la comercialización de los productos

agrícolas.1

Una plaga se define como un organismo que reduce la disponibilidad, calidad o

valor de recursos valiosos para los humanos, estos recursos pueden ser plantas que

son dañadas por plagas la mayoría insectos; los cuales tienen una gran

adaptabilidad, es decir que se acomodan a muchas condiciones y situaciones

ecológicas del mundo.2

En algunas zonas agrícolas de Lima, Ancash y La Libertad se registra como una

plaga principal a Heliothis virescens, causando severos daños en el espárrago; que

es un cultivo de gran exportación en el Perú, el cual se produce mucho más en la

costa norte cerca de Trujillo, por las condiciones climáticas especiales y atención a

la naturaleza cíclica de la planta permiten su cultivo todo el año.3, 4 Las primeras

infestaciones por esta especie se observaron a fines de 1993 e inicios de 1994,

alcanzando niveles alarmantes en algunos fundos, mientras que en otros recién se

les registro en 1995 con el carácter de plaga clave.5, 6



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Heliothis virescens, es un lepidóptero que ataca a diversos cultivos entre ellos el

espárrago (Asparagus officinalis Linnaeus).7,8 La hembra de H. virescens, deposita

los huevos en forma aislada, pero próximos de preferencia en flores y tejido tierno

en una cantidad de 400 huevos por noche, son de color blanco cuando recién

puestos y su forma es de una cúpula ligeramente surcada.8,9 Las larvas tienen de 5

a 6 estadios con muy pocos caracteres peculiares varía mucho en coloración que

puede ser verde clara, amarillenta, verde oscura, colorada y en gris muy oscuro; su

cuerpo está cubierto de tubérculos donde se insertan pelos finos observándose

siempre en el cuerpo de la oruga un brillo especial que le da la apariencia del

terciopelo, pudiendo alcanzar un tamaño de 3.5 cm; comienzan alimentándose del

tejido foliar luego perforan tallos y comen frutos pero también roe la corteza de la

planta como otros noctuidos del follaje.6,10 El ciclo de desarrollo (huevo, larva,

pupa, emergencia de adultos), toma un mes en el verano y las altas temperaturas y

presencia de flores favorecen el incremento del insecto.11

Si bien los insecticidas químicos han permitido un control eficaz de H. virescens

por un tiempo, el problema se ha agravado debido a las aplicaciones

indiscriminadas para su control.12 Las larvas son difíciles de controlar una vez que

alcanzan el tercer estadio causan severos daños al esparrago lo que determino el

empleo de insecticidas organofosforados, piretroides, inhibidores de síntesis de

quitina en mezclas que determinaron un rápido desarrollo de resistencia.13,14 La

evidencia más común de resistencia involucra a la permitrina, haciendo difícil su

control por medios químicos, incrementando los costos de producción causando

residuos no adminisibles tanto en la planta como en el suelo, un desequilibrio en la

entomofauna benéfica y un impacto negativo sobre el ambiente.15,16,17



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Tomando en cuenta lo antes mencionado es esencial el establecimiento del manejo

integrado de esta plaga mediante control biológico porque así se conserva el

ambiente y permite obtener productos limpios, es decir libres de residuos de

plaguicidas y permitiendo obtener altos niveles de producción;18,19 además son

inofensivos para las personas y al contrario de muchos productos fitosanitarios

puede ser muy selectivo lo que redunda tanto en una mayor eficacia al tratarse

únicamente el problema real como en una mayor seguridad en su manejo, menor

interferencia en otros elementos del medio agrícola evitando resurgimiento de

plagas secundarias y no existe problemas con intoxicaciones ni presenta resistencia

de las plagas.20,21

Una alternativa para el control biológico de esta plaga es la utilización de hongos

entomopatógenos, que son un grupo de microorganismos ampliamente conocidos en

todo el mundo, existiendo más de 750 especies reunidas en 100 géneros; siendo hoy

en día la Clase Deuteromycetes la más promocionada en el control de plagas.22,23 El

uso de estos microorganismos ha ido aumentando en la agricultura en los últimos

años debido al gran potencial que tienen en el manejo de insectos, puesto que tiene

la particularidad de parasitar a todos los órdenes de insectos en sus diferentes

estadios durante su ciclo biológico, siendo una alternativa eficiente al uso de

insecticidas químicos, considerados altamente nocivos para la salud del hombre y

los ecosistemas, representando una alternativa ecológica sostenible.24, 25,26

Los hongos entomopatógeno inician el proceso de infección cuando las esporas

viables entran en contacto con la superficie del integumento del hospedero. 27 Una

vez establecido el contacto, factores ambientales como la humedad relativa y una

temperatura adecuada van a favorecer a la germinación de la espora y a la posterior



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formación del tubo germinativo y el apresorio, dentro del cual se disemina; la

reproducción del patógeno ocurre entre las 48 y 60 horas aproximadamente.28,29 Al

morir el hospedero las hifas penetran la cutícula desde el interior y emergen a la

superficie iniciando así la diseminación del hongo, este tiempo de colonización

puede variar de tres a once días.30,31

Dentro de los hongos considerados como entomopatógenos se tiene a B. bassiana,

del cual se han obtenido mas de treinta y ocho cepas entomopatogenas pudiendo

atacar a los insectos plagas pertenecientes a los órdenes Homoptera, Orthoptera,

Coleoptera y Lepidoptera.32, 33 Por otro lado Lecanicillium lecani, que es un

entomopatógeno que aparece frecuentemente sobre afidos pero también fue

reportado atacando insecto del orden Coleoptero, Diptera y Hymenoptera. Siendo

considerados tanto a B. bassiana y L. lecanii, como hongos entomopatógenos de

gran potencial que tienen un amplio espectro de acción. 27,34

Beauveria bassiana, se caracteriza por presentar esporas de 5 a 7.5µm de largo por

2.3 a 3.5µm de ancho, cilíndricas a ovales, produce colonias que pueden tener uno o

muchos matices de verde y presenta conidias globosas a subglobosas de 2 a 3µm

con estigmas en forma de zigzag de color blanco cremoso.35 Presenta un crecimiento

lento, circular, llegando alcanzar 20 mm de diámetro en 10 días, aspecto lanoso,

apareciendo en forma de polvo debido a las abundantes conidias, colonia de color

blanca en un principio tornándose amarillenta posteriormente en la parte del centro,

textura blanda y superficie plana.36, 37 Los factores favorables para este hongo son

humedad relativa mayor a 70% y una temperatura que oscile entre 22 a 26° C, lo

que va permitir que una vez que el insecto sea cadáver el hongo lo cubra con un

polvo blanco. 38



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Lecanicillium lecanii de la Clase Deuteromycetes se caracteriza por presentar

fiálides que son alargadas y se estrechan desde la base, presentándose en verticilos

de 2 – 6, apareados o solitarios sobre hifas o apicalmente sobre ramas cortas. Las

conidias son hialinas generalmente elípticos de 2.5 a 7 um son envueltas por una

masa gelatinosa de forma esférica y normalmente emiten dos tubos germinativos.39,

40 Las condiciones favorables para este hongo son humedad relativa encima de 85%

y temperatura entre 20 a 25°C. Los cadáveres de insectos atacados por este hongo,

presentan un aspecto algodonoso de color blanco crema o amarillo. L. lecanii

produce la toxina bassinolide que ha sido aislada del micelio del hongo y que

también es producido por Beauveria bassiana. 41

Si bien es cierto Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii tienen efecto sobre los

lepidópteros y considerando que la aplicación de estos hongos entomopatógenos no

contaminan el medio ambiente ni generan resistencia en el insecto a diferencia de

los insecticidas, además teniendo en cuenta la resistencia de Heliothis virescens a

diferentes químicos, que es una plaga distribuida a nivel mundial y que no solo

afecta al espárrago sino también al garbanzo, algodón, arveja, papa, vid y otros

cultivos, ocasionando grandes pérdidas en la agricultura; dicho trabajo tiene como

objetivo conocer el efecto de B. bassiana y L. lecanii sobre los estadios larvarios de

H. virescens en condiciones de laboratorio.



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MATERIAL Y METODO

1. Material de estudio

Cultivo puro de Beauveria bassiana, proporcionado por el

laboratorio de Fitopatología del Departamento de Microbiología y

Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad

Nacional de Trujillo.

Cultivo puro de Lecanicillium lecanii, proporcionado por el

laboratorio de Fitopatología del Departamento de Microbiología y

Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad

Nacional de Trujillo.

180 larvas de Heliothis virescens recolectados de cultivos de

garbanzo del pueblo de Collambay, localizado en el Distrito de

Simbal

2. Procedimiento

2.1 Recolección, crianza de adultos y obtención de larvas de Heliothis

virescens.

