COORDINADORA CIENTIFICA DE REPRODUCCION HUMANA SEF02... · 136 24 Congreso Nacional SEF REVISTA...

INTRODUCCIÓN

Mutaciones menos severas del gen CFTR han si-do asociadas, además de con la conocida ausenciaunilateral o bilateral del conducto deferente, conotras alteraciones del aparato reproductor masculino.Estas incluyen alteraciones testiculares y una reduc-ción en la cantidad y calidad de las células germina-les en el epitelio de los túbulos seminíferos (1-4).Evidencia reciente sugiere que mutaciones del genCFTR podrían ser una causa importante de infertili-dad masculina. Van der Ven et al., han encontradoque un 17,5% de pacientes de infertilidad masculinacon una disminución en la calidad espermática y un14,3% de pacientes con azoospermia podrían tener almenos una mutación en el gen CFTR (5). Estos auto-res encontraron que la frecuencia de mutaciones delgen CFTR en pacientes de infertilidad masculina fuémuy superior a la encontrada en una muestra aleato-ria de la población local donde se realizó el estudio.No se encontraron mutaciones del gen CFTR en elgrupo control con parámetros de semen normales (5).Estos resultados sugieren que el CFTR podría estarinvolucrado en la regulación de la espermatogénesisy espermiogénesis, además de en el desarrollo delconducto deferente.

La expresión de CFTR ha sido identificada enbiopsias de testículo (6), en espermátidas redondas(7, 8) y en células de Sertoli (7, 9). Más recientemen-te, la presencia de CFTR ha sido detectada en la zonapostacrosómica y el flagelo de espermatozoides hu-manos maduros por técnicas inmunocitoquímicas(10). La presencia de CFTR (un canal de cloro acti-

El ácido docosahexaenoico corrige un defecto lipídico en células germina-les y esperma del epidídimo y aumenta la producción de esperma en rato-nes cftr -/-

G. Álvarez J1,2, Ollero M1, D. Freedman S3.

1Unidad de la Mujer, USP-Hospital Santa Teresa, La Coruña

Departamentos de 2Obstetricia y Ginecología y 3Medicina, Beth Israel Deaconess MedicalCenter. Harvard Medical School, Boston, MA

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R E V I S T A I B E R O A M E R I C A N A D E

COORDINADORA CIENTIF ICA DE REPRODUCCION H U M A N APonencia

vado por cAMP) en espermatozoides maduros sugie-re que la conductancia del cloro regulada por elcAMP podría jugar un papel específico en la funcióndel espermatozoide. Esta hipótesis está apoyada porhallazgos recientes que demuestran la presencia dereceptores de neurotransmisores relacionados con ca-nales del cloro en espermatozoides humanos y de ra-tón en relación a la reacción acrosómica (11, 12).

Nuestro grupo ha demostrado la presencia de undefecto lipídico de membrana en ratones cftr -/- ca-racterizado por una marcada disminución en ácidodocosahexaenoico (DHA) y un aumento en ácidosgrasos de la serie n-6 (13). Este defecto está presentede forma específica en células reguladas por CFTR,incluyendo páncreas e íleum. La corrección de estedefecto, tras la administración oral de DHA, reviertela patología que se observa en estos ratones (13).Este defecto lipídico, que es corregible en ratones cftr-/-, también se encuentra en biopsias nasales de pa-cientes con fibrosis quística.

Recientemente se ha demostrado la biosíntesis deDHA en el epitelio de los túbulos seminíferos y lapresencia de un contenido relativamente elevado deDHA en espermátidas redondas de ratones wild-type(14). Esto sugiere que el DHA de membrana en es-permátidas redondas podría jugar un papel importan-te en la regulación de la espermatogénesis. Estudiosprevios realizados en nuestro laboratorio indican quese puede modificar de forma significativa la concen-tración de ácidos grasos de membrana en células ger-minales y espermatozoides del epidídimo modifican-do la concentración de estos ácidos grasos en la dieta(15), confirmando los resultados obtenidos en otrasespecies animales (16).

La importancia de este estudio radica en el hechode que una disfunción del canal CFTR en células deSertoli o en células germinales podría conducir a alte-raciones en la maduración espermática y de la fun-ción del espermatozoide. Como ya se ha sugerido enotros modelos de células reguladas por CFTR, la dis-función del CFTR podría resultar en una alteración enla biosíntesis y/o transporte de DHA, una disminu-ción en su contenido de membrana y en una altera-ción de la función celular. Si el mismo defecto, quees corregible en páncreas e íleum de ratones cftr -/-(ambos regulados por CFTR), también estuviese pre-sente en testículo de hombres con mutaciones del genCFTR, la corrección de este defecto en estos pacien-tes, tras la administración oral de DHA, podría poten-cialmente utilizarse en el tratamiento de la infertili-dad masculina no obstructiva. La recienteidentificación de CFTR en espermatozoides madurospor métodos inmunocitoquímicos, sugiere un papelespecífico del CFTR en la función espermática.Alteraciones en la función del CFTR en espermato-zoides maduros podría también ayudar a explicar lacausa de infertilidad en pacientes diagnosticados deinfertilidad idiopática. Por último, este estudio tam-bién serviría para clarificar el efecto terapeútico delDHA en ratones cftr -/- y proporcionar las bases parael desarrollo de una terapia para el tratamiento de estetipo de infertilidad masculina.

Los objetivos de este estudio son: (i) determinarlos niveles de ácidos grasos en membranas de célulasgerminales y esperma del epidídimo en ratones wild-type y ratones cftr -/-; y (ii) determinar los efectos dela administración oral de DHA a ratones wild-type ycftr -/- en la incorporación de DHA en estas células yla producción espermática.

MATERIALES Y MÉTODOS

Colonias previamente establecidas de ratonesexon-10 knockout y wild-type fueron usadas en esteestudio. Biopsias de las colas de ratones de 14 díasfueron utilizadas para el análisis genotípico. Los rato-nes wild-type y cftr -/- fueron destetados a los 23 díasde edad y alimentados con agua y Peptamen (NestleClinical Nutrition, Deerfield, IL) ad lib durante 60 dí-as y luego alimentados con Peptamen o Peptamen su-plementada con 40 mg de DHA por día durante 5 se-manas (que es la duración de un cicloespermatogénico en estos ratones) en forma de unaemulsión estable. Esta concentración de DHA fué se-leccionada en base a su eficacia en un estudio pilotoprevio en el que se utilizaron dosis de DHA entre 5 y

80 mg por día. No se encontraron diferencias en laconcentración de DHA en plasma de ratones wild-ty-pe y cftr -/- tras la administración de 40 mg de DHApor día durante 5 semanas, indicando que la absorp-ción y/o transporte intestinal de DHA no está afecta-do en ratones cftr -/- a las dosis utilizadas.

El esperma de epidídimo de ratón adulto (> 60 dí-as) se obtuvo por disección del epidídimo. Las sus-pensiones resultantes fueron lavadas en PBS y el pe-llet resuspendido en mHTF. Los testículos de ratónadulto fueron diseccionados en mHTF y las célulasgerminales (principalmente espermátidas redondas yespermatocitos primarios en estadío paquiteno) aisla-das a través de un gradiente de ISolate (50/70/90%).

Una alíquota de las suspensiones fué usada paramedir la concentración, motilidad y morfología y elresto extraído con cloroformo-metanol (2:1, v/v). Losácidos grasos libres y esterificados a glicerolípidosfueron transmetilados con BF3-metanol/0.5N NaOHmetanólico y los ésteres de metilo de los ácidos gra-sos analizados por cromatografía de gases usando uncromatógrafo de gases Hewlett Packard 5890A II(14). Los ésteres de metilo de los ácidos grasos fue-ron identificados por comparación con los tiempos deretención obtenidos de una mezcla estándar de ácidosgrasos (Sigma Chemical, Saint Louis, MO y Nu-Chek-Prep, Elysian, MN) y por espectrometría demasas, y cuantificados utilizando el ácido heptadeca-noico como estándar interno.

Dado que el tamaño de los ratones cftr -/- es engeneral inferior al de ratones wild-type de la mismaedad, la producción espermática obtenida en los dife-rentes grupos de ratones fué normalizada al peso deltestículo.

Los resultados fueron analizados estadísticamenteutilizando el Student t-test. Todos los experimentosfueron realizados de acuerdo con los protocolos apro-bados por el Beth Israel Deaconess Medical CenterAnimal Care Committee, Harvard Medical School.

RESULTADOS

Los niveles de DHA y DPA (ácido docosapentae-noico ó 22:5n-6) en células germinales y espermato-zoides del epidídimo se muestran en la Tabla 1. Losvalores de DHA en ratones cftr -/- fueron aproxima-damente la mitad de los encontrados en ratones wild-type, mientras que los valores de DPA fueron casi eldoble. Estas diferencias fueron estadísticamente sig-nificativas (p<0.05). Diferencias en la relaciónDPA/DHA en células germinales y espermatozoidesdel epidídimo fueron también estadísticamente signi-ficativas (p=0.02 y p=0.005) (Tabla 1).

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La administración oral de 40 mg de DHA por díadurante 5 semanas resultó en un aumento en el conte-nido de DHA en células germinales y espermatozoi-des del epidídimo (Tabla 2). La producción espermá-tica en ratones cftr -/- fué significativamente más bajaque en ratones wild-type. (p<0,001). La administra-ción de DHA a ratones cftr -/- resultó en un aumentosignificativo en la producción espermática (p<0,001)(Tabla 2). Esta producción espermática fué compara-ble a la observada en ratones wild-type control. Sinembargo, el contenido de DHA en células germinalesal cual se observó este aumento en la producción es-permática en ratones cftr -/- tratados con DHA, fuésignificativamente superior al observado en célulasgerminales de ratones wild-type control (p<0,001).La administración de DHA a ratones wild-type no re-sultó en diferencias significativas en la producciónespermática comparado con ratones wild-type con-trol. No se encontraron diferencias significativas enla movilidad espermática ó morfología entre los dife-rentes grupos.

CONCLUSIONES

Uno de los hallazgos más relevantes de este estu-dio es que un defecto lipídico similar al encontradopreviamente en páncreas e íleum de ratones cftr -/-también está presente en células germinales y esper-ma del epidídimo de estos ratones. Sin embargo, a di-ferencia de los hallazgos encontrados en páncreas eíleum, en testículo no se encuentra un aumento en losniveles del ácido araquidónico (AA, 20:4n-6) sino delácido docosapentaenoico (22:5n-6), el producto finalde la vía n-6 del que es precursor el AA. Estos hallaz-gos refuerzan la hipótesis de que el aumento de AA

que se observa en páncreas e íleum o el aumento deDPA que se encuentra en testículo de ratones cftr -/-es secundario y responde a un mecanismo compensa-torio para corregir una posible alteración de las pro-piedades físico-químicas de la membrana causada porun descenso en los niveles de DHA. Este descenso enlos niveles de DHA pudiera producirse por un defectoen su biosíntesis en el retículo endoplásmico (RE), enel transporte de su precursor, el ácido docasatetrae-noico (24:6n-3) desde el RE a los peroxisomas, en eltransporte del DHA desde los peroxisomas al RE, odesde el RE a la membrana. Un defecto en la biosín-tesis del DHA en el RE o en su transporte entre losdiferentes compartimentos celulares involucrados ensu metabolismo parece ser el defecto primario queocasiona la alteración lipídica observada (3). La ma-yor parte de las células responden a una disminuciónen los niveles de DHA aumentado la biosíntesis deácidos grasos polinsaturados de la vía n-6 (AA yDPA) y/o de la vía n-9 (20:3n-9 ó ácido eicosatrienoi-co). Sin embargo, no todas las células tienen delta-6desaturasa de cadena larga en el RE (conversión del24:5n-3 a 24:6n-3 y del 24:4n-6 a 24:5n-6) ni el com-plejo de ß-oxidación en los peroxisomas (conversióndel 24:6n-3 a 22:6n-3 ó DHA y del 24:5n-6 a 22:5n-6ó DPA) requeridos para la biosíntesis de DPA yDHA. Los resultados de este estudio demuestran quelas células germinales de ratones wild-type tienen lacapacidad de producir DPA y DHA y que las célulasgerminales de ratones cftr -/- responden a una dismi-nución en los niveles de DHA con un aumento signi-ficativo en la biosíntesis de DPA, sugiriendo que losniveles de DHA en estas células podrían jugar un pa-pel importante en su función celular y en la regula-ción de la maduración espermática.

El segundo hallazgo importante de este estudio esque la administración de DHA a ratones cftr -/- corri-


Tabla 1Contenido de DHA y relación DPA/DHA en células germinalesy espermatozoides del epidídimo en ratones wild-type y cftr -/-.

Grupo % DHA % DHA DPA/DHA DPA/DHACG EE CG EE

WT 6,60±1,281 9,98±2,85 2,14±0,14 0,85±0,12

CF 3,53±0,20 4,85±1,25 5,89±0,39 3,62±0,15

WT+DHA 13,5±1,20 16,4±0,58 1,10±0,04 0,61+0,05

CF+DHA 12,2±0,99 15,8±0,45 1,00±0,05 0,58±0,02

CG: células germinales; EE: espermatozoides del epidídimoWT: wild-type; CF: cftr -/-1valores representan la media ± desviación standard de 5 experimen-tos diferentes

Tabla 2Producción espermática en ratones wild-type y cftr -/- antes y

después de la administración de DHA

Grupo Producción Espermática

WT 49,8±9,801

CF 27,4±9,30

WT+DHA 53,2±8,50

CF+DHA 51,0±12,6

WT: wild-type; CF: cftr -/-1valores expresados en millones de espermatozoides y re-presentan la media ± desviación standard de 5 experimentosdiferentes

ge este defecto lipídico de membrana, aumentandolos niveles de DHA en células germinales y esperma-tozoides del epidídimo, disminuyendo la relaciónDPA/DHA, y aumentando la producción espermáticaen ratones cftr -/-. Cabría destacar, sin embargo, quela concentración de DHA en células germinales a lacual se normaliza la producción de esperma en rato-nes cftr -/- es significativamente más alta que la quese observa en ratones wild-type control. Este hallazgoes similar al previamente encontrado en páncreas eíleum de ratones cftr -/- (13). Esto podría indicar que,ó bien existe un enriquecimiento en el contenido deDHA en ciertos compartimentos subcelulares de lascélulas germinales de ratones wild-type, ó que elefecto del DHA podría ser independiente de la co-rrección del defecto lipídico y estar relacionado conotros mecanismos. En el primer caso, la corrección delos niveles reducidos de DHA en dicho compartimen-to en células germinales de ratones cftr -/- resultaríaen una “sobrecarga” en los niveles de DHA en el res-to de la célula tras la administración de DHA dandolugar así a una “sobrecorrección” en los niveles deDHA a nivel celular (si bien los niveles de DHA en elcompartimento celular en cuestión serían los adecua-dos). En el segundo caso, la disponibilidad de nivelessuprafisiológicos de DHA libre y esterificado enotros compartimentos celulares podría resultar en laactivación de vías de trasducción, canales del clororegulados por el calcio, inducción de apoptosis, acti-vación de genes involucrados en el ciclo celular, in-ducción en la expresión de trasportadores tipo ABC,etc.

El tercer hallazgo importante de este estudio esque la administración de DHA a ratones cftr -/- tam-bién corrige el defecto lipídico en espermatozoidesdel epidídimo. Sin embargo, la corrección de este de-fecto en espermatozoides del epidídimo es más unaconsecuencia de la corrección de este defecto en célu-las germinales que de la incorporación de DHA a ni-vel del epidídimo. Como ya ha sido demostrado enestudios previos, los niveles de DHA en espermato-zoides del epidídimo reflejan el remodelado de mem-branas que se produce en espermátidas redondas du-rante el proceso de la espermiogénesis (15). Es decir,los espermatozoides diferenciados que ya han com-pletado la espermiogénesis en el epitelio de los túbu-los seminíferos tienen el mismo contenido en DHAque los espermatozoides del epidídimo. El aumentoen DHA que se encuentra en espermatozoides delepidídimo de ratones wild-type, expresado como%DHA de ácidos grasos totales (Tabla 1), es un au-mento “aparente” ya que durante el paso de los esper-matozoides por el epidídimo se produce una disminu-

ción en el contenido de ácidos grasos saturados, prin-cipalmente de ácidos palmítico y esteárico, que sonlos ácidos grasos más abundantes en las membranasdel espermatozoide. Sin embargo, cuando los nivelesde DHA se expresan como moles/célula, el contenidode DHA en espermatozoides que han completado laespermiogénesis es similar al que se encuentra en es-permatozoides del epidídimo (14). Este mismo perfilde remodelado de ácidos grasos también se observaen ratones cftr -/- antes y después de la administra-ción de DHA. Los únicos cambios que se observantras la administración de DHA son el aumento en laincorporación de DHA y la disminución en los nive-les de DPA de membrana.

