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i
CONSEJO NACIONAL DE Secretaría Nacional CIENCIA Y TECNOLOGÍA de Ciencia y Tecnología
CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA –CONCYT-
SECRETARÍA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA –SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA –FONACYT-
CENTRO DE ESTUDIOS DEL MAR Y ACUICULTURA –CEMA-
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA –USAC-
INFORME FINAL
EVALUACIÓN DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE LAS POBLACIONES DE
Atractosteus tropicus PRESENTES EN LA COSTA DEL PACÍFICO DE
GUATEMALA
PROYECTO FODECYT No. 02-2009
M.Sc. Leonel Carrillo Ovalle
Investigador Principal
GUATEMALA, DICIEMBRE DE 2016.
Centro de Estudios del Mar y Acuicultura
ii
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro
del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología –FONACYT-, otorgado por la Secretaría
Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y el Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología –CONCYT-.
iii
Mis agradecimientos al Centro de Estudios del Mar y Acuicultura de la
Universidad de San Carlos de Guatemala, sin cuyo apoyo este proyecto no habría
alcanzado los resultados plasmados en los objetivos, en especial al Laboratorio de
Sanidad Acuícola.
Quiero externar mis más sinceros agradecimientos a la Licda. Carolina Marroquín
Mora investigadora asociada a este proyecto, especialista en los análisis de PCR, sin
quien este proyecto no hubiera sido posible.
iv
RESUMEN
En Guatemala existe una alta diversidad íctica, compuesta principalmente por
cíclidos y poecílidos, a la que se suman peces de importancia económica y ecológica
como el Atractosteus tropicus, comúnmente llamado pejelagarto o machorra. Debido a la
importancia y atractivo de la machorra, la especie ha estado bajo un excesivo régimen de
explotación (CECON, 1999). Esto aunado al deterioro de los ecosistemas donde habita,
ha disminuido significativamente las poblaciones naturales.
En respuesta, se han propuesto proyectos de investigación y manejo de la especie,
incluyendo la reproducción en sistemas controlados y la acuicultura. Sin embargo, son
pocos los estudios que se han realizado sobre su biología, y casi inexistentes los estudios
sobre su genética, limitándose principalmente a los desarrollados por la Universidad de
Juárez en Tabasco, México. Este proyecto evaluó la diversidad genética de las cuatro
poblaciones de Atractosteus tropicus identificadas en la costa del Pacífico de Guatemala
mediante la utilización de microsatélites polimórficos.
Esta evaluación determinó que los distintos grupos de animales que aún existen en
Guatemala, no pueden ser considerados como poblaciones diferentes, ya que su
variabilidad genética es limitada y los genomas de sus miembros son muy cercanos.
Adicionalmente, se determinó que el genoma de Atractosteus tropicus es muy cercano al
genoma de otros peces del mismo género.
v
ABSTRACT
There is a great diversity of fishes in Guatemala. Most of those fishes are
either cichlids or pocilids; however, there are other species like Atractosteus tropicus,
commonly named machorra o pejelagarto, that are economically and ecologically
important. Because of the economic and ecological importance of machorra, this species
has been under excessive exploitation (CECON, 1999). These pressures, added to the
deterioration of its natural habitat have greatly diminished the natural populations.
In response to this problem, different research projects have been proposed in
order to manage the species. Those projects include aspects such as reproduction under
controlled systems and aquaculture. However, there are only a few studies about the
biology of the species, and only a couple of studies of its genetics. Most of the genetic
studies of this species have been conducted by the Universidad Juárez de Tabasco,
México. Our project evaluated the genetic diversity of the four Atractosteus tropicus
natural populations identified in the pacific coast of Guatemala. Polymorphic
microsatalites were used to determine genetic diversity.
Results from this project determined that the different Atractosteus tropicus
groups that still inhabit the Gatemalan pacific coast cannot be considered different
genetic populations. Genetic variability is limited amongst populations and genomes of
fish from different groups are closely related. Additionally, it was determined that the
genome of Atractosteus tropicus is closely related to the genome of other species within
the same genus.
vi
INDICE
PORTADA i
AGRADECIMIENTOS ii
AGRADECIMIENTOS ESPECIALES iii
RESUMEN iv
ABSTRACT v
INDICE vi
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN 1
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3
I.3 OBJETIVOS 4
I.3.1 Objetivo General 4
I.3.2 Objetivos Específicos 4
I.4 HIPÓTESIS 5
I.5 METODOLOGÍA 6
I.5.1 VARIABLES E INDICADORES 6
I.5.2 POBLACIONES Y MÉTODOS 6
1.5.3 Etapa 1 7
1.5.3.1 Identificación de zonas de habitación de A. tropicus en la
Costa del Pacífico guatemalteco y colecta de material
genético 7
1.5.3.2 Identificación taxonómica de la especie 8
vii
1.5.3.3 Desarrollo de marcadores moleculares microsatelitales
del genoma de la machorra A. tropicus 8
1.5.3.4 Extracción de ADN genómico para comparación de
poblaciones 8
1.5.3.5 Secuenciación, análisis de secuencias y diseño de
iniciadores 10
1.5.4 Etapa 2 10
PARTE II 12
MARCO TEÓRICO 12
II.1 Atractosteus tropicus 12
II.2 Historia evolutiva, biología y genética de los Lepisosteidos 12
II.3 Importancia biológica y económica de la especie 13
II.4 Importancia de los estudios de genética en peces 14
II.5 Marcadores genéticos 16
II.6 Marcadores bioquímicos o variantes proteicos 17
II.7 Marcadores moleculares 18
II.7.1 Secuencias de ADN mitocondrial (ADNmt) 19
II.7.2 Secuencias de ARN ribosomal (ARNr) 19
II.7.3 Secuencias de ADN nuclear (ADNn) 20
II.7.4 ADN satélite o satelital 21
II.8 Ventajas y desventajas de los marcadores moleculares 22
II.9 Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos 25
viii
PARTE III 30
III.1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 30
III.1.1 Etapa 1 30
III.1.1.1 Identificación de zonas de habitación de A. tropicus en la
Costa del Pacífico guatemalteco y colecta de material genético 30
III.1.1.2 Identificación taxonómica de la especie 36
III.1.1.3 Desarrollo de marcadores moleculares microsatelitales,
secuenciación y análisis de secuencias 38
III.1.2 Etapa 2 40
III.2 Otras actividades realizadas durante el desarrollo
del proyecto 41
PARTE IV 42
IV.1 CONCLUSIONES 42
IV.2 RECOMENDACIONES 44
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45
IV.4 ANEXO 49
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO 55
ix
INDICE DE FOTOGRAFÍAS, GRÁFICAS Y CUADROS
Cuadro No. 1. Variables e indicadores del proyecto 6
Cuadro No. 2. Comparación entre las ventajas y desventajas
de los diferentes marcadores protéicos y moleculares.
Tomado de: Arias-Rodríguez (2007a). 23 y 24
Fotografía No. 1. Pila de un hogar de la comunidad La Blanca en
el Departamento de San Marcos, donde se observa que tienen a un
Atractosteus tropicus como mascota. 31
Fotografías 2, 3 y 4. Serie de fotografías de uno de los puestos
de comercialización de productos de la pesca donde se observó
la presencia de Atractosteus tropicus adultos, saludables y bien
alimentados. 33
Figura No. 1. Imagen satelital de Laguneta la Palmilla en el
Departamento de Santa Rosa, Guatemala. Esta laguna constituye
una especie de santuario para Atractosteus tropicus, ya que
permite que la especie se refugie durante parte de su ciclo de vida
y al encontrarse dentro de una propiedad privada no es explotada
por la pesca artesanal. 35 Fotografía No. 5. Proceso de muestreo de un ejemplar vivo de
A. tropicus obtenido del Canal de Chiquimulilla en la Aldea
de Monterrico, Santa Rosa, Guatemala. La muestra consiste
en 1 cm2 de tejido de la aleta caudal fijado en alcohol
metílico 95% grado biología molecular. 36
Figura No. 2. Características de identificación taxonómica
de Lepisosteidos de la región centroamericana. Tomado de
Wiley (en FAO, 2003). 36
Fotografías 6, 7 y 8. Proceso de identificación de A. tropicus
durante los muestreos de campo. 37
Fotografía No. 9. Trabajo en el laboratorio durante la fase de
extracción de ADN genómico de las muestras colectadas. 40
Fotografías 10 y 11. Imágenes del trabajo de laboratorio desarrollado
durante el proyecto de investigación. 41
1
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
En la pesquería costera y ribereña guatemalteca existen varias especies de peces
que son apreciadas por el precio de compra, el sabor de la carne y la versatilidad para
cocinarlas. Entre las especies nativas, el Atractosteus tropicus conocida localmente como
pejelagarto o machorra es una de las especies más sobresalientes (CECON, 1999).
Debido a su importancia y al deterioro de los ecosistemas que ésta habita, la especie está
bajo un excesivo régimen de explotación por lo que se le considera una especie
amenazada, por lo menos en algunas regiones del país (CECON, 1999).
En respuesta a la situación de la especie, se han propuesto varios trabajos de
conservación del hábitat y la especie misma, así como investigaciones sobre su
reproducción en cautiverio y cultivo (Carrillo y otros, 2011). Sin embargo, existen
pocos estudios sobre su biología, y son prácticamente inexistentes los estudios
relacionados con su genética, limitándose a estudios sobre su cariotipo (Arias-Rodríguez,
2007; Arias-Rodríguez y otros, 2009). Es por ello urgente, la aplicación de estudios
innovadores que consideren la comprensión de algunos aspectos de genética poblacional
y mendeliana como herramienta básica para el buen manejo, conservación y explotación
del recurso.
La aplicación de técnicas moleculares para determinar la diversidad genética de
organismos permite tener datos concluyentes sobre su grado de diversidad genética, y
evaluar de esta forma la situación y perspectivas de futuro. La información que se
genera, debido a su calidad y especificidad permite sentar las bases genéticas para la
conservación y reglamentación de cultivo y aprovechamiento de la especie.
Este trabajo, desarrollado en dos fases, consistió en aislar marcadores moleculares
satelitales de Atractosteus tropicus a partir de la información generada por la
secuenciación de su ADN genómico, siendo esta la primera vez, de acuerdo a la
información disponible para los autores, que ambas técnicas de biología molecular se
aplicaron en Guatemala para el estudio de genética de peces. Las secuencias encontradas
fueron comparadas con las secuencias genéticas de Atractosteus sp. reportadas en el
banco de genes (GenBank® NCBI) y se emplearon para comparar la variabilidad genética
entre las poblaciones de machorra identificadas en la costa del Pacífico de Guatemala.
Este proyecto, además de la información generada sobre la genética de
Atractosteus tropicus permitió la capacitación de profesionales del Laboratorio de
Sanidad Acuícola del CEMA-USAC en distintas técnicas y metodologías de biología
molecular que pueden ser aplicadas a otras especies nativas y cultivadas de organismos
acuáticos. Así mismo, propició la implementación de una técnica de evaluación
2
genética que puede ser utilizada en otras especies acuícolas y de importancia ecológica
para el país y para el CEMA-USAC.
Durante la investigación se determinó que las poblaciones silvestres de
Atractosteus tropicus en Guatemala son muy pequeñas y se encuentran principalmente
concentradas en lagunas o áreas inundables de los ríos caudalosos de la parte baja de la
Costa del Pacífico que son poco accesibles o tienen zonas protegidas o restringidas a la
pesca. Las zonas identificadas como zonas de habitación de estos organismos son poco
accesibles y la densidad poblacional es baja en la mayoría de ellas; por lo que no fue
posible colectar suficientes muestras para hacer una comparación genética entre las
poblaciones.
En total se identificaron cuatro poblaciones de machorra aisladas geográficamente
y con pocas posibilidades de intercambio de material genético. Las poblaciones
identificadas son: población de San Marcos ubicada en Laguna Las Palmas y La Blanca;
población de Retalhuleu ubicada en El Chico y La Barrita, Población de Escuintla
localizada en El Semillero y Sipacate; y población de Santa Rosa ubicada en Candelaria y
Monterrico, ambas en el Canal de Chiquimulilla.
Estas poblaciones presentan ligeras variaciones en su morfología, sin embargo el
análisis del material genético no evidenció diferencias significativas entre las
poblaciones, por lo que se infiere que no pueden considerarse poblaciones genéticamente
distintas, confirmándose de esta forma la hipótesis planteada para la investigación. Las
variaciones encontradas se deben, muy probablemente, a las condiciones ambientales y
disponibilidad de alimento propio de la zona que habitan.
3
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Atractosteus tropicus es una especie íctica nativa de Guatemala, el sur de México y
Centroamérica. Es una especie importante no solo en la pesca de subsistencia (CECON,
1999) sino también como una posible alternativa de especie de cultivo (Carrillo y otros,
2011). Desde hace varios años existen reportes de su sobreexplotación y del interés de
las comunidades donde normalmente habita, y de entidades ambientalistas y de gobierno,
en el cultivo o repoblación de cuerpos de agua naturales. Aunque ya se hacen trabajos de
investigación sobre la reproducción y producción acuícola de la especie, y existen
experiencias, principalmente en México, sobre su cultivo y comercialización, no se tiene
conocimiento básico sobre su genética. Este desconocimiento implica el riesgo de que si
se inicia una industria de cultivo, el impacto ecológico de la misma incluya también el
riesgo de contaminación genética de las poblaciones naturales. Si por otra parte se
iniciaran esfuerzos de repoblación, no se tiene información de línea base sobre las
poblaciones naturales que permitan evaluar el impacto de la introducción de animales
producidos de otras poblaciones o bien de reproductores en cautiverio.
