Consideraciones Prácticas en LC/MS y...
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Isidro MasanaQuímico de Aplicaciones6 de Noviembre, 2003
Consideraciones Prácticas en LC/MS y CE/MS
Horario: 15.00 - 16.00 p.m. CETTeléfono: (+34) 902 011.818Coordinador: Dr. Carlos Barceló
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Consideraciones Prácticas en LC/MS y CE/MS
1.- Introdución Técnicas de Ionización a Presión Atmosférica Utilizadas en LC/MS y CE/MS
2.- Consideraciones en la Selección de Eluyentes y Tampones para LC/MS y CE/MS
3.- Características del Espectro de Masas por Ionización a Presión Atmosférica (ESI/APCI/APPI):
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Consideraciones Prácticas en LCMS y CE/MS
1.- Introducción Técnicas de Ionización a Presión Atmosférica Utilizadas en
Las distintas fuentes de ionización son intercambiables entre los Agilent-1100 LC/MS y CE/MS con Cuadrupolo y Trampa de Iones
LC/MS y CE/MS• API-Electrospray• APCI• APPI• Electrospray CE/MS• MALDI (fuente “off-line”)
Muy Rápido Intercambio de Fuentes:
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Aplicabilidad Relativa de las Técnicasde Ionización en LC/MS
API-Electrospray (LC y CE):• La técnica de ionización más suave.• Ideal también para compuestos lábiles.• Interfase con mayor sensibilidad y aplicabilidad.• Válida para compuestos de baja-media a muy
alta polaridad que se puedan ionizar en solución.• Mediante la formación de iones con múltiples
cargas, permite el análisis de compuestos de muy elevado peso molecular.
APCI (LC):• Válida para compuestos de baja a alta polaridad;
no se requiere que estén ionizados en solución.• Requiere compuestos con una cierta volatilidad.• Buena sensibilidad para compuestos de polaridad
y peso molecular intermedios.• Técnica que complementa a API - Electrospray
para el análisis de analitos poco polares.APPI (LC y CE):• Válida para compuestos de muy baja a alta polaridad;
no requiere que estén ionizados en solución.• Requiere compuestos con una cierta volatilidad.• Posibilita el análisis de compuestos apolares.
Las interfases LC/MS tipo A.P.I.: Electrospray /APCI
son hoy en día las más utilizadas
Peso
Mol
ecul
ar
Polaridad del analito/Solubilidad en Agua
API-Electrospray
ParticleBeam
APCI1000
100,000
10,000
Thermospray
no polar muy polar
GC/MS
FAB
APPI
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Diseño Ortogonal de la Fuente de Iones API - Electrospray
EvaporaciónLímite
RayleigAlcanzado
ExplosiónCoulomb Iónes Analito
DesolvatadoEvaporación
+
-
++
-
++
+ ++ +
++
+++
-- -
- -- ++ +
+
+ +++
+++
-- -- --
+
++
+
+ +++
++
+-- -
- --
+
+ +++
+++
-- ---
++++
++
----
+ +++
++ ----
++
++
+
+--
-
-
+++ +
+
+---
-
++++++ -- --
++++++- --
+++
+ + +++
+++
-- -
- -- ++++++
++
+++- -- -- +
++++ +
++
+++
-- -- --
+
+
++
++ ----
+
Iones Desolvatados
+
Gas de secado(nitrógeno calentado)
Entrada Capilar Dieléctrico
Disolvente Nebulizado
Gas de Nebulización (N2)
-4.500 V (End Plate)
en un angulo de 90º con La punta del nebulizador está
respecto a la entrada del
NEBULIZADOR ORTOGONAL
capilar
+++ +
++
+ + + + + + + + + + + + + + +
HPLC
p.e. Vcap: -5,000 V (típico -1500 -6000)
0 V (nebulizador conectado a tierra)muy conveniente para CE/MS
Mesh Assembly: -3500 V(atraerá cargas + a la superficiede la gota)
Ejemplo con Polaridad +
Iones en solución
N2
SECADO
La presencia de sales no volátiles dificultara considerablemente la eficiciencia del proceso de desolvatación
+
+
+
+
+
+
++
+
+
Slide 8Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Proceso APCI (Ionización Química)
Vapor
Formación del gas reactivo cargado
El disolvente vaporizado se ioniza mediante descargas eléctricas producidas por el electrodo/aguja de descarga
Aerosol con el analito
Iones de Analito
Transferencia de carga al analito según su afinidad
protónica para captar ó ceder un protón al gas reactivo (o su afinidad
electronónica)
+
++
+
+
+ +++
+ ++
++
++
++
+
+++
+
++ + +
+
Evaporación
Capilar
EntradaHPLC Nebulizador
Vaporizador(calentador)
Gas de Secado
+ + + ++ +
+
AgujaCorona
fasegasMeOH + e- [MeOH]+ + 2 e-- [MeOH]+ + MeOH [MeOH2]+ + MeO-fase
gas
fasegas
AcN + e- [AcN]+ + 2 e-- [AcN]+ + H2O [AcN-H]+ + OH-gasfase
fasegas
H2O + e- [H2O]+ + 2 e-- [H2O]+ + H2O [H3O]+ + OH-fasegas
[Solv+H]+ + A --> Solv + [A+H]+Proceso APCI +El analito CAPTA
protones del disolventeEmpleados en APCI -
Empleados en APCI +[Solv+H]+
APCI
Entre otros mecanismos:
N2 + e- N2+ + 2 e- N2
+ + Solv [Solv.+H ]+ + N2fasegas
fasegas
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Proceso APPI (Fotoionización)
Capilar MS
Capilar
EntradaHPLC
Nebulizador
Vaporizador(calentador)
hv
Gas deSecado
+ + + ++ +
+
LámparaKripton
Evaporación
Vapor
Se fotoioniza a un Agente Dopante yéste actúa como gas reactivo
Aerosol que contiene al analito
Iones de Analito+
+
++
+
+ +++
+ +
+
++
++
+
++
++
+
+
Fotones ionizan al
analito (con P.I.<10eV) +
+ ++
+
+
++
+
+
hv
hv
APPI
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CE/MS Diseño exclusivo Agilent de la Fuente de Iones API - Electrospray
+++
+ + +++
+++
-- -- -- ++++++
+++
++
-- -- --
+++++++++
++-- -- --
++
+++ ++++++
-- -- -- +
+++
++
----
+++
++
+----
+
++++
+ ----
+
+++--
++
--
+++ +++-
++
EvaporaciónLímite
RayleigAlcanzado
ExplosiónCoulomb Ión AnalitoEvaporación
++ ++--
+
++++ + +
++
+++
-- -- -- ++++++
+++
++
-- -- -- ++++++
+++
++-- -- --
+++
++
+ ----
• Mediante un simple intercambio de nebulizador se conmuta entre LC/MS y CE/MS
• Diseño “Nebulizador Triconcéntrico” con “Cámara de flujo co-axial ”.