Una pregunta que este estudio no ha abordado yque todavía queda por responder es si las células deSertoli, que también tienen CFTR funcional (9), ex-presan o no este defecto lipídico. Dado el papel cen-tral que juega la célula de Sertoli en la regulación dela espermatogénesis, quizás la disminución en la pro-ducción espermática que se observa en ratones cftr -/-esté relacionada, al menos en parte, con este defectolipídico en células de Sertoli y que la corrección deeste defecto en estas células en ratones cftr -/- sea elque conlleve al aumento en la producción espermáti-ca que se observa en ratones cftr -/- tras la adminis-tración de DHA.

En resumen, los resultados de este estudio sugierenque los niveles de DHA en las membranas de célulasgerminales y/o células de Sertoli podrían jugar un pa-pel importante en la regulación de la espermatogénesisy que la administración de DHA podría potencialmenteutilizarse en el tratamiento de la infertilidad masculinano obstructiva en pacientes con mutaciones menos se-veras del gen CFTR. Teniendo en cuenta las diferen-cias en la tasa de metabolismo basal y consumo calóri-co que se encuentran en hombres y en ratones cftr -/-,la cantidad de DHA que se requeriría para corregir estedefecto en pacientes con mutaciones del gen CFTR (deexistir el mismo defecto lipídico a nivel de células ger-minales y/o células de Sertoli), sería de 1g por día du-rante al menos diez semanas.

BIBLIOGRAFÍA

1. Brugman, S.M. and Taussig, L.M.: in CysticFibrosis (Taussig, L.M., ed.), 1984; pp. 323-337,Thieme-Stratton, New York.

2. Denning, CR, Sommers, SC and Quigley, HJ, Jr.:Pediatrics, 1968; 41, 7-17.

3. Stern, R.C.: in Cystic Fibrosis (Davis, P.B., ed.), Vol.64, pp. 381-400, Marcel Dekker, 1993; New York.



4. Tomashefski JF, Abramowsky CR, Dahms BB.: inCystic Fibrosis (Davis, P.B., ed.), 1993; pp. 421-440,Marcel Dekker, New York.

5. Van der Ven K, Messer L, van der Ven H,Jeyendran RS, Ober C.: Hum Reprod, 1996; 11,513-7.

6. Larriba S, Bassas L, Egozcue S, Giménez J, RamosM D, Briceno O, Estivill X, Casals T:. Biol Reprod,2001; 65: 394-400.

7. Trezise AE, Buchwald M.: Nature, 1991; 353, 434-7.8. Gong X D, Li J C H, Cheung KH, Leung GPH,

Chew S B C, Wong P Y D.:. Mol Hum Reprod, 2001;7: 705-71.

9. Boockfor F R, Morris R A, DeSimone D C, Hunt DM, Walsh K B.:. Am. J. Physiol, 1998; 274: 922C-930.

10. Ollero M Brown D A Patrizio P, Regadera J, López

MC, Álvarez J G.: VII International Congress ofAndrology, Montreal 2001.

11. Calogero A E, Burrello N, Barone N, Palermo I,Grasso U, D’Agata R.: Hum Reprod 15 Suppl, 2000;1, 28-45.

12. Sato Y, Son J H, Meizel S.: J Androl, 2000; 21, 99-106.

13. Freedman S D, Katz M H, Parker E M, LaposataM, Urman M Y, Álvarez J G.: Proc Natl Acad Sci,1999; U S A 96, 13995-4000.

14. Ollero M, Powers RD, Álvarez JG.: Mol ReprodDev, 2000; 55, 326-34.

15. Ollero M, Blanco PG, Rigau TM, Freedman S D,Álvarez J G.: Journal of Andrology, 2000; 21, 48.

16. Surai P F, Noble RC, Sparks N H, Speake BK.: JReprod Fertil, 2000; 120, 257-264.




Cambios hemodinámicos en pacientes asintomáticas en un ciclo de fecun-dación in vitro: Caracterización cronológica a lo largo de la fase lútea y surelación con los esteroides ováricos y citoquinas

Manau D1, Arroyo V2, Jiménez W3, Fábregues F1, Balasch J1,Vanrell J.A1

1Instituto Clínic de Ginecología, Obstetricia i Neonatología, 2Unidad de Hepatología-Instituto Clínic de Enfermedades Digestivas, 3Laboratorio Hormonalc

Hospital Clínic-Institut d´Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS),Facultad de Medicina-Universidad de Barcelona

INTRODUCCIÓN

El síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO)es una complicación yatrogénica que puede apareceren los tratamientos de estimulación ovárica con go-nadotrofinas y que se produce generalmente en laprimera semana tras la inducción de la ovulación yque puede llegar a provocar una morbilidad grave eincluso mortalidad (1,3).

Estudios de nuestro grupo ha demostrado que lafisiopatología del SHO grave es mucho más comple-ja y que la marcada vasodilatación arteriolar periféri-ca es el principal proceso asociado de manera cons-tante al desarrollo del s índrome (4-7). Másrecientemente en un estudio de Evbuomwan (8) sedemostró por primera vez que tanto la hipovolemia(circulación hipodinámica) como la hipervolemia(circulación hiperdinámica) están presentes a lo largodel síndrome de hiperestimulación ovárica severo, enel cual la hipovolemia ocurriría en la fase aguda yposteriormente la hipervolemia en la fase de recupe-ración. El desarrollo simultáneo de un aumento de lapermeabilidad vascular periférica junto a una marca-da vasodilatación arterial podrían provocar una dis-función circulatoria caracterizada por hipotensión ar-terial, elevación del gasto cardíaco, disminución delas resistencias vasculares periféricas y una marcadaestimulación homeostática del sistema nervioso sim-pático (SNS), del sistema renina-angiotensina y de lahormona antidiurética (6).

La forma severa del síndrome generalmente seasocia a ovarios multifoliculares y a niveles circulan-tes de estradiol muy elevados, por ello se ha pro-puesto que éste sólo se desarrolla en pacientes conalta respuesta al tratamiento con gonadotrofinas (1,2). De acuerdo con esta hipótesis, en la mayoría delas pacientes la respuesta ovárica sería insuficientepara alterar la función circulatoria. Estudios recientesde nuestro laboratorio han presentado evidencias queindican que la disfunción circulatoria es un eventouniversal en todos los ciclos de fecundación in vitroy que los síntomas sólo aparecen en unas pocas pa-cientes, las cuales desarrollan una profunda altera-ción circulatoria (7).

El desarrollo constante de esta disfunción circula-toria en las pacientes asintomáticas de un ciclo deFIV nos llevó a diseñar estudios cronológicos paraestudiar la relación temporal entre el desarrollo delsíndrome y cambios en las sustancias vasoactivas po-tencialmente relacionadas. Por consiguiente el pre-sente estudio fue realizado para caracterizar la rela-ción temporal entre el desarrollo de los cambioshemodinámicos que sufren las pacientes y los cam-bios que aparecen en los esteroides ováricos.Además, también se ha sugerido que el SHO gravepodría estar relacionado con un aumento de actividadde citoquinas, así pues se estudió la relación cronoló-gica entre los cambios circulatorios y el sistema reni-na-aldosterona con los niveles del factor de creci-miento l vascular endotelial (VEGF) , interleuquina-6

(IL-6), tumor necrosis factor (TNF-α) y concentra-ción de nitritos/nitratos.

MATERIAL Y MÉTODOS

El grupo de estudio incluyó 88 pacientes del pro-grama de fecundación in vitro de 28 a 37 años, conpresencia de ambos ovarios, ciclos ovulatorios regu-lares, sin síndrome de ovarios poliquísticos, con pun-ción y recuperación ovocitaria correcta tras la estimu-lación ovárica con gonadotrofinas y que no hubieranquedado gestantes en el ciclo estudiado. Este últimocriterio era necesario para evitar los efectos de unembarazo sobre los niveles de hormonas ováricas y lafunción circulatoria. Todas las pacientes tenían unapresión arterial y un índice de masa corporal dentrode la normalidad, no fumaban, no realizaban un ejer-cicio físico intenso ni tomaban ninguna medicación.Cada paciente firmó su consentimiento informado pa-ra ser incluida en el estudio que había sido aprobadopreviamente por el Comité Ético de nuestro hospital.

El crecimiento folicular múltiple se realizó deacuerdo a nuestro protocolo previamente publicado(7, 9). Se inicia la supresión hipofisaria con aGnRH(acetato de leuprolide) en fase lútea media del cicloprevio, y se continua hasta la administración de lahCG. La estimulación ovárica con gonadotrofinas(FSH) se empieza 13-14 días más tarde, cuando ya seha comprobado la supresión hipofisaria con nivelesde estradiol < 50 pg/mL. La punción aspiración foli-cular se realiza mediante un ecografía transvaginal35-36 horas después de la inyección de hCG (5000UI) bajo anestesia local. Tras 48 horas se realiza latransferencia embrionaria de no más de tres embrio-nes en el útero. Como suplemento de la fase lútea seadministran dosis adicionales de hCG : 5000 UI,2500 UI y 2500 UI en el día de la aspiración folicu-lar, 3 y 5 días más tarde respectivamente.

Este es un estudio transversal. Las 88 pacientesdel grupo de estudio fueron randomizadas aleatoria-mente en 11 grupos de 8 pacientes cada uno. En todaslas pacientes de cada grupo se obtuvo una muestra desangre en uno de los 11 puntos de estudio. Estos pun-tos de estudio se corresponden con los siguientes dí-as: Punto1: el día de comprobación de la supresiónhipofisaria (de 9 a 14 días antes de la administraciónde la hCG, media de 12 días); Punto 2: el día de laadministración de la hCG (día 0) tras una adecuadaestimulación ovárica con FSH (día del pico de estra-diol); Puntos 3 al 11: se corresponden a nueve díasconsecutivos en la fase lutea (días 3 al 11 después dela hCG ovulatoria).

Entre las 8-9 horas de la mañana y en condicionesbasales (en ayunas y sin consumo de tabaco) se reali-zó la cateterización de la vena antecubital. Una horamás tarde y con la paciente en decúbito se obtuvo unamuestra de 100 cc de sangre en las 88 pacientes delgrupo de estudio. Esta cantidad era necesaria para ladeterminación de todas las sustancias neurohormona-les y vasoactivas del estudio.

La tensión arterial se midió mediante un esfingo-manómetro manual. La presión arterial media se cal-culó como la presión diastólica más una tercera partede la diferencia entre la presión sistólica y diastólica.Los niveles séricos de estradiol, progesterona, nitri-tos/nitratos, IL-6, y la concentración plasmática deVEGF, TNF-α, aldosterona, norepinefrina y actividadrenina plasmática fueron determinados mediante mé-todos previamente descritos (7, 9-11).

Se incluyó un grupo control para las determinacio-nes neurohormonales (ARP, aldosterona, y norepine-frina) y de presión arterial media en el día 7 postovu-lación (comprobada por ecografía) de 15 voluntariassanas de edades comprendidas entre 27 y 32 años,con ciclos menstruales regulares.

Los resultados se presentaron como media ± SEM.El análisis estadístico de los resultados fue realizadomediante el test no paramétrico de Mann-Whitneycon la corrección del test de Bonferroni para las com-paraciones múltiples, y el test de Pearson para corre-laciones bivariadas.

RESULTADOS

Todas las pacientes tuvieron un desarrollo folicu-lar múltiple y con un incremento en los niveles de es-tradiol (media 2386 ± 366 pg/mL con un rango de1490-3565 pg/mL) y una punción folicular con recu-peración ovocitaria. La media de folículos observa-dos el día de la hCG fue de 15 (rango 8-26 ); la mediade ovocitos obtenidos fue de 9,6 (rango 5-21). No hu-bo diferencias respecto a las principales característi-cas de las pacientes (edad, índice de masa corporal,FSH basal del 2º al 4º día del ciclo), respuesta ovárica(número total de ampollas de gonadotrofinas admi-nistradas, número de folículos, nivel de estradiol enel día de la hCG), y en la recuperación ovocitaria yresultados del ciclo de FIV (número de ovocitos recu-perados, número de embriones transferidos) en los 11grupos de pacientes. Por definición, todas las pacien-tes permanecieron asintomáticas a lo largo del estu-dio y ninguna quedó embarazada en ese ciclo.

Como era de esperar el estradiol y la progestero-na, así como la ARP, aldosterona y norepinefrina fue-


ron significativamente más bajos en el día de la inhi-bición hipofisaria (día-12 hCG) en el grupo de estu-dio que en grupo control. En contraste la presión arte-rial media fue significativamente mayor en laspacientes del estudio en comparación con las del gru-po control.

Es decir, hubo un incremento significativo de reni-na, aldosterona y norepinefrina y una reducción signi-ficativa en la presión arterial media, desde los días-12hCG al día +7 hCG. La disminución de la presión ar-terial fue cronológicamente el primer fenómeno enobservarse siendo detectado en el día 0 (administra-ción de la hCG) cuando el estradiol estaba en el picomáximo al final de la estimulación ovárica. La activa-ción del sistema renina-aldosterona y del SNS fue unhecho más tardío, siendo observado en el día +4 hCG(4 días más tarde del inicio de la hipotensión), cuan-do se evidenció un incremento significativo en la no-repinefrina y aldosterona.

La máxima estimulación del sistema renina-aldos-terona y SNS se observó +7 días después de la admi-nistración de la hCG. Después del día +7 los valoresdisminuyeron, aunque permanecieron todavía eleva-dos con respecto al grupo control en el día +11. Lapresión arterial media en las pacientes de FIV tam-bién permaneció significativamente inferior respectoal grupo control a lo largo de toda la fase lútea.

Hubo una estrecha correlación entre la actividadde renina plasmática y los valores de norepinefrina alo largo del período de estudio (r=0.60; p<0.001).Hubo una clara relación temporal entre los cambiosen la activación del sistema renina-aldosterona y losniveles circulantes de progesterona. En realidad seobservó una correlación significativa entre los nivelesde progesterona y las diferentes sustancias neurohor-monales vasoactivas. En contraste se observó una po-bre correlación entre los cambios de los niveles de es-tradiol y del sistema renina-aldosterona. Esto fuedebido al marcado incremento en los niveles de estra-diol junto a valores normales de ARP y disminuidosde aldosterona observados en el día 0 HCG.

No se observaron cambios significativos en lasconcentraciones de citoquinas, VEGF y TNFα a lolargo del período de estudio (Fig.4). La concentraciónde la IL-6 fue inferior al límite detectable a lo largodel periodo de estudio. Tampoco hubieron cambiosen las concentraciones de nitritos/nitratos.

DISCUSIÓN

El presente estudio confirma y amplia investiga-ciones previas de nuestro grupo que apuntaban que la

hipotensión arterial , la activación del sistema renina-aldosterona y del SNS son un hecho universal en laspacientes asintomáticas en un ciclo de FIV (7). La ac-tividad renina presenta un marcado incremento a los7 días de la administración de la hCG, momento enque suele manifestarse la ascitis en aquellas pacientesque desarrollan un síndrome de hiperestimulacióngrave.

La hipotensión arterial es un cambio hemodinámi-co muy precoz en los ciclos de FIV, siendo detectadaen el día de la administración de la hCG coincidiendocon el dramático aumento del estradiol sérico asocia-do al desarrollo multifolicular. Esta disminución en lapresión arterial media permanece a lo largo de todo elperíodo de estudio. Aunque observamos 4 días entrela disminución de la presión arterial y la activacióndel sistema renina-aldosterona y SNS. Esto hecho su-giere que el efecto vasodilatador del estradiol aunquesuficiente para disminuir la presión arterial no es losuficientemente intenso para comprometer la funcióncirculatoria , activando los sistemas vasoactivos en-dógenos.