El desconocimiento sobre la genética básica de peces nativos de Guatemala no se
limita a Atractosteus tropicus. Antes de este estudio, no existía en Guatemala ningún
reporte científico que evaluara la variación genética de las poblaciones de especies
nativas de peces. Esta deficiencia se debe en parte a que el país no se cuenta con
laboratorios que tengan metodologías establecidas y validadas que permitan el desarrollo
de este tipo de estudio. Este proyecto fue el primero, de acuerdo a la información
disponible a los autores, en aplicar técnicas de biología molecular para estudiar
poblaciones de peces de Guatemala.
El desarrollo de este proyecto permitió implementar una técnica que puede ser
utilizada, con algunas modificaciones menores, en cualquier otra especie de pez.
También generó espacios de capacitación al personal del Laboratorio de Sanidad
Acuícola de CEMA en técnicas de biología molecular básicas, las cuales son
herramientas esenciales en estudios de biología y genética de organismos.
4
I.3 OBJETIVOS
I.3.1 Objetivo General
Determinar y evaluar mediante la utilización de la técnica de marcadores microsatelitales
polimórficos del genoma de la machorra (Atractosteus tropicus) y la variación genética
de las diferentes poblaciones que se presentan en la Costa del Pacífico Guatemala.
I.3.2 Objetivos Específicos
Desarrollar una técnica de enriquecimiento para aislar marcadores moleculares
microsatelitales del genoma de A. tropicus (machorra), para su uso en programas de
conservación, repoblamiento y manejo de la especie.
Identificar el grado de polimorfismo de los microsatélites desarrollados y compararlos
con las secuencias genéticas registradas en el banco de genes, y las que se desarrollen
en México.
Determinar si la especie de A. tropicus que habita en el país es la misma que habita en
el Sur de México y otros países centroamericanos, a través de la comparación de la
diversidad genética encontrada en la Costa del Pacífico de Guatemala, con la
información generada en proyectos similares en México y Centro América.
Implementar la técnica de desarrollo de marcadores moleculares microsatelitales en el
Laboratorio de Sanidad Acuícola y formar recursos humanos en el uso y aplicación
de técnicas de biología molecular en estudios genéticos de organismos acuáticos.
5
I.4 HIPÓTESIS
La especie de Atractosteus tropicus que habita en los diferentes ecosistemas
acuáticos de la Costa Sur de Guatemala es la misma especie que habita el Sur de México
y los demás países de Centro América, y no existe variación genética significativa entre
las distintas poblaciones de esa región.
6
I. 5 METODOLOGÍA
El proyecto se llevó a cabo en dos etapas y se completó en aproximadamente 24
meses, de febrero de 2010 a diciembre de 2011. En la Etapa 1 se muestreó el área de
distribución de la especie y se colectó material genético de los organismos encontrados.
Este material genético sirvió para el desarrollo de los marcadores moleculares que se
utilizaron en la fase dos del proyecto. La Etapa 2 del proyecto consistió en la utilización
de los microsatélites desarrollados en la etapa uno, para la determinación de la
variabilidad genética de las diferentes poblaciones de machorra en la Costa del Pacífico
de Guatemala.
I.5.1 VARIABLES E INDICADORES
VARIABLE TIPO DE
VARIABLE
INDICADOR
Grado de polimorfismo de los
microsatélites desarrollados
Cuantitativa
Porcentaje de variación
entre marcadores
Frecuencia de microsatélites
en el genoma de cada
individuo
Especie de pez, determinada de
acuerdo a las características
merísticas y morfométricas de
clasificación taxonómica clásica
basada en claves dicotómicas
Cualitativa
Identificación de los peces
colectados durante los
muestreos de campo
utilizando claves
dicotómica de identificación
Número de personas calificadas en la
utilización de la técnica de
marcadores moleculares
microsatelitales en el Laboratorio de
Sanidad Acuícola del CEMA-USAC
Cuantitativa
Registros de trabajo en el
laboratorio, procedimientos
operativos estandarizados
para llevar a cabo los
procedimientos en las
condiciones propias del
laboratorio.
Cuadro No. 1. Variables e indicadores del proyecto.
I.5.2 POBLACIONES Y MÉTODOS
Las poblaciones objetivo de estudio de la presente investigación son los peces
comúnmente llamados machorra o pejelagarto que se encuentran en las zonas inundiables
de ríos caudalosos de la Costa del Pacífico de Guatemala.
7
Tal como se indicara anteriormente esta investigación utilizó varios métodos de
investigación, incluyendo el método deductivo analítico para determinar a partir de la
información colectada y los datos generados en el laboratorio la diversidad genética de
las poblaciones de peces estudiadas. También se utilizaron métodos analíticos de
biología molecular y métodos estadísticos básicos para la determinación del porcentaje de
ocurrencia de los diferentes marcadores moleculares en las poblaciones estudiadas y el
grado de similitud entre las secuencias de microsatélites identificadas.
1.5.3 Etapa 1
En esta etapa se llevaron a cabo varias actividades, siendo estas: identificación de
posibles zonas de habitación de la especies, muestreo de las zonas de habitación
identificadas, colecta de material genético, identificación taxonómica de la especie
usando claves dicotómicas de identificación, y desarrollo de marcadores moleculares
microsatelitales del genoma de A. tropicus.
1.5.3.1 Identificación de zonas de habitación de A. tropicus en la costa del Pacífico
guatemalteco y colecta de material genético
De acuerdo a la información bibliográfica disponible para la especie (CECON,
1999), información colectada durante investigaciones anteriores (Carrillo, 2011), y
registros anecdóticos de pescadores artesanales, se determinó que las zonas inundables de
las desembocaduras de los ríos más caudalosos de la Costa Sur, eran posiblemente las
zonas más pobladas de A. tropicus en Guatemala.
El muestreo se limitó a las zonas que cumplían con los siguientes dos requisitos:
registro, real o anecdótico de pesca de la especie; y posición geográfica aislada, lo que
suponía la posibilidad de albergar poblaciones distintas y sin posibilidad de reproducción
entre sí. La baja densidad de organismos silvestres condicionó a que la mayoría de las
muestras fueran colectadas de peces capturados por pescadores. En los casos que se pudo
colectar organismos vivos, se tomó una porción de la aleta dorsal y los animales fueron
devueltos a su hábitat natural.
Se empleó muestras de tejido de la aleta caudal (1cm2) fijado en alcohol metílico
grado biología molecular (95%). Cada tejido individual fue conservado y etiquetado en
tubos de reacción individuales. Estas muestras fueron conservadas a -20 ºC hasta que se
emplearon para la extracción de ADN.
8
1.5.3.2 Identificación taxonómica de la especie
La determinación taxonómica de los especímenes utilizados en esta investigación
se basó en los caracteres taxonómicos señalados por Miller y otros (2005).
Adicionalmente a la identificación taxonómica de los organismos colectados, se hicieron
observaciones generales respecto a su fenotipo y estado incluyendo: coloración general y
de líneas, tamaño, apariencia sobre el estado de madurez sexual, y condición general de
los animales.
1.5.3.3 Desarrollo de marcadores moleculares microsatelitales del genoma de la
machorra A. tropicus
La metodología utilizada en esta investigación es una modificación de la
metodología desarrollada por el Dr. Lenin Arias, Ph.D., de la Universidad de Juárez
Autónoma de Tabasco, quien nos asesoró durante el proyecto. Para muchos de los
procesos, incluyendo la extracción de ADN se validaron kits comerciales de biología
molecular (Merck®). La secuenciación genómica de A. tropicus fue contratada con el
laboratorio UCLA Genotyping and Sequencing Core, de la Universidad de California en
Los Angeles, California, Estados Unidos de América. La metodología de secuenciación
fue pirosecuenciación de segunda generación por “shotgun sequencing” utilizando un
equipo Titanium Shotgun-050411. La secuenciación del ADN genómico se obtuvo a
partir de ADN extraído con un kit comercial Qiagen® para tejidos. El ADN genómico
extraído se preservó en buffer TE y almacenó en hielo seco para su transporte, hasta su
secuenciación.
1.5.3.4 Extracción de ADN genómico para comparación de poblaciones
La extracción de ADN de las muestras se realizó de acuerdo al protocolo
implementado por Arias-Rodriguez (2007a) en el pez loach Japonés. La técnica consiste
en una extracción fenol-cloroformo, ligeramente modificada a la técnica clásica que fue
previamente validada para tejido de A. tropicus en el laboratorio, para asegurar la calidad
del ADN extraído (Ramírez, 2009).
En este método modificado se sigue el siguiente protocolo de extracción
(modificado de Arias-Rodríguez, 2007a):
- Macerado de las muestras individuales de tejido en tubos de reacción independientes,
debidamente identificados
- Adición de 400 µl de buffer de lisis + 10 µl de proteinasa (20 mg/ml) a cada muestra
9
- Incubación en una estufa de hibridación a 37 ºC y rotación de 11 rpm durante la
noche. Debido a que el Laboratorio de Sanidad Acuícola del CEMA-USAC no
cuenta con estufa de hibridación se utilizó un vortex en una velocidad de mezcla baja,
con una bandeja para tubos de reacción, dentro de una incubadora a 37°C para hacer
la extracción (Anexo 1).
- Adición de 50 µl de NaCl (5M) mezclando con vortex (mezclado suave),
manteniendo las muestras conservadas a 4ºC hasta la recuperación del ADN
- Recuperación de ADN: adición de 400 µl de fenol neutralizado (fenol 1:1 Buffer TE)
a temperatura ambiente 25 ºC por 20 min en estufa de hibridación con rotación de 11
rpm
- Adición de 400 µl de la mezcla de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1)
- Centrifugación a temperatura ambiente (25 ºC) por 20 min a 15000 rpm
- Recuperación de 400 µl de la capa superior (de tres que se formarán) compuesta por
ADN:Buffer de lisis
- Transferencia de 200 µl a un nuevo tubo nuevo de reacción estéril de 1.5 ml
- Repetir el procedimiento para recuperar el ADN 3 o más veces o hasta que la mezcla
de ADN:Buffer se observe totalmente transparente
- Adición a cada muestra 40 µl de acetato de sodio (3M-pH 5.2)
- Precipitación del ADN: adición a cada tubo 800 µl de etanol absoluto frío (4 ºC),
mezclar suavemente dejando las muestras por 20 min en la estufa de hibridación con
rotación de 11 rpm
- Al término del paso anterior centrifugar las muestras 4 ºC por 30 min a 15000 rpm y
consecutivamente drenar el etanol de cada tubo (evitar que el ADN precipitado en el
fondo del tubo se desprenda)
- Lavar cada muestra con 200 µl de etanol frío al 70 % evitando desprender el ADN
precipitado
- Remover los restos de etanol por centrifugación (mini-centrifuga) por 1 min cada
muestra y dejar los tubos abiertos por 15 min dentro de la campana de flujo laminar
para evitar la entrada de partículas basura en las muestras
- Adicionar a cada muestra 100 µl de buffer TE (1M tris-HCl 2ml+ 0.5M EDTA 0.4
ml+ H2O DD197.6 ml)
- Colocar en la estufa de hibridación a temperatura ambiente con rotación de 11 rpm
durante la noche para mezclar adecuadamente el ADN con el buffer TE
- Para cada muestra determinar la concentración final de ADN empleando un
espectrofotómetro para cuantificar el ADN
- Ajustar la concentración de ADN de cada muestra a 100 ng/µl empleando como
diluyente el buffer TE
- En caso de no usar las muestras inmediatamente, conservarlas a 4 ºC hasta su empleo
10
1.5.3.5 Secuenciación, análisis de secuencias y diseño de iniciadores
Posterior a la secuenciación, las secuencias de ADN se analizaron para encontrar
secuencias de cadenas complementarias, las secuencias resultantes se alinearon con
ayuda del software Nomachine NX Client y el programa BioEdit v7.0.9, por
recomendación del laboratorio de secuenciación. Las secuencias alineadas se verificaron
visualmente y con la ayuda del programa para identificar secuencias repetitivas de
nucleótidos o microsatelites. Este análisis se hizo con ayuda de las herramientas
disponibles en GenBank® (NCBI) parte de International Nucleotide Sequence Database,
Collaboration, específicamente la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool). De las secuencias encontradas se procedió a verificar los primers publicados por
otros autores utilizando el programa PrimerExpress (Marshall, 2004). Finalmente, se
analizó las secuencias aisladas con una prueba de homología, empleando en línea el
programa BLAST del banco de genes (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), para
identificar regiones correlacionadas entre secuencias identificadas en otros organismos.
1.5.4 Etapa 2
En esta etapa se procedió a evaluar la diversidad genética de las distintas
poblaciones de machorra (A. tropicus) de la Costa del Pacífico de Guatemala, utilizando
como parámetro de comparación la frecuencia de los microsatélites identificados.
Para evaluar la diversidad genética del las distintas poblaciones se utilizaron las
muestras de tejido anteriormente colectadas. El ADN se extrajo utilizando un kit
comercial de extracción que utiliza silica como sustrato de adherencia de ADN
(GeneReach Biotechnology®. Este ADN fue limpiado y purificado usando filtros de
extracción AppliedBiosystems®. Se emplearon cinco de los marcadores microsatelitales
para evaluar el grado de variación genética de las poblaciones. Debido al bajo número de
muestras para trabajar no pudieron ser analizados utilizando las medidas comunes de
heterocigosidad.