• Aguja del Spray conectada a tierra.• Se requiere una bomba para
adicionar el “Liquid Shield”.• El “Liquid Shield” proporciona el
contacto eléctrico para la CE.
Punta del Nebulizador
+++
+++
++++
++
gas de nebulización
+
+
++
+++
+
++ +++++ +
+
+
++
++
+
+
+
++ ++ +
+
+ ++
+
++
++
+ ++
+
+++
+
+
+
+
+
+++++++
CAPILAR ++ + ++ ++
+
Gas de secado(nitrógeno calentado)
Entrada CapilarDieléctrico
DisolventeNebulizado
Gas deNebulización (N 2 )
Iones Electrospray
-5,000 Ven un ángulo de 90º conLa punta del nebulizador está
respecto a la entrada del
NEBULIZADORORTOGONAL
capilar
+++ +
++
+ + + + + + + + + + + + + + +
“Liquid Shield”
“Liquid Shield”
N2
N2
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Ejemplos de Aplicación de la Técnica LC/MSAPI-Electrospray:
SulfonilureasHidratos de CarbonoLSDBenzodiazepinasMorfinasPesticidasPigmentosMicotoxinasPéptidos y proteinasFármacosSalbutamolPenicilinaAminas AromáticasAntidepresivosEsteroides y corticoesteroidesAntocianinas
APCI:CarbamatosHerbicidas: FenilureaPesticidasTriglicéridosAditivos en pláticosExplosivosMicotoxinasFármacosAntioxidantesAzúcaresÁcido SuccínicoCompuestos FenólicosAldehídos / Cetonas*a
Amidas *b
Recordatorio: LC/MS-API no puede detectar analitos que no se ionicen !!
*a APCI: Los compuestos carbonílicos en ocasiones pueden llegar a protonarse. *b APCI: Las amidas e hidroxilos aromáticos perder un protón.
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Criterios Selección Técnica IonizaciónELECTROSPRAY:• Compuestos iónicos, o polímeros/biopolímeros que en disolución
adquieren múltiples cargas (péptidos – proteínas - ...).• Compuestos termolábiles con grupos funcionales ionizables en
disolución, o de los que se pueden obtener sus sales sódicas (ESI-) o sus clorhidratos (ESI+)
• Técnicas que requieran trabajar a nano o microflujosAPCI / APPI:• Compuestos NO termolábiles de media-baja polaridad y que contengan
algún heteroátomo. Moléculas sin grupos funcionales ionizables.• Preferencia por trabajar con fases móviles NO tamponadas • “Necesidad” de trabajar con fases fuertemente tamponadas por
necesidades cromatográficas. (APCI/APPI toleran mayores concentraciones de tampón)
APPI:• Compuestos apolares NO termolábiles y sin heteroátomos
En buena parte de los casos se podrán utilizar las 3 técnicas
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Consideraciones Prácticas en LCMS y CE/MS
2.- Consideraciones en la Selecciónde Eluyentes y Tampones paraLC/MS y CE/MS
• pH• Concentración y Volatilidad del tampón
• Tampones y Disolventes Típicos en LC/MS y CE/MS• Supresión de la Ionización por formación par iónico fuerte• Iones típicos de “Background”• Adaptación de un método de HPLC a LC/MS• ...................
Influencia de:
Consideraciones Varias:
Slide 14Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Consideraciones Electrospray “versus” APCIElectrospray:1.- La sensibilidad depende de la
concentración de analito; por ello admite flujos muy bajos (microbore /CE).
2.- El pH de la fase móvil es crítico. Con gradientes habrá que controlar pH en todos los canales (acidular/basificar también fases orgánicas).
3.- El solvente orgánico de la fase móvil apenas afecta a la ionización.
4.- [Tampón volátil] < 25mM**Concentraciones elevadas pueden dificultar la evaporación/ionización por formación de par iónico
5.- [Tampón no volátil]* <5-10mM*tampón no volátil dificulta la desolvatación/ionización (el fosfato la dificulta menos con polaridad negativa, pero ensucia más el detector).