El inicio de la activación del sistema renina-aldos-terona y SNS aparece estrechamente relacionado conel proceso de luteinización. Una elevación significati-va de la aldosterona, y norepinefrina con respecto alos valores obtenidos en fase lútea media de un cicloespontáneo se observa alrededor de 4 días después dela inyección de hCG asociada a un incremento signi-ficativo en los niveles de progesterona. A partir deeste momento los niveles de renina, aldosterona y no-repinefrina aumentan paralelamente a los niveles deprogesterona hasta llegar al día +7 cuando empiezana disminuir coincidiendo con la luteolisis.

Este hecho sugiere que la sustancia o sustanciasproducidas por el cuerpo lúteo juegan un importantepapel en el deterioro de la función circulatoria en laspacientes asintomáticas de FIV. Es interesante de re-saltar que al final del estudio, 11 días después de laadministración de la hCG, la presión arterial estabatodavía disminuida y renina, aldosterona y norepine-frina aumentadas con respecto a los valores control,indicando que los cambios circulatorios en las pa-cientes asintomáticas de FIV están presentes en todala fase lútea.

Sealey y cols. (12) informan de una estrecha co-rrelación cronológica entre el incremento de renina ylos niveles de estradiol y progesterona durante la esti-mulación ovárica en las pacientes de FIV. Sugierenque el estradiol podría jugar un papel en el aumentode renina debido a su efecto vasodilatador. Por otrolado la aldosterona disminuye la actividad de la al-dosterona a nivel de los túbulos renales. En conse-


cuencia, Sealey y cols. (12) proponen que la proges-terona podría incrementar la renina a través de la dis-minución del volumen sanguíneo debido a un aumen-to de la natriuresis.

Para finalizar, la significativa disminución en lapresión arterial que aparece universalmente en las pa-cientes de FIV sirve para apoyar el concepto que el au-mento del sistema renina-aldosteron es una respuestahomeostática compensadora a la vasodilatación (13).

A pesar de todo, la causa primaria de los cambioshemodinámicos y de la activación compensadora dela renina y SNS en pacientes asintomáticas de FIVpermanece sin descubrir. Recientemente sustanciasdiferentes a los esteroides ováricos han sido propues-tas para explicar la patogénesis del síndrome, princi-palmente el VEGF y otras citoquinas como la inter-leuquina-6 y el TNFα (14-18).

Nosotros no hemos observado cambios significati-vos en los valores circulantes de citoquinas en nues-tras pacientes asintomáticas. Existen dos posibles ex-plicaciones. La primera, es que la concentraciónelevada que se observa en pacientes con el síndromeno esté relacionada con los cambios hemodinámicosdel mismo. Una explicación alternativa es que el sín-drome se desarrolle como consecuencia de la acciónsimultánea de varias sustancias vasodilatadoras queincluyen el estradiol, sustancias vasoactivas produci-das por el cuerpo lúteo y citoquinas. Cuando sóloexiste hiperproducción de hormonas ováricas y sus-tancias vasoactivas lúteas, los cambios circulatorios,aunque funcionalmente significativos, son clínica-mente asintomáticos.

Estudios previos apoyan este concepto, puesmuestran que los niveles de IL-6 se elevan despuésde la hiperestimulación ovárica principalmente en pa-cientes con riesgo de desarrollar el síndrome y en pa-cientes que lo desarrollan (16,19).

En resumen, nuestros resultados indican que loscambios circulatorios y la activación homeostática delsistema renina-aldosterona y del sistema nervioso sim-pático que de manera universal desarrollan las pacien-tes asintomáticas tras una hiperestimulación ovárica deFIV es un hecho asociado al proceso de luteinización.Estos cambios hemodinámicos tienen lugar en ausen-cia de variaciones en los niveles circulantes de VEGF,TNFα, IL-6 y de metabolitos del óxido nítrico.

BIBLIOGRAFÍA

1. Golan A, Ron El R, Herman A, Soffer Y, WeinraubZ, Caspi E.: Ovarian hyperstimulation syndrome; anupdate review. Obstet Gynecol Surv 1989; 44: 430-40.

2. Elchalal U, Schenker JG.: The pathophysiology ofovarian hyperstimulation syndrome-views and ideas.Hum Reprod 1997; 12: 1129-37.

3. Bergh P, Navot D.: Ovarian hyperstimulation syndro-me. A review of pathophysiology. J Assist ReprodGenet 1992; 5: 429-38.

4. Balasch J, Arroyo V, Carmona F, Llach J, JiménezW, Paré JC et al.: Severe ovarian hyperstimulationsyndrome: role of peripheral vasodilation. Fertil Steril1991; 56: 1077-83.

5. Balasch J, Arroyo V, Fábregues F, Saló J, JiménezW, Paré JC et al.: Neurohormonal and hemodynamicchanges in severe cases of the ovarian hyperstimula-tion syndrome. Ann Intern Med 1994; 121: 27-33.

6. Balasch J, Fábregues F, Arroyo V.: Peripheral arte-rial vasodilation hypothesis: a new insight into thepathogenesis of ovarian hyperstimulation syndrome.Hum Reprod 1998; 13: 2718-30.

7. Manau D, Balasch J, Arroyo V, Jiménez W,Fábregues F, Casamitjana R, et al.: Circulatory dys-function in asymptomatic in vitro fertilization pa-tients. Relatioship with hyperestrogenemia and acti-vity of endogenous vasodilators. J Clin EndocrinolMetab 1998; 83: 1489-93.

8. Evbuomwan IO, Davison JM, Murdoch AP.:Coexistent hemoconcentration and hypoosmolalityduring superovulation and in severe ovarian hyperesti-mulation syndrome: a volume homeostasis paradox.Fertil Steril 2000; 74: 67-72.

9. Manau D, Balasch J, Jiménez W, Fábregues F, CívicoS, Casamitjana R, et al.: Follicular fluid concentra-tions of adrenomedullin, vascular endothelial growthfactor and nitric oxide in IVF cycles : relationship toovarian response. Hum Reprod 2000; 15: 1295-99.

10. Jiménez W, Ros J, Morales-Ruiz M, Navasa M, SoléM, Colmenero J et al.: Nitric oxid production and in-ducible nitric oxide synthase expression in peritonealmacrophages of cirrhotic patients. Hepatology 1999;30: 670-6

11. Pérez-Ruiz M, Ros J, Morales-Ruiz M, Navasa M,Colmenero J, Ruiz del Arbol L et al.: Vascular en-dothelial growth factor production in peritoneal ma-crophages of cirrhotic patients: regulation by cytoki-nes and bacterial lipopolisaccharide. Hepatology 1999;29: 1057-63.

12. Sealey JE, Itskovitz-Eldor J, Rubattu S, James GD,August P, Thaler I et al.: Estradiol and progesterone-related increases in the renin-aldosterone system: stu-dies during ovarian stimulation and early pregnancy. JClin Endocrinol Metab 1994; 79: 258-64.

13. Fábregues F, Balasch J, Manau D, Jiménez W,Arroyo V, Creus M, et al.: Haematocrit, leukocyte andplatelet counts and the severity of the ovarian hypersti-mulation syndrome. Hum Reprod 1998; 13: 2406-10.



14. Rizk B, Aboulghar M, Smitz J, Ron-El R.: The roleof vascular endothelial growth factor and interleukinsin the pathogenesis of severe ovarian hyperstimulationsyndrome . Hum Reprod Update 1997; 3: 255-66.

15. Mathur RS, Jenkins JM, Bansal AS.: The possiblerole of the immune system in the aetiopathogenesis ofovarian hyperstimulation syndrome. Hum Reprod1997; 12: 2629-34.

16. Pellicer A, Albert C, Mercader A, Bonilla-Musoles F,Remohí J, Simón C.: The pathogenesis of ovarian hy-perstimulation syndrome : in vivo studies investigatingthe role of interleukin-1(,interleukin-6, and vascular en-dothelial growth factor . Fertil Steril 1999; 71: 482-9.

17. Chen CD, Wu My, Chen HF.: Relationships of serumpro-inflammatory cytokines and vascular endothelialgrowth factor with liver dysfunction in severe ovarian hy-perstimulation syndrome. Hum Reprod 2000; 15: 66-71.

18. Geva E, Jaffe RB.: Role of vascular endothelialgrowth factor in ovarian physiology and pathology.Fertil Steril 2000; 74: 429-38.

19. Loret de Mola JR, Flores JP, Baumgardner GP,Golfarb JM, Ginglesperger V, Friedlander MA.:Elevated interleukin-6 levels in the ovarian hypersti-mulation syndrome: ovarian immunohistochemical lo-calization of interleukin-6 signal. Obstet Gynecol1996; 87: 581-7

La dosis diaria umbral o eficaz de FSH requeridapara inducir un ciclo monofolicular en una pacienteanovuladora grupo II, puede variar considerablemen-te de paciente a paciente. Por otra parte, el día de ini-cio del estímulo y la dosis inicial de FSH, ha sidohasta ahora, determinado de modo pragmático y enfunción del tipo y calidad de la gonadotropina em-pleada ( en el protocolo clásico de baja dosis, se nosaconseja iniciar con “1 ampolla” al día de 75 UI).Recientemente, hemos podido ir comprobando queesta dosis de 1 ampolla /día no es universal, debiendoser individualizada, prescribiendo la FSH en base aunidades/día, y modificando la dosis en función de larespuesta ovárica Es en estas frecuentes pobres res-pondedoras por nula respuesta dónde hemos utilizadoun modificado protocolo que tiene dos principios bá-sicos:

1)Aumentar, adelantando la dosis inicial de FSHr.Se ha observado con bajas dosis iniciales (50 UI/día)una elevada tasa de cancelaciones por baja respuesta(36.3%) (Hayden et al, 1999). Además, en pacientes(sobre todo obesas) con ciclos cancelados por bajarespuesta, se aconseja aumentar la dosis inicial a másde 75 UI/día. Por otra parte, hay que recordar que elempleo, ya casi abandonado, de protocolos conven-cionales con dosis iniciales suprafisiológicas (150UI/día o más), condujeron a un peligroso desarrollomultifolicular. Por todo ello, nuestra primera modifi-cación fue aumentar la dosis inicial de FSHr a más de75 UI/día y a menos de 150 UI/día, eligiendo 100UI/día y comenzando siempre el día 3 del ciclo.

2)Aplicar un protocolo step-down. Al protocolostep-up se le critica que no sigue el patrón secretor fi-siológico de la FSH en un ciclo natural. El step-downintenta imitar los acontecimientos del ciclo natural,disminuyendo la dosis de FSHr cuando el futuro folí-culo líder ha sido reclutado. Nuestro segundo princi-

INTRODUCCIÓN

La anovulación por ovario poliquístico, constitu-ye una de las causas más frecuentes de esterilidad. Elobjetivo ideal de la inducción de la ovulación es con-seguir el desarrollo de un único folículo que albergueun ovocito de alta calidad, que de lugar a un embriónexcelente, con el resultado final de tener un niño encasa sano (Buckler et al, 1999). Al inducir la ovula-ción en mujeres con S índrome de OvariosPoliquísticos (SOP), alcanzar respuesta monofolicu-lar es difícil, debido a la elevada sensibilidad de lascélulas granulosas foliculares al estímulo FSH, qui-zás debido a una dosis umbral diferente de estos ova-rios, o a que contienen en su cohorte el doble de folí-culos sensibles a la FSH comparados con el ovarionormal (Homburg y Howles, 1999; Van der Meer,1998).

La mayoría de investigadores han observado lautilidad de administrar FSH recombinante (FSHr) enel llamado protocolo clásico de baja dosis step-up enestas pacientes SOP, consiguiendo una aceptable tasade embarazo, reduciéndose las complicaciones debi-das el desarrollo múltiple folicular (White et al, 1996;Coeling-Bennick et al, 1998; Hedón et al, 1998). Peropocas referencias se han publicado sobre las pacientes“pobres respondedoras por nula respuesta” a este ha-bitual protocolo, que suponen entre un 10 y 22% decancelaciones en estos ciclos inducidos.

La experiencia clínica nos indica que realizar ci-clos en estas pacientes “pobres respondedoras” con elmismo clásico protocolo de baja dosis FSH, conducea repetir malos resultados, alargar los ciclos, con unelevado coste económico y múltiples monitorizacio-nes ecográficas y plasmáticas, con el consiguientedesánimo por parte de la pareja y del equipo médico.

Nuevo protocolo de estimulación con FSH recombinante en pacientes ano-vuladoras grupo II de la OMS con ciclos cancelados por nula respuesta

López-López E, Fernández-Olmedilla L, Miguel Celis M

Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. Departamento de Obstetricia y Ginecología.Facultad de Medicina. Murcia.




pio intenta minimizar las consecuencias derivadas delprimer principio (peligro de un excesivo reclutamien-to al aumentar la dosis inicial ).

MATERIAL Y MÉTODO

Pacientes

Para poder realizar este estudio hemos partido de125 mujeres con SOP, no obesas (IMC< 30 kg/m2) ycon factor tubárico normal, con características semi-nales normales en su pareja. En estas 125 mujeres re-alizamos 376 ciclos de inducción de la ovulación conFSHr en protocolo clásico de baja dosis step-up. Deellas, seleccionamos a 25 mujeres, a las cuales se leshabían cancelado 50 ciclos (2 por mujer), por nularespuesta a este clásico protocolo, lo que supone ungrado de cancelación por mujer del 20%, y por ciclodel 13.3%. Su edad estaba comprendida entre 25 y 32años, siendo la edad media (± DS) de 28.2 ±3.1 años,y la duración media de la esterilidad fue de 3.2 ± 0.8años. El índice de masa corporal (IMC) fue < 30kg/m2. Habitualmente, no inducimos a pacientes SOPcon IMC>30 kg/m2, pues se ha comprobado que elIMC es el factor predictivo que más influye en el éxi-to o fracaso tras la inducción con gonadotrofinas(Yarali et al, 1999). Todas las pacientes fueron diag-nosticadas de SOP según criterios clínicos (oligome-norrea-amenorrea), bioquímicos (cociente LH/FSHbasal >2), y ultrasonográficos (ovarios poliquísticossegún Adams et al,1986). A todas las mujeres se lesefectuó histerosalpingografía y/o laparoscopia, cuyoresultado fue normal, y su pareja mostró unos pará-metros seminales normales según los criterios de laOMS. Todas fueron resistentes a clomifeno, definidala resistencia como anovulación o no embarazo trastres ciclos de estímulo con 100 mg/día durante 5 días.

Posteriormente, estas 125 mujeres fueron tratadascon protocolo “clásico” de FSHr (Gonal-F 75,Serono,España). De ellas, seleccionamos a 25 muje-res (50 ciclos), que habían sido catalogadas de pobresrespondedoras al protocolo clásico, al haber tenidoque cancelar todos los ciclos por nula respuesta. Elcriterio de cancelación fue no alcanzar folículos > de10 mm de diámetro tras 20 días de estímulo, siendo ladosis máxima/día alcanzada de FSHr de 187.5 UI.

Protocolo de Estudio

Cada paciente fue su propio control dentro de unnuevo protocolo. Este consistió en administrar FSHr(Puregón 100, Organon, España), comenzando siem-

pre el día 3 de un ciclo inducido con gestágenos, au-mentando la dosis inicial a 100 UI/día, realizandomonitorizaciones foliculares más frecuentes que en elprotocolo clásico. Cuando se observó la existencia deun folículo > 10 mm de diámetro, se continuó el estí-mulo en pauta step-down reduciendo la dosis a la mi-tad (50 UI/día) hasta alcanzar 1 folículo > 17 mm dediámetro. Se administraron 5.000 UI de HCG (Profasi10.000, 1/2 ampolla, Serono,España), para desenca-denar la ovulación. El criterio de cancelación por nu-la respuesta fue idéntico que en el protocolo clásicostep-up, y por excesiva respuesta, si existían 4 o másfolículos > 14 mm de diámetro. A todas las pacientesse les determinó estradiol plasmático el día previo ala HCG. Se realizó una determinación de progestero-na el día + 7 tras la HCG para confirmar los ciclosovulatorios.

Método

El estradiol fue analizado por inmunoanálisis“ECLIA” en un analizador Elecsys module, propor-cionado por Roche Diagnostics GMBH, D-68298,Indianápolis, USA. La sensibilidad fue de 18.4pmol/ml (5.0 pg/l). El coeficiente de variación intra-ensayo fue de 3.0% y el coeficiente total interensayodel 2.6%.