Cada reacción de amplificación fue de 10 µL, integrando los siguientes
componentes:
- 1 µL de ADN purificado
- 0.25 U de Taq DNA polimerasa (Merck®)
- 1 µL de 10X buffer + 0.2 mmol / L de mezcla de dNTP
- 1.5 mmol / L de MgCl2
- 0.2 µmol / L de cada primer
11
La reacción de amplificación (PCR) se realizó en el termociclador Applied
Biosystems serie RealTime 7300, bajo el siguiente programa:
- Desnaturalización a 96°C por 10 minutos
- 35 ciclos de los siguientes pasos: 94°C por 1 minuto, y 72°C por 1 minuto
- 5 minutos de extensión a 72°C
El ADN resultante se cada reacción fue corrido en geles de agarosa grado biología
molecular 1.5% en un equipo de electroforesis horizontal, junto con una regla molecular
de 100 pares de bases (pb) a 100 voltios por 30 minutos. Al final de la corrida los geles
fueron teñidos con bromuro de etidio y fotodocumentados para su análisis.
Debido a que no se tenía suficientes muestras de ADN de todas las poblaciones de
machorra identificadas, solo se utilizaron las muestras de las poblaciones de El Chico en
Retalhuleu; Candelaria y Monterrico en el Canal de Chiquimulilla, Santa Rosa.
12
PARTE II
MARCO TÉORICO
II.1 Atractosteus tropicus
A esta especie se le conoce como machorra, pejelagarto, pez armado o Gaspar, en
diferentes localidades de su distribución geográfica normal. Es una especie acuática
considerada como pez fósil viviente por su poca evolución comparada con otros
teleósteos. Habita en ríos, lagunas y pantanos del Sureste de México y Centroamérica
(Castillo, 2006).
Se distribuye en tres poblaciones geográficas que no son adyacentes una de otra.
Dichas poblaciones están en la vertiente Atlántica en las cuencas del Usumacinta hasta
Coatzacoalcos en el sur de México y Guatemala, y hasta más al sur en el Lago Nicaragua
y el Río San Juan y sus tributarios en Costa Rica. Otra población geográfica registrada
para la especie se extiende en la vertiente del Pacífico desde el Sur del Estado de
Chiapas, México hasta el Río Negro en Nicaragua (Miller y otros, 2005; Bussing, 1987).
En Tabasco México, estudios realizados para establecer el estado de salud de las
poblaciones silvestres de machorra en la Reserva de la Biosfera Pantanos de Centla,
señalan que se requiere incluir a la especie dentro de los programas piscícolas para
fomentar su cultivo y evitar que ingrese en la lista de especies amenazadas o en peligro
de extinción (Márquez, 2002). De acuerdo a estudios del Centro de Estudios
Conservacionistas de la Universidad de San Carlos de Guatemala –CECON- (1999) esta
especie se encuentra en peligro en el área del Canal de Chiquimulilla de Guatemala,
debido a la sobre-explotación del recurso y el deterioro de su hábitat natural.
Existe evidencia de que especies similares y emparentadas, tales como el catán
(Atractosteus spatula) (Mendoza y otros, 2000), y el manjuarí (Atractosteus tristoechus)
(León y otros, 1978) que han estado sometidos a sobreexplotación, también se consideran
como especies amenazadas en sus regiones de localización.
II.2 Historia evolutiva, biología y genética de los Lepisosteidos
Los peces Lepisosteidos, dentro de los cuales se encuentra el pejelagarto junto a
otras 6 especies, (Reséndez y Salvadores, 1983) son peces de agua dulce y pantanosa que
han habitado la Tierra desde la Era Mesozoica (Willey, 1976). Hay registros fósiles de
peces Lepisosteidos en Europa, Asia y América. Solo en Norte y Centroamérica existen
siete especies de Lepisosteidos vivientes, distribuidas seis de ellas en Norteamérica desde
el norte de México hasta el sur de Canadá (Atractosteus spatula, A. tristoechus,
13
Lepisosteus oculatus, L. platostomus, L. osseus, L. platyrhincus) y A. tropicus en
Centroamérica, desde el sureste de México hasta el sur de Costa Rica (Willey, 1976;
Nelson, 1994; Bussing, 2005; Miller y otros, 2005).
Las machorras son peces de cuerpo cilíndrico alargado, cubiertos por escamas
romboides articuladas entre sí por sus bordes. Dicha particularidad de las escamas
proporciona a estos organismos una cubierta rígida que los protege de los depredadores
(Miller y otros, 2005). Los Lepisosteidos son carnívoros, con una vejiga natatoria muy
vascularizada (que funciona como un aparato de respiración) e intestino con válvula
espiral (Nelson, 1994). Son peces ovíparos de fecundación externa. La reproducción se
lleva a cabo en sitios con vegetación abundante que sirve de sustrato para que los huevos
se adhieran (Resendez y Salvadores, 1983; Bussing, 2005).
Las machorras muestran características particulares de morfología y fisiología que
las hacen organismos muy tolerantes a condiciones extremas de temperatura y baja
concentración de oxígeno del agua (Chavez, 2003). Las hembras de esta especie muestran
mayor talla y peso que los machos (Resendez y Salvadores, 1983; Contreras y Alemán,
1987; Márquez, 2002). La proporción de sexos puede variar entre las poblaciones
naturales y domesticadas, especialmente durante la etapa reproductiva (Chávez-Lomeli y
otros, 1989).
El control artificial de la reproducción de machorras bajo condiciones de
laboratorio, con el empleo de tratamientos hormonales (Hernández, 2002) ha favorecido
la producción en masa de larvas de la especie que han servido para la repoblación de
sitios donde esta especie ha sido sobreexplotada. Actualmente, en los programas
acuícolas de México ha surgido preocupación por altos índices de mortalidad observados
durante el desarrollo embrionario y larvario, sospechándose que dicho fenómeno se debe
al alto grado de endogamia del lote de reproductores mantenidos en cautiverio por varios
años (Arias-Rodríguez, y otros, 2009).
II.3 Importancia biológica y económica de la especie
Dentro de la biodiversidad acuática conocida, los peces son uno de los grupos más
representativos e importantes de la región, por el número de especies descritas y la
importancia económica de éstos para muchas de las comunidades costeras. La utilidad de
la ictiofauna nativa guatemalteca no ha sido realmente estimada y su aprovechamiento
para cultivo es incipiente en algunas especies y en otras totalmente inexistente, debido en
parte al desconocimiento de muchos aspectos básicos de su biología.
Siendo la pesca tradicional una de las actividades de subsistencia de la mayoría de
las comunidades costeras, ríos, lagunas y áreas temporales de inundación; el impacto que
14
dicha actividad ha tenido sobre las poblaciones de peces nativos ha causado la
disminución de los volúmenes de captura (Bussing, 2005; Miller y otros, 2005). En
Guatemala A. tropicus ha sufrido sobreexplotación principalmente por la pesca excesiva
con artes no selectivas, períodos prolongados de pesca incluyendo la temporada de
reproducción, y deterioro de los sitios naturales de desove (CECON, 1999).
Entre los recursos pesqueros, de los peces nativos dulceacuícolas de las zonas
costeras algunos se destacan por su tradición de consumo. La captura y el consumo local
de la machorra constituyen una de las bases de la pesca de tipo artesanal en los ríos y
lagunas de México y también de Guatemala (Chavez-Lomeli y otros, 1989). En el área
del Canal de Chiquimulilla, uno de los ecosistemas acuáticos más importantes de la Costa
del Pacífico de Guatemala, la machorra es la especie más atrapada por los pescadores
artesanales (CECON, 1999). Esta captura para la explotación comercial y para
autoconsumo, sumada a la disminución en la disponibilidad de ecosistemas y hábitats
naturales por deterioro antropogénico, han contribuido a que la especie se considere
amenazada (CECON, 1999).
II.4 Importancia de los estudios de genética en peces
El estudio de los peces nativos con fines acuícolas y de conservación ha sido en
los últimos años, una línea de investigación fructífera en varios países debido
principalmente a la preocupación existente por los efectos desmedidos de las pesquerías
sobre los recursos naturales (Mendoza y otros, 1995; Nelson, 1994; Miller y otros, 2005).
Existe un elevado interés en el uso racional de los recursos, la conservación del medio
ambiente, y una creciente inquietud de conocer el efecto de la introducción de especies
exóticas como las tilapias, carpas, y plecostomos, sobre las poblaciones de especies
nativas, tanto dulce acuícolas como marinas.
Adicionalmente, a nivel mundial existe una demanda creciente de alimento de alta
calidad, a bajo costo de producción y que sea simultánea al desarrollo rural y económico
de las poblaciones. Esta coyuntura ha propiciado que los peces se presenten como un
grupo importante y potencial con una diversidad de especies potenciales para cultivo.
En Guatemala existen pocos estudios sobre diversidad biológica de peces, pero se
sabe que existen muchas especies de interés recreativo, ecológico y comercial. Los
estudios clásicos de taxonomía realizados en otros países permitieron la separación
acertada de la mayoría de las especies peces de América. Sin embargo, el empleo de
estudios innovadores posteriores que permitieran separar poblaciones de peces de una
especie, aún no se realizan en ninguna de las especies de peces nativos de Guatemala,
mucho menos en A. tropicus que es el único representante de su grupo en Centroamérica.
15
El empleo de herramientas citológicas, junto con la tinción diferencial de ciertas
estructuras del ADN de los cromosomas han permitido la separación de especies y
poblaciones de especies como la sardina (Astyanax scanbripinnis), y el anguila de
pantano (Synbranchus marmoratus) y algunos cíclidos de Sudamérica (Denton, 1973).
Además, se ha visto que especies con cariotipos semejantes son susceptibles de ser
hibridizadas, mientras que en caso contrario las posibilidades de cruzamiento son
biológicamente nulas en la mayoría de los casos (Arias-Rodríguez y otros, 2007b). En A.
tropicus el cariotipo de la especie ha sido determinado (Arias-Rodríguez, 2009). Sin
embargo, mayores esfuerzos son necesarios para establecer la posición que guarda las
diferencias en la estructura cromósomica de varias poblaciones de la especie.
La tipificación del genoma se aplica para la identificación de alelos en estudios de
taxonomía, fisiología y genética de varios organismos incluyendo los peces marinos y
continentales (Avise, 2004). En peces, este análisis ha sido empleado para determinar
pesos moleculares de proteínas y marcadores moleculares, caracterización de moléculas y
alelos, identificación y caracterización de diferentes poblaciones genéticas (especies,
clones, razas, linajes, etc.) (Avise, 2004). Por ejemplo, en el loach Misgurnus
anguillicaudatus usando estas técnicas fue posible identificar poblaciones y razas
genéticas de la misma especie (Arias-Rodriguez y otros, 2007).
A partir del empleo de marcadores moleculares, se ha demostrado que existen
locus y alelos que son particulares para cada especie (Avise, 2004), o de una población de
la misma especie (Arias-Rodriguez, y otros, 2007). Los marcadores genéticos han sido
empleados para el estudio poblacional, de varias especies de peces y se ha determinado la
presencia de varios fenotipos (o polimorfismo) que dependiendo de la especie y
población, pueden mostrar loci homocigotos o heterocigotos (Avise, 2004). La presencia
de homocigosis y heterocigosis en poblaciones y especies independientes, es una
herramienta indispensable para la conservación de poblaciones y selección de lotes de
reproductores para repoblación y acuicultura (Arai, 2001).
Varias especies de peces han sido evaluadas, identificadas, separadas y cotejadas
desde el punto de vista genético usando diferentes herramientas (Avise, 2004). De los
marcadores moleculares los que presentan mayor potencial de utilización en peces para
estimar variación genética en una especie, son los microsatélites o unidades repetitivas de
ADN-SSR (Avise, 2004). Con el empleo de los marcadores microsatelitales se ha logrado
la separación de varias especies de peces y otros animales, incluso la separación de
poblaciones e híbridos en una misma especie, como el loach (Misgurnus
anguillicaudatus) con un alto grado de precisión (Arias-Rodriguez, 2007a; Arias-
Rodriguez y otros, 2007b).
La variación genética de las poblaciones naturales, también puede ser detectada
por la medición de caracteres fenotípicos como los empleados en taxonomía clásica
16
(merísticos y morfométricos) para separar especies y grupos taxonómicos (Cailliet y
otros, 1986). La combinación analítica de los caracteres taxonómicos, es una herramienta
que permite detectar endemismo y variantes taxonómicas que pueden emplearse no solo
para la conservación de áreas geográficas especificas, sino también para un desarrollo
sostenido del recurso mediante selección genética y la creación de líneas con
características deseables (Kirpichnikov, 1981).
Como se ha mencionado anteriormente, el potencial de la machorra para su cultivo
y manejo es alto, debido a las características biológicas propias del grupo taxonómico al
que pertenece, que le confieren mayor resistencia y crecimiento. Algunos de los aspectos
preliminares de su cultivo y reproducción han sido abordados en México y Costa Rica y
empiezan a abordarse en Guatemala, sin embargo, dado los lineamientos globales para
utilización y manejo de recursos naturales; es de crucial importancia estimar, la variación
genética de las poblacionales de la especie antes de proponer proyectos complejos de
manejo y explotación de la especie.