6.- Fácilmente forma aductos con Na y K- Basta una concentración 25-100µM para una buena
formación de aductos.- Los aductos con NH4 son menos estables.- La formación de aductos dificulta la Fragmentación
APCI (/APPI):1.- La sensibilidad depende de la
CANTIDAD de analito; por ello no convienen flujos muy bajos
2.- El pH de la fase móvil NO es crítico. No requiere del empleo de tampones
3.- El solvente orgánico de la fase móvil afecta mucho a la ionización.Metanol o Acetona (y aún más el agua) mejor que Acetonitrilo
4.- [Tampón volátil] < 100mM
5.- [Tampón no volátil] <5-10mM6.- No forma aductos con Na y K. Si los
puede formar con NH47.- En modo APCI Negativo, se puede
mejorar la sensibilidad mediante la adición al eluyente de 0.5-1% de compuestos clorados* (o el empleo de un 1-2% de oxígeno en el gas de secado/ nebulizado).* Según analito se puede formar el (M+X)- o el (M-H)- .
Slide 15Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Influencia del pH en LC/MS con Electrospray
• Para Óptima Sensibilidad con Electrospray trabajar:pH (básico) > pK + 1 (2) para Ácidos en modo negativopH (ácido) < pK - 1 (2) para Bases en modo positivo
• Para una buena repetibilidad de la respuesta obtenida en Electrospray y de lostiempos de retención será especialmente importante un buen control del pH de la fase móvil, cuando éste sea próximo al pKa (+/-1 (2)) de alguno de los analitos, dada la gran variabilidad en su grado de ionización en esta zona
pH Comp. Básicos Comp. ÁcidospH=pK+2 (pH básico) 1% ionización
10% ionización50% ionización90% ionización99% ionización
99% ionizaciónpH=pK+1 90% ionizaciónpH=pK 50% ionizaciónpH=pK-1 10% ionizaciónpH=pK-2 (pH ácido) 1% ionización
Modo Ión Positivo
H - N R + A+
2
3R
R 1-
AnalitoIonizado
ÁcidoBase
:N R2 + HA
R1
R3
(Analito NOIonizado)
Modo ión NegativoO
BaseÁcidoR C O + H:BO
+-R C OH + :BpH Ácido
pH Básico
(Analito NO Ionizado)
Analito Ionizado
pH Ácido
pH Básico
x100 x100
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Influencia del pH en la Detección de Iones Negativos mediante Electrospray (ESI)
R C OH + :B
100
Compound Class
b-Lactams Aminoglycosides Ivermeitin Tetracyclines Sulfamides
Rel
ativ
eR
espo
nse
pH 7
pH 10
pH 3
1 .5 1.2 1.1 .90
50
pH3 7 10
• Para iones Negativos trabajar a pH básico : pH> pk+1 ó 2 (análisis de ácidos)
pH3 7 10
pH3 7 10
pKa aprox. 5 pKa aprox. 7 pKa aprox.7.5
Modo ión NegativoO
BaseR C O + H:BO
+-Analito
IonizadoÁcido
(Analito NO Ionizado)
pH Ácido
pH Básico
Slide 17Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Comparación entre Tampón Volátil y NO Volátil (ambos a pH 4.6)
Condiciones MS:Ionización: ESIModo: PositivoRango Masa: 100 –200 (m/z )Volt. Capilar: 3.5kV Volt. Fragm.: 100V“Gas secado”: N2 (12.0L/min 350ºC)“Gas Nebulizacióm”: N2 (50psi)
2) 5mM KH2PO4 pH 4.6
1) 5mM AcONH4 pH 4.6
Condiciones HPLC:Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C18
2.1 x 150 mm, 5µmEluyente: 1) 5mM AcONH4 (pH 4.6)/MeOH=80:20
2) 5mM KH2PO4 (pH 4.6)/MeOH=80:20Flujo: 0.2mL/minTemp: 40ºC Volumen iny.: 5µL sol. 10ppm
Los tampones no volátiles dificultan considerablemente el proceso de desolvatación y producen una muy importante pérdida de sensibilidad y robustez del método de LC/MS
Slide 18Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Comparación entre Tampón Volátil y NO Volátil (fosfato a pH 2.5)
Condiciones HPLC:Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C18
2.1 x 150 mm, 5µmEluyente: 1) 5mM AcONH4 (pH 4.6)/MeOH=80:20
2) 5mM KH2PO4 (pH 2.5)/MeOH=80:20Flujo: 0.2mL/minTemp: 40ºC Volumen iny.: 5µL sol. 10ppm
Condiciones MS:Ionización: ESIModo: PositivoRango Masa: 100 –200 (m/z )Volt. Capilar: 3.5kV Volt. Fragm.: 100V“Gas secado”: N2 (12.0L/min 350ºC)“Gas Nebulizacióm”: N2 (50psi)
2) 5mM KH2PO4 pH 2.5
1) 5mM AcONH4 pH 4.6
* En este ejemplo se observa que al reducir el pH del tampón fosfato de 4.6 a 2.5 se mejora algo la respuesta
Slide 19Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Ejemplo de Mejora Sensibilidad en APCINegativo por Adición Solvente Clorado* a la Fase Móvil
m/z150 200 250 300 350 400
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
Abundance 395.
337
7.3
365.
3
335.
3
421.
3
[M+Cl]-
m/z150 200 250 300 350 400
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
Abundance
O
O
OH
OHHO
Con CH2Cl2 Sin Clorado
O
O
OH
OHHO
* Adiciones típicas: 0.5-1% de solvente
clorado
m/z150 200 250 300 350 400 m/z150 200 250 300 350 400
La Prednisolone en APCI(-) en presencia de CH2Cl2*, proporciona un intenso ión [M+Cl]-.
Slide 20Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Consideraciones Prácticas en Electrospray "versus" APCI
• Sensibilidad• Si una muestra puede ser ionizada por ambas técnicas, Electrosprayes normalmente más sensible y da menos ruido de fondo.
• Efectos de la matriz y la fase móvil.• Electrospray es más sensible que APCI al tipo de matriz de la muestra y a la supresión de ionización por exceso de sales en el disolvente.• Electrospray requiere una menor concentración de tamponesvolátiles con respecto a APCI.• La elección del disolvente orgánico afecta fuertemente a la ionización en APCI: el metanol suele dar mejor resultado que el acetonitrilo.