De los cultivos de garbanzo ubicado en el pueblo de Collambay ubicado

en el Distrito de Simbal, Provincia Trujillo, Región La Libertad, se

recolectó 180 ejemplares de Heliothis virescens, estadío larvario, los que

fueron llevados al laboratorio de Fitopatología para su crianza.

Para la crianza de larvas de H. virescens se utilizó recipientes de plástico

de 100mL, adaptados para permitir el intercambio gaseoso y evitar la



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fuga de los especímenes. En el fondo de cada uno se colocó hojas de

garbanzo hasta una altura de 2cm, depositándose luego las larvas. Los

recipientes se taparon y se mantuvieron a temperatura ambiente. Después

de 20 días se obtuvieron pupas que fueron colocadas cada una en

recipientes de plástico de 100mL sin tapa dentro de cámaras de crianza

con las siguientes dimensiones 25cm x 30cm x 50cm, cubiertas con tul

fino, siendo la base y la parte posterior de triplay forradas en su interior

con papel toalla; en esta cámara emergieron los adultos, los que fueron

seleccionados en hembras y machos. (Anexo 2)

Para la obtención de huevos, se pasaron una hembra con dos machos en

una cámara de cúpula y en cada una de ellas se colocaron dos pequeños

recipientes, uno con agua y el otro con una solución de azúcar, los cuales

fueron depositados en la base de la cámara. Cuando la hembra realizó las

posturas, se extrajeron los huevos con un pincel y se colocaron cada

huevo sobre hojas frescas de garbanzo dentro de un recipiente de

plástico, las que sirvieron de alimento cuando eclosionaron. (Anexo 3)

2.2 Obtención de cultivo joven de Beauveria bassiana y Lecanicillium

lecanii

Se sembró por puntura B. bassiana y L. lecanii en frascos pequeños

conteniendo Agar Sabouraud, incubándose a 25 ± 0.1 ºC durante 7 días.

2.3 Propagación y Estandarización del Inóculo

Se preparó una suspensión de Beauveria bassiana en solución estéril de

Tween 80 al 0.1%, la cual se utilizó para propagar el hongo en ASb



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inclinado (contenido en frascos planos), se utilizó 0.1mL de la

suspensión del hongo, se incubó a 25 ± 0.1 ºC hasta la formación de

esporas. Posteriormente se le agregó una solución acuosa de Tween 80 al

0.1% para obtener las esporas. La suspensión de esporas fue colocada en

un matraz estéril. Luego se estandarizó en cámara de Neubauer a la

concentración de 106conidias/mL, las que sirvieron de inóculo. Los

mismos pasos se siguieron para preparar y estandarizar el inóculo de

Lecanicillium lecanii.

2.4 Inoculación

La muestra estuvo constituida por 180 larvas de H. virescens, de las

cuales 2 grupos de 20 larvas cada uno fueron ejemplares problema y otro

grupo de 20 larvas fueron ejemplares testigo, realizando un total de 3

repeticiones. A los ejemplares problema se les inoculó por aspersión una

suspensión acuosa de Tween 80 al 0,1% con la concentración utilizada de

106esporas/mL de B. bassiana. Se siguieron los mismos pasos para el

caso de Lecanicillium lecanii. Mientras que a los ejemplares testigo se les

inoculó por aspersión una solución acuosa de Tween 80 al 0,1%, tratando

en lo posible, de suministrar la misma cantidad de inóculo al testigo y al

problema.

Para este procedimiento se realizó la puesta de larvas de H. virescens en

hojas de garbanzo, una por recipiente el cual estaba adaptado para

permitir el intercambio gaseoso y evitar la fuga de los especímenes.



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2.5 Evaluación de la actividad entomopatógena de Beauveria bassiana y

Lecanicillium lecanii

Después de la inoculación se evaluó cada 24 horas la aparición de

síntomas y/o signos de la infección micótica que presentaron las larvas

problema en comparación a los testigos. La observación de cada una de

las larvas y el posible progreso de la infección micótica se realizó

diariamente anotando la aparición de síntomas como lentitud en

movimiento, pérdida de apetito, melanización, u otros, que se produjeron

durante el ensayo, siendo el tiempo máximo de observación 14 días

(tanto problema como testigo).

2.6 Recuperación e identificación de Beauveria bassiana y Lecanicillium

lecanii.

Esto se realizó con la finalidad de confirmar que la causa de la muerte de

las larvas de H. virescens por la acción de los hongos inoculados;

consistió en colocar los especímenes muertos en cámara húmeda e

incubados a temperatura ambiente, una vez emergido el micelio se

extrajo con ayuda de una asa microbiológica para realizar el

microcultivo comparado e identificado según las claves taxonómicas de

Barnett. (Anexo 4 y 5)

2.7 Análisis de Datos

Los datos obtenidos se procesaron utilizando el paquete estadístico SPSS

v.20, aplicando un análisis de varianza simple para comparar las medias



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de mortalidad producida por el hongo evaluado; aplicándose, el análisis

postanava mediante la prueba de Tukey.42 (Anexo 7)



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RESULTADOS

En la tabla 1 observamos los síntomas y signos presentados por las larvas de H.

virescens inoculadas con B. bassiana y L. lecanii.

En la figura 1 y 2 se muestran la melanización así como el crecimiento miceliar

en las larvas de H. virescens inoculadas con B. bassiana y L. lecanii

respectivamente.

En la fgura 3 se observa que B. bassiana fue el hongo que ocasionó el mayor

porcentaje de mortandad en las larvas de H. virescens.



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Tabla1. Síntomas y signos presentados por larvas de Heliothis virescens inoculadas con

Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii.

Síntomas y/o signos

observados

Conidios /mL

Control Beauveria bassiana Lecanicillium

lecanii

0* 106 106

Pérdida de apetito - + +

Escasa movilidad - + +

Melanización - + +

Muerte - + +

Aparición de micelio - + +

Momificación - + +

(*) Representa al control

(+) Presencia

(-) Sin presencia



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Figura 1.Larva de Heliothis virescens con síntomas y/o signos luego de ser inoculadas

con B. bassiana: A. Sin inocular (control) B. Presentando melanización (se

observa el oscurecimiento en comparación al control) C. Cubierta con micelio

(signo).

A

C

B



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Figura 2. Larva de Heliothis virescens con síntomas y/o signos luego de ser inoculadas

con L. lecanii: A. Sin inocular (control) B. Presentando melanización (se

observa el oscurecimiento en comparación al control) C. Cubierta con micelio

(signo).

A B

C



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Figura 3. Porcentaje de mortandad de larvas de Heliothis virescens inoculadas con una

concentración de 106con/mL de Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii

respectivamente.

a: p<0.05, existe diferencia significativa

a CONTROL B. bassiana 106 L. lecanii 106

Conidias/mL

a

a

a



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DISCUSION

La mayoría de los insectos plaga son muy susceptibles frente al ataque de hongos

entomopatógeno y a menudo ocasionan una alta reducción de su población. Durante el

proceso de infección de las larvas de Heliothis virescens por Beauveria bassiana y

Lecanicillium lecanii, estas fueron presentando diversos cambios fisiológicos

producidos como respuesta frente al ataque y al mecanismo de acción de los hongos

entomopatógeno (Tabla 1).

Para que estos cambios ocurran debe producirse inicialmente la adherencia de la espora

de B. bassiana y L. lecanii a la cutícula del insecto o también esta puede ingresar a

través de la cavidad bucal, espiráculos y otras aberturas externas del insecto.43

Sabiendo de las posibles vías de acceso de las esporas de los hongos entomopatógenos,

la aplicación de B. bassiana y L. Lecanii se realizó por medio de aspersión para que el

ingreso de la espora a las larvas de H. virescens sea por las diferentes vías. Así la

espora ingresa y realiza el proceso de germinación mediante el cual se forma uno o

varios tubos germinativos, los cuales por crecimiento y alargamiento dan origen a las

hifas.44

La germinación de las esporas en gran parte depende de la humedad ambiental,

temperatura y en menor grado de las condiciones de luz y nutricionales ya que el nivel

del agua es determinante en el crecimiento de los hongos y pequeñas diferencias en los

niveles de humedad relativa después de la aplicación de conidias, pueden determinar

de un modo u otro el éxito del hongo en el control de insectos plaga.33, 45

También se menciona que puedes diferenciarse tres fases en este mecanismo: Adsorción

o inmovilización, contacto y adhesión propiamente dicha. En la adhesión puede

intervenir sustancias simples o complejas que participan en la fijación del propágulo;



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algunas de estas moléculas son conocidas como lecitinas, que son proteínas o

glucoproteinas de origen inmunológico pero que pueden provocar in vitro fenómenos

semejantes a reacciones inmunológicas37; de modo que Beauveria bassiana pudo

haberse favorecido por alguno de estos factores para producir un mayor porcentaje de

mortandad de larvas de Heliothis virescens en comparación a Lecanicillium lecanii

(Figura 3).