II.5 Marcadores genéticos
Una de las principales publicaciones sobre taxonomía es el libro clásico The New
Sistematics (Huxley, 1940). A partir de esta publicación se ha avanzado
significativamente. Existen muchos libros y ensayos sobre quimiotaxonomía,
serotaxonomía, cariotaxonomía y otros tópicos afines como el uso de las secuencias de
proteínas y de ácidos nucleícos en taxonomía (Denton, 1973; Ayala, 1980; Cailliet y
otros, 1986).
Aunque el empleo de características merísticas y morfométricas y el estudio de la
estructura y número de cromosomas fueron vistos como dispositivos eventualmente
convincentes para el reconocimiento de relaciones entre algunas especies y a pesar del
éxito obtenido en algunas de ellas, su aplicación se vio mermada por la carencia de
pruebas estadísticas adecuadas para el análisis de los datos generados. En las últimas
cuatro o cinco décadas, estudios de serología y grupos sanguíneos, dieron un nuevo
impulso a los estudios que involucran a una gran diversidad de organismos, como las
poblaciones de peces (Ferguson y otros, 1995).
Dichos estudios pueden ser incluidos de acuerdo a lo que señalan Ferguson y
otros (1995) dentro de los primeros estudios moleculares en las poblaciones de peces y
que tuvieron como propósito la identificación de caracteres bioquímicos y moleculares en
las poblaciones naturales. En peces se desarrolló la electroforesis en gel de almidón,
junto con la tinción histoquímica que permitió la identificación de enzimas y otros
polimorfismos proteicos (Ferguson y otros, 1995).
17
Las variantes genéticas de estos marcadores, en poblaciones naturales o en
cultivo, han permitido muchos logros y avances en el área de acuicultura, entre los que
se pueden mencionar los siguientes: identificación de híbridos y especies; establecimiento
de la historia filogenética y filogeográfica de especies y poblaciones; determinación de la
estructura poblacional (y del stock de reproductores) de poblaciones explotadas;
identificación de las propiedades de líneas puras; y determinación de la contribución
individual de un lote de reproductores cuando estos son empleados en programas de
repoblación (Ferguson y otros, 1995; Zhu y otros, 2006).
También se ha podido medir los niveles de cambio y los propios cambios en la
variación genética de las poblaciones silvestres y cultivadas; estimar el tamaño real de
una población; identificar los atributos (claves) poblacionales con fines de conservación;
localizar recursos materiales para suplementación y restauración de especies; realizar
ensayos del rendimiento de lotes de peces; determinar el impacto de la introducción
deliberada e inadvertida de peces cultivados en las poblaciones naturales, establecer el
género de los individuos (de una población); determinar las estrategias de cultivo para
especies nuevas o afines a especies cultivadas; comparar el rendimiento relativo del
historial de variantes (comprobando la sobrevivencia relativa de la descendencia en
relación con los parámetros de los progenitores); eliminar el efecto de tanque en
experimentos de selección; mapear genomas; hacer mapas de recombinación; analizar
cuantitativamente de genes ligados y hacer ensayos del éxito de la manipulación del
genoma; entre otras aplicaciones (Ferguson y otros, 1995; Zhu y otros, 2006).
II.6 Marcadores bioquímicos o variantes proteicos
Los estudios iniciales que involucraron el empleo de las proteínas (como la
hemoglobina y transferina) en los 60´s, cambiaron de posición por el empleo de proteínas
enzimáticas (aloenzimas) en las que muchos estudios subsecuentes se han realizado
(Ferguson y otros, 1995; Zhu y otros, 2006). La identificación electroforética de
proteínas polimórficas ha sido empleada extensamente para investigar la variación de
poblaciones de peces silvestres y domesticadas (Moav y otros, 1976), así como también
la variación generacional en programas de selección en ostras (English y otros, 2000). El
procedimiento de identificación consiste en que después de haber sido teñida una enzima,
un número variable de bandas pueden presentarse en los extractos (de un tejido dado) de
cada individuo. Estas bandas son llamadas isoenzimas y pueden corresponder de acuerdo
con English y otros (2000) a lo siguiente:
a) Los productos de la expresión de varios genes en varios loci
b) Los productos de expresión de varios alelos de un gen dado en un locus dado
c) Moléculas producidas por cambios conformacionales de una molécula proteica dada
d) Moléculas sintetizadas por un gen o grupo de genes, que ha sufrido varias
transformaciones pos-traducción.
18
Las proteínas que difieren en su carga eléctrica neta pueden separarse mediante
técnicas de electroforesis en gel, pero no todos los cambios de aminoácidos en la
estructura primaria pueden detectarse con esta técnica, si no sólo los que determinan
diferencias en la carga eléctrica de las proteínas y ocasionalmente aquellos que cambien
la conformación de las mismas (Zhu y otros, 2006). Por esta razón y debido también a la
redundancia del código genético no todas las diferencias alélicas pueden identificarse por
electroforesis de las proteínas correspondientes, subestimándose así la variación genética
hasta en un 60 % (Zhu y otros, 2006).
Sin embargo, las proteínas que se pueden distinguir mediante la electroforesis son
siempre producto de diferentes alelos (Moav y otros, 1976). Por esta razón una de las
principales limitaciones de las variantes proteicas como marcadores genéticos es el bajo
nivel de polimorfismo en algunas especies y poblaciones, aunque un considerable número
de proteínas polimorficas han sido identificadas en algunas especies, otras especies han
mostrado niveles bajos de variabilidad (Ferguson y otros, 1995).
II.7 Marcadores moleculares
Esta tecnología basada en la biología molecular tiene como fundamento el
aprovechar las características estructurales y funcionales de los ácidos nucleicos que
constituyen el material genético de los seres vivos y en cuya secuencia de bases está
contenida toda la información que requiere un organismo para llevar a cabo sus
funciones vitales (Zhu y otros, 2006).
Los atributos de los ácidos nucleicos han permitido un incremento substancial en
el empleo de las herramientas de las que dispone actualmente la biología molecular para
el análisis directo del ADN y ARN de tal forma que ahora es posible analizar el ADN
nuclear (ADNn) y ARN ribosomal (ARNr) de organismos vivos y muertos. Estas
técnicas se han utilizado principalmente para el análisis molecular de una secuencia de
ADN o ARN o bien en el análisis molecular de todo un cromosoma (o genoma
bacteriano) (Ferguson y otros, 1995).
El desarrollo de la amplificación del ADN empleando la reacción en cadena de la
polimerasa –PCR- ha dado cabida a la posibilidad de analizar cambios en las
poblaciones de peces (y todos los seres vivos susceptibles de ser analizados) empleando
material archivado, y además ha dado vida nueva a muchos colecciones de animales,
incluyendo los laboratorios de pesquerías, especímenes de museo en todo el mundo
(Ferguson y otros, 1995). Estas técnicas son, sin embargo, de alto costo y de requieren de
ciertas destrezas técnicas. Sin embargo, el estudio del ADN ofrece un número
aparentemente ilimitado de avances prácticos en relación con el empleo de las proteínas.
Los marcadores moleculares de mayor empleo son los que se mencionan a continuación.
19
II.7.1 Secuencias de ADN mitocondrial (ADNmt)
Esta es una de las primeras técnicas moleculares que incluye el uso de
endonucleasas de restricción para comparar secuencias de ADN. Las propiedades del
ADNmt, permiten de acuerdo con Ayala (1980) y Avise (2004):
a) Que este sea más fácil de purificar que cualquier segmento específico de ADN
nuclear, debido a una densidad de flotación poco frecuente, un alto número de
copias y de su presencia en un organelo diferente al núcleo
b) El ADNmt es fácil de caracterizar porque es pequeño y carece de muchos de los
rasgos complejos del ADN nuclear (tales como intrones y secuencias repetitivas)
c) El ADNmt está distribuido universalmente en el reino animal y es notablemente
uniforme en contenido genético
d) Los tipos de cambio evolutivo que sufre el ADNmt son relativamente simples, son
principalmente sustituciones de bases y adiciones mutacionales de longitud que se
acumulan principalmente en las regiones pequeñas no codificadoras
e) El ADNmt tiene una tasa de cambio mucho más rápida que el ADN nuclear
f) Hasta donde se sabe el ADNmt se hereda maternalmente y todos los organismos
son haploides con respecto al tipo de ADNmt trasmitido
g) La recombinación no existe en el ADNmt, esta propiedad, aunado a las
características anteriores sugieren que el ADNmt es un marcador molecular
importante de tomarse en cuenta en el reconocimiento de las especies y
poblaciones.
Desde el punto de vista filogenético, la carencia de recombinación del ADNmt
como marcador, lo hacen susceptible de ser empleado como un organizador individual
dentro de linajes de matriarcados incluso después del entrecruzamiento (Ferguson y otros,
1995; Avise, 2004).
II.7.2 Secuencias de ARN ribosomal (ARNr)
El estudio de las relaciones filogenéticos y de la variación genética de una especie y
población de organismos también se ha efectuado empleando el ácido ribonucleico
(ARN), en especial el ácido nucleico ribosomal (ARNr) (Farias y otros, 2000; Avise,
2004).
20
El uso de este ácido se ha generalizado simultáneamente al del ADN nuclear. Los
argumentos que comúnmente se manejan a favor del empleo del ARNr son los siguientes:
a) El ARNr es fácil de aislar en cantidades adecuadas
b) El ARNr parece haber mantenido una función constante durante espacios de tiempo
evolutivo muy extensos en los diferentes linajes, de esta forma es enteramente
comparable
c) Por lo menos en alguna parte de su secuencia el ARNr ha cambiado con suficiente
lentitud, como para que la secuencia ancestral no haya sido modificada totalmente
d) El empleo del ARNr garantiza que las secuencias comparadas representan genes
transcritos a ARNm y no genes menores e inactivos
e) El ARNr 5S´ es particularmente adecuado para el análisis de las relaciones
genealógicas entre organismos muy distantemente relacionados en virtud de los
atributos, que le confieren una baja tasa de sustitución de nucleótidos y de la
similitud básica de la estructura entre todos los organismos, así como una longitud
casi igual (de aproximadamente 120 nucleótidos) lo que permite alinear fácilmente
sus secuencias para la construcción de dendogramas filogenéticos.
II.7.3 Secuencias de ADN nuclear (ADNn)
En células animales y vegetales, el ADN forma una estructura de doble hélice
donde las cadenas individuales que la constituyen son complementarias y antiparalelas,
complementarias por que los 4 desoxinucleótidos forman parejas y antiparalelas por que
una de las cadenas corre de 3´→5´ y la otra de 5´→3´. El apareamiento entre las bases A-
T y G-C se debe a que cuando estas se encuentran frente a frente en las cadenas
antiparalelas, se forman puentes de hidrógeno, estos puentes de hidrógeno se pueden
romper elevando la temperatura o mediante la acción de proteínas (Farias y otros, 2000;
Avise, 2004).
El ADN queda entonces como dos cadenas sencillas independientes. A este
evento se le llama desnaturalización y es reversible (Farias y otros, 2000). Si se dan las
condiciones apropiadas las cadenas complementarias pueden volver a reunirse. En el
proceso de reunión, las cadenas que se unen formando la doble hélice pueden tener
orígenes diferentes, en este caso la doble cadena formada es en realidad un híbrido
(proceso conocido como hibridación) (Farías y otros, 2000). La puesta en práctica de este
fenómeno puede emplearse para detectar en una muestra heterogénea de ADN la
presencia de una secuencia especifica (identificación de parentesco entre individuos de
un mismo género o especie), para esto se requiere tener copias de la secuencia que se
desea encontrar. Estas copias se marcan de alguna manera que nos permita confirmar la
formación de las moléculas híbridas. A las cadenas marcadas se les llama sondas porque
son utilizadas para buscar en la muestra la cadena con secuencia complementaria
21
(secuencia blanco) (Karp, 2002). El procedimiento de hibridación consta de los siguientes
pasos: transferencia, marcado de la sonda, hibridación y detección de los híbridos.
II.7.4 ADN satélite o satelital
Los marcadores proteicos y de ADNmt, están basados en cambios en la
secuencia de ADN, generalmente como resultado de mutaciones puntuales que
involucran la sustitución de bases (Ferguson y otros, 1995). Recientemente se ha prestado
atención a otro tipo de variación de marcadores moleculares que difieren en el número
de copias repetidas de un segmento de ADN (Ferguson y otros, 1995; Avise, 2004). Estas
secuencias son llamadas ADN satélite. El ADN satélite es un marcador que se
caracteriza por ser una fracción del ADN genómico de los organismos eucariotas que
difiere (suficientemente) en su composición de bases de la mayoría de los fragmentos de
ADN, debido a que es altamente repetitivo y rico en timina y citosina (Neff y otros,
2000; Avise, 2004). Ferguson y otros (1995) y Avise (2004) clasifican estas secuencias
de acuerdo a su tamaño en:
Satélites: compuestos de unidades de varios cientos de pares de bases repetidas cientos o
millones de veces.
Minisatélites: secuencias de ADN de entre 9 a 100 pares de bases en longitud que son
repetidas de dos a varios cientos de veces en un locus dado.
Microsatélites: tienen una unidad de longitud de 1 a 6 pares de bases, repetidas varios
cientos de veces en un cada locus.