• Flujos de fase móvil• Electrospray también trabaja adecuadamente a flujos bajos (<100 µl/min) y puede ser utilizada en CE/MS mientras que APCI no.• APCI es más sensible y tiene menos ruido que el Electrospray a flujos altos ( >750µl/min).• APPI mediante fotoionización directa puede proporcionar también buena sensibilidad a flujos bajos y utilizarse en CE/MS.
Slide 21Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Disolventes Compatibles con LC/MSAdecuados para ES y APCI
MetanolEtanolPropanolIsopropanolButanolAcetonitriloAguaDMF(1)
DMSO(1)
Ácido Acético Ácido FórmicoAcetonaCH2Cl2CHCl3
Adecuados sólo en APCIToluenoBencenoHidrocarburos (p.e., Hexano)EstireneCCl4CS2Hidrocarburos Ciclicos (p.e., Ciclohexano)
(1) A bajos porcentajes (<10%) en ES
Slide 22Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Descanso - Sesiónde PreguntasNúmero 1
Para preguntar en directo,
Marque 1 en su teléfono
o use la “Chat Box”
“Chat” Público
“Chat” Privado X( sólo lo reciben los moderadores)
Enviar mensaje
Texto Pregunta/Mensaje
Slide 23Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Tampones Típicos para API-ES y APCIModo ión positivo (uso pH < 7.0; <5 preferido)
• Ácido acético (rango pH 3.8-5.8)• Ácido fórmico (rango pH 2.8-4.8)• (Ácido trifluoroacético (TFA) (rango pH 1.5-2.5))
(no recomendable – usar mínima concentración posible de TFA)
Modo ión negativo (pH > 7.0; 9 preferido)• Hidróxido amónico (rango pH 8.2-10.2) (o formiato/ acetato amónico)• Trietilamina (TEA) (rango pH 10.0-12.0) • Dietilamina (DEA) (rango pH 9.5-11.5) • Piperidina (rango pH 10.1-12.1)
Consideraciones Varias:• La adición post-columna de ácido o base permite ajustar el pH si el proceso cromatográfico necesita otro de diferente.
• Los tensoactivos pueden interferir en la evaporación. Los reactivos de par iónico suelen producir un elevado background, si se requieren utilizarlos volátiles como tributilamina (TBA) o ácido heptaflurobutírico (HFBA). La formación de un par iónico fuerte puede suprimir la ionización del analito.
MSD
Bomba
Eluyente
Mta
Columna
Inyector
BombaAuxiliar
AdiciónPost-columna
ConexiónT
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Supresión de la señal al usar TFAModo FIA con CH3-COOH vs. TFA
1.0% CH3-COOH
min
Abundance
10.00 12.00 14.00 16.002.00 4.00 6.00 8.00
50000100000150000200000250000
0.2% TFA
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00
50000100000150000200000250000
min
Abundance
[M+H]+ + [CF3COO]- => [M+H CF3COO] +
La formación de un “fuerte par iónico” suprime la ionización
Convendrá utilizar la mínima cantidad posible de TFA !!!, o.......
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Aumento de la Señal mediante AdiciónPost-Columna cuando se utiliza TFA
1.00 2.00 3.00 4.00 min
Abundance
CON "TFA-Fix"Incremento Señal 30x !!
1.00 2.00 3.00 4.00min
40000
80000
120000
160000
200000
240000
280000
320000
Abundance
40000
80000
120000
160000
200000
240000
280000
320000SIN "TFA-Fix"
Condiciones: 100% agua0.2% TFA
Flujo: 200 µl/min
1(LC):2 Adición post-columna de 75/25 ácido propiónico/ isopropanol El propiónico desplaza al TFA del par iónico, formando un par iónico más débil que se “deshace” en la fuente de iones del MS. Evitándose así la “supresión iónica” producida por el “fuerte par iónico” que forma el TFA.
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Iones más Típicos como ”Background"Iones Modo Procedencia
64 ES + Acetonitrilo + Na102 ES + Trietilamina (se absorbe en teflón y plástico del HPLC)
113 ES - TFA116 ES + ó - Contenedor de calibrante145,147 ES + Acetonitrilo + Cu (proviene del acero del sistema)
149, 391, 419, 413 ES + ó - Ftalatos (contenedores de dtes., N2, filtro de gases...)
331 ES + Polietilén propilenoES - Sellos de las válv.CDS
Para evitar contaminaciones “persistentes” de aditivos utilizados anteriormente, se recomienda reservar un canal (y material de vidrio: botellas – matraces-…) para utilizar con aditivos “problemáticos“ (TEA / aminas / TFA / … ) que queden adsorbidos
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Tampones Típicos para CE/MSTampones
• Ácido acético• Ácido fórmico• Acetato amónico• Formiato amónico• Tampones diluidos
de CE
• Metanol/H2O o Isopropanol/H2O(40 - 70 % orgánico)
• a pH ácido en modo positivo (ácido acético o fórmico al 0.1 - 1 % )
• a pH básico en modo negativo (acetato amónico o amoniaco 1-5 mM)
Soluciones “Liquid Shield”
Se recomienda la utilización de tampones no volátiles dado que éstos no interfieren en el proceso de ES.
Con detección DAD+MS si la ventana del detector queda más próxima a la entrada del capilar que a la salida, se recomienda trabajar a no más de 15-20Kv para evitar que un potencial excesivo en la ventana de detección UV (zona sin recubrimiento de poliamida) facilite “fugas” de corriente y fisure el capilar.