La penetración de la cutícula de la larva por conidias germinadas, ocurre como resultado

de una combinación entra la degradación enzimática de la cutícula y la presión

mecánica por el tubo germinal. El modo de penetración principalmente depende de las

propiedades de la cutícula, grosor, esclerotización y la presencia de sustancias

antifúngicas y nutricionales de las larvas de H. virescens. En la penetración participan

dos mecanismos: El físico debido a la presión mecánica de la hifa rompe las áreas

membranosas esclerosadas y el químico que es resultante de la acción enzimática

principalmente de proteasas, lipasas y quitinasas 23, 46; ya que la cutícula está formada en

un 70% aproximadamente de proteínas, lo que explica que la proteasas son las enzimas

clave en la penetración de la cutícula.

Después de la penetración de las hifas, estas se diseminas vía hemolinfa, producen

blastosporas y cuerpos filamentosos de hifas que invaden el sistema inmune del

hospedero multiplicándose rápidamente en los tejidos. En el hemocele se producen

toxinas y enzimas como proteasas, lipasas y quitinasas, que matan al insecto al

consumir todos los nutrientes.47 B.bassiana y L. lecanii evitan la defensa inmune del

insecto por desarrollo de protoplastos que no son reconocidos por la población de

hemocitos de insecto, formando cuerpos hifales, multiplicándose , dispersándose

rápidamente y produciendo micotoxinas.43



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Las micotoxinas que producen estos hongos, son metabolitos fúngicos secundarios que

son parte de los mecanismos de infección y pueden dar lugar a una respuesta toxica en

diferentes organismos48; así pues los síntomas como pérdida de apetito, escaza

movilidad y melanización (Tabla 1), que son debido a la presencia de las toxinas

secretadas por el patógeno cuando entra en contacto con la hemolinfa del huésped.

Referente a la melanización observada en las larvas (Figura 1B y 2B), es un mecanismo

de defensa del huésped, en la cual están presentes compuestos fenólicos que

regularmente están libres en la hemolinfa y que son germicidas no específicos; es así

que H. vriescens frente al ataque de B. bassiana y L.lecanii realiza el proceso de

fagocitosis, el cual se da cuando las concentración de los microorganismos son bajas

pero a mayor concentración también se forman nódulos debido a que las melaninas se

depositan sobre la superficie del patógeno invasor para luego encapsularlo y evitar la

propagación, produciéndose entonces la coloración del insecto.49,50 Este proceso es

observado en las larvas inoculados con conidias de Beauveria bassiana y Lecanicillium

lecanii (Figura 1A y 2B), a diferencia de las larvas inoculadas con Tween 80 al 0.1% no

presentaron ningún cambio fisiológico debido a que este inóculo no causa ningún

proceso infectivo en el insecto por ese motivo es considerado como el control.

Es importante recalcar que existen otros tipos de toxinas que produce B. bassiana, tales

como la beuvericina que poseen una acción insecticida, los beauverólidos que tienen

una fuerte acción inmunomoduladora, las dextruinas que inducen la parálisis flácida y la

contracción muscular visceral del insecto (Tabla 1) y la presencia de oospereina,

bassianina, acido oxálico, bassianolido, enniatinas y ácido dipinolico 51,52; en cambio L.

lecanii produce una serie de toxinas como ácido dipicolinico, acido oxálico,

bassianolido, que muestra una fuerte acción insecticida tanto por ingestión como por



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inyección51; sin embargo Beauveria bassiana produce mayor diversidad de toxinas que

Lecanicillium lecanii lo que pudo ser un factor para que el efecto de B.bassiana

ocasione mayor mortalidad en larvas de H. virescens que L. lecanii (Figura 3).

Luego de sobrepasados los mecanismos de defensa del insecto este muere y el hongo

entomopatógeno entra en la fase de colonización. Si la disponibilidad de agua es alta los

hongos emergen al exterior a través de la cutícula y esporulan sobre el cadáver y se da

la momificación de la larva33, como se observó después de 2-3 días de haber sido

colocadas las larvas en cámara húmeda e incubadas a temperatura ambiente (Figura 1C

y 2C). En el insecto, el hongo puede sobrevivir por algunos meses y eventualmente

producirá espora cuando tenga condiciones favorables.