Estos autores también definen al polimorfismo de un solo nucleótido como el
grado de variación se muestra en uno o varios nucleótidos (Ferguson y otros, 1995;
Avise, 2006).
Los primeros estudios que involucraron pruebas generalizadas de minisatélites,
mostraron simultáneamente varios loci que dieron como resultado bandas múltiples de
ADN (fingerprints), pero debido a que el número de loci detectados y la asignación de
locus a los alelos individuales no fueron observables directamente, los análisis
estadísticos estándar de las poblaciones no pudieron ser aplicadas a esos datos (Ferguson
y otros, 1995). Sin embargo, el grado de heterocigocidad, distancias genéticas y medidas
de diversidad si pueden ser obtenidas de tales patrones (Ferguson y otros, 1995; Avise,
2004). Actualmente el progreso y aplicación de los marcadores moleculares y el
desarrollo de primers, ha incrementado el número de estudios que involucran el empleo
de marcadores microsatelitales, colectivamente conocidos como “variable number
tandem repeat loci” (VNTRs por sus siglas en inglés) (Neff y otros, 2000; Avise, 2004).
22
El ADN satélite es un grupo de marcadores genéticos con alto índice de
versatilidad que ha encontrado aplicaciones en muchos estudios de ecología, evolución y
conservación (Neff y otros, 2000; Avise, 2004). En biología pesquera estos marcadores
son ampliamente usados para los siguientes tipos de ensayos (Neff y otros, 2000):
determinación del tamaño efectivo de un lote poblacional, identificación de un grupo de
individuos (lote), evaluación del nivel de entrecruzamiento, evaluación de la estructura
poblacional y flujo genético, estudios de parentesco y caracteres cuantitativos (Neff y
otros, 2000).
II.8 Ventajas y desventajas de los marcadores moleculares
La identificación correcta de especies, poblaciones e individuos dentro de un lote
de reproductores es de suma importancia en los programas de manejo y conservación de
una especie biológica. La mayoría de los atributos que se toman en cuenta para el buen
manejo y conservación de una especie, están contenidos en su genoma. Dicho genoma
muestra una gran variedad de rasgos (marcadores) que permiten un monitoreo adecuado
de la especie. Estos atributos pueden ser empleados con ciertas limitaciones, en función
de la disponibilidad de recursos y aspectos técnicos (Arias-Rodríguez, 2009).
Para hacer uso de los diferentes marcadores moleculares que existen, es necesario
conocer algunas de sus características. Las principales se resumen a continuación:
23
Cuadro No. 2. Comparación entre las ventajas y desventajas de los diferentes
marcadores protéicos y moleculares.
MARCADOR VENTAJAS DESVENTAJAS
Proteínas - Las muestras pueden ser analizadas con rapidez
- Bajo costo de los reactivos
- Técnicas sencillas de aprender
- Las proteínas tienen función conocida
- Algunos loci están sujetos a selección
- Base de datos amplia para
varias especies
- Colecta del tejido y almacenamiento (fresco o
congelado) para que las
proteínas reaccionen
- Se requiere de varios tejidos
en cantidades grandes
(sacrificio del especimen)
- Bajo número de alelos por locus
- Solo proteínas pueden ser identificadas con tinciones
histoquímicas
- Algunos loci están sujetos a una selección significativa
- El análisis de los patrones
pueden ser difíciles de
identificar (especialmente en
los poliploides)
- Algunos la señalan como una metodología anticuada (con
bajos fundamentos)
DNA - Se emplea un solo tejido, en
pequeñas cantidades
- La amplificación por PCR permite cantidades
pequeñísimas de tejido
- Permite el empleo de escamas y especimes de
museo
- El tejido puede ser preservado en etanol
- Hay cientos de marcadores
potenciales
- Algunos loci son multialelicos
- Algunos loci no codifican y no están sujetos a selección
- Las mutaciones no resultan en proteínas que puedan dar
movilidad electroforética
- Relativamente lento y caro
- Difícil de entender
- Muy poca información comparativa disponible
24
MARCADOR VENTAJAS DESVENTAJAS
Microsatélites
- Pueden ser amplificados por
PCR
- Se emplea poco tejido
- Todos los alelos pueden ser discriminados
- Las secuencias existentes de dinucleótidos, son más
fáciles de aislar que la de los
minisatélites
- Se pueden conocer con
rapidez por medio de
secuenciadores automáticos
- Bandas-artefacto
especialmente con dinucleótidos
repetidos
- Se requiere de geles de acrilamida
- Allelos no amplificados dan homocigotos falsos y nulos
- Susceptibles de contaminación
- No todos los microsatélites
son altamente variables
Minisatélites - Separación en geles de
agarosa
- Corrimiento rápido de las
muestras (un solo filtro
permite correr hasta seis
muestras)
- Pocos problemas técnicos en las rutinas de trabajo
- Número grande de alelos para algunos loci
- No todos los alelos se pueden separar
- Solo alelos pequeños se
pueden tratar por PCR
- Se requiere de muchas destrezas técnicas y también se
requieren técnicos expertos
VNTRs
- Alta tasa de mutación y estadios alelicos múltiples,
muy variables
- No codifican, no están influenciados por la
selección
- Cientos de loci dispersos en todo el genoma
- Requiere de clonación para producir sondas o información de
la secuencia.
- Sondas especificas para un locus/iniciadores específicos para
el género en estudio.
- Información disponible limitada de los mecanismos
evolutivos.
Tomado de: Arias-Rodríguez (2007a.).
25
II.9 Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos
Las técnicas de secuenciación del ADN se utilizan para determinar el orden de los
nucleótidos (A adenina, T timina, C citosina, G guanina) en la molécula de ADN, o en
una región particular de la molécula de ADN. La secuenciación del genoma ha ayudado
considerablemente en el estudio de la genética de poblaciones.
Aunque han existido técnicas de secuenciación de proteínas desde la década de
1950, las técnicas de secuenciación de ADN se desarrollaron hasta mediados de la década
de 1970. La estructura de doble hélice del ADN se conocía desde hacía
aproximadamente 15 años antes de la determinación de la primera secuencia de ADN de
forma experimental. Las dificultades en la secuenciación del ADN se debieron
principalmente a que las diferentes moléculas de ADN tienen propiedades químicas
similares, son mucho más largas que las cadenas polipeptídicas de las proteínas, y no se
conocían ADNasas específicas.
Antes de secuenciar el ADN se secuenció el ARN ya que algunas moléculas de
ARN, particularmente el ARN de transferencia eran pequeñas y se podían purificar
individualmente, además de conocerse ARNasas base-específicas y de que se
desarrollaron métodos análogos a los que se utilizaron para secuenciar proteínas. En
1970 se descubrieron las enzimas de restricción, lo que se constituyó un paso importante
en el desarrollo de métodos de secuenciación de ADN. Las enzimas de restricción
reconocen y cortan el ADN en secuencias específicas de entre 4 y 6 bases de largo
generalmente. El uso de enzimas de restricción permitió desarrollar un método general
para fragmentar moléculas largas de ADN en pequeñas piezas que podían separarse por
agarosa. A partir de ese momento la secuenciación genética ha pasado por lo que los
expertos en biología molecular consideran tres generaciones de técnicas.
La primera generación de secuenciación de ADN surgió en dos grupos distintos
de investigación distintos, en forma simultánea. Uno de estos grupos fue el grupo de
Walter Gilbert en la Universidad de Harvard. El otro grupo fue el grupo de Frederick
Sanger en la Universidad de Cambridge. Los secuenciadores Sanger y Gilbert se
consideran técnicas de primera generación. Estas primeras técnicas de secuenciación
eran considerablemente caras y tomaban tiempo. Otra de sus desventajas era que
utilizaban nucleótidos con etiquetas radioactivas, lo cual representaba riesgo a los
usuarios.
El método original de Sanger, publicado por Sanger y Coulson, se conoce como el
método “más-menos” (“plus-minus” method). Este método permitía la secuenciación de
fragmentos de ADN utilizando la enzima ADN polimerasa de E. coli. Siete años después
de la publicación del método de “más-menos” Sanger hizo una nueva publicación con
26
Nicklen y Coulson; este nuevo método mejoraba el método original, se utilizó en el
proyecto de secuenciación del genoma humano que se completó en el 2003 y fue el más
utilizado durante los 30 años siguientes. Por el desarrollo de este método de
secuenciación Frederick Sanger obtuvo su segundo Premio Novel en Química.
El método de Sanger era básicamente una modificación de una reacción de
replicación de ADN in vitro. Muchas de las tecnologías de secuenciación masiva utilizan
el principio de nucleótidos terminadores descrito por Sanger. Los componentes que se
requerían en esta reacción eran: ADN diana, polimerasa de ADN, primer (iniciador o
cebador) de la región de ADN inmediata anterior a la secuencia que se quiere replicar,
dNTPs y ddNTPs. La utilización de los ddNTPs es lo que distingue la secuenciación de
Sanger de cualquier otra reacción de replicación.
La secuenciación Sanger se basa en el uso de cadenas terminales, ddNTPs que se
agregan a las cadenas en proceso de alargamiento de ADN y terminan su síntesis en
diferentes puntos. En la mayoría de las reacciones la polimerasa agregará el dNTP
correcto a la secuencia creciente que ADN que se está sintetizando in vitro. En algunos
sitios, al azar, se agregará un ddNTP en lugar del dNTP. Si se agrega suficiente ADN
diana en la premezcla de la reacción, cada cadena sintetizada tendrá el ddNTP insertado
en un sitio aleatorio diferente y habrá por lo menos un ADN terminado en cada uno de
los diferentes nucleóticos a lo largo de la cadena, mientras la reacción esté ocurriendo
(por cerca de 900 nucleótidos bajo condiciones normales).
Los ddNTPs terminales tienen etiquetas fluorescentes fijadas covalentemente.
Cada uno de los cuatro ddNTPs tiene una etiqueta diferente, de forma que cada ddNTP
diferente fluorecerá de diferente color. Después de terminar la reacción, las secuencias de
ADN se separan por electroforesis de capilaridad de acuerdo a su tamaño. Cuando cada
segmento de diferente tamaño sale de la columna de capilaridad, un láser estimula la
etiqueta fluorescente del extremo terminal del nucleótido. De acuerdo al color que
resulta de la fluorescencia, una computadora lleva el registro del orden en que aparecen
los nucleótidos terminales, de esta forma se leen las secuencias completas del ADN
utilizado como diana.
El método de Gilbert, o de Maxam y Gilbert se publicó antes que el método de
Sanger. De acuerdo a los autores el procedimiento determinaba la secuencia nucleotídica
de un ADN marcado radioactivamente en un extremo, cortándolo con agentes químicos
en cada una de las bases. El corte parcial de cada base generaba un set de fragmentos
marcados desde el extremo marcado hasta la base donde fueron clivados. Utilizando
geles de poliacrilamida y separando dichos fragmentos por tamaño es posible determinar
la secuencia de la molécula de ADN. El método original de Maxam y Gilbert estaba
27
limitado por la capacidad de resolución de los geles de poliacrilamida y presentaba la
posibilidad de secuenciar 100 bases de ADN.
Tanto el método de Sanger como el método de Gilbert se conocían como primera
generación de secuenciadores y han caído en desuso debido al costo y el tiempo de
trabajo. La secuenciación de Sanger producía únicamente varios cientos de secuencias de
nucleótidos por reacción, además de las desventajas anteriormente descritas.
En 1986 Hood y colaboradores, en colaboración con Applied Biosystems,
publicaron el primer reporte de automatización de la secuenciación de ADN, que
establece la secuenciación con terminadores fluorescentes como variante del método de
Sanger. Esta variante utiliza una molécula fluorescente diferente unida a cada
dideoxinucleótido y permite realizar la reacción en un único tubo, permitiendo que la
secuencia sea leída por una computadora. Las secuencias obtenidas con esta variante
eran de entre 500 y 1000 nucleótidos.
La mayoría de las técnicas de segunda generación, conocidas en inglés como
“next-generation sequencing” generan bloques de secuencias aún más pequeñas que las
secuencias generadas con la primera generación de secuenciadores. Los genomas están
conformados por cromosomas que tienen decenas de miles de millones de pares de bases.
Estos genomas pueden secuenciarse únicamente en pequeños fragmentos y los
fragmentos tienen que ordenarse en el orden correcto para generar una secuencia
ininterrumpida, el genoma. La mayoría de los proyectos de secuenciación trabajados
con técnicas de segunda generación utilizan la técnica de secuenciación de genoma
completo conocida como “shutgun sequencing”.
La secuenciación shotgun es una técnica para determinar la secuencia de
cromosomas completos y genomas completos. La técnica se conoce formalmente como
“Whole genome Shotgun secuencing” y se acredita a Craig Venter. Se basa en la
producción al azar de fragmentos del ADN de todo el genoma. Estos fragmentos se
clonan en plásmidos y secuencian en ambas hebras. Una vez obtenidas las secuencias,
éstas se alinean y ensamblan para formar contigs basándose en las secuencias que se
sobreponen. El ensamblaje final de las secuencias se hace con programas de
bioinformática. Estos programas ordenan los fragmentos encontrando segmentos
terminales de secuencias que se sobreponen.