Slide 28Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Adaptación de un Método HPLC a LC/MSELECTROSPRAY
• Sustitución de tampones no volátiles por tampones volátiles• La concentración de tampón volátil deberá ser < 10 mM• Si ha de emplearse tampón no volátil, usar uno donde la parte aniónica o catiónica sea volátil (y a la menor concentración posible)
Fosfato amónico en lugar de fosfato sódico ó potásico• Mejor si la porción no volátil del tampón es ionizable en el modo usado
Fosfato (H2PO4- ) en modo negativo
APCI• Debe emplearse tampón volátil• La concentración de tampón volátil deberá ser < 100 mM• Al no requerir APCI el uso de tampones para controlar la ionización del analito bastantes métodos pueden transferirse directamente
Slide 29Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Selección de Fases Estacionarias según el pH de Fases Móviles Típicas en LC/MS
+++xxxx
Hidróxido AmónicopKa = 9.2
Típicas Fases Móviles en LC/MS
+++++++++Bonus-RP
++++++Extend-C18
++++++++Eclipse XDB
++++++Rx-C18
+++++++++StableBond
Acetato*pKa = 4.8
Formiato*pKa = 3.8
TFAÁcido fuerte
pKa< 2
Fases Estacionarias(Zorbax)
+++
* Usado como ácidos fórmico ó acético o como sus respectivas sales amónicas
+++ : Opción óptima ++ : Opción adecuada x : Opción inadecuada
Slide 30Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Fuentes y Nebulizadores a Utilizar enLC/MS y CE/MS
µ
Nano-Electrospray
Ortogonal
Nano LC 100 µm75 µm50 µm
500 nl/min250 nl/min100 nl/min
Micro LC 1 mm800 µm
40 µl/min20 µl/min
LC Capilar 300 µm180 µm
4 µl/min2 µl/min
LC Estándar 4.6 mm2.1 mm
1000 µl/min200 µl/min
AplicaciónFlujotípicoD.I. Columna
Ganancia Teórica en Sensibilidad
~ 1~ 5
~ 20~ 30
~ 200~ 600
~ 2000~ 3500~ 8500
Elec
tros
pray
Neb
uliz
ador
Sta
ndar
dM
icro
-N
ebul
izad
or
Electroforesis Capilar (CE/MS): Electrospray + nebulizador CE (triconcéntrico)
• En Nano / Cap - LC se pueden inyectar volúmenes “muy grandes” (p.e. 8 µl en nano-LC) mediante configuraciones multi-válvulas.• La Nano-LC interesa cuando se dispone de muy poca de muestra y/o se requiere máxima sensibilidad (p.e. en Proteómica).
x10
x200
Muy utilizadas en ESI
Slide 31Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Consideraciones Prácticas en LCMS y CE/MS
3.- Características del Espectro de Masas por Ionización a Presión Atmosférica (ESI/APCI/APPI)
• Características Generales del Espectro de LC/MS• La Formación de Aductos y Dímeros• Características de Espectros de Iones con Múltiples Cargas
El Espectro de Masas en LC/MS:
Slide 32Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Características Típicas del Espectro en LC/MSH2N S NH
O
O S
NN
CH3
m/z100 150 200 2500
20
40
60
80
100API-ES, Pos, Scan, Frag: 75, "Pos scan"
Max: 120.223271.
0
156.
1
272.
0
293.
0
157.
1
m/z100 150 200 2500
10
20
30
40
50
60 API-ES, Neg, Scan, Frag: 100, "Neg scan" Max: 73.200269.
1
196.
1
270.
0
197.
1
M+H
M+Na
M-HPolaridad Positiva : M+1
Modo iones PositivosH N R + A
Muestra
+2
3R
R 1-
Modo iones Negativos
Polaridad Negativa : M-1
R C O + H:BR C OH + :BO
BaseÁcido Muestra
O+-
Base Ácido
:N R2 + HAR3
R1Distinta
Fragmentación entre + / –
ESI+
ESI-
• Suele presentar poca fragmentación• El pico base suele ser el ión “quasi molecular”• El espectro y proporción entre iones es instrumento-dependiente >> Las bibliotecas se las debe crear el propio usuario
Utilizar en los cálculos Pesos mono-Isotópicos (no los moleculares)Ejemplo Cl = 35 (ó 37 para cálculos isotópicos - no 35.45)
Slide 33Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Calculadora Pesos Moleculares mono-Isotópicos (Software Deconvolución LC/MS con cuadrupolo)
En MS hay que utilizar “Pesos Moleculares Mono-Isotópicos” calculados a partir de la masa el isótopo más abundante (no el que viene en los catálogos/frascos de reactivo)
4) Copiar directamente
en la tabla SIM
2.- Seleccionar el aducto de la lista o teclearlo (número o fórmula)
1.- Teclear Fórmula Molecular
(p.e. CH3-COOH )también C2H4O2
3) Calcular la masa (m/z)
Es sensible a mayúsculas/ minúsculas
Un error en el cálculo de PMevitaría la detección del analito
cuando se trabaja en SIM
Teclear ShowMW en la línea de comandos
Alternativa – teclear directamente p.e.: PRINT MW ("CH2Cl2") (Es sensible a mayúsculas/ minúsculas)
Slide 34Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Ejemplos Espectros LC/MS (AP-ESI / APCI)
M+3 = 1/3 (M+1) >> Existencia de 1 Cl
Ión con doble carga
• Representaciones en forma “diagrama barras”• Representación espectro “completo”
Siduron
VENTAJAS MÍNIMA FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO LC/MS:
• Mayor Selectividad
• Mayor Sensibilidad
INCONVENIENTES:
• Menor información estructural*
* En LC/MS aumentando suficientemente el Voltaje del Fragmentador (voltaje a la salida del capilar) se puede aumentar la fragmentación en los espectros para obtener mayor información estructural, aunque la mejor alternativa es la utilización de sistemas de LC/MSn
• Los espectros en LC/MS suelen presentar poca fragmentación
• Las proporciones de los iones a A, A+2, A+4,... Permite reconocer la presencia de ciertos elementos
Slide 35Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Br2 Cl2
Br3 ClBr2 Cl2
Cl4Br4 Si4 S4 BrCl3
Br Cl
Cl3Br3 Si3
Si2
Si S
S2
S3
BrCl
33%
65%
11%
5%3%
10%7%0.4
98%
77%
49%
11%1%
3%
32%
98%
15%11%
1%
20%15%
2%1% 3%22%
2%
2%13%
51%65%
18%
2%
38%
89%
32%
4%
2%9%
1%4.4%
77%
24%
26%
85%
49%
8%
98%
51% 49%
34% 32%
17%
68%65%
16%
A+X: +0 +2 +4 +6 +8
M = impar
nº impar de N
M = par
no existe N o existe un nº par de N
nº C ~ %(A+1)* / 1.11
Contribución C13
* %(A+1) = % de abundancia de la señal correspondiente al C13 (A+1)
con respecto a la del C12 (A). A+X: +0 +2 +4
+1 +3A+X:+0 +2 +4
+1 +3
Pérfiles y Proporciones Isótopos (A+2 )
A+X: +0 +2 +4 +6 +8A+X: +0 +2 +4 +6 +8 10x C -> A+1= 11.1% de A
Slide 36Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Formación de Aductos en LC/MS• Na+, K+, NH4+, pueden competir con los H+ en la ionización del analito. • En Electrospray +: en presencia pequeñas concentraciones*a de sales Na+ (K+ / NH4
+) se observan muy habitualmente los aductos M+23 (M+39 / M+18). Estos NO se observan en polaridad negativa. En caso de duda (p.e. análisis de trazas) la adición de Na+ y K+ puede ayudar a confirmar el M. Incluso en algunas ocasiones pueden facilitar su ionización: algunas moléculas neutras con tendencia a formar puentes de hidrógeno (p.e. Mentol y carbohidratos) se pueden conseguir ionizar mediante la formación de aductos con NH4+ y metales alcalinos (probar AcNH4 o AcNa como tampón).
• En APCI+: Se pueden formar aductos con NH4+, pero NO con Na+ o K+.
• En APCI-: se pueden formar en ocasiones aductos con compuestos halogenados si el eluyente contiene algún disolvente halogenado (basta un pequeño porcentaje).• En modo Negativo (ESI y APCI) puede adicionarse un anión procedente del eluyente: M + A- => [M+A]-
A-: Carboxilato (AcO-, HCOO-, TFA-), Haluro (Cl-,I-,,...)• En instrumentos que no desolvaten perfectamente al analito se puede observar la formación de aductos con disolvente. (p.e. acetonitrilo - por formación puentes hidrógeno) (no con LC/MSD serie 1100 Agilent) .
*a Bastan niveles µM de Na, K o NH4 para poder obtener aductos.
Aducto con NH4+
APCI+
NH4 presente en eluyente
300 400 500 600 700 800 900 1000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
110000
m/z-->
Abundancia
603639
903
987
<- [M+NH4+ ]
Trioleina (C18:1,[cis]-9) M 884.781 C57H104O6
Slide 37Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Ejemplos Formación Aductos LC/MS:Espectros Aflatoxinas (ESI+) y Saponina (ESI-)
ADUCTO ESI- con TFA-ADUCTOS ESI+ con Na+
• Muestra analizada por ESI(-) mediante infusión de una disolución que contiene TFA (ácido trifluoroacético)
Aductos por la presencia de Na+ en eluyentePérdidas agua (-18)
120 160 200 240 280 320
285
Aflatoxina B1
335
313[M+H]+
O
OCH3OO
O
O50
90
[M+Na]+
120 160 200 240 280 320 360
50
90
329[M+H]+
243 283
Aflatoxina G1
351
311[M-OH]+
OO
O O
O O
OCH3[M+Na]+
331[M+H]+
120 160 200 240 280 320 360
50
90 Aflatoxina G2
353[M+Na]+
313[M-OH]+
OO
O OO O
OCH3
-18+22
120 160 200 240 280 320
50
90
287
Aflatoxina B2
O
OCH3OO
O
O
315
337[M+Na]+
[M+H]+
MS/MS con Trampa IonesMS2 (1363)
m/z20
60
100
-TFAH (-114)
1363
1249
1087
250 500 750 1000 1250
-Glc
(M + TFA)--
(M + TFA)--
(M -1)--
MS
20
60
100 1363COO-Glc
Rha Glc GlcGlc
O
(M-H)-
Saponina ESI(-)M=1250
M (CF3-COOH) = 114
Slide 38Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Ejemplo de Detección de Dímeros con Electrospray
• Algunas moléculas pueden agregarse en solución dando nM+H+ (pueden provenir de la disolución inyectada o formarse en la fuente cuando el analito está a elevadas concentraciones).• La mayor energía del proceso de ionización por APCI suele disgregar/evitar la formación de agregaciones en la fuente
DIMEROS Siduron
Siduron
APCI
ESI
• La mayor suavidad del proceso de ionización
por ESI facilita la detección de agregados
Slide 39Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Espectros de Iones con Múltiples Cargas
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
12000
10000
8000
6000
40002000
Abun
dan c
eAb
u nda
nce
18000160001400012000100008000600040002000
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
800
600
400
200
Abun
d anc
e
pH 2.5
pH 6
pH 12
Ejemplo de Iones + con Múltiples cargas
+14
+13
+12
+11
+10+9+15
+14
+13
+12+11
+10
+9
+15+8
m/z: (14.306+11)/11= 1302
• Moléculas de gran tamaño, p.e. péptidos y proteínas, suelen proporcionar en ESI iones con Múltiples Cargas respuesta a múltiples relaciones m/z (masa/carga)
• Con moléculas amfotéricas (moléculas con grupos ácidos y básicos - p.e. Péptidos y Proteínas) si pH = pI (pto. Isoeléctrico) => molécula globalmente será neutra:
• El perfil del espectro de iones con múltiples cargas variará en función del pH de la fase móvil.