Respecto a la progesterona también fue determi-nada por inmunoanálisis empleando un sistema“ELECSYS E170” , proporcionado por RocheDiagnosticcs Corporation, Indianápolis, USA. Lasensibilidad fue de 0.095 nmol/l (0.03 ng/ml). El coe-ficiente de variación intraensayo fue de 2.7% y el in-terensayo de 4.1%.

Análisis Estadístico

La muestra analizada sigue una distribución nor-mal o de Gauss, cuyas medidas se agrupan alrededorde un valor central y presentan una frecuencia cadavez menor a medida que se alejan de dicho valor me-dio. Se caracteriza por 2 medidas, media y desviacióntípica, es unimodal, es simétrica alrededor de la me-dia, y el área bajo la curva es igual a uno. Los valorescorresponden a variables cuantitativas contínuas, to-man valores numéricos y entre un valor y otro existeuno intermedio, dependientes o apareadas, puesto queson medidas en los mismos sujetos en momentos di-ferentes. El estudio se ha basado en un contraste dehipótesis, realizando una t experimental, utilizando:la diferencia de medias,la desviación estándart , elnúmero de ciclos de la muestra, admitiendo un gradode significación de 0.05 y 0.01. Para realizar el con-



traste de hipótesis se ha seguido la t de Student para49 grados de libertad.

RESULTADOS

Resultados comparativos de la respuesta ováricafolicular, con ambos protocolos, y en la misma pa-ciente, están reflejados en la Tabla 1. Los datos delprotocolo clásico habitual corresponden a los 50 ci-clos cancelados, por ello no hay datos sobre la dosisdía eficaz de FSHr, ni existen folículos > 16 mm dediámetro el día de la HCG. Con el protocolo de estu-dio step-down, se realizaron 48 ciclos (y no 50) por-que hubo 8 embarazos, de los cuales 2 en el primerciclo y 6 en el segundo, por lo que las dos primerasmujeres embarazadas obviamente no repitieron ciclo.La duración media del tratamiento fue inferior en elprotocolo de estudio (14 ± 5 vs 19 ± 3 días, NS). Lacantidad total de FSHr requerida en el nuevo protoco-lo fue significativamente inferior respecto al clásicostep-up (1211± 625 UI vs 1785 ± 832 UI, p<0.001), apesar de haber aumentado la dosis inicial. La dosisdía eficaz de FSHr en el nuevo protocolo fue de 125± 48 UI, superior a la observada en pacientes SOPrespondedoras al protocolo clásico habitual. Se desa-rrollaron una media de 1.4 ± 0.9 folículos > 16 mmde diámetro, y el valor del estradiol preHCG fue de476 ( 222 pg/ml. En la Tabla 2 se describen los resul-tados clínicos con el nuevo protocolo de estudio. Solose cancelaron el 16.6% de ciclos (8 ciclos de nuevopor nula respuesta y ninguno por riesgo de hiperesti-

mulación). El grado de ovulación fue del 81.2%. Latasa de fecundidad por ciclo fue del 16.6% y el gradode embarazo acumulado por paciente (tras 2 ciclos)del 32% (8 embarazos, 2 en el primer ciclo y 6 en elsegundo). Hubo 2 abortos del primer trimestre (25%).Las complicaciones fueron un 6.2% de SHO de ca-rácter leve (aumento de volumen ovárico sin ascitis,que no motivó ingreso hospitalario), sin observar em-barazos gemelares (0%).

DISCUSIÓN

Este grupo de anovuladoras II de la OMS (sobretodo pacientes con SOP), está constituido por mujerescon ovarios anómalos (poliquísticos) y con alteracio-nes hormonales (aumento de LH y/o andrógenos).Diversas evidencias indican que el desarrollo folicu-lar inicial es normal, y la anovulación es producidapor una alteración en la selección del folículo domi-nante (Pache TD et al, 1992), probablemente debido auna alteración en la regulación intraovárica a la ac-ción de la FSH, y por ello, la respuesta a la FSH exó-gena es diferente a la observada en una mujer normal(Fauser, 1994).

Las gonadotrofinas exógenas han sido utilizadaspara el tratamiento de la esterilidad por anovulacióndesde 1958. Durante los últimos años, los protocolosde estimulación con baja dosis de FSH en anovulado-ras grupo II, han proporcionado excelentes resultadosen términos de ovulación (60-100%), y de grado acu-mulativo de embarazo (20-75%). El protocolo clásico

Tabla 1Respuesta ovárica

PARÁMETROS CLÁSICO PROTOCOLO ESTUDIO PSTEP-UP STEP-DOWN

Pacientes (nº) 25 25 -

Ciclos (nº) 50 48 -

Días Tratamiento (nº) 19 ± 3 14 ± 5 NS

Dosis Total FSHr (UI) 1785 ± 832 1211 ± 625 <0.001

Dosis FSH día eficaz (UI) 0 125 ± 48 -

Folículos > 16mm 0 1.4 ± 0.9 <0.001

Estradiol (pg/ml) 325 ± 189* 476 ± 222** -

* En el día de cancelación. ** En el día preHCG.Los valores son medias ( DSNS : no significativo- : no procede análisis de significación

de baja dosis step-up con FSH, es el más utilizado enpacientes anovuladoras grupo II de la OMS, funda-mentalmente SOP, pues mejora la respuesta monofo-licular reduciendo las complicaciones derivadas deldesarrollo folicular múltiple (White et al,1996;Coeling-Bennick et al, 1998; Hedon et al, 1998;Balasch et al,1996). Pero con el paso del tiempo, seha evidenciado que esto no siempre es así, y en oca-siones los ciclos han de ser cancelados, unas vecespor riesgo de hiperestimulación ovárica (20% de can-celaciones en las grandes series de Hamilton-Farleyet al,1991 y White et al,1996), y otras por pobre o nu-la respuesta (12-22% en las series de Balasch etal,1996; Homburg et al, 1995; Coeling-Bennink etal,1998; López,1999).

Muy escasa información existe en la literatura res-pecto a qué hacer con estas pacientes pobres respon-dedoras con anovulación grupo II de la OMS, trata-das con FSH en protocolo clásico baja dosis step-up.

Este grupo particular de pacientes, constituye unserio problema en inducción de la ovulación. Sonmujeres ya tratadas previamente con clomifeno, yposteriormente con FSHr en ciclos de 20 o más días,con múltiples controles ecográficos, determinacionesanalíticas, que se ven abocadas a la cancelación (fra-caso), con el consiguiente desánimo en la relaciónmédico-paciente.

El protocolo con FSHr diseñado para estas pobresrespondedoras nos ha proporcionado unos excelentesresultados iniciales, tanto en respuesta ovárica comoen eficacia clínica. Se ha alcanzado un aceptable gra-do de embarazo (16.6% por ciclo y 32% por pacientetras 2 ciclos), cancelando tan sólo el 16.6% de ciclos(cuando en el step-up clásico la cancelación fue enestas mujeres del 100%). La explicación a estos bue-nos resultados iniciales puede estar en que, en deter-minadas pacientes, hay que aumentar la dosis inicial

de estímulo FSH (a 100-150-225 o incluso a 300UI/día) , debido a que estas pacientes pobres respon-dedoras a un modelo clásico de baja dosis step-up,pueden necesitar una dosis umbral eficaz de FSH li-geramente superior a la observada en las buenas res-pondedoras, para iniciar el reclutamiento y selecciónde uno o dos folículos dominantes. En trabajos publi-cados en grupo II, la dosis diaria eficaz de FSH varíaligeramente entre 73.9 ( 6.1 UI (Balasch et al, 1998),75 UI (Yarali et al,1999), 84.6 ( 5.5 UI (Balasch et al2001), 108 ( 4 UI (Hughes et al, 1996), y 112.5 ( 45UI (Homburg y Ben Rafael, 1995). En el estudio mul-ticéntrico español efectuado en 534 ciclos fue de101.3 ( 45 UI (Balasch et al, 1996). Nuestros propiosresultados en 175 ciclos empleando un protocolostep-up individualizado, fue de 105 ( 37.5 UI (López-López,1999). En estas pacientes con dos ciclos pre-vios cancelados por nula respuesta, cada paciente ac-tua como su propio control. Utilizar en la misma pa-ciente dos protocolos de FSHr diferentes, es unexcelente mé todo para analizar resultados(Daya,1999).

* Nuestra primera hipótesis fue adelantar el estí-mulo al día 3 del ciclo, incrementando moderadamen-te la dosis de FSHr a 100 UI/día, con el objetivo deno caer en los riesgos inducidos por el ya casi aban-donado protocolo de alta dosis (Hamilton-Farley yFranks,1990; Homburg et al,1995). Así, hemos con-seguido iniciar el desarrollo de algún folículo (folícu-lo mayor de 10 mm), observando que la dosis día efi-caz de FSH era superior a la descrita en la mayoría delas publicaciones (125 ( 48 UI). Alcanzar la dosisumbral eficaz es difícil, debido a las grandes varia-ciones individuales, incluso de ciclo a ciclo en unmismo individuo . Pensamos que estas pacientes po-bres respondedoras precisan una dosis FSH inicial deestímulo superior a la clásicamente aceptada en losprotocolos lentos a baja dosis, por lo que tenemos queaceptar individualizar la inducción en ciertas pacien-tes, asumiendo ciertos riesgos pero que hemos de in-tentar minimizar. La FSHr actual tiene una larga vidamedia (36-48 horas), por lo que algunos autores(Buckler et al,1999) sugieren que utilizar inyeccionesdiarias de FSHr no es necesario. En su estudio utili-zan FSHr a días alternos, obteniendo buenos resulta-dos en cuanto a respuesta ovárica, aunque sólo anali-zan 27 ciclos. Balasch ha diseñado recientemente unprotocolo step-down en el que administra una alta do-sis inicial de FSHr (300 UI el día 3 del ciclo), inte-rrumpe la FSHr 3 días (periodo de coasting), y reducela dosis a 75 UI/día a partir del 7º día del ciclo (step-down), con unos resultados excelentes en cuanto a


Tabla 2Resultados clínicos al protocolo de estudio STEP-DOWN en

nulas respondedoras con SOP

PARÁMETROS RESULTADO

Ovulación (%) 81.25

Fecundidad por ciclo (%) 16.66

Embarazo por paciente (%) 32.0

Cancelación por ciclo (%) 16.66

Embarazo gemelar (%) 0

SHO Leve (%) 6.25

Aborto (%) 25

respuesta ovárica, pero con poca validez clínica alanalizar un número reducido de ciclos (Balasch etal,2001). En nuestro estudio, mantener la dosis inicialde 100 UI/día desde el 3º día del ciclo o incrementar-la en protocolo step-up, podría conducir a una acu-mulación de FSH en los folículos durante la fase foli-cular tardía (Van Santbrink y Fauser, 1997), con losconsiguientes riesgos de hiperestimulación ovárica yaobservada en pacientes sometidas a fertilización invitro ( Ben-Rafael Z, et al, 1986.). Además, es posi-ble que esta elevada FSH en fase folicular tardía enmodelo step-up, puede interferir con la selección deun único folículo dominante (Fauser BCJM, 1994).Por todo ello, ideamos continuar el estímulo según unmodelo step-down.

* La segunda modificación terapéutica consistióen aplicar un modelo step-down, reduciendo la dosisinicial de 100 UI/día a 50 UI/día durante la fase foli-cular tardía, al observar un folículo > de 10 mm. Estemodelo surge experimentalmente con los trabajos deZeleznik (Zeleznik et al, 1985), desarrollados en pri-mates, donde observaron que el folículo dominantenecesita poco estímulo FSH para continuar su creci-miento y maduración, siendo estas bajas concentra-ciones de FSH incapaces de estimular el desarrollo deotros folículos inmaduros. También observaron que lallamada ventana ovulatoria estaba mejor sincronizadacon un modelo step-down que con uno step-up .Estemodelo ya ha sido utilizado con buenos resultados enSOP por el grupo de Fauser (Van Santbrink yFauser,1997; Fauser y Van Heusden,1997). En condi-ciones normales, el incremento de los niveles de laFSH interciclo (periodo de transición fase lútea-fasefolicular), son suficientes para iniciar el reclutamien-to folicular (nivel umbral eficaz), rescatándolos de laatresia. La disminución de FSH durante la fase foli-cular media es crucial para seleccionar un único folí-culo dominante. El crecimiento del folículo seleccio-nado con bajo estímulo FSH, sugiere un aumento dela sensibilidad del folículo en crecimiento a la FSH.Se ha sugerido que este aumento de la sensibilidaddepende de una regulación autocrina intraovárica enla secreción de estradiol, pero probablemente inter-vienen otros factores, actualmente no identificados(Fauser y Van Heusden,1997).

El aplicar conceptos fisiológicos a la estimulaciónovárica, mejora los éxitos y reduce las complicacio-nes, ya que el perfil endocrino de FSH y estradiol, asícomo el crecimiento del folículo, durante un protoco-lo step-down, se asemeja a lo observado durante lafase folicular del ciclo menstrual normal.

Esta variación en el protocolo de estimulación,

evitando el reclutamiento de más de un folículo líder,probablemente ha contribuido a reducir la incidenciadel SHO (leve) a un 6.2%, sin observar ningún emba-razo gemelar, manteniendo unos aceptables nivelesde estradiol preHCG de 476 ( 222 pg/ml.

En conclusión, cuando se induce la ovulación a unelevado número de pacientes con SOP, las cancela-ciones por mala respuesta, son relativamente frecuen-tes. En estas pacientes debemos de ir prescindiendode esquemas fisiopatológicos pragmáticos, simplistasy antiguos, y buscar nuevos protocolos basados en laevidencia.

Si la paciente no responde al protocolo clásica-mente establecido, debemos individualizar el trata-miento, buscando la dosis diaria eficaz de FSH en esapaciente, que nos conduzca al objetivo final de alcan-zar un ciclo mono o bifolicular. La adopción de unmodelo step-down puede ayudar a conseguir este ob-jetivo.

Este protocolo, basado en incrementar y adelantarla dosis inicial de FSHr, seguido de un step-down, haproporcionado unos resultados iniciales satisfactorios.

Desgraciadamente, a pesar de diseñar nuevos pro-tocolos, asociando metformina, utilizando antagonis-tas, realizando cirugía ovárica laparoscópica, o inclu-so FIV, las pacientes con SOP malas respondedorassiguen siendo problemáticas.

BIBLIOGRAFÍA

1. Buckler HM, Robertson WR et al.: Ovulation induc-tion with low dose alternate day recombinant folliclestimulating hormone (Puregon). Hum Reprod, 1999;14:2969-2973.

2. Homburg R and Howles CM.: Low-dose therapy foranovulatory infertility associated with polycysticovary syndrome: rationale, results, reflections and re-finements. Hum Reprod Update, 1999; 5:493-499.

3. Van der Meer M, Hompes PGA, et al.: Cohort sizerather than FSH threshold level determines ovariansensivity in polycystic ovary syndrome. J ClinEndocrinol Metab, 1998; 83:423-426.

4. White DM, Polson DW, et al.: Induction of ovulationwith low-dose gonadotropins in polycystic ovary syn-drome: an analysis of 109 pregnancies in 225 women.J Clin Endocrinol Metab, 1996; 81:3821-3824.

5. Coelingh-Bennink HJT, Fauser BCJM, and Out HJT.:Recombinant follicle-stimulating hormone (FSH:Puregon)is more efficient than urinary FSH (Metrodin) in womenwith clomiphene citrate resistant, normogonadotophic, chro-nic anovulation: a prospective, multicenter, assessor-blind,randomised, clinical trial. Fertil Steril, 1998; 69:19-27.



6. Hedon B, Hugues JN, et al.: A comparative prospec-tive study of a chronic low dose versus a conventionalovulation stimulation regimen using recombinant hu-man follicle-stimulating hormone in anovulatory in-fertile women. Hum Reprod, 1998; 13:2688-2692.

7. Hayden CJ, Rutherford AJ and Balen AH.:Induction of ovulation with the use of a starting doseof 50 units of recombinant human follicle-stimulatinghormone (Puregon*). Fertil Steril, 1999; 71:106-109.

8. Yarali H, et al.: Urinary follicle-stimulating hormone(FSH) versus recombinant FSH in clomiphene citrate-resistant, normogonatropic, chronic anovulation: aprospective randomized study. Fertil Steril, 1999;72:276-281.

9. Yarali H, et al.: Gonadotropin treatment using low-dose step-up protocol in patients with clomiphene ci-trate (CC) resistant polycystic ovary syndrome : fac-tors affecting outcome. Fertil Steril, 2001; 76:3s,291-295.

10. Adams J., Polson DW, Franks S.: Prevalence ofpolycystic ovaries in women with anovulation or idio-pathic hirsutism. Br Med J, 1986; 293:355-359.

11. Pache TD, Hop WC, et al.: 17 beta oestradiol, an-drostenedione and inhibin levels in fluid from indivi-dual follicles of normal and polycystic ovaries, and inovaries from androgen treated female to male transse-xuals. Clin Endocrinol (Oxf) 1992; 36:565-571.

12. Fauser BCJM.: Observations in favour of normalearly follicle development and disturbed follicle selec-tion in PCOS. Gynecol Endocrinol 1994; 8:75-82.

13. Balasch J, Fábregues,F, et al.: Desarrollo folicular yniveles hormonales tras la administración de hormonafolículoestimulante recombinante o altamente purifica-da en mujeres normo-ovuladoras y en pacientes estéri-les con anovulación tipo II de la OMS. J Assis ReprodGenet 1998; 15:1-11.

14. Hugues JN, et al: Sequential step-up and step-down do-se regimen: an alternative method for ovulation induc-tion with follicle-stimulating hormone in polycysticovary syndrome. Hum Reprod 1996; 11: 2581-2584.

15. Balasch J, Tur R, et al.: The safety and effectivenessof stepwise and low-dose administration of follicle sti-

mulating hormone in WHO group II anovulatory infer-tile women: evidence from a large multicenter study inSpain. J.Assist.Reprod.Genet 1996; 13:551-556.

16. Homburg R, Levy T and Ben Rafael Z.: A compara-tive prospective study of conventional regimen withchronic low dose administration of follicle-stimulatinghormone for anovulation associated with polycysticovary syndrome. Fertil Steril 1995; 63:729-733.

17. López-López E.: Gonadotropinas recombinantes eninducción de la ovulación. Rev Ib Fert 1999; 16:279-288,

18. Daya,S.: Differences between crossover and parallelstudy designs debate?. Fertil Steril 1999; 71: 771-772.

19: Van Santbrink EJP and Fauser BCJM.: Urinary fo-llicle-stimulating hormone for normogonadotropic clo-miphene resistant anovulatory infertility: prospective,randomised comparison between low-dose step-up andstep-down dose regimens. J Clin Endocrinol Metab1997; 82:3597-3602.

20. Balasch J, Fábregues F., et al.: Follicular develop-ment and hormone concentrations following recombi-nant FSH administration for anovulation associatedwith polycystic ovary síndrome : prospective, rando-mised comparison between low-dose step-up and mo-dified step-down regimens. Hum Reprod 2001;16:652-656.

21. Ben-Rafael Z, Straus JF, et al.: Differences in ova-rian stimulation in human menopausal gonadotropin-treated women may be related to follicle-stimulatinghormone accumulation. Fertil steril 1986; 46: 586-592.

22. Fauser BCJM.: Step-down regimen in PCOS. In:Filicori M ed. Ovulation induction:basic science andclinical advances. Excerpt Med Int Congr Ser 1046.Amsterdam:Elsevier 1994; 153-162.

23. Zeleznik AJ, Hutchinson JS, Schuler HM.:Interference with the gonadotropin-suppressing ac-tions of estradiol in macaques overrides the selectionof a single preovulatory follicle. Endocrinology 1985;117: 991-999.

24. Fauser BCJM and Van Heusden A.: Manipulation ofhuman ovarian function: physiological concepts andclinical consequences. Endocr Rev 1997; 18: 71-106.

Análisis citoquímico ultraestructural de los componentes glucídicos conte-nidos en la zona pelúcida y gránulos corticales de ovocitos humanos.

Fernández PJ***, Jiménez-Movilla M*, Avilés M*, Gómez-Torres MJ**, Castells MT*, DeJuan J**, Romeu A*** y Ballesta J*

*Departamento de Biología Celular, Universidad de Murcia, Murcia; **Departamento deBiotecnología, Universidad de Alicante, Alicante; ***Servicio de Ginecología(Reproducción Humana), Hospital Universitario La Fe, Valencia.




ANTECEDENTES

La zona pelúcida (ZP) es una matriz extracelularque recubre los ovocitos ováricos, ovocitos ovuladosy el embrión preimplantado. Esta matriz extracelularestá constituida principalmente por tres glicoproteí-nas altamente glicosiladas denominadas ZP1, ZP2 yZP3. Estas proteínas están involucradas en el reco-nocimiento y unión del espermatozoide, en la reac-ción acrosómica y en la protección del embrión du-rante su tránsito por el oviducto (Yanagimachi,1994). Se ha demostrado en diferentes especies in-cluido el hombre que los azúcares juegan un papelimportante durante la unión primaria entre el esper-matozoide y el ovocito (Wassarman et al., 2001;Oehninger S., 2001). Tras la fecundación, los gránu-los corticales presentes en el córtex del ovocito libe-ran su contenido al espacio perivitelino e inducenuna serie de cambios en la zona pelúcida, conocidoscomo reacción zonal, responsables del bloqueo de lapoliespermia. Así, más concretamente el receptor pri-mario, ZP3, pierde su actividad biológica; es decirdeja de tener capacidad para unirse a los espermato-zoides y no es capaz de inducir la reacción acrosómi-ca (Bleil and Wassarman, 1980; Miller et al., 1994).

Se han descrito cambios producidos en las propie-dades electroforéticas de la ZP en el ratón (Bleil etal, 1981; Moller y Wassarman, 1989), en el hámster(Moller et al, 1990), en el cerdo (Brown et al, 1990;Hatanake et al 1992) y en la especie humana(Shabanowitz & O´Rand, 1988, Bauskin et al 1999).Estos estudios revelan que se trata de un procesocomplejo que no afecta por igual a las distintas espe-

cies. Así, en la especie humana, se observa un cam-bio en la movilidad electroforética únicamente de laZP1. Sin embargo en el ratón y en el hámster se ob-servan cambios en la ZP2, apareciendo una nuevaglicoproteína denominada ZP2f fruto de la proteolisisparcial de la ZP2 debida a la acción de una proteasapresente en los gránulos corticales. En cambio, no seobserva variación alguna en la ZP1 y la ZP3 tanto deratón como en hámster. Sin embargo se sabe que laZP3 aislada de embriones de dos células ha perdidototalmente su actividad biológica. Es aceptado queeste cambio en la ZP3 podría ser debido a un cambioen los oligosacáridos que componen esta glicoproteí-na. Estos cambios son tan sutiles que no son detecta-dos con una simple electroforésis (Miller et al., 1994;Wassarman et al., 2001), siendo necesario utilizartécnicas más sensibles para la detección de carbohi-dratos como son anticuerpos específicos y lectinas.Se ha sugerido que estos cambios pueden ser debidosa una modificación de estas glicoproteínas por la ac-ción de exoglicosidasas (Miller et al, 1992), o inclusodebido a la adición de nuevas proteínas con carbohi-dratos diferentes que puedan modificar la composi-ción de la zona (Pierce KE et al, 1990). Así se ha de-tectado una exoglicosidasa, concretamente el enzimaN-acetilglucosaminidasa, en los gránulos corticalesde óvulos de ratón (Miller et al, 1994).

Los gránulos corticales (GC) fueron descritos porprimera vez por Austin en 1956 en ovocitos de háms-ter. Estos GC son de un tamaño variable, entre 0,2 y0,6 micras según la especie animal, localizándose enlas cercanías del oolema. Desempeñan un importantepapel en el bloqueo de la polispermia debido a su

composición enzimática (Hoodbhoy T y Talbot P,1994). Tras la fecundación los GC son liberados alespacio perivitelino, proceso llamado reacción corti-cal. Es muy escasa la información que se tiene sobrela composición química y actuación de estos GC enmamíferos. La naturaleza glicoproteica de su conte-nido fue observada por primera vez con el microsco-pio de luz mediante técnicas convencionales enhámster, mono y hombre, confirmándose posterior-mente en el microscopio electrónico. Estudios poste-riores, gracias al uso de técnicas mucho más específi-cas como es la histoqu ímica de lectinas, hanpermitido identificar algunos carbohidratos en gránu-los corticales de diferentes especies (Roux et al,1991; Hoodbhoy T y Talbot P, 1994, Avilés et al1994, 1996, 1997 y 1999). Sin embargo solo hemosencontrado en la bibliografía un estudio que sugierela presencia de residuos de fucosa en los gránuloscorticales de ovocitos humanos utilizando la lectinaUEA1 con microscopia de luz (Hoodbhoy T y TalbotP, 1994). En cuanto a la composición enzimáticaapenas hay algún dato en GC de ratón (Pierce et al,1990) y prácticamente nada en humanos.

En este estudio nos planteamos como objetivosfundamentales el análisis ultraestructural de la com-posición glucídica de la ZP así como de los gránuloscorticales como base para futuros estudios que nospermitan dilucidar los cambios producidos durante lareacción zonal y el posible efecto producido por losgránulos corticales durante este proceso. Tambiénpretendemos investigar el origen de la formación dela zona pelúcida humana así como el nivel subcelularen el que ocurre su procesado.

METODOLOGÍA

Los ovocitos humanos fueron obtenidos de pa-cientes incluidas en el Programa de Fecundación InVitro del Hospital Universitario “La Fe” de Valencia,a las que se les estimuló la ovulación mediante FSHhasta el día de la administración de la gonadotrofinacoriónica humana (hCG) que fue administrada cuan-do, al menos, tres folículos alcanzaron un diámetromayor de 16 mm. 36 horas después de la administra-ción de la hCG, los ovocitos fueron obtenidos me-diante punción-aspiración folicular por vía vaginalguiada por ultrasonidos. Tras la punción folicular serealizó una evaluación preliminar de los ovocitos ca-talogándose como zona pelúcida fracturada, atrésicoo degenerado, profase I, metafase I, metafase II o me-tafase II postmaduro. Los ovocitos en profase I y MIfueron fijados, tal como se indica a continuación, a

las 3-4 horas tras la punción folicular. Los ovocitosen metafase II que no fecundaron in vitro fueron la-vados e inmediatamente fijados por inmersión englutaraldehído al 2% tamponado en cacodilato 0,1 MpH 7,4 durante dos horas a 4ºC. Tras la fijación todoslos ovocitos fueron lavados en tampón cacodilato yposteriormente fueron procesados para su posteriorinclusión en Lowicryl K4M para posteriores estudiosultraestructurales. Para la caracterización de glico-proteínas en diferentes estructuras de los ovocitos in-cluidos se utilizaron conjugados de lectinas o enzi-mas con digoxigenina siguiendo una técnica indirectade dos o tres capas. Así, los bloques obtenidos fueroncortados en secciones ultrafinas que fueron deposita-das sobre rejillas de níquel revestidas de Formvar-carbón. Las rejillas fueron incubadas en la lectina oenzima marcada con digoxigenina. La segunda capaes un anticuerpo monoclonal antidigoxigenina y co-mo tercera capa un anticuerpo de ratón marcado conoro coloidal. Cuando el marcaje fue de dos capas lasrejillas se colocaron en lectina sin marcar y despuésincubadas con glucoproteína-oro coloidal.

Las diferentes lectinas conjugadas con digoxigeni-na utilizadas en este estudio son las siguientes: AAA,DSA, GNA, LTA, MAA, MPA, PNA, SNA, WGA.Cada una de ellas reconoce un resto glicídico (mono-sacárido o disacárido). También se utilizaron variosanticuerpos monoclonales frente a los antígenos lewisa, lewis b, lewis x, sialil-lewis a y sialil-lewis x. Parala visualización de la unión específica entre la lectinao anticuerpo con su correspondiente azúcar se emplea-ron técnicas indirectas utilizando como marcador par-tículas de oro coloidal tal y como ha sido previamen-te descrito (Avilés et al., 1996, 1997, 1999, 2000 a,b).

Algunas secciones ultrafinas fueron tratadas pre-viamente al uso de la lectina PNA con el enzima neu-raminidasa tipo V de Clostridium perfringens a unaconcentración de 1 U/ml diluido en tampón acetato apH 5 durante 3 horas a 37ºC en una cámara húmeda.Este tratamiento permite la eliminación de los resi-duos glucídicos Neu5Ac presentes en posición termi-nal de las cadenas glucídicas.

También se utilizaron anticuerpos anti ZP3 de cer-do (que presenta reacción cruzada con la ZP humana,no olvidemos que ambas glicoproteínas presentan unaanalogía del 74%) para el marcaje total de la ZP hu-mana y de otras estructuras subcelulares.

Para determinar si los diferentes residuos glucídi-cos detectados mediante técnicas citoquímicas se en-contraban distribuidos de un modo homogéneo o he-terogéneo en el espesor de la zona pelúcida se harealizado un estudio cuantitativo mediante la utiliza-ción de un analizador de imágenes IMCO10. Para


ello se divide la zona pelúcida en dos partes iguales,una próxima al ovocito denominada zona interna yotra próxima a las células del cúmulo denominada zo-na externa. La cuantificación se realiza determinandola densidad de marcaje en cada una de estas zonas ex-presada como número de partículas de oro coloidalpor cada micrómetro cuadrado de zona pelúcida. Ladensidad de marcaje obtenida en cada zona se compa-ra mediante un análisis estadístico utilizando la t destudent.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

El anticuerpo anti ZP total de cerdo marcó conclaridad la zona pelúcida humana (ver Figura 1) ob-servándose una intensidad mayor de marcaje en la re-gión interna (próxima al oolema) que en la externa(próxima a la granulosa). Ello se debe a la mayor po-rosidad (como puede comprobarse por microscopíaelectrónica de barrido) de la ZP externa que la inter-na. Así mismo el anticuerpo anti ZP total de cerdotambién mostró marcaje en el Aparato de Golgi, porlo que parece claro que el origen de la zona pelúcidahumana está en el propio ovocito. Estos resultados sehan visto confirmados al utilizar anticuerpos anti ZP3humana (Figura 2). Actualmente estamos preparandola fijación de cortes de ovario para establecer si, co-mo sugieren otros autores, las células de la granulosatambién participan en la formación de la ZP humana.

La ZP humana fue intensamente marcada con las

lectinas AAA (Figura 3), DSA (Figura 4), MAA,MPA y WGA (Figura 5) . No se observó reactividadalguna con las lectinas GNA, PNA, LTA y SNA. Lalectina PNA mostró una alta afinidad por la zona pe-lúcida únicamente en las secciones tratadas previa-mente con el enzima neuraminidasa (Figura 6). Todosestos resultados sugieren la presencia de los siguien-tes residuos glucídicos terminales: GlcNAc (WGA),Gal(1,4GlcNAc (DSA), Neu5Ac(2,3Galß1,4 (MAA),Neu5Ac-Galß1,3GlcNAc (Neuraminidasa-PNA) ytambién el residuo Fucosa unido por enlace ß1,6 al“core” de las cadenas oligosacarídicas N-unidas a laproteína (AAA). El uso de los diferentes anticuerposmonoclonales contra los antígenos lewis y sialil-lewisnos demuestra que la zona pelúcida humana presentalos siguientes tetrasacáridos αNeuAc2-3ßGal1-3(α Fuc1-4)ßGlcNAc y NeuAcßGal1-4(α Fuc1-3)ßGlcNAc correspondientes a los antígenos sialil-le-wis a y anti-sialil-lewis x respectivamente.

El análisis de las diferentes electronografías de-muestran que el marcaje obtenido con las diferenteslectinas y anticuerpos se encuentra distribuido en to-do el espesor de la zona pelúcida. Sin embargo, cabedestacar que algunos residuos detectados en concretocon el anticuerpo anti-sialil-lewis a no se encuentranpresentes en la región próxima al ovocito (Figura 7).Esto demuestra que la composición glucídica de lazona pelúcida es heterogénea en su espesor. Este re-sultado ha sido previamente descrito en roedores (ratay ratón) (Avilés et al., 1997,1999,2000 a,b), pero no


Figura 1Zona pelúcida (ZP) humana marcada con anticuerpo ZP

total de cerdo.