La secuenciación de genoma completo utilizando esta técnica involucra aislar
muchas copias del ADN cromosomal de interés. Como resultado, cada copia del mismo
cromosoma se fragmenta en diferentes puntos y los fragmentos de un solo cromosoma se
sobrepondrán unos con otros. Cada fragmento se secuencia y se emplean algoritmos
28
generados por computadora para comparar todos los fragmentos y para determinar cuál se
sobrepone a cuál. Al alinear las regiones sobrepuestas, un proceso conocido como
“tiling” la computadora encuentra las secuencias continuas más largas posibles a partir de
los fragmentos generados. Finalmente, se ensambla la secuencia completa de los
cromosomas.
La secuenciación shutgun frecuentemente se parea con la pirosecuenciación,
técnica que también corresponde a la segunda generación de secuenciadores, o “next
generation sequencing (NGS)”. La pirosecuenciación es un método de secuenciación de
ADN basado en el monitoreo, en tiempo real de la síntesis de ADN. Todo el proceso de
pirosecuenciación se realiza in vitro. Fue originalmente publicado en 2005 en Nature, y
llevado al mercado por la empresa 454 (posteriormente comprada por Roche).
De acuerdo a la publicación original del método, éste era escalable y con un
rendimiento significativamente mayor que los métodos de electroforesis capilar. El
equipo comercial permitía secuenciar 25 millones de bases con 99% de precisión en una
corrida de 4 horas, lo que significaba un rendimiento 100 veces superior a la cantidad de
bases secuenciadas con los secuenciadores más grandes de Applied Biosystems.
El método de pirosecuanciación consiste de cuatro pasos:
Fragmentación del ADN (o ARN)
Ligación de oligonucleótidos (adaptadores) en cada uno de los extremos
Amplificación clonar (mediante PCR de emulsión)
Secuenciado por síntesis usando un protocolo de pirosecuenciación optimizado en
un soporte sólido y en escala de picolitros
La secuenciación Illumina corresponde, según algunos autores a la tercera generación
de secuenciación de ADN. Otros autores prefieren incluir este método de secuenciación
entre los métodos conocidos como métodos de secuenciación masiva. Se le conoce con
ese nombre por la empresa que comercializó la técnica, aunque otras compañías tienen
secuenciadores similares. Los secuenciadores Illumina utilizan nucleótidos terminadores
marcados con moléculas fluorescentes, al igual que en la Secuenciación de Sanger.
Las principales diferencias del método Illumina respecto al método convencional son
la capacidad de realizar millones de secuencias en cada corrida; y la posibilidad de
eliminar la fluorescencia una vez obtenida la imagen y desbloquear el carbono 3´ de
modo que pueda aceptar una nueva base para continuar la reacción de secuenciación,
haciendo que la incorporación de un nucleótido terminador sea reversible; obteniendo
longitudes de onda menores; mayor capacidad de realizar secuencias en paralelo; y como
resultado obtener hasta 6X1012 secuencias en una corrida.
29
Similar a los métodos antes desarrollados el método Illumina inicia con una
fragmentación del ADN y una posterior ligación de adaptadores. Luego continúa con una
amplificación en superficie sólida conocida como “flow cell”, donde también se hace la
reacción de secuenciación. Durante la reacción, a diferencia de la pirosecuenciación, se
ofrecen los cuatro nucleótidos terminadores marcados cada uno con un fluorocromo
diferente, al igual que en el método de Sanger. Luego de un lavado se obtienen las
imágenes y se obtiene la primera base de cada cluster. Luego se elimina el fluorocromo y
se desbloquea el carbono 3, permitiendo que un nuevo nucleótido pueda extender la
cadena de ADN que se está sintetizando. Otra vez los cuatro nucleótidos terminadores
marcados son ofrecidos a los clusters, comenzando un nuevo ciclo.
Existen otros métodos y tecnologías de secuenciación masivas desarrolladas por
diferentes compañías. Algunas de ellas corresponden a la tercera generación de
secuenciadores ya que permiten la secuenciación a partir de una única molécula de ADN
en tiempo real (SMRT y Helicos) y algunas incluso teóricamente no tienen límite en
cuanto al largo de las moléculas secuenciales generadas, pudiendo eventualmente
secuenciar cromosomas enteros (Pacific Biosciences). La tecnología de Ion Torrent se
basa en el registro de los cambios de pH producidos durante la incorporación de bases
durante la síntesis de ADN medidos mediante micropHímetros.
La secuenciación Illumina involucra más de quinientos millones de reacciones de
secuenciación simultáneas en una sola lámina y utilizando un único equipo. Cada
reacción se analiza separadamente y las secuencias generadas a partir de cada una de las quinientas millones de reacciones se almacenan en un programa de bioinformática. Cada
una de las secuenciaciones es una reacción de replicación modificada, incluye
nucleótidos maracods con fluorescencia pero no se requiere de nucleótidos dideoxy
terminales. Esta técnica utiliza una reacción de replicación modificada y utiliza
nucleótidos con etiquetas fluorescentes.
30
PARTE III
III.1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
En años recientes se han utilizado marcadores genéticos y otras técnicas
moleculares en la evaluación de aspectos genéticos de especies silvestres y domesticadas,
e incluso muestras fósiles de animales y plantas. Estos estudios han permitido, entre
varias cosas, determinar la relación genética entre especies, evaluación de poblaciones en
peligro de extinción, determinación del flujo genético entre poblaciones, evaluación de
estructura genética y definición de unidades genéticas para conservación (Lamprea y
otros, 2004). Estas técnicas aunque muy valiosas, con frecuencia se encuentran con la
limitación de que el análisis de los datos requiere de muestras de varios organismos, con
frecuencia un mínimo de 30, para ser representativas de las poblaciones y para hacer
comparaciones entre grupos.
El presente estudio utilizó marcadores moleculares satelitales para determinar si la
especie de pez localmente conocido como machorra o pejelagarto (Atractosteus tropicus)
es la misma que habita en el Sur de México y si existía flujo genético entre las diferentes
poblaciones silvestres localizadas en la Costa Sur de Guatemala. Los microsatélites son
secuencias de repetición en tándem de 1 a 6 pares de bases y han demostrado ser útiles en
este tipo de estudio debido a su amplia distribución en el genoma de todos los
organismos; además de ser selectivamente neutros y de fácil manejo en el laboratorio
(Lamprea y otros, 2004).
III.1.1 Etapa 1
III.1.1.1 Identificación de zonas de habitación de A. tropicus en la costa del Pacífico
guatemalteco y colecta de material genético
En la primera fase del proyecto, realizada durante el año 2010, se determinó que
la especie todavía se encuentra presente en los principales ríos de la Costa Sur de
Guatemala. Los criterios de selección de las zonas de muestreo fueron: registros
anecdóticos de la presencia de la especie; y zonas inundables de ríos caudalosos. De
acuerdo a estos criterios de definieron las siguientes zonas de muestreo:
a. Costa del Departamento de San Marcos inundada por el Río Naranjo.
b. Costa del Departamento de Retalhuleu, inundada por el sistema de los Ríos
Ocós y Tilapa, que confluyen en el Área de Protección Especial Manchón
Guamuchal.
c. Desembocadura del Río Nahualate, en la zona de El Semillero, Departamento
de Escuintla.
31
d. Canal de Chiquimulilla, en los Departamentos de Escuintla y Santa Rosa.
Todas las zonas donde se reportó la presencia de la especie comparten las
siguientes características: se encuentran dentro de áreas privadas o zonas de protección
donde la pesca está prohibida o restringida; y el acceso es limitado a las zonas inundables
es limitado durante los meses de mayor lluvia, que coinciden con las épocas de
reproducción de la especie.
En el Departamento de San Marcos, pescadores artesanales reportan que las
mayores concentraciones de peces se encuentran en las localidades de La Blanca y Las
Palmas. Ambas localidades tienen sistemas inundables por aguas del Río Naranjo. El
acceso a las zonas de ubicación de los peces es difícil, ya que se encuentran dentro de
fincas de cultivo de caña. La densidad problacional en estas zonas se estima baja y en
disminución, de acuerdo a lo reportado por los pescadores artesanales de la zona. El
consumo de este producto es limitado en la zona y en muchos casos las personas
conservan a los peces como mascotas y para ornato (Fig. No.). De estas localidades
solamente se colectaron 5 muestras de tejido, todas de animales vivos que se conservaban
en tanques o pilas de casas.
Fotografía No. 1. Pila de un hogar de la comunidad La Blanca en el Departamento de San
Marcos, donde se observa que tienen a un Atractosteus tropicus como mascota.
Las poblaciones encontradas en el Departamento de Retalhuleu se concentran en
las comunidades de El Chico y La Barrita, rivereñas a los ríos Ocós y Tilapa, que
desembocan dentro del sistema de la Zona de Protección Especial Manchón Guamuchal.
La Zona de Protección Especial Manchón Guamuchal es la reserva de humedales más
extensa de la Costa Sur de Centroamérica. Esta reserva fue declarada Sitio RAMSAR
por servir de paso y descanso para numerosas especies migratorias, además de su
32
biodiversidad local. En los reportes y estudios de la pesca artesanal de esta zona de
protección especial no se reporta la presencia de A. tropicus, posiblemente debido a que
estos estudios se concentran principalmente en los productos de la pesca dentro de la
zona de estuario y la costa (Sánchez-Castañeda, 2000).
En esta zona la pesca artesanal es la principal actividad económica de las
comunidades. Los productos de la pesca se aprovechan en su totalidad para
comercializarse a través de acopiadores o para consumo directo (Sánchez Castañeda,
200). En el caso de A. tropicus, éste no se extrae dentro del área de la Zona de
Protección Especial, sino de las zonas inundadas de los ríos que desembocan dentro del
humedal. Las machorras que se extraen de esta zona no se comercializan localmente,
sino que se transportan hacia San Marcos, especialmente Ocós, donde se acopian para su
posterior comercialización.
Se muestrearon peces provenientes de zonas inundadas de los ríos Ocós y Tilapa,
las comunidades El Chico y la Barrita, respectivamente. Estas dos poblaciones de A.
tropicus parecen ser de las más grandes del país, especialmente la comunidad de El Chico
de donde se obtuvieron muestras de 40 peces. De la comunidad La Barrita se obtuvieron
10 muestras. Todas estas muestras fueron obtenidas de peces extraídos por pescadores
artesanales y que eran transportadas a San Marcos para ser comercializadas en el
altiplano del país, principalmente en San Juan Ostuncalco, Quetzaltengo donde se utiliza
para preparar tamales de machorra los que se consideran un platillo local muy especial.
Todos los organismos muestreados en estas comunidades se observaron sanos y
bien alimentados, lo que sugiere que estas poblaciones son saludables. También se
observó que todos los organismos que se encontraban disponibles para la venta en ese
momento correspondían a peces adultos, sexualmente maduros.
33
Fotografías 2, 3 y 4. Serie de fotografías de uno de los puestos de comercialización de productos
de la pesca donde se observó la presencia de Atractosteus tropicus adultos, saludables y bien
alimentados.
En la desembocadura del Río Nahualate, en la comunidad de El Semillero,
Departamento de Escuintla se detectó la presencia de otra comunidad aparentemente
pequeña de A. tropicus. Los pescadores artesanales, y pobladores locales indican que
esta especie es muy preciada por lo que la presión de pesca que se ha ejercido es alta y la
población está muy mermada. Es difícil observar organismos adultos, en la mayoría de
los casos se observan peces jóvenes de tallas pequeñas con poco valor comercial, por lo
que cuando son capturados incidentalmente con frecuencia son devueltos al río. Debido a
esta condición no se considera, actualmente, en esta zona un producto comerciable.
En el Canal de Chiquimulilla se encontraron varias poblaciones, o posibles
subpoblaciones de A. tropicus. En el Municipio de Sipacate, Departamento de Escuintla
se encontró un número reducido de organismos que son extraídos por pescadores
artesanales y comunidades locales para autoconsumo. El excedente y durante los meses
de mayor abundancia que coinciden con la mayor precipitación pluvial el excedente se
comercializa en el mercado de Santa Lucía Cotzumalguapa. De esta población no fue
34
posible obtener muestras ya que los tejidos a los que se tuvo acceso se encontraban muy
deteriorados y no se extrajo ADN de los mismos.
En las aldeas de Candelaria y Monterrico del Departamento de Santa Rosa se
encontraron las poblaciones más abundantes de machorra de la Costa Sur de Guatemala.
Sin embargo, no todos los peces se observaban bien alimentados y algunos parecían
ligeramente flacos. La abundancia de organismos en estas zonas coincide con la
inundación de zonas de manglar, en estas épocas de abundancia los pobladores locales la
conservan utilizando la técnica de seco-salado, y la comercializan localmente. De estas
poblaciones se obtuvieron 40 muestras de cada una.
En la siguiente imagen se observa La Laguneta la Palmilla. Esta laguna se
encuentra dentro de una finca privada. Durante los meses de verano, varios de los
canales y quineles se secan, limitando la comunicación entre la laguna y el Canal de
Chiquimulilla. En los meses de lluviosos, estos canales se inundan y la comunicación
entre la laguna y el Canal de Chiquimulilla permanece abierta, permitiendo el
desplazamiento de los animales hacia la zona costera. Este desplazamiento de los
animales coincide con la temporada de reproducción, permitiendo que las larvas y
alevines se desarrollen en la zona del Canal de Chiquimulilla donde hay mayor
disponibilidad de alimento natural. Cuando el nivel del agua empieza a bajar, por
diminución de las lluvias y caudal de los ríos, los peces migran de vuelta a La Laguneta
la Pamilla, la que se convierte en una especie de santuario de protección de la especie en
esta zona.
Todos los organismos muestreados en estas poblaciones se encontraban vivos,
fueron capturados con ayuda de pescadores artesanales locales y se devolvieron al Canal
de Chiquimulilla después de medirlos, y de obtener las muestras de aleta caudal.
35
Figura No. 1. Imagen satelital de Laguneta la Palmilla en el Departamento de Santa Rosa,
Guatemala. Esta laguna constituye una especie de santuario para Atractosteus tropicus, ya que
permite que la especie se refugie durante parte de su ciclo de vida, y al encontrarse dentro de una
propiedad privada, no es explotada por la pesca artesanal.
A pesar de que el Departamento de Jutiapa se encuentra dentro del área de
distribución de la especie, no se encontraron referencias bibliográficas o anecdóticas de
presencia de la especie en este Departamento, por lo que no se muestreó ninguno de los
ríos caudalosos de esta zona.
En total se tomaron 136 muestras de aleta caudal de A. tropicus fijadas en alcohol
metílico 95% grado biología molecular, procedentes de 6 poblaciones diferentes, todas de
la Costa Sur de Guatemala.
36
Fotografía No. 5. Proceso de muestreo de un ejemplar vivo de A. tropicus obtenido del Canal de
Chiquimulilla en la Aldea de Monterrico, Santa Rosa, Guatemala. La muestra consiste en 1 cm2
de tejido de de la aleta caudal fijado en alcohol metílico 95% grado biología molecular.
III.1.1.2 Identificación taxonómica de la especie
La determinación taxonómica de los especímenes utilizados en esta investigación
se basó en los caracteres taxonómicos señalados por Miller y otros (2005), y a las
características de identificación taxonómica recomendadas para Lepisosteidos por Wiley
(En FAO, 2003).
Figura No. 2. Características de identificación taxonómica de Lepisosteidos de la región
centroamericana. Tomado de Wiley (en FAO, 2003).
37
Fotografías 6, 7 y 8. Proceso de identificación de A. tropicus durante los muestreos de campo.
Después de la evaluación de las características de los organismos encontrados, se
determinó que todos los peces evaluados pertenecen a la misma especie, y son
Atractosteus tropicus correspondientes a la siguiente clasificación taxonómica:
Familia: Lepisosteidae
Orden: Lepisosteiformes
Clase: Actinopterygii
Género: Atractosteus
Especie: tropicus
Nombres comunes: machorra, pejelagarto, pez armado, el más común en
Guatemala es machorra.
38
Entre las distintas poblaciones evaluadas se observaron variaciones ligeras de
coloración y en algunos casos la intensidad de las manchas laterales. Sin embargo, no se
observaron características que sugieran que estos cambios en la coloración se deban a
condiciones distintas a la alimentación o condiciones ambientales locales. También es
posible que algunos de los cambios de coloración observados se deban al tiempo de
refrigeración de los organismos. Sin embargo, las observaciones de cambio sugieren que
existen variaciones normales en la genética y adaptaciones a las condiciones locales. Los
peces incluidos en este estudio forman parte de la población geográfica registrada para la
especie que se extiende en la vertiente del Pacífico desde el Sur del Estado de Chiapas,
México hasta el Río Negro en Nicaragua (Miller, 1954; Bussing, 1998).
La presente investigación confirma la hipótesis planteada de que la especie de
Atractosteus tropicus que habita en los diferentes ecosistemas acuáticos de la Costa Sur
de Guatemala evaluados es la misma especie que habita el Sur de México y los demás
países de Centro América. Sin embargo no fue posible establecer la variación genética
entre poblaciones, debido al bajo número de muestras analizado.
III.1.1.3 Desarrollo de marcadores moleculares microsatelitales, secuenciación y
análisis de secuencias
En los peces primitivos, dentro de los cuales se cuenta a la machorra (A. tropicus),
objeto de este estudio, los estudios de genética han sido pocos en comparación con los
realizados en otros grupos taxonómicos como los salmónidos. Los estudios disponibles
indican en general que estos peces comparten características de tipo citogenético como
son presencia de cromosomas birrámeos y microcromosomas, ambos tipos en mayor o
menor abundancia dependiendo de la especie en particular (Arias-Rodríguez, y otros,
2009).
Arias-Rodríguez y otros (2009) describieron el cariotipo de A. tropicus por medio de
tinción de Giemsa de 295 preparaciones cromosómicas en mitosis de larvas y adultos.
Estos autores encontraron el número diploide de cromosomas 2n=56 cromosomas. Ocho
pares de cromosomas metacéntricos, cuatro pares de cromosomas submetacéntricos, ocho
pares teleocéntricos y ocho pares telocéntricos, no encontrando diferencias sexuales,
observando variación en el número de cromosomas desde 46 hasta 64 elementos
cromosómicos en larvas relacionando la variación cromosómica con microcromosomas
móviles.
La metodología de trabajo originalmente planteada para esta investigación proponía
el desarrollo de marcadores moleculares satelitales utilizando la siguiente secuencia de
procesos: extracción de ADN genómico, digestión de ADN, selección de fragmentos y
ligación de adaptadores, creación de una biblioteca de ADN enriquecida, clonación del
39
ADN-PCR enriquecido y secuenciación y análisis de secuencias. Todos estos pasos para
poder diseñar los iniciadores o cebadores.
Sin embargo durante el curso de la investigación se hizo viable, y económicamente
posible la contratación de la secuenciación del ADN genómico de A. tropicus. Como se
indica en la metodología, la secuenciación se hizo con el laboratorio UCLA Genotyping
and Sequencing Core de la Universidad de California en Los Angeles, California, Estados
Unidos de América. La metodología de secuenciación empleada fue pirosecuenciación
de segunda generación por “shotgun sequencing” utilizando un equipo Titanium Shotgun
-050411.
La información de la secuenciación fue subida al servidor del laboratorio UCLA
Genotyping and Sequencing Core data server. Para descargar y analizar la información
se utilizó el programa gratuito Nomachine NX client (de libre acceso, disponible en:
http:www.nomachine.com), y el programa BioEdit V7.0.9 teniendo de esta forma acceso
al servidor del laboratorio. Con ayuda del Dr. Lenin Arias-Rodríguez de la Universidad
de Juárez Autónoma de Tabasco y el apoyo del personal técnico del laboratorio de la
UCLS se identificaron las secuencias microsatelitales.
El tamaño del genoma de A. tropicus se estimó en 2C=2.780.02±0.02 (pg). Se
identificaron cuatros sets de microsatélites, agrupados de la siguiente forma:
a) AAAT, AACT, AAGT, CAT, AGAT;
b) AAT, ACT, ATC, AAC, AAG, TG, AG;
c) AAAC, AAAG, AATC; y
d) AATG, ACAG, ACCT, ACTC, ACTG.
Estas secuencias fueron comparadas con 81 secuencias registradas actualmente en el
GenBank® (NCBI) para especies cercanas. De estas 81 secuencias, 30 están registradas
para A. spatula, la especie genéticamente más cercana registrada en esta base de datos.
De los cuatro sets de microsatélites se determinó que diez secuencias microsatelitales son
similares a las encontradas en A. spatula, de acuerdo a los registros de la colección
principal CoreNucleotide. Este análisis se hizo con ayuda de las herramientas
disponibles en GenBank® (NCBI) parte de International Nucleotide Sequence Database,
Collaboration, específicamente la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool).
Al comparar los sets de microsatélites identificados se determinó que eran
prácticamente idénticos a los reportados para A. spatula por Moyer, Sloss, Kreiser, y
Feldheims (2009), por lo que se procedió a utilizar los primers (iniciadores) de estos
autores en las pruebas de variabilidad genética. Nueve de los iniciadores de estos autores
son polimórficos en Lepisosteus oculatus y L. osseus.
40
III.1.2 Etapa 2
Para poder realizar el análisis de diversidad genética entre poblaciones se requería
de un mínimo de 40 muestras de ADN genómico, en buenas condiciones, de cada una de
las poblaciones. Debido al bajo número de muestras colectadas de cada una de las
poblaciones no fue posible establecer la frecuencia alélica y número de alelos por área de
colecta en cada marcador microsatelital o locus analizado. Por lo cual no fue posible
establecer la variación genética en cada población. Se determinó únicamente la presencia
o no de cada uno de los microsatélites en cada una de las muestra, mediante la separación
de bandas en geles de electroforesis.
Este análisis determinó que todos los microsatélites se encontraban presentes en
todas las poblaciones evaluadas. Las secuencias de nucleótidos generadas fueron
alineadas, sin embargo solamente se analizó heterocigosidad observada y esperada (Ho y
He, respectivamente) entre las poblaciones de Monterrico, Candelaria y El Chico, donde
se contaba con 40 muestras distintas. Este análisis se hizo con el programa GENEPOP
(P>0.005) determinándose que no existe diferencia significativa en la frecuencia de
microsatélites entre las poblaciones evaluadas, por lo que no pueden considerarse
unidades genéticas separadas (Lamprea y otros, 2004).
Fotografía No. 9. Trabajo en el laboratorio durante la fase de extracción de ADN genómico de
las muestras colectadas.
Al plantearse originalmente esta investigación también se esperaba poder comparar las
secuencias genéticas identificadas con secuencias genéticas de la especie identificadas por
colegas de la Universidad de Juárez Autónoma de México. Sin embargo, el proyecto de
41
investigación que iba a generar tales secuencias no fue financiado, por lo que esta parte del
trabajo no pudo completarse.
III.2 OTRAS ACTIVIDADES REALIZADAS DURANTE EL DESARROLLO DEL
PROYECTO
Dentro de los objetivos de este proyecto se buscaba implementar la técnica de desarrollo
de marcadores moleculares microsatelitales en el Laboratorio de Sanidad Acuícola de CEMA y la
formación de recurso humano en el uso y aplicación de técnicas de biología molecular en estudios
genéticos de organismos acuáticos. Resultado de este trabajo se capacitó a cuatro personas y se
generaron los Procedimientos Operativos Estandarizados (POEs) para las técnicas de: preparación
de kits de colecta; colecta de material genético para desarrollo de microsatélites; extracción de
ADN genómico; amplificación e identificación de material genético utilizando las técnicas de
PCR y electroforesis horizontal. Estos POEs, los procedimientos resumidos de trabajo y los
registros de verificación de trabajo quedaron disponibles en las instalaciones del Laboratorio de
Sanidad Acuícola.
Durante el desarrollo del trabajo también fue posible gestionar la donación de un equipo
de electroforesis horizontal al CEMA.
Fotografías 10 y 11. Imágenes del trabajo de laboratorio desarrollado durante el proyecto de
investigación.
42
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES
Utilizando técnicas de identificación convencionales y la técnica molecular de
microsatélites polimórficos del genoma de Atractosteus tropicus, se determinó
científicamente que los peces de agua dulce identificados comúnmente como
Machorras o Pejes Lagarto que habitan en los sistemas acuáticos de la Costa del
Pacífico de Guatemala son miembros de la especie Atractosteus tropicus. La
evaluación del genoma de esta especie permitió determinar que los grupos que
habitan en la costa del Pacífico de Guatemala no pueden considerarse, desde el punto
de vista genético, como poblaciones diferentes.
Se desarrolló una técnica molecular de análisis del genoma de Atractosteus tropicus
utilizando marcadores microsatelitales que puede ser utilizada en programas de
conservación, repoblamiento y manejo de la especie.
Aunque no fue posible determinar el grado de polimorfismo de los microsatélites
identificados en el genoma de Atroctosteus tropicus, se determinó que las secuencias
microsatelitales identificadas se encuentran también presentes en el genoma de
Atractosteus spatula, registradas en el banco de genes. No fue posible hacer
comparaciones con otros microsatélites registrados del genoma de A. tropicus, ya que
no se encontraron registros de marcadores moleculares genómicos de la especie en los
bancos de genes disponibles.
De acuerdo a las características fenotípicas dominantes en los organismos extraídos
de diferentes áreas de la costa del Pacífico de Guatemala, se identificaron tres grupos
de A. tropicus, delimitados por las características geográficas de los lugares que
habitan. Aunque estos grupos de peces presentan características fenotípicas
ligeramente distintas, se asume que éstas se deben a condiciones ambientales propias
del lugar que habitan, ya que no se encontró diferencia significativa en la frecuencia
alélica de los marcadores moleculares de los grupos evaluados. Los grupo de peces
identificados se encuentran presentes en: Laguna Las Palmas y La Blanca, San
Marcos; estuarios El Chico y La Barrita en Retalhuleu; el Semillero y Sipacate,
Escuintla; Canal de Chiquimulilla, concentrándose en las aldeas de Candelaria y
Monterrico, en Santa Rosa.
43
Utilizando técnicas convencionales de clasificación taxonómica de peces, basadas en
características morfométricas y merísticas, se determinó que la especie de peces
identificados como A. tropicus que habita en la costa del Pacífico de Guatemala es la
misma que se reporta para los demás países del área centroamericana y el sur de
México.
En el Laboratorio de Sanidad Acuícola del Centro de Estudios del Mar y Acuicultura
de la Universidad de San Carlos de Guatemala, se implementó la técnica de
evaluación de poblaciones de peces utilizando marcadores moleculares
microsatelitales. El laboratorio cuenta con el equipo, la capacidad analítica y los
procedimientos establecidos para implementar la técnica en otras especies de peces.
44
IV.2 RECOMENDACIONES
A los investigadores y entidades relacionadas con los recursos naturales,
especialmente los recursos acuáticos de Guatemala donde se encuentra presente
Atractosteus tropicus, utilizar la técnica de análisis del genoma desarrollada en la
presente investigación.
A los investigadores y entidades relacionados con el manejo de los ecosistemas y
zonas donde habita Atractosteus tropicus implementar programas regionales de
manejo con las autoridades y entidades de los países que forman parte de la
distribución de la especie, ya que se determinó que en todos estos países habita la
misma especie.
A los investigadores y comunidad del Laboratorio de Sanidad Acuícola del Centro de
Estudios del Mar y Acuicultura de la Universidad de San Carlos de Guatemala,
implementar mecanismos de colecta de información sobre poblaciones y distribución
de especies acuáticas a partir de la pesca y venta de productos acuáticos en los
mercados. En esta investigación se evidenció que estas fuentes de información son
importantes en la orientación de las áreas y temporadas de muestreo.
Continuar con los esfuerzos e investigación para el manejo de Atractosteus tropicus
en Guatemala, ya que las poblaciones rurales de la costa del país reconocen y valoran
la especie debido a la larga historia de consumo que existe en algunas de las
comunidades costeras y en otras comunidades que utilizan este pescado dentro de su
gastronomía.
No descartar el valor de las técnicas de clasificación taxonómica y sistemática clásica
de especies, ya que los investigadores creemos que éstas deben ser el primer paso en
la identificación y estudio de peces, aún cuando se utilicen técnicas moleculares para
la identificación y estudios poblacionales.
45
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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49
IV.4 ANEXO
Anexo 1. Debido a que el Laboratorio de Sanidad Acuícola no cuenta con una estufa de
hibridación de adaptó un vortex (agitador), con una bandeja para tubos de reacción dentro
de una incubadora ajustada a 37°C o a temperatura ambiente, según el procedimiento
establecido para cada reacción.
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1. Materiales Pinzas pequeñas, de acero inoxidable. De punta fina, preferentemente con dientes de ratón Tijeras de disección pequeñas, de acero inoxidable Tubos de reacción de 1.5 o 2.0 mL de volumen Marcador permanente de punta fina de color oscuro (negro o azul) Bolsa de cierre hermético Algodón Pizeta o botella plástica con boca delgada para dispensar líquidos con facilidad Etiquetas para rotular o en su defecto masking tape grueso Guantes para la persona que colecta Recipiente de transporte (caja plástica o de cartón grueso)
En los casos en que sea necesario extraer a los animales del agua y el sitio de colecta no cuente con sus propios materiales.
Atarraya pequeña Quecha (chachanga) Cubeta plástica de por lo menos 20 litros de volumen
Reactivos y soluciones
Alcohol metílico 95% (solución que se compra) Alcohol etílico 70% Anestésico adecuado para la especie
Equipos Cámara fotográfica para documentar el procedimiento GPS si se requiere geoposicionar el sitio de colecta de la muestra
En los casos en que se requiera de información morfométrica de los animales:
Ictiómetro o cinta métrica Balanza con baterías cargadas, capacidad mayor a 200 g
2. Procedimiento Previo a la visita de colecta
a. Asegúrese de que tiene un compañero para que lo acompañe en el trabajo b. Llene suficientes tubos de reacción con 1.0 mL de alcohol metílico 95% c. Prepare una pizeta con metanol 95% para poder agregar más fijador en los casos que sea necesario d. Prepare lotes de 40 tubos en bolsas de cierre hermético individuales e. Empaque por lo menos 30 tubos adicionales sin alcohol f. Revise que tiene todos los materiales necesarios para la colecta, incluyendo registros y equipo de
documentación
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Preparación del área de trabajo a. Asegúrese de que cuenta con un área de trabajo apropiada para colocar todos los materiales y manipular a
los organismos sin causarles daño. Verifique que la ventilación sea adecuada para no inhalar los vapores del alcohol
b. Verificar que cuenta con todos los insumos necesarios para trabajar y que tiene a mano el número adecuado de tubos para la colecta
Colecta de información general
a. En el cuaderno de campo y en el registro de colecta proceda a iniciar el registro de la colecta que está realizando
b. Asigne un código a las muestras por colectar c. Colecta la información morfométrica que requiera de los animales, preferentemente antes de la colecta de
tejido o inmediatamente después de la misma, para no interferir con el proceso de colecta de muestra de material genético
Colecta de organismos
a. Colectar a los animales de acuerdo al método más apropiado para el sitio de colecta b. Anestesiar a los animales que no estén en condiciones de manipulación sin anestésico, o c. Sacrificar a los animales que no serán regresados al medio natural usando una sobre-dosis de anestésico d. En el caso de las muestras que se colecten de pescadores asegúrese de que los animales están todavía en
buen estado y que no existe descomposición de la carne Colecta de muestra de tejido
a. Con la tijera limpia proceda a cortar una sección no menor a 1 cm² de tejido de la aleta caudal. Asegúrese de que tiene suficiente tejido blando en la muestra
b. Sumerja la muestra de tejido en un tubo de reacción c. Identifique el tubo de acuerdo al código asignado para la muestra d. Agregue más alcohol si lo considera necesario y si tiene suficiente espacio en el tubo e. Limpie la tijera con un algodón humedecido con alcohol etílico 70%, asegúrese de repetir este procedimiento
después de cada muestra Identificación y transporte de muestras
a. Una vez concluido el proceso de colecta de tejido, asegúrese que todas las muestras están debidamente identificadas, verifique la legibilidad de los números que pudieron ser borrados o no estar claros
b. Introduzca las muestras, de acuerdo al lote que correspondan en bolsas de cierre hermético individuales por lote de muestras
c. Identifique la bolsa de acuerdo al lote de muestras que contiene d. Prepare una etiqueta de papel o masking tape con la identificación de la muestra y adhiérala al exterior de la
bolsa con los tubos de reacción e. Introduzca esta bolsa identificada dentro de una bolsa de cierre hermético de mayor tamaño e identifíquela
con la misma información de la bolsa interior f. Coloque sus muestras en un recipiente de transporte adecuado. No es necesario transportarlas en frío
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Posterior a la colecta, en el laboratorio a. Verifique la identificación de los diferentes lotes de muestras colectados b. Proceda a cambiar las bolsas de transporte y las etiquetas si la calidad de las mismas ya no es adecuada c. Revise cada muestra individual y verifique que el volumen de alcohol es el adecuado y que el mismo no se
encuentre turbio d. En caso de que el alcohol esté turbio, cambie el alcohol por alcohol nuevo e. Conserve las muestras, preferentemente en refrigeración (4°C) hasta su utilización
a. Tamaño de muestras
Muestra de tejido: no menor a 1 cm², sin incluir, preferentemente tejidos óseos o cartilaginosos. Para estudios genéticos se prefiere que estas muestras sean colectadas de la aleta caudal Muestra poblacional: consistente de 40 muestras de tejido individuales 3. Diagrama de flujo el proceso
ACTIVIDAD RESPONSABLE OBSERVACIONES Persona que colecta conocer área, # de muestras Investigador principal Trabajo de Gabinete Persona que colecta in situ Persona que asiste Persona que asiste verificar que se tiene toda la Información según boleta de campo Persona que colecta Esta es la etapa más crítica Persona que asiste Persona que colecta Trabajo en el laboratorio Investigador a cargo del Trabajo en el laboratorio
Preparación previa
de materiales
Preparación de área
de trabajo
Colecta de información
general y de animales
Colecta de tejido
Identificación de
muestras
Identificación de
muestras
PROTOCOLO DE
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TITULO:
IDENTIFICACIÓN DE MATERIALES DEL
PROYECTO
PROYECTO
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Noviembre de 2010 Noviembre de 2010 Noviembre de 2010
1. OBJETIVO Llevar un buen control de los insumos de trabajo que se adquieren con los fondos del proyecto FODECYT 02-2009. Cumplir con las recomendaciones del Asesor Técnico de SENACYT. 2. ALCANCE Todos los insumos (equipo, materiales fungibles, reactivos, cristalería, Etc.), así como muestras, procedimientos, documentos y resultados que se compren, generen u obtengan como parte del trabajo del proyecto FODECYT 02-2009, titulado: “Evaluación de la diversidad genética de las poblaciones de Atractosteus tropicus presentes en la costa del Pacífico de Guatemala”. 3. RESPONSABLES Investigador principal: M.Sc. Leonel Carrillo Ovalle Investigador asociado: M.Sc. Dora Carolina Marroquín Mora 4. DEFINICIONES Insumos: reactivos, materiales fungibles, papelería Reactivos: materiales químicos Cristalería: instrumentos de medición, empaque, transporte o almacenaje de reactivos y/o insumos Muestras: material genético y/o biológico Procedimientos: documentos que describen actividades del proyecto Documentos: documentos físicos y/o electrónicos que contengan información referencial, documental o que de alguna forma tenga relación con el proyecto Resultados: información generada como resultado directo o indirecto del proyecto 5. PROCEDIMIENTO - Identifique todos los materiales sujetos a este procedimiento que pertenezcan al proyecto - Identifique en forma clara y visible todos estos materiales. Asegúrese de utilizar etiquetas o marcador
indeleble - Almacene los materiales de forma adecuada y separada a los demás materiales del laboratorio 6. FORMULARIOS Y REGISTROS Listados de materiales del laboratorio y del proyecto. Listado de muestras. Cuaderno de campo.
Nombre del Proyecto:
No. del Proyecto:
SUB DESCRIPCION MONTO MONTO DE MONTO
GRUPO GRUPO RENGLON SENACYT CONTRAPARTIDA TOTAL
1 SERVICIOS PERSONALES
181 Estudios, investigacioones y proyectos de factibilidad 101.295,68 101.295,68
SOLICITADO Este rubro incluye una hora de trabajo del investigador principal, una hora del investigador asociado y la contratación de cuatro horas para un laboratorista.
CONTRAPARTIDA El investigador principal y el investigador asociado también laboran para la Universidad de San Carlos de Guatemala con lo que se completan las horas de trabajo en el proyecto.
1 PUBLICIDAD, IMPRESIÓN Y ENCUADERNACION 0,00
122 Impresión, encuadernación y reproducción 2.000,00 2.000,00
CONTRAPARTIDA la totalidad de los gastos de este rubro fueron cubiertos por el Centro de Estudios del Mar y Acuicultura de la Unviersidad de San Carlos de Guatemala
13 VIATICOS Y GASTOS CONEXOS 0,00
133 Viáticos en el interior 6.250,00 6.250,00
CONTRAPARTIDA la totalidad de los gastos de este rubro fueron cubiertos por el Centro de Estudios del Mar y Acuicultura de la Unviersidad de San Carlos de Guatemala
18 SERVICIOS TECNICOS Y PROFESIONALES 0,00
189 Otros estudios y/o servicios 0,00
SOLICITADO En este rubro se cancelaron los servicios de secuenciación del laboratorio de la UCLA
24 PRODUCTOS DE PAPEL, CARTON E IMPRESOS 0,00
241 Papel de escritorio 485,55 200,00 685,55
26 PRODUCTOS QUIMICOS Y CONEXOS 0,00
261 Elementos y compuestos químicos 50.952,51 12.000,00 62.952,51
262 Combustibles y lubricantes 5.000,00 5.000,00
266 Productos medicinales y farmaceuticos 3.650,00 3.650,00
268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc 13.000,00 13.000,00
269 Otros productos químicos y conexos 27.000,00 27.000,00
29 OTROS MATERIALES Y SUMINISTROS 0,00
291 Útiles de oficina 1.000,00 1.000,00
292 Útiles de limpieza y productos sanitarios 446,00 446,00
295 Útiles menores médico-quirúrgicos y de laboratorio 3.560,08 3.560,08
SOLICITADO el monto solicitado servirá para la compra de un juego de micropipetas (hasta 1, 5, 20, 200 y 1000 µl), dos tijeras de disección y dos espátulas de laboratorio
CONTRAPARTIDA el Centro de Estudios del Mar y Acuicultura de la Universidad de San Carlos de Guatemala aportará los útiles menores de oficina necesarios para este proyecto
32 MAQUINARIA Y EQUIPO 0,00
323 Equipo médico-sanitario y de laboratorio 3.000,00 3.000,00
Gastos de Administración 10% 27.279,60 27.279,60
SOLICITADO Este monto servirá para la compra de un termociclador punto final y dos cámaras electroforéticas una horizontal y una vertical
CONTRAPARTIDA El Centro de Estudios del Mar y Acuicultura aportará todos los equipos necesarios para la preparación, extracción y almacenamiento de las muestras, tejidos y material genético
TOTAL 184.019,42 73.100,00
El aporte total recibido de CONCYT asciende a Q.184,019.42. El aporte total de la contraparte asciende a Q.73,100.00. El costo total del proyecto es de Q.257,119.42.
El aporte de CONCYT corresponde al 71.57% del costo total del proyecto, y el aporte de CEMA-USAC al 28.43% restante.
Evaluación de la diversidad genética de las poblaciones de Atractosteus tropicus presentes en la Costa del Pacífico de
02 -- 2009
Nombre del Investigador Principal: M.Sc. Héctor Leonel Carrillo Ovalle
Nombre de la Unidad Ejecutora: Centro de Estudios del Mar y Acuicultura, Universidad de San Carlos de Guatemala