+
+
+
+-
-
-
-
pH < pI pH = pI pH > pICarga: positiva neutra negativa
Espectro MS (ESI+) de LISOZIMA proteína M=14.306
Slide 40Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Reconocimiento de Iones con Múltiples Cargas
m/z
[M+2H]2+
644 646 648 650 652 654
20
40
60
80
100 648.92
649.40
649.89
∆=0.48
Iones con 2 cargas: ∆m/z = 0.5
Con Trampa Iones∆=0.48
790 795 800 805 810 815 8200.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 807.00
807.50
807.92
808.60
m/z
Intens.x106
Con Cuadrupolo
[M+2H]2+
∆=0.50
∆=0.42
Iones con 2 cargas: ∆m/z =0.5
• Los sistemas con Trampa de Iones proporcionan mayor resolución y selectividad espectral que los sistemas con cuadrupolo
100
1294 1296 1298 1300 1302 1304
20
40
60
80
1297.29
1298.28
1299.26
[M+H]+
m/z
∆=0.99
% A
bund
anci
a R
elat
iva
∆=0.98
Iones con 1 carga: ∆m/z = 1.0• En Iones con 1 sola carga la diferencia entre las señales correspondientes a C12 y C13 es de ∆m/z = 1.• En iones con múltiples cargas la diferencias serán:
∆m/z = 1 /z (nº cargas) • Por consiguiente:
∆m/z = 1.0 1 carga ∆m/z = 0.5 2 cargas∆m/z = 0.33 3 cargas ∆m/z = 0.25 4 cargas
• Para reconocimiento del nº de cargas se recomienda guardar el espectro de masas en modo completo
Con Trampa Iones
TRAP: Angiotensina I Humana: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu PM 1296
Slide 41Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Espectros de Iones con Múltiples Cargas
DECONVOLUCION ESPECTROS
• Proceso matemático de localización de series de señales en un espectro de masas que correspondan al mismo peso molecular:
M = (m/z).z - z.(H+) m/z=[M+z(H+)]/z
• La deconvolución de espectros de masas de ESI de iones con múltiples cargas permitirá la determinación de Pesos Moleculares de grandes moléculas con gran exactitud (hasta 0.02%)
Obtenido con Trampa de Iones - estas
diferencias son ya muy difíciles de
apreciar en sistemas con cuadrupolo
% A
bund
anci
a R
elat
iva
428 430 432 434 436 438
20
40
60
80
100 432.82
433.18
433.51
[M+3H]3+
m/z
Iones con 3 cargas: ∆m/z = 0.33
∆=0.36
∆=0.33
Iones con 4 cargas: ∆m/z = 0.25100
323 324 325 326 327 328
20
40
60
80
324.85
325.10
[M+4H]4+
325.36
m/z
∆=0.26
∆=0.25
m/z600 800 1000 1200 1400
0
20
40
60
80
100
*MSD1 SPC, time=4.664:4.817 of MSDEMO\PROT_FIA.D API-ES, Pos, Scan, Frag: 120
Max: 87866
893.
1
848.
5
942.
6
998.
1
808.
0
1060
.5
1131
.0
771.
5
738.
2
622.
0
921.
9
1211
.8
1304
.8
637.
2
754.
3
694.
0
947.
0
1413
.6
600 800 1000 1200 14000
1000020000300004000050000600007000080000
A:2
4 A:2
3A
:22 A
:21 A
:20
A:1
9A
:18
A:1
7A
:16
A:1
5
A:1
4
A:1
3
A:1
2
Espectro MioglobinaMcalculado = 16.950
nº cargas calculado
Con Trampa Iones
Slide 42Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Sesión Final dePreguntas
Para preguntar en directo,
Marque 1 en su teléfono
o use la “Chat Box”
“Chat” Público
“Chat” Privado X( sólo lo reciben los moderadores)
Enviar mensaje
Texto Pregunta/Mensaje
Slide 43Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Algunas Direcciones Web de Utilidad>> Acceso a la página web para búsqueda y visualización de Notas de Aplicación y otras publicaciones de Agilent Technologies:
http://www.chem.agilent.com/scripts/LiteratureSearch.asp
>> Acceso web para inscripción a los Agilent "e-seminars" (gratuita)*, bastará conectarse a la dirección de internet:
http://webshop.chem.agilent.com* En el período Septiembre-Noviembre 2003 se han programado 10 “e-seminars” en Español sobre HPLC - DAD - LC/MS - GC - GC/MS - CE/MS - CE y Validación de Métodos Analíticos (éste último está previsto a mediados de Noviembre)
>> Acceso web del grupo de análisis químico de Agilent Technologies:
http://www.chem.agilent.com
>> Acceso web española de Agilent Technologies que permite acceso directo información por técnicas analíticas y productos: HPLC, LC/MS, GC, GC/MS, Electroforesis Capilar, UV/VIS,Columnas y accesorios,.....