Figura 2Ovocito humano MII marcado con el anticuerpo anti ZP3humana cedida por el Dr. Dean. Obsérvese el mayor mar-caje en región interna de la zona pelucida (ZP). Ov: ovo-

plasma. CG: gránulos corticales.


Figura 3Ovocito humano marcado con la lectina AAA (reconocerestos de fucosa). Hay un marcaje de la ZP y, de forma

muy específica, de los gránulos corticales (GC).

Figura 5Marcaje de ovocito humano con la lectina WGA que reco-

noce el resto _aN-acetilglucosamina. Nótese el intensomarcaje (flechas) de los gránulos corticales. (GC)

Figura 6Marcaje de ovocito humano con la lectina PNA. En la fotode la izquierda tenemos un corte sin tratar con la enzimaneuroaminidasa (PN). A la derecha un corte tratado con

enzima neuroaminidasa (NEU/PN). El marcaje neuroami-nidasa-PNA reconoce el disacárido Gal_1,3GlcNAc.

Figura 4Marcaje con la lectina DSA de la ZP de un ovocito huma-no. Reconoce el disacárido lactosamina. Nótese el detalle(flechas) de la presencia de lactosamina en los gránulos

corticales (GC). Ov. Ovoplasma.

en la especie humana. Aunque su significado biológi-co aún está por clarificar, pudiera ser que los tetrasacá-ridos conocidos como sialyl Lewis x y sialyl Lewis atuvieran afinidad por moléculas tipo selectina presen-tes en el espermatozoide. En concreto se ha demostra-do se ha encontrado la presencia de P-selectina en lamembrana acrosómica de espermatozoides de cerdo.Así, el tetrasacárido sialyl Lewis a podría estar impli-cado en el reconocimiento primario del espermatozoi-de humano. Estos resultados están siendo confirmadosactualmente gracias a un análisis cuantitativo.

Los gránulos corticales fueron reactivos a las lecti-nas AAA (Figura 3), DSA (Figura 4), MAA, MPA,PNA y WGA (Figura 5). De igual modo se observó quelos anticuerpos anti-sialil-Lewis x mostraron afinidadpor estas organelas. Cabe destacar que se pueden distin-guir algunos gránulos corticales que no mostraron reac-tividad o una reactividad muy débil con las lectinas y elanticuerpo descritos anteriormente. Esto nos sugiereque existen al menos dos poblaciones de gránulos corti-cales que difieren en su contenido glucídico.Desconocemos cual puede ser el significado fisiológicode esta diferente composición. Hasta la fecha, estos sonlos primeros resultados ultraestructurales que demues-tran la composición glucídica de los gránulos corticalesde los ovocitos humanos.

Por otro lado, la lectina AAA (que reconoce restos

de fucosa) y la DSA (reconoce el disacárido lactosa-mina) marca la membrana de vesículas de gran tama-ño (Figura 8a , Figura 8b) que no proceden del retícu-lo endoplasmático liso y que parecen demostrar quelas glicoproteínas de la ZP humana no son cortadas anivel de la furina en el aparato de Golgi. Este puntose ve reforzado por el hecho de que estas membranasson también marcadas con un anticuerpo contra ZPtotal de cerdo (Figura 9). Ello nos sugiere que, encontra de lo que hasta ahora se pensaba, la proteolísisde las proteínas ZP humana a nivel de la furina ocu-rre en el oolema. Este es un punto todavía controver-tido (Kiefer SM, Saling P, 2002; Qi H et al., 2002)que esperamos clarificar pronto si confirmamos nues-tros resultados realizando marcajes con anticuerposhumanos anti ZP3.

Este estudio ha sido subvencionado por laFundación Salud 2000 y por el Ministerio de Cienciay Tecnología (PM99-0137 y BFI2000-156).


Figura 7Anticuerpo anti-sialyl-lewis a (Sla). Reconoce el tretrasa-cárido _NeuAc2-3_Gal1-3(_Fuc1-4)_GlcNAc. Se observaun intenso marcaje en la región externa (más proxima a lagranulosa) de la ZP humana. La composición glicídica de

la ZP humana varía en su espesor.

Figura 8a y 8bLas lectinas AAA (reconoce fucosa) y DSA (reconoce lacto-samina) marcan la membrana de vesículas de gran tamaño

que no pertenecen al retículo endoplasmático liso.


BIBLIOGRAFÍA

1. Avilés M, Okinaga T, Shur BD, Ballesta J.:Differential expression of glycoside residues in themammalian zona pellucida. Mol Reprod Dev. 2000aNov;57(3):296-308.

2. Avilés M, El-Mestrah M, Jaber L, Castells MT,Ballesta J, Kan FW.: Cytochemical demonstration ofmodification of carbohydrates in the mouse zona pe-llucida during folliculogenesis. Histochem Cell Biol.2000b Mar;113(3):207-19.

3. Avilés M, Castells MT, Abascal I, Martínez-Menarguez JA, Draber P, Kan FW, Ballesta J.:Cytochemical localization of GalNAc andGalNAcbeta1,4Galbeta1,4 disaccharide in mouse zonapellucida. Cell Tissue Res. 1999; Feb;295(2):269-77

4. Avilés M, Jaber L, Castells MT, Ballesta J, Kan FW.:Modifications of carbohydrate residues and ZP2 andZP3 glycoproteins in the mouse zona pellucida after fer-tilization. Biol Reprod. 1997 Nov; 57(5):1155-63.

5. Avilés M, Jaber L, Castells MT, Kan FK, BallestaJ.: Modifications of the lectin binding pattern in therat zona pellucida after in vivo fertilization. MolReprod Dev. 1996 Jul;44(3):370-81.

6. Bauskin AR et al.: Mol Hum Reprod. 1999; 5:534-540.

7. Bleil JD, Wassarma PM.: Structure and function ofthe zona pellucida: identification and characterizationof the proteins of the mouse oocyte’s zona pellucida.Bev Biol, 1980a; 76:185-202-

8. Bleil JD, Beall CF, Wassarman PM.: Mammaliansperm-egg interaction: fertilization of mouse eggstriggers modification of the major zona pellucida gly-coprotein, ZP2. Dev Biol. 1981 Aug; 86(1):189-97.

9. Brown et al.: J Reprod Fert. 1990; 90:447-454.10. Hatanake et al.: J Reprod Fert. 1992; 95:431-440.11. Hoodbhoy T, Talbot P.: Mol Reprod Dev. 1994;

39:349-448.12. Kiefer SM, Sailing P.: Proteolytic processing of hu-

man zona pellucida proteins. Biol Reprod. 2002 Feb;66(2): 407-414.

13. Miller DJ, Macer MB, Sur BD.: Complementaritybetween sperm surface ß-1,4-galactosyltransferaseand egg-coat ZP3 mediates sperm-egg binding.Nature. 1992; 357:589-593.

14. Miller DJ, Gong X, Decker G, Shur BD.: Egg corti-cal granule N-acetylglucosaminidase is required formouse zona block to polyspermy. Nature. 1994;123:1431-1440.

15. Moller CC, Wassarman PM.: Dev Biol. 1989;132:103-212.

16. Moller CC et al.: Structural and functional relations-hip between mouse and hamster zona pellucida glyco-proteins. Dev Biol. 1990; 137:276-286.

17. Oehninger S.: Cells Tissues Organs. 2001, 168:58-64.18. Pierce KE et al.: Dev Biol.1990; 141:381-392.19. Qi H, Williams Z, Wassarman PM.: Secretion and

assembly of zona pellucida glycoproteins by growingmouse oocytes microinjected with epitope-taggedcDNAs for mZP2 and mZP3. Mol Biol Cell. 2002 Feb;13(2): 530-541.

20. Roux E, Kan FWK.: Changes of glycoconjugate con-tents of the zona pellucida during oocyte growth anddevelopment in golden hamster: a quantitative cyto-chemical study. Anat Rec. 1991; 230: 347-360.

21. Shabanowitz RB, O’Rand MG.: Molecular changesin the human zona pellucida associated with fertiliza-tion and human sperm-zona interactions. Ann N YAcad Sci. 1988; 541:621-32.

22. Wassarman PM, Jovine L, Litscher ES.: A profile offertilization in mammals. Nat Cell Biol. 2001 Feb;3(2):E59-64. Review.

23. Yanagimachi R.: Mammalian fertilization. En: ThePhysiology of Reproduction. 2ª Edición. Raven Press,Nueva York, 1994: 189-317

Figura 9Al utilizar anticuerpo anti ZP total de cerdo se marcan (ver

flechas) grandes vesículas presentes en el ovoplasma delovocito humano. Ello sugiere que la digestión de las glico-proteínas, a nivel de la furina, ocurre en el oolema, y no en

el aparto de Golgi.

avances que han experimentado las técnicas de re-producción asistida, las tasas de embarazo y de im-plantación que se consiguen con dichas técnicas si-guen siendo bajas. Datos recientes (CDC, 2000;ESHRE, 2001) muestran que entre el 75-80% de losembriones transferidos dos o tres días después de lapunción folicular no consiguen implantarse en el úte-ro. Se ha estimado que alrededor del 75% de los em-briones presentan fragmentación y asimetría y que sison cultivados in vitro, el 50% de ellos acaba dete-niendo su desarrollo durante la primera semana decultivo (Hardy, 1999; Hardy et al., 2001). Las razo-nes de ésta importante pérdida de embriones no estánclaras pero se han relacionado con una elevada inci-dencia de anomalías cromosómicas (Munné et al.,1995; Wells and Delhanty, 2000) y con condicionesde cultivo subóptimas (Hardy, 1993; Bavister, 1995).

Los nuevos conocimientos sobre los mecanismosmoleculares que rigen procesos como la maduracióndel ovocito, el inicio de la expresión del genoma delembrión o las primeras fases del desarrollo embrio-nario están ofreciendo nuevas perspectivas a la medi-cina reproductiva (Heikinheimo and Gibbons, 1998).Diferentes estudios han relacionado la presencia delfactor promotor de la maduración (MPF) con la sali-da de meiosis de la célula y a la proteína quinasa c-mos con el bloqueo en metafase II de los ovocitoshasta el momento en que se produce la fecundación(Heikinheimo and Gibbons, 1998; Cohen et al.,1999). Tras la fecundación, el MPF juega un papelimportante en la regulación del ciclo celular durantelas primeras divisiones mitóticas. Pero si bien elMPF es fundamental para que las células entren enmitosis, las ciclinas y sus respectivas quinasas sonlas responsables de la progresión del ciclo. Tanto laproteína quinasa c-mos como productos de trascrip-ción y proteínas del ciclo celular han sido identifica-

SUMARIO

El 50% de los embriones obtenidos mediante fe-cundación in vitro detienen su proceso de divisióncelular durante la primera semana de cultivo. Losfactores tradicionalmente asociados al bloqueo em-brionario son las anomalías cromosómicas y las con-diciones subóptimas de cultivo. No obstante, inclusoen condiciones ideales de cultivo y embriones de ex-celente calidad se produce el bloqueo de los embrio-nes. Existen claras evidencias de que la proteína nu-clear p27, un miembro de la familia Cip/Kip deinhibidores de ciclinas dependientes de kinasas(CDKs), juega un papel importante en diversos pro-cesos celulares fundamentales tales como la prolifera-ción y la diferenciación celular o la apoptosis. El pre-sente estudio, en el que se emplearon técnicas deinmunocitoquímica y microscopía confocal, se llevó acabo con el fin de determinar si la proteína p27 estáimplicada en el bloqueo de los embriones humanos invitro. Se analizaron 28 embriones de entre 4 y 8 célu-las de los cuales 16 eran embriones diploides bloque-ados in vitro y 12 eran embriones con desarrollo nor-mal. La expresión del inhibidor de ciclo celular p27fue dos veces superior en el grupo de embriones blo-queados in vitro respecto al grupo de los embrionescon desarrollo normal utilizados como control. Esteestudio demuestra por primera vez el incremento deexpresión de la proteína p27 en embriones humanosbloqueados en estadío de 4-8 células.

INTRODUCCIÓN

La fecundidad y la implantación natural en huma-nos son procesos de escaso éxito si se comparan conotras especies. Del mismo modo, y a pesar de los

Incremento de la expresión del inhibidor de CDKs (“Cyclin DependentKinase”) p27 en embriones bloqueados en estadío de células

Cívico S, Agell N, Bachs O, Balasch J, Vanrell JA

Unidad de Reproducción Asistida. Institut Clínic de Ginecología, Obstretricia yNeonatología. Hospital Clínic de Barcelona. Barcelona




das en ovocitos y pre-embriones humanos(Heikinheimo and Gibbons, 1998; Cohen et al.,1999).

Las primeras divisiones embrionarias están con-troladas por el RNAm materno. En el embrión huma-no, la expresión de los genes propios se inicia cuandoel embrión se encuentra en estadío de 4-8 células(Braude et al., 1988; Tesarik et al., 1988). Algunos delos primeros genes que se expresan en el embrión hu-mano codifican para proteínas asociadas con la divi-sión celular, proteínas que modulan las señales extra-celulares de crecimiento de la célula así como parafactores asociados con la implantación (Heikinheimoand Gibbons, 1998).

La progresión del ciclo celular en mamíferos estácontrolada por una serie de proteínas llamadas cicli-nas que constituyen la subunidad reguladora de unafamilia de quinasas, las quinasas dependientes de ci-clina (CDKs) cuya actividad es inhibida por los inhi-bidores de las CDKs (Tsihlias et al., 1999; Sgambatoet al., 2000; Slingerland and Pagano, 2000). Los inhi-bidores de las CDKs bloquean el ciclo celular en faseG1 cuando éstos son sobreexpresados en célulastransfectadas y se clasifican en dos familias: la fami-lia de las Cip/Kip (p21, p27, p57) que inhiben una va-riedad de complejos ciclina-CDK y la familia de lasInk4 (p15, p16, p18, p19) que son inhibidores especí-ficos de las CDK4/CDK6 (Sherr, 1994; Sherr andRoberts, 1995). La proteína nuclear p27 juega un pa-pel importante en diversos procesos celulares funda-mentales tales como la proliferación y la diferencia-ción celular o la apoptosis. Además la p27 es un gensupresor de tumores crítico en cuanto a la patogénesisde diversos procesos malignos en humanos y la dis-minución en su expresión se ha correlacionado conmal pronóstico en los pacientes de cáncer (Tsihlias etal., 1999; Sgambato et al., 2000; Slingerland andPagano, 2000).

El presente estudio, en el que se emplearon técni-cas de inmunocitoquímica y microscopía confocal, sellevó a cabo con el fin de determinar si la proteínap27 está implicada en el bloqueo de los embrioneshumanos in vitro, lo que, por lo que a nosotros nosconsta, no ha sido previamente investigado.

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención de embriones

Se estudian 28 embriones de entre 4 y 8 célulasprocedentes de 14 ciclos de Fecundación in vitro delos cuales 16 eran embriones diploides bloqueados in

vitro y 12 eran embriones que se desarrollaban nor-malmente. Los embriones no bloqueados empleadoscomo control proceden de pacientes sometidas a FIVpara diagnóstico genético preimplantacional (PGD)que fueron descartados para la transferencia embrio-naria por tratarse de embriones afectos.

Immunocitoquímica

Los embriones fueron fijados con paraformald-hehido y permeabilizados con una solución de TritónX-100 previamente a la incubación con anti- p27 (an-ticuerpo primario) y Cyanine 3 (anticuerpo secunda-rio fluorescente).

El control de la especificidad del anticuerpo anti-p27 fue realizado mediante incubación del anticuerpoprimario con proteína p27 purificada (p27 GST). El“background” de las muestras se determinó medianteincubación con el anticuerpo secundario en ausenciade anticuerpo primario. Sólo se observó backgroundcitoplasmático.

El análisis y cuantificación de la p27 se realizómediante microscopía confocal. Para estandarizar lasdiferentes medidas, se evaluó la relación entre elbackground citoplasmático y el marcaje nuclear.

Microcopía Confocal

Las muestras fueron analizadas mediante un mi-croscopio láser confocal TCS NT (Leica, Heidelberg,Germany). Para el procesamiento de las imágenes seempleó el software del propio microscopio. Los nive-les de p27 se expresaron como el ratio entre la densi-dad media (marcaje) que aparecía en el núcleo y laque aparecía en el citoplasma (background). Estos pa-rámetros se midieron utilizando el mismo software deLeica.

Estudio estadístico

Los resultados se presentan como media (desvia-ción standard. Se emplearon los test de Mann-Whitnery U-test y Fisher. Los datos fueron analizadoscon el programa SPSS (Statistics Package for SocialSciences, Chicago, IL, USA).

RESULTADOS

El grado de fragmentación que presentaban losembriones de uno y otro grupo era similar pero laproporción de embriones que presentaban al menosuna blastómera multinucleada era significativamente


superior en el grupo de embriones bloqueados(p<0.05).

Para analizar la expresión de la proteína p27 seutilizaron técnicas de inmunocitoquímica. La expre-sión de p27 fue significativamente superior en el gru-po de embriones bloqueados (media 2.53 (0.22) queen el grupo control (media 1.15 (0.14) (p<0.0001).Independientemente del grado de fragmentación o dela multinucleación, el grado de expresión de la p27 enlos embriones bloqueados fue siempre elevada. Sóloun embrión bloqueado, que no presentaba ni frag-mentación ni multinucleación, presentó niveles dep27 dentro del rango del grupo control. Es de resaltarel caso de dos embriones control y un embrión blo-queado que procedían de la misma paciente, los dosprimeros fueron p27 negativa y el embrión bloqueadofue claramente positivo para la proteína.

DISCUSIÓN

Sólo el 30% de los embriones obtenidos mediantefecundación in vitro alcanzan el estadío de blastocisto(Jones, 2000) y la mayoría de los embriones detienensu crecimiento entre las 4 y las 8 células (Bolton andBraude, 1987). El presente estudio es el primero endemostrar un incremento en la expresión de la proteí-na p27 en embriones bloqueados in vitro en estadíode células. La expresión de la proteína p27 fue dosveces superior en los embriones bloqueados que enlos embriones control.

El control preciso de la progresión del ciclo celu-lar se sabe que es crítico para el desarrollo normal dela célula. El desarrollo del embrión humano es unproceso rigurosamente controlado y una de las clavespara su regulación podría ser el equilibrio entre la ex-presión de promotores del ciclo celular, como las ci-clinas, y de inhibidores de ciclo, como los inhibidoresde las CDKs. Un estudio reciente mostraba que la so-brexpresión del inhibidor de ciclo p27 en ausencia deciclina E en el sincitiotrofoblasto podría ser un meca-nismo de control de proliferación de la placenta enhumanos (Bamberger et al., 1999). Los primeros ci-clos celulares en el embrión humano son muy rápi-dos: la primera división se produce entre las 20 y las22 horas postfecundación. De acuerdo con esto, losgenes que codifican para las ciclinas están entre losprimeros genes en ser expresados tras la activacióndel genoma propio del embrión (Heikinheimo andGibbons, 1998). Se cree que los mecanismos de con-trol del ciclo celular (checkpoints) no son operativosen los primeros estadíos de desarrollo (Handysideand Delhanty, 1997; Hunt, 1998) lo que explicaría la

elevada incidencia de aneuploidías y mosaicismo en-contrada en los embriones preimplantatorios (Munnéet al., 1995; Wells and Delhanty, 2000).

La elevada tasa de embriones que se bloquean enel estadío en el que se produce la activación del geno-ma (Braude et al., 1988; Tesarik et al., 1988) ha lleva-do a la hipótesis de que los embriones detienen sucrecimiento por un fallo de activación del genoma delembrión o de al menos una proporción significativade las blastómeras que lo componen. Sin embargo,otros estudios han demostrado que hay síntesis deproteínas en embriones bloqueados lo que sugiereque la causa del bloqueo de los embriones no essiempre un fallo en la expresión del genoma del em-brión (Artley et al., 1992; Artley and Braude, 1993).Además, se ha encontrado que aunque el patrón desíntesis de proteínas es diferente entre las blastómerasde un mismo embrión, en términos de activación delgenoma las blastómeras se comportan de forma sin-crónica, presentando todas o ninguna activación delgenoma . Así pues, se ha postulado que las anomalíasen el desarrollo podrían relacionarse con anomalíasen el citoplasma inducidas por las condiciones de cul-tivo in vitro y que la activación del genoma no seríala causa primera de bloqueo del embrión sino que se-ría inducido como un evento secundario (Artley andBraude, 1993). Por tanto, las estrategias para superarel bloqueo de los embriones in vitro pasan por enten-der los requerimientos del embrión humano y mejorarlos sistemas de cultivo (Heikinheimo and Gibbons,1998; Jones, 2000; Loutradis et al., 2000). No obstan-te, incluso en condiciones ideales de cultivo y em-briones de excelente calidad se produce una elevadaincidencia de bloqueo embrionario (Jones, 2000;Hardy et al., 2001).

El pre-embrión humano tiene la capacidad de res-ponder a estímulos externos (Heikinheimo andGibbons, 1998) y se ha postulado que los inhibidoresde CDKs juegan un papel fundamental en el bloqueodel desarrollo y la diferenciación celular en respuestaa señales extracelulares (Nakayama and Nakayama,1998).

Las proteínas de la matriz extracelular juegan unpapel importante durante el desarrollo embrionario,afectando al crecimiento y a la diferenciación celular(Sueoka et al., 1997). Estas moléculas no sólo conec-tan las proteínas de la matriz extracelular a compo-nentes del citoesqueleto sino que transfieren informa-ción fundamental para la normal morfogénesis ydiferenciación celular (Sueoka et al., 1997). Variosestudios han demostrado la expresión de diversas in-tegrinas en el embrión humano (Campbell et al.,1995; Sueoka et al., 1997; Dubey et al., 2001). Las


integrinas podrían regular la progresión del ciclo ce-lular a través de la adhesión de las células (Fang etal., 1996). Muchos tipos celulares sólo pueden crecery proliferar si se encuentran adheridas a un sustrato.

Un incremento en los niveles del inhibidor deCDKs p27 provoca el bloqueo del ciclo celular en cé-lulas a las que se separa del sustrato (Sgambato et al.,2000). Por tanto, es tentador especular que el incre-mento de p27 en los embriones bloqueados in vitropuede explicarse por la falta de adhesión de los em-briones a proteínas de la matriz extracelular. La mul-tinucleación y la elevada incidencia de anomalíascromosómicas en los embriones humanos, más fre-cuentes en los embriones bloqueados, son limitacio-nes de nuestro estudio. Sin embargo, ni la multinucle-ación ni las anomalías cromosómicas o el daño en elDNA han sido asociados en células de mamífero a in-crementos de expresión de la p27 (Wang, 1998).Además, el 67% (10/15) de los embriones bloqueadosque mostraron niveles altos de expresión de p27 nopresentaban blastómeras multinucleadas.

En conclusión, este estudio representa la primerademostración del incremento de expresión de la pro-teína p27 en los embriones humanos bloqueados enestadío de células.

BIBLIOGRAFÍA

1. Artley JK, Braude PR.: Biochemistry of the preim-plantation embryo: Assist Reprod Rev 1993; 3, 13-18.

2. Artley J, Braude P, Johnson M.: Gene activity andcleavage arrest in human pre-embryos. Hum Reprod1992; 7, 1014-1021.

3. Bamberger AM, Sudahl S, Bamberger CM et al.:Expression patterns of the cell-cycle inhibitor p27 andthe cell-cycle promoter cyclin E in the human placentathroughout gestation: implications for the control ofproliferation. Placenta 1999; 20, 401-406.

4. Bavister BD.: Culture of preimplantation embryos:facts and artifacts. Hum Reprod Update 1995; 1, 91-148.

5. Bolton VN, Braude PR.: Development of the humanpreimplantation embryo in vitro. Curr Top Dev Biol1987; 23, 93-114.

6. Braude P, Bolton V, Moore S.: Human gene expres-sion first occurs between the four- and eight-cell sta-ges of preimplantation development. Nature 1988;332, 459-461.

7. Campbell S, Swann HR, Seif MW et al.: Cell adhe-sion molecules on the oocyte and preimplantation hu-man embryo. Hum Reprod 1995; 10, 1871-1878.

8. CDC.: 1998 Assisted Reproductive Technology

Success Rates. National summary and fertility clinicreports. Centers for Disease Control and Prevention,2000; Atlanta, Georgia.

9. Cohen J, Brenner C, Warner C et al.: Genetics ofthe fertilizing egg. In Jansen R and Mortimer D (eds.),Towards Reproductive Certainty; Ferti l i l ty andGenetics Beyond 1999. The Parthenon PublishingGroup, New York, 1999; pp. 231-246.

10. Dubey AK, Cruz JR, Hartog B et al.: Expression ofthe (v integrin adhesion molecule during developmentof preimplantation human embryos. Fertil Steril 2001;76, 153-156.

11. ESHRE.: Assisted reproductive technology in Europe,1997. Results generated from European registers byESHRE. Hum Reprod 2001; 16, 384-391.

12. Fang F, Orend G, Watanabe N et al.: Dependence ofcyclin E-CDK2 kinase activity on cell anchorage.Science 1996; 271, 499-502.

13. Handyside A, Delhanty J.: Preimplantation geneticdiagnosis: strategies and surprises. Trends Genet1997;13, 270-275

14. Hardy K.: Development of human blastocysts in vitro.In Bavister BD (ed.) , Preimplantation EmbryoDevelopment. Springer-Verlag, New York 1993; pp.184-199.

15. Hardy K.: Apoptosis in the human embryo. RevReprod 4, 125-134.

16. Hardy K, Spanos S, Becker D et al.: From cell deathto embryo arrest: mathematical models of humanpreimplantation embryo development. Proc Natl AcadSci USA 2001; 1999; 98, 1655-1660.

17. Heikinheimo O, Gibbons WE.: The molecular me-chanisms of oocyte maturation and early embryonicdevelopment are unveiling new insights into reproduc-tive medicine. Mol Hum Reprod 1998; 4, 745-756.

18. Hunt PA.: The control of mammalian female meiosis:factors that influence chromosome segregation. JAssist Reprod Genet, 1998; 15, 246-252.

19. Jones GM.: Growth and viability of human blas-tocysts in vitro. Reprod Med Rev 2000; 8, 241-287.

20. Loutradis D, Drakakis P, Kallianidis K et al.:Biological factors in culture media affecting in vitrofertilization, preimplantation embryo development,and implantation. Ann N Y Acad Sci 2000; 900, 325-335.

21. Munné S, Alikani M, Tomkin G et al.: embryo morp-hology, developmental rates, and maternal age are co-rrelated with chromosome abnormalities. Fertil Steril1995; 64, 382-391.

22. Nakayama K, Nakayama K.: Cip/Kip cyclin-depen-dent kinase inhibitors: brakes of the cell cycle engineduring development. BioEssays 1998; 20, 1020-1029.

23. Sueoka K, Shiokawa S, Miyazaki T et al.: Integrinsand reproductive physiology: expression and modula-



tion in fertilization, embryogenesis, and implantation.Fertil Steril 1997; 67, 799-811.

24. Sgambato A, Cittadini A, Faraglia B et al.: Multiplefunctions of p27kip1 and its alterations in tumor cells:a review. J Cell Physiol 2000; 183, 18-27.

25. Sherr CJ.: G1 phase progression: cycling on cue. Cell1994; 79, 551-555.

26. Sherr CJ, Roberts JM.: Inhibitors of mammalian G1 cy-clin-dependent kinases. Genes Dev 1995; 9, 1149-1163.

27. Slingerland J, Pagano M.: Regulation of the Cdk in-hibitor p27 and its deregulation in cancer. J CellPhysiol 2000; 183, 10-17.

28. Tesarik J, Kopecny V, Plachot M et al.: Early morp-hological signs of embryonic genome expression in

human preimplantation development as revealed byquantitative electron microscopy. Dev Biol 1988; 128,15-20.

29. Tsihilas J, Kapusta L, Slingerland J.: The prognosticsignificance of altered cyclin-dependent kinase inhibi-tors in human cancer. Annu Rev Med 1999; 50, 401-423.

30. Wang JYJ.: Cellular responses to DNA damage. CurrOpin Cell Biol 1998; 10, 240-247.

31. Wells D, Delhanty JDA.: Comprehensive chromoso-mal analysis of human preimplantation embryos usingwhole genome amplification and single cell compara-tive genomic hybridization. Mol Hum Reprod 2000; 6,1055-1062.

Prevención de embarazos triples transfiriendo “al menos un embrión demuy buena calidad”

Fernández-Shaw Zulueta S, Rodríguez Ramírez L, Grande de la Iglesia C, Pons Mallol I,Gallego Pastor E, Mayoral Figueroa M, García del Real Carvajal E.

URH-García Del Real. Madrid




INTRODUCCIÓN

En la especie humana siempre han existido algu-nos embarazos mú l t iples espontáneos. Gene-ralmente se trata de gemelos, más raramente trilli-zos y muy ocasionalmente de mas de 3 fetos(Moore, 1999; Capri Workshop group, 2000). Enlas últimas décadas, debido a la aparición las técni-cas de reproducción asistida, la frecuencia de estosembarazos múltiples se ha incrementado enorme-mente (Bortolus, 1999). Esto es debido a que, en unesfuerzo por incrementar la tasa de embarazo porciclo, los centros de FIV transfieren múltiples em-briones. De hecho, en muchos países europeos, setransfieren frecuentemente mas de 2 embriones(Nygren K. G., 2001).

Se sabe que las gestaciones múltiples conllevanmayores riesgos de morbilidad y mortalidad que lasúnicas, y que estos son progresivamente mayores amedida que el número de fetos aumenta (Moore1999). Por tanto, a pesar de que gracias a las mejo-ras de los cuidados perinatales ha habido un descen-so de los riesgos maternos y perinatales durante losúltimos 20 años, no se deben menospreciar cuandodecidimos el número de embriones a transferir.(Capri work shop, 2000). Por eso, en nuestra unidadde reproducción asistida se tiende a transferir 2 em-briones en lugar de 3 cada vez con mas frecuencia.

En este estudio hacemos un análisis retrospectivode los resultados de nuestra unidad de reproducciónasistida para determinar si la transferencia de 2 em-briones disminuye de forma considerable la probabi-lidad de embarazo o no.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se revisan las 318 transferencias embrionariasrealizadas entre Enero de 2000 y Junio de 2001. Setransfirieron uno, dos, tres, o cuatro embriones segúnel número de embriones disponibles, la edad de lapaciente, la presencia de factores uterinos, las peti-ciones de la pareja y los antecedentes de tratamientosde fertilidad. Pero no de una forma sistematizada, si-no que, caso por caso, se decidió el número de em-briones a transferir. El 87% de las transferencias fue-ron de 2 ó 3 embriones. La mayor ía de lastransferencias de 1 embrión se debieron a que la pa-reja no tenía mas embriones, y las transferencias de 4embriones se debieron a que la calidad embrionariaera extremadamente baja, solamente el 2,5% de lastransferencias fue de 4 embriones.

La edad de las pacientes tenía una media de 35,0años y una desviación típica de 3,82.

Se realizaron protocolos de estimulación ováricacon gonadotropinas en pauta larga o corta, punciónfolicular 35 horas después de administrar HCG yapoyo de fase lútea con progesterona. Se utilizaronmedios de cultivo Vitrolife, la inseminación de losovocitos se realizó mediante FIV o ICSI, y las trans-ferencias embrionarias se hicieron en D+2. La clasi-ficación de los embriones se hizo teniendo en cuentael número de blastómeros, grado de simetría y frag-mentación. Según estas características los embrionespodían tener una clasificación 10 (embriones de muybuena calidad), 8 (embriones de buena calidad) ó < 8(embriones de mala calidad). La confirmación delembarazo clínico se llevó a cabo mediante ecografíatransvaginal a partir de la 6ª semana de embarazo.

RESULTADOS

En la tabla 1 se muestran el número (N) y el porcen-taje (%) de transferencias con 1, 2, 3 ó 4 embriones, yel N y % de los embarazos obtenidos en cada caso.

Se puede observar que la tasa de embarazo más al-ta corresponde a las transferencias de 3 embriones,aunque no se han hallado diferencias estadísticamentesignificativas entre las tasas de embarazo (p = 0.083).Si comparamos solamente las transferencias de 2 y 3embriones se obtiene una p = 0,056 que indica quetampoco hay diferencias al 95 % de confianza.

El 12,5% de las transferencias de 3 embriones danlugar a embarazos triples en nuestra unidad. Las difi-cultades que conllevan estas gestaciones, tanto parala mujer como para los fetos son suficientemente im-portantes para que evitarlos resulte una prioridad delprograma de FIV, aún a costa de una cierta disminu-ción de las tasas de embarazo generales. A pesar deque nuestro equipo no considera que un embarazo ge-melar sea un fracaso del tratamiento, hay que recor-dar que el resultado deseado de un ciclo de FIV es unembarazo único. Las transferencias de 3 embrionesno solamente pueden dar lugar a embarazos triples,sino que además la frecuencia de embarazos únicosque se producen con ellas disminuye drásticamentefrente a la que obtenemos cuando transferimos 2 em-briones, como se puede ver en la tabla 2.

La proporción de embarazos únicos pasa del 73%cuando se transfieren 2 embriones al 54,2% cuando

se transfieren 3, siendo el valor de p = 0,044 (estadís-tico de Fisher).

Se han agrupado las transferencias según la cali-dad embrionaria del mejor embrión transferido, orde-nando los embriones de una transferencia en ordendecreciente de manera que se considera como “em-brión 1” el mejor embrión transferido y “embrión 4”el de peor calidad, siendo “embrión 2” y “embrión 3”las calidades intermedias. Esta clasificación no tieneen cuenta el número de embriones transferidos, así,cuando “embrión 1” = 10, se trata de “transferenciascon al menos un 10”

En la tabla 3 se reflejan las tasas de embarazo se-gún la calidad del “embrión 1” .

Se puede observar como,la tasa de embarazo másalta corresponde a aquellos casos en los que había almenos un embrión 10, independientemente del númerode embriones que se transfieran. Para analizar si exis-ten diferencias estadísticamente significativas entre es-tas tasas de embarazo se realizó una prueba exacta parachi cuadrado (prueba de Monte Carlo), obteniéndoseuna p = 0,04, rechazándose la hipótesis nula de inde-pendencia entre calidad del embrión 1 y embarazo.

Es interesante tener en cuenta que, según nuestraclasificación, cuando “embrión 2” es 10, “embrión1” también lo es. En esta situación solamente puedetratarse de transferencias de 2 embriones [10, 10] ode 3 embriones [10, 10, x] (siendo x cualquier calidadembrionaria). En cualquier caso se trata de transfe-rencias de dos embriones 10. Comparamos estos re-sultados con los obtenidos cuando solamente se trans-fiere un embrión 10. Los embarazos obtenidos enestos dos grupos de transferencias son:

“Embrión 1”= 10 “Embrión 2”= 10n = 64 n = 165embarazos = 23 (35,9%) embarazos=74 (44,8%)

Las diferencias entre transferir un embrión 10 odos, a pesar de presentar tasas de embarazos diferen-tes, siendo más elevada la correspondiente a dos em-


Nº embriones transferidos

1 2 3 4 Total

Total N 32 174 104 8 318% 10,1% 54,7% 32,7% 2,5% 100%

Embarazo N 8 60 48 2 118% 25% 34,5% 46,2% 25% 37,1%

Tabla 1Transferencias con 1, 2, 3 ó 4 embriones y tasas de embarazos

Nº embriones transferidos

2 3

Embarazos únicos 44 (73,3%) 26 (54,2%)

Embarazos múltiples 16 (26,7%) 22 (45,8%)

Tabla 2Distribución de los tipos de embarazo con 2 y 3 embriones

Tabla 3Tasas de embarazo según la calidad del “embrión 1”

. Embrión 1

< 8 8 10

Nº de transferencias 8 64 144

% embarazos 0% 25% 41,5%


briones 10, no son estadísticamente significativas,con una p = 0,237.

Hemos combinado el factor “embrión 1”, que estádirectamente relacionada con la tasa de embarazo, yel factor “número de embriones transferidos”, que noafecta por sí solo a la tasa de embarazo. No se han te-nido en cuenta las transferencias de 1 embrión porqueno son electivas ya que solo se realizan cuando nohay mas embriones, ni las de 4 porque son escasas ysolo se realizan cuando hay muy mala calidad em-brionaria, por lo que prácticamente se puede conside-rar que tampoco son electivas.

En la tabla 4 se puede observar que cuando el“embrión 1” es 8, es decir la pareja no tiene ningúnembrión 10, la tasa de embarazo es del 8,7% si trans-ferimos 2 embriones y de 37,5% si transferimos 3,con diferencias estadísticamente significativas entreestas tasas de embarazo (P=0,036).

Sin embargo, si el “embrión 1” es 10, es decir lapareja tiene al menos un embrión 10, la tasa de emba-razo con 2 ó 3 embriones no presenta diferencias es-tadísticamente significativas (p=0,119).

CONCLUSIONES

Según estos datos, cuando hay al menos un em-brión 10, si se transfieren solamente dos embrionesno se ve disminuida la probabilidad de éxito de la pa-reja y sin embargo desaparece el riesgo de embarazotriple.

No obstante, cuando no hay ningún embrión 10hay que sopesar que, por una parte, si transferimos 2

embriones la probabilidad de embarazo disminuyenotablemente, pero si transferimos 3, entonces apare-ce el riesgo de embarazos triples.

Tal vez la decisión de transferir tres embrionescuando no hay ninguno de muy buena calidad, debatomarse con la pareja y sean ellos quienes deban asu-mir los riesgos de una posible gestación triple.

En cualquier caso, parece determinante que hayaal menos un embrión de muy buena calidad paratransferir solamente dos embriones sin mermar laprobabilidad de embarazo de una pareja.

BIBLIOGRAFÍA

1. Licciardi F., Berkeley A. S., Krey L., Grifo J.,Noyes N.: “A two-versus three-embryo transfer: theoocyte donation model.” Fert. Ster. Vol. 75, nº 3,2001; 510-513

2. Dean N.L., Phillips S.J., Buckett W. M., BiljanM.M., Lin Tan S.: “Impact of reducing the number ofembryos transferred from three to two in women un-der the age of 35 who produced three or more high-quality embryos.” Fert. Ster., vol. 74, 2000; nº4, 820-823.

3. ESHRE Capri Worksop Group.: “Multiple gestationpregnancy”. Human Reproduction vol. 15, nº 7, 2000;1856-1864.

4. Van Royen E, Mangelschots K, De Neubourg D,Valkenburg M, Van de Meerssche M, Ryckaert G,Eestermans W, Gerris J.: “Characterization of a topquality embryo, a step towards single-embryo trans-fer” Hum. Rep., vol. 14, nº 9, 1999; 2345-2349.

Tabla 4Tasa de embarazo según la calidad del embrión 1 y el número de embriones transferidos.

Embrión 1 Nº embriones transferidos

2 3 p

Nº transferencias 1 1<8

% embarazos 0% 0%

Nº transferencias 23 248 0.036

% embarazos 8,7% 37,5%

Nº transferencias 150 7910 0,119% embarazos 38,7% 49,4%

Durante los últimos años se han realizado una se-rie de trabajos para estudiar la ET ecoguiada. Sin em-bargo, pocos de ellos están realmente randomizados ylos resultados son controvertidos (Coroleu et al,2000; Tang et al, 2001). En realidad, el mecanismopor el cual las tasas de embarazo aumentan, si es quelo hacen, no se conoce bien.

El objetivo de nuestro estudio es valorar si latransferencia ecoguiada disminuye la frecuencia detransferencias difíciles y aumenta la tasa de embarazopor transfer.

MATERIAL Y MÉTODOS

Este estudio prospectivo y randomizado se ha rea-lizado con todas las mujeres tratadas durante este pe-riodo en nuestro programa de FIV en la Unidad deReproducción Humana. Se han excluido las transfe-rencias de embriones congelados y los obtenidos pordonación ovocitaria. Tampoco se han incluido casosde ICSI ya que esta técnica no se realizaba en nuestraUnidad cuando el estudio se llevó a cabo. En todoslos casos la edad de las mujeres ha sido inferior a 40años. La randomización se realizó en el momento deltransfer, gracias a un programa informático de crea-ción de tablas randomizadas.

El manejo de nuestro ciclo ha consistido en la in-hibición farmacológica del eje hipotálamo-hipofisariomediante el acetato de triptorelina (Decapeptyl(®),Lasa, Madrid), administrado diariamente de formasubcutánea desde el día 20º-22º del ciclo previo altratamiento. Se ha comenzado con la inyección deFSH recombinante (Gonal F(®), Serono, Madrid) enel segundo día del ciclo en tratamiento y se han ad-ministrado 10000 UI de Gonadotropina CoriónicaHumana (Profasi(®), Serono, Madrid), por vía intra-

INTRODUCCIÓN

Desde que Steptoe y Edwards consiguieron la pri-mera gestación mediante la técnica de fertilizaciónin-vitro (FIV) en 1978, se han conseguido grandesavances para aumentar las tasas de embarazo comolas mejoras en la inducción de la ovulación (Diedrichet al, 1988), en los medios de cultivo (Gardner et al,1998) y el desarrollo de la microinyección espermáti-ca (ICSI) (Palermo et al, 1998). La embriotransferen-cia (ET) es el último paso en todo el proceso, siendoel más ineficiente y al que no se le ha prestado aten-ción hasta hace poco.

Se han descrito muchos factores para intentar ex-plicar el fracaso en la implantación embrionaria co-mo las anormalidades genéticas o defectos en la re-ceptividad uterina. Sin embargo, el fallo en laimplantación se puede deber, en gran medida, a lapropia transferencia.

Una encuesta realizada recientemente en el ReinoUnido sobre la práctica de la ET (Salha et al, 2001),mostró que el factor que obtuvo más puntuación fuela necesidad de un protocolo estandarizado para latécnica de la ET.

Schoolcraft et al. proponen, en una revisión bi-bliográfica reciente (2001), que el éxito de una ETconsiste en depositar los embriones en el fondo uteri-no de manera cuidadosa y atraumática, evitando lapresencia de moco o sangre en la punta del catéter, laretención de embriones en el mismo y la generaciónde contracciones uterinas. Para ello, sugieren la reali-zación de transferencias de prueba previas a la inicia-ción del ciclo, el lavado cervical con medio de culti-vo, el uso de catéteres blandos y la práctica deltransfer bajo control ecográfico para aumentar las ta-sas de embarazo.

La transferencia ecoguiada mejora las tasas de embarazo y aumenta lafrecuencia de las transferencias fáciles.

Urquijo E, Matorras R, Mendoza R, Corcóstegui B, Expósito A, Rodríguez-Escudero FJ.

Dpto. Ginecología y Obstetricia. Hospital de Cruces. Vizcaya.




muscular cuando se han objetivado al menos tres folí-culos de 18 mm de diámetro. La punción folicular pa-ra la obtención de ovocitos se ha programado a las 36horas tras la inyección de HCG y se ha realizadoguiada por ecografía transvaginal. La fase lútea se hasuplementado con 200 mg/12 horas de progesteronamicronizada (Progeffik(®), Effik) por vía vaginal.

Antes de comenzar la estimulación ovárica se hapracticado una transferencia de prueba para conocerlas características de ésta de cara a la ET. Para la ETse ha utilizado siempre el caté ter de Frydman(Laboratorio CCD, París). Este catéter consta de unacánula interna de poliuretano, que es blanda y mide23 cm de longitud, con un diámetro externo de 1,53mm y con un final abierto. Tiene una vaina externamás rígida que da estabilidad a la cánula interna sien-do ésta última la que lleva los embriones y la que pe-netra en la cavidad endometrial.

La ET se ha llevado a cabo a las 48-72 horas de laobtención de los ovocitos en el 86,8% de los casos.Las pacientes han sido colocadas en posición de litoto-mía dorsal y el cérvix se ha expuesto gracias a un espé-culo bivalvo, limpiando el exocérvix con medio HamF-10 (GIBCO BRL) y sin retirar el moco del canal cer-vical. Para seleccionar los embriones a transferir, se haevaluado su morfología, eligiendo los mejores embrio-nes y cargándolos en el catéter de Frydman medianteel procedimiento de las “tres gotas”, en el cual los em-briones están separados por una burbuja de aire de lagota de medio de Ham anterior y posterior.

La transferencia clínica clásica ha consistido en lainserción suave del catéter de Frydman a través delcanal cervical. Si tras tres intentos el paso del catéterno ha sido posible, se ha utilizado la pinza de Pozzien el labio anterior del cuello para horizontalizar elútero. Si, a pesar de esto, no se ha conseguido la in-serción, se ha usado un histerómetro. En muy pocoscasos se ha tenido que administrar anestesia paracer-vical por dolor o dificultad en el transfer. En todas lastransferencias, los embriones se han liberado según lasensación del clínico, intentando depositarlos a 1 cmdel fondo uterino gracias a la transferencia de pruebapreviamente realizada.

Se indicó a las mujeres a quienes se iba a realizarla transferencia bajo control ecográfico, que acudie-ran con la vejiga relativamente llena (3-4 horas desdela última micción). El ecógrafo que se ha usado ha si-do un Aloka SSD-1200 de 3,5 MHz. En estos casos,los embriones se han liberado cuando el catéter se halocalizado a 1 cm del fundus gracias a la imagen eco-gráfica. Las transferencias ecoguiadas se han realiza-do con el mismo catéter de Frydman. En la mayoríade los casos, el transfer se ha llevado a cabo sólo con

la cánula interna blanda, sin necesidad de utilizar lavaina externa. En los casos en los que no se ha podi-do realizar de la forma descrita se ha usado ayudainstrumental, como previamente se ha enunciado parala transferencia clásica.

En ambos tipos de transferencia, el catéter se haretirado cuidadosamente a los 10 segundos y se hacomprobado al microscopio la ausencia de embrionesretenidos en el catéter. Tras las transferencias, las mu-jeres han permanecido 30 minutos en la sala de recu-peración antes de ser dadas de alta, pudiendo vaciarla vejiga a los 10-15 minutos del transfer.

Nuestro protocolo de transferencia de embrionesha consistido en el transfer de 4 embriones, cuandoha sido posible, excepto en las transferencias de blas-tocistos, en los que sólo se han transferido 3.

Se ha definido gestación como test de embarazopositivo y presencia de saco gestacional por ecografía.

La clasificación de las transferencias es la siguiente:

1. Fácil: só lo se ha necesitado el caté ter deFrydman.

2. Dificultad media: ha sido necesaria la utilizaciónde una pinza de Pozzi.

3. Difícil: se ha necesitado el uso del histerómetro.4. Muy difíciles: han sido necesarios procedimientos

adicionales como la dilatación cervical, la anes-tesia paracervical o múltiples cambios de catéter.

Para el meta-análisis, se ha realizado una búsquedaen el Medline con las palabras clave “embryo transfer”y limitado con “randomized contolled trial”. Búsquedasadicionales se han llevado a cabo con: “embryo trans-fer”, “ultrasound” y “ultrasound-guided”.

Para comparar las variables cualitativas se ha uti-lizado el test estadístico de ß2 y el test de la t deStudent para comparar variables cuantitativas. El ni-vel de significación estadística se ha establecido en p< 0,05. La tasa de implantación y de embarazo se hanexpresado en forma de “odds ratio” (OR) y su 95%de intervalo de confianza (IC).

RESULTADOS

1. Homogeneidad de los grupos. (Tabla 1)

Ambos grupos han sido comparables en cuanto alas principales características demográficas y las ca-racterísticas del ciclo.

2. Tasa de embarazo. (Tabla 2)

La tasa de embarazo en el grupo ecoguiado ha si-


do significativamente más alta que en el grupo de latransferencia clásica (26,3% vs 18,1%; ß2 = 4,5, p =0,03; OR = 1,6, IC 95% = 1,.04-2,51).

La tasa de implantación ha sido de 11,1% en elgrupo ecoguiado frente a 7,5% en el grupo clásico (2= 6,5, p =0,01; OR = 1,5, IC 95% = 1,1-2,2). La tasade gestaciones evolutivas ha sido también superior enel grupo ecoguiado (22,4%) que en el grupo clásico(14,2%) (ß2 = 5,1, p = 0,02; OR = 1,7, IC 95% =1,07-2.8).

La frecuencia de embarazos ectópicos fue similaren ambos grupos: 3,0% en el grupo ecoguiado y 2,1%en el grupo clásico, al igual que la tasa de embarazosmúltiples.

3. Características de las transferencias. (Tabla 3)

En el grupo de la ET clásica el 80,8% de los tráns-feres han sido fáciles, 12,3% han sido de dificultad

media, 5,8% difíciles y 