Construcción Curva de Calibrado
3
Construcción curva de calibrado de células – Peso seco Para la curva de calibrado de peso seco, se debe realizar haciendo una correlación con la turbidimetría, es decir, se realiza la turbidimetría, y con ésta misma muestra se realiza la determinación de peso seco. Así se obtiene una gráfica que relaciona el peso seco con la turbidimetría, dando una idea de lo que se debería obtener en el cultivo de E. coli. Turbidimetría: El método de turbidimetría se utiliza para la determinación de la biomasa celular y se caracteriza por ser rápido y útil. Se basa en que cuando un haz de luz paralelo golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida, la turbidimetría cuantifica la luz residual transmitida mediante el uso de un espectrofotómetro. La turbidimetría se realiza usualmente en la región de 600 a 700 nm donde la absorción de luz por parte de las células es mínima. En un espectrofotómetro la linealidad de los datos obtenidos se mantiene entre las 0.2 a 1.0 unidades de absorbancia (1 unidad de absorbancia ≈ 0.5 g L-1 de célula). Sin embargo, esta relación debe ser confirmada para cada experimento por cuando depende del color del caldo y del tamaño y forma de las células. La conversión de unidades de absorbancia a masa de ulula seca debe ser tratada con cuidado. Al respecto, estudios teóricos y experimentales han demostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de microorganismos, independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir que en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes para células microbianas de distintos tamaños. Por esta razón, para estimar la biomasa de microorganismos totales en una suspensión se debe realizarse una "curva de calibración" para cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar la absorbancia con la biomasa de microorganismos totales. (BRIAN MCNEIL, 2008) Determinación de la concentración de sustrato Para esta experiencia se utilizará el método del DNS, el cual se basa en la reacción del reactivo DNS (Dinitrosalicílico) con azúcares reductores, lo que resulta en la formación de un compuesto de color amarillo cuya densidad óptica es proporcional a la concentración de grupos reductores. (Instituto Vasco De Investigacion Y Desarrollo Rural, 2008) (Universidad de Valencia, 2006) Preparación del reactivo DNS Disolver 4 g de NaOH en 125 mL de agua destilada en un vaso de precipitado de 500mL. Adicionar 75 g de tartrato de sodio y potasio.
description
curva de calibradp
Transcript of Construcción Curva de Calibrado
Construcción curva de calibrado de células – Peso secoPara la curva de calibrado de peso seco, se debe realizar haciendo una correlación con la turbidimetría, es decir, se realiza la turbidimetría, y con ésta misma muestra se realiza la determinación de peso seco. Así se obtiene una gráfica que relaciona el peso seco con la turbidimetría, dando una idea de lo que se debería obtener en el cultivo de E. coli.
Turbidimetría:El método de turbidimetría se utiliza para la determinación de la biomasa celular y se caracteriza por ser rápido y útil. Se basa en que cuando un haz de luz paralelo golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida, la turbidimetría cuantifica la luz residual transmitida mediante el uso de un espectrofotómetro. La turbidimetría se realiza usualmente en la región de 600 a 700 nm donde la absorción de luz por parte de las células es mínima. En un espectrofotómetro la linealidad de los datos obtenidos se mantiene entre las 0.2 a 1.0 unidades de absorbancia (1 unidad de absorbancia ≈ 0.5 g L-1 de célula). Sin embargo, esta relación debe ser confirmada para cada experimento por cuando depende del color del caldo y del tamaño y forma de las células. La conversión de unidades de absorbancia a masa de ulula seca debe ser tratada con cuidado. Al respecto, estudios teóricos y experimentales han demostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de microorganismos, independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir que en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes para células microbianas de distintos tamaños. Por esta razón, para estimar la biomasa de microorganismos totales en una suspensión se debe realizarse una "curva de calibración" para cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar la absorbancia con la biomasa de microorganismos totales. (BRIAN MCNEIL, 2008)
Determinación de la concentración de sustratoPara esta experiencia se utilizará el método del DNS, el cual se basa en la reacción del reactivo DNS (Dinitrosalicílico) con azúcares reductores, lo que resulta en la formación de un compuesto de color amarillo cuya densidad óptica es proporcional a la concentración de grupos reductores. (Instituto Vasco De Investigacion Y Desarrollo Rural, 2008) (Universidad de Valencia, 2006)
Preparación del reactivo DNS Disolver 4 g de NaOH en 125 mL de agua destilada en un vaso de precipitado de
500mL. Adicionar 75 g de tartrato de sodio y potasio. Agregar lentamente 2.5 g de ácido Dinitrosalicílico, agitando bajo calentamiento. Aforar a 250 mL con agua destilada. Almacenar a temperatura ambiente protegido de la luz.
Determinación de la concentración de azucares: Agregar 1 mL de reactivo DNS a una muestra de volumen conocido en un tubo de ensayo
con tapa. Llevar a baño con agua en ebullición durante 5 min. Enfriar rápidamente en un baño de hielo. Agregar 10 mL de agua destilada y dejar reposar por 15 min. Leer la densidad óptica a 540 nm, contra un blanco de 1 mL de agua destilada.
Construcción de Curva de Calibrado DNSSe realizaran diluciones seriadas de glucosa tomando en un tubo de ensayo tomando primero un blanco de 0 ml de glucosa y 10 de agua destilada, luego, 1 ml de Energética y 9 de agua destilada hasta llegar a un tubo con solo 10 ml de Energética. (Las diluciones pueden variar según la concentración inicial de azucares en la Bebida Energética, la cual se determinara en un inicio) Reactivos
Medio LB NaOH Tartrato de sodio y potasio Ácido Dinitrosalicílico Glucosa KH2PO4
Na2HPO4 anhidro
- Agua destilada- Hielo
Materiales 3 vasos de precipitado de 500 mL. 1 matraz Erlenmeyer 500ml 1 matraz aforo 100 ml 3 matraz aforo 500 ml Petris o capsula (para peso-seco) Pipetas (1ml, 5 ml, 10ml) Pro-pipetas Papel filtro (para peso-seco) Espátula Papel aluminio Maskin tape PLASTICO PARA SELLAR, NO ME ACUERDO EL NOMBRE
Equipo- Agitador magnético y temperatura- Balanza analítica- Espectrofotómetro (con cubetas)- Estufa de incubación (para peso-seco)- Autoclave- Reactor-