En relación al porcentaje de mortandad ocasionado por B. bassiana (97.5%) y L. lecanii

(87.5%) sobre las larvas de H. virescens (Figura 3), se observa que existe diferencia

significativa lo que significa que L. lecanii ocasiona menor porcentaje de mortandad en

las larvas del insecto en comparación a la mortandad producida por B. bassiana; la cual

pudo ser ocasionada por diversos factores como temperatura(que puede ocasionar la

perdida de patogenicidad y estabilidad del patógeno), humedad relativa (puede

intervenir en las fases del ciclo de infección del hongo), proceso de adherencia de la

espora, lo relacionado con el hongo (concentración y tiempo de vida media), espectro de

acción o las diferentes toxinas producidas por estos hongos que según Jegorov51 y

Borges52 et al. ,B. bassiana tiene mayor variedad de toxinas y mayor espectro de acción,

lo que le favorece en el modo de acción sobre las larvas de H. virescens y va permitir

que su aplicación en campo tenga un resultando eficiente, obteniendo un buen control

sobre la plaga sin ocasionar gran inversión de dinero, disminuyendo perdidas en la

agricultura y sin dañar el ambiente.



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CONCLUSIONES

Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii presentan efecto entomopatógeno sobre

larvas de Heliothis virescens en condiciones de laboratorio

Beauveria bassiana produce mayor porcentaje de mortandad sobre las larvas de

Heliothis virescens que Lecanicillium lecanii en condiciones de laboratorio.



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RECOMENDACIÓN

En relación a la crianza de las larvas de Heliothis virescens es recomendable se críen

una por recipiente ya que la larva de mayor desarrollo tiende a comerse a la más

pequeña por causa de su hambre voraz, no quedando satisfecha solo con las hojas del

garbanzo, por cual también se recomienda adicionarle un alimento como la coronta la

maíz, el cual satisface su necesidad de alimentarse.



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ANEXOS



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Anexo 1. Esquema de Ciclo biológico de Heliothis virescens (A) huevo

(B) larva (C) pupa (D) adulto.

A. Ovo: 3- 4 días

C. Pupa: 8 - 10 días

D. Longevidad: 10 - 12 días B. Larva: 20-23 días (6 estadios)



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Anexo 2. (A) Instalación de la cámara de crianza de adultos y pupas de Heliothis

virescens (B) vista interior de la cámara de crianza (C) instalación del

sistema de crianza de larvas.

A

C

B

C



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Anexo 3. (A)Cámara para cópula de Heliothis virescens, (B) vista interna de la

cámara para cópula

A

B



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Anexo 4. Observación microscópica del microcultivo de Beauveria bassiana




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Anexo 5. Observación microscópica del microcultivo de Lecanicillium lecanii




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Anexo 6.Porcentaje de mortandad de larvas de Heliothis virescens producido por una

concentración de Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii en condiciones

de laboratorio.

TRATAMIENTO

NUMERO DE LARVAS MUERTAS

PROMEDIO

PORCENTAJE

DE

MORTANDAD R1 % R2 % R3 %

Control 1 5 0 0 1 5 0.7 2.5

B.bassiana 10+6 20 100 19 95 20 100 19.7 97.5

L.lecanii 10+6 18 90 17 85 18 90 17.7 87.5



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Anexo 7. Análisis estadístico de las medias de los porcentajes de mortandad de larvas

de Heliothis virescens producidas por la aplicación de Beauveria bassiana y

Lecanicillium lecanii (a) ANOVA de un factor (Analisis de varianza de un

factor), (b) Prueba de Tukey y Duncan

a. ANOVA de un factor

PORCENTAJE DE MORTANDAD DE LARVAS DE Heliothis virescens

b. Prueba de Tukey y Duncan

PORCENTAJE DE MORTANDAD DE LARVAS DE Heliothis virescens

Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3.000.

Suma de

cuadrados Gl Media

cuadrática F Sig. Inter-grupos 16350.000 2 8175.000 981.000 .000 Intra-grupos 50.000 6 8.333 Total 16400.000 8

Concentracion N

Subconjunto para alfa = .05

2 3 1 HSD de Tukey(a) Control 3 3.3333

Lecanicillium 3 88.3333 Beauveria 3 98.3333 Sig. 1.000 1.000 1.000

Duncan(a) Control 3 3.3333 Lecanicillium 3 88.3333 Beauveria 3 98.3333 Sig. 1.000 1.000 1.000



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