http://www.chem.agilent.com/scripts/cHome.asp?country=ES
Slide 44Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
ANEXOS VARIOS
• Programa MS TOUR (diciembre 2003)• Parámetros Típicos de Trabajo• Orden Recomendado de Optimización de Parámetros
Slide 45Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
MS TOUR, Diciembre 2003 – Programa:• Nuevo 5973 inerte para análisis de compuestos activos por GC/MS• Nuevas Columnas Inertes para GC/MS y la Importancia de la Inercia en el Análisis de Trazas• Trap XCT• Evaluación de “Unknowns” por LC/MS con Analizadores de Tiempo de Vuelo y Trampa de Iones• Nuevo Agilent LC/MS TOF • Mejoras en el LC/MS de un Cuadrupolo • LC Preparativa – Preparación de Muestras por GPC• Selección de Columnas y Condiciones para LC/MSHorario: 9:30 – 16:00h. (solicite formulario de inscripción en el teléfono: 901.11.6890)
Lugar: Barcelona, 3 diciembre 2003: World Trade CenterMadrid, 4 diciembre 2003: Casino Gran Madrid Torrelodones
Presentadores: • Dr. Amadeo Rguez. Fernández-Alba (Responsable Servicio Espectrometría Masas - Universidad Almería)• Pedro Arranz / Bernhard Wuest / Mitch Hastings / Andre Dams (Agilent Technologies)
Slide 46Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Parámetros Típicos de Trabajo (I)"Drying Gas Flow" (mantener siempre un mínimo de 3 l/min)
Electrospray: Flujo HPLC (µl/min) Flujo Gas secado (l/min)<100 7100-300 10>300 13
APCI: 0-1500 típico 4 (rango habitual 3-5)
"Nebulizer Pressure":(Con eluyentes muy acuosos puede convenir incrementar ligeramente los valores indicados)
Electrospray: Flujo HPLC (µl/min) Presión Nebulizador (psi.)<50 1050-300 20300-600 30600-800 40800-1000 50>1000 60
APCI: 0-1500 60
(Durante el autosintonizado se recomienda una presión de nebulizador de 10 psi)
• Los parámetros aquí indicados se refieren a modelos LC/MS Agilent 1100 (tanto con cudrupolo como con Trampa de Iones). Otros equipos pueden requerir valores diferentes.
• En algunos equipos NO Agilent, dependiendo del flujo se deberá cambiar manualmente la posición del nebulizador.
Slide 47Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Parámetros Típicos de Trabajo (II)"Drying Gas Temperature" : típico 325ºC
Se puede reducir para compuestos termolábiles o eluyentes muy volátiles
"Vaporizer Temperature" (sólo APCI): típico 350ºC rango habitual: 300-400ºCSe puede incrementar para flujos y porcentajes acuosos elevados o reducir para compuestos termolábiles
"Capillary Voltage": Modo Positivo (V) Modo Negativo (V)
Electrospray (ESI): típico 3000 (rango habitual 1500-6000) típico 2500 (rango habitual 1500-3000)APCI/APPI*: 3000 (*1500 appi con dopante acetona o tolueno) 3000
- Para la mayoría de compuestos voltajes en el rango 2500-5000 volts apenas afectan a la respuesta. - Para moléculas de elevado peso molecular, como proteínas, valores en el rango 5000-6000 volts ó 3000-4000
volts para péptidos suelen proporcionar una mejor respuesta con ESI+.- En ESI(-) un voltaje excesivo puede producir "descargas corona" (chispas azules y repentino incremento “chamber current”)
"Corona Current" (sólo APCI): Modo Positivo (µA) Modo Negativo (µA)
típico 4 (rango habitual 4-6) típico 25 (hab.25-40) (4 para sintonizado)- En modo negativo y en presencia de compuestos electronegativos (en eluyente o gases de secado/
nebulización) la corriente óptima es mucho más baja (proporciona menor ruído y mayor sensibilidad).- La adición en APCI (-) de un 0.5-1% de cloroformo al eluyente o de un 1-2% de oxígeno* en el gas de
secado/nebulizado puede proporcionar una mejor sensibilidad (comp. electronegativos --> menor corrientecorona). * No sobrepasar el 2% de oxígeno, con los disolventes en APCI podría producir una atmósfera potencialmente explosiva.
Slide 48Marque (+34) 902 011.818 para recibir el sonido. Coordinador: Carlos Barceló
Orden Recomendado para la Optimización Parámetros de TrabajoDependientes de Flujo y Composición Eluyente (Q+Trap):1.- Presión Nebulizador2.- Temperatura del Gas de Secado /+Vaporizador (APCI)3.- Voltaje del Capilar4.- Flujo del Gas de secadoDependiente del Analito (parámetros importantes a optimizar) :5.- Vfrag (Q)/“Compound Stability” (Skimmer+Cap Exit en Trampa de iones)
- Es independiente del modo y condiciones de ionización (ES o APCI) empleado.- La fragmentación se incrementa al aumentar el voltaje del fragmentador (Q)/ “compound stability” (Trap)/.
6.- sólo en MS/MS/…(con Trap) : “Frag. Ampl.”- Afecta a la energía utilizada para fragmentar al ión precursor. Valores excesivamente bajos no fragmentarán al ión precursor, valores excesivamente altos expulsarán de la trampa al ión precursor y a los iones “hijo” obtenidos.
7.- sólo en MS/MS/… : “Frag. CutOff”- Define la masa mínima de los iones “hijo” obtenidos que son capaces de permanecer en la trampa y afecta considerablemente a la eficiencia en el atrapado de los iones obtenidos. Los valores óptimos típicos suelen rondar alrededor del 27% de la m/z del ión precursor seleccionado.
Para disponer de una óptima sensibilidad la optimización manual o semi-automática de todos estos parámetros “compuesto-dependientes” es importante para la óptima eficiencia de todo el proceso.
EXC
LUSI
VOS
TRA
MPA
IO
NES
EN
MO
DO
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CO
MU
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CU
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POLO
Y TR
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NES
TRAMPA IONES
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Cierre / Conclusiones Finales “e-Seminar”
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