Preparación de una muestra fija de bacterias para tinción’ y ‘Tinción simple con colorantes básicos’
consumen como cannabinoides sintéticos alquilindazoles y ... · Métodos Ensayo de electroforesis...
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Propiedades genotóxicas de representantes de alquilindazoles y aminoalquil-indoles que se consumen como cannabinoides sintéticos
Integrantes:Blas Rosales Violeta BelemLuna Barba Alexander KevinMedina Ramirez Marco AntonioMiguel Nava Alexa Fernanda
Introducción
● Los canabinoides sinteticos (SC) se comercializan como un sustituto de la marihuana.
● En 2004, los primeros compuestos de "Spice" se vendieron en mezclas de hierbas como un sustituto de la marihuana.
● Se investigaron las propiedades genotoxicas de 4 CS.
● Los diferentes fármacos se probaron en ensayos SCGE (ensayos de cometas) con linfocitos humanos.
Cannabinoides sintéticos ● Los cannabinoides sintéticos forman parte de un grupo de
drogas llamadas nuevas sustancias psicoactivas (new
psychoactive substances, NPS).
● actúan sobre los mismos receptores de las células del
cerebro que el THC (delta-9-tetrahidrocannabinol), el
ingrediente psicoactivo de la marihuana.
● Estas sustancias se rocían sobre la materia seca y triturada
de una planta o se vaporizan.
Cannabinoides sintéticos
Ensayo Cometa
Ensayo de salmonella
typhimurium
Ensayo de MN
Pruebas a realizar...
linfocitos humanos
SCGE en linfocitos humanos
Materiales
● Compuestos de prueba utilizados
AM-2201 ; UR-144; 5F-AKB-48; AM-2201-IC
● Aislamiento de linfocitos humanos
Sangre periférica de cuatro voluntarios sanos, no fumadores (edad 25-32, peso corporal 80,6 ± 11,2, IMC 25,1 ± 2,9) sin antecedentes de enfermedad reciente o exposición a agentes químicos tóxicos.
Métodos ● Ensayo de electroforesis en gel de células individuales
(SCGE)
5
Tinción y
análisis
Tinción de porta
objetos con yo
duro de
propidio. Porce
ntaje de ADN medido
mediante siste
ma de análisis
de imágenes.
4
Lisis,
tratamiento alca
lino y
electroforesis
Frotis, lis
is en osc
uridad a 4°C
. 30 m
inutos de
reposo en pH>1
3 y electr
oforesis.
3
Incubació
n, centri
fugación y
determinació
n de vitalid
ad
Incubació
n en oscurid
ad durante 3 horas.
Lavado co
n RPMI 1640 y
centrif
ugación.
Determinació
n de vitalid
ad con azu
l tripán.
Tratamiento con ca
nnabinoides
sintétic
os
Se trataron co
n distintas c
oncentra
ciones d
e
CS (50-500 uM). H
2O2 como co
ntrol p
ositivo
.
21
Preparación y
recuento de lin
focitos
LDescongelació
n y ce
ntrifugació
n de
linfocit
os. Vita
lidad determ
inada con
azul tr
ipán y recu
ento con cá
mara
Neubauer.
● Ensayo de micronúcleos con bloqueo de citocinesis (CBMN) con linfocitos humanos
Preparación de linfocitos
Se añadieron linfocitos RPMI 1640 con solución de PHA. Los cultivos se establecieron en viales duplicados y se incubaron a 37 ° C.
Tratamiento con cannabinoides
Los medios se reemplazaron por medios frescos que contenían diferentes concentraciones de los fármacos (25.0, 50.0, 75.0, 100.0 y 150.0 μM). El tratamiento se realizó durante 3 horas.
Lavado, resuspensión y adición de citocalasina-B
Después del tratamiento, las células se lavaron dos veces con RPMI 1640 y los sedimentos se resuspendieron en medio de cultivo. Se añadió citocalasina-B a los cultivos.
Puntos finales
Se puntuaron diferentes puntos finales, a saber, células mononucleadas, binucleadas (BN) y multinucleadas, así como las tasas de micronúcleos (MN) brotes nucleares (Nbuds) y puentes nucleoplásmicos (NPB)
Secado, fijación y tinción
Después de secarse, las células se fijaron y se tiñeron con Diff Quick.
05
01
02 03
04
● Ensayos de Salmonella typhimurium
1
Los compuesto
s se analiz
aron con el
ensayo
de Ames
2
Se utiliza
ron cepas T
A98 de S.
typhim
urium, T
A100, TA1535 y
TA1537.
TA100 y TA1535 detecta
n susti
tuciones d
e
pares de base
s, mientra
s que TA98 y
TA1537 son se
nsibles
a mutágenos que
provoca
n cambios e
n el marco
3
Dosis utili
zadas
ResultadosEnsayos SCGE
Ensayo SCGE
≥
Ensayos de CBMN
≥
Continuación
Discusión
● Los representantes de ambos grupos causan la inducción de MN en linfocitos humanos.
● Las actividades genotóxicas de los diferentes CS fueron similares y en el mismo rango que las observadas con otros CS en células derivadas de humanos.
En particular, UR144 fue notablemente más activo en los experimentos de SCGE y también en ensayos de MN que AM-2201. Ambos compuestos están estrechamente relacionados estructuralmente y las diferencias pueden deberse al hecho de que el último compuesto lleva un sustituyente naftaleno en lugar de un grupo ciclopropilo.
Se encontró en un experimento preliminar que la adición de homogeneizado de enzimas hepáticas no aumenta los efectos genotóxicos de los CS en los linfocitos, pero causa una disminución en la formación del cometa.
Se realizó una observación similar con SC CP-47,497-C8 y con albúmina sérica bovina ,por tanto, se postuló que la reducción de la actividad genotóxica después de la adición de homogenaizado hepático se debe a efectos vinculantes de proteínas.
Se sabe que las tasas de MN en linfocitos son un biomarcador válido para aumentar los riesgos de cáncer en humanos , pero es poco probable que las concentraciones plasmáticas de CS en usuarios alcancen niveles suficientemente altos como para causar efectos en las células sanguíneas.
Conclusiones ● Se obtuvieron resultados negativos en pruebas de mutagenicidad bacteriana.
● Los estudios de biomonitoreo humano demuestran que la exposición laboral crónica a los humos de los CS y las predisposiciones individuales (por ejemplo, debido a mecanismos de reparación del ADN y desintoxicación deteriorados) pueden causar un aumento de los efectos adversos para la salud.
Bibliografia
● Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas; Institutos Nacionales de la Salud;
Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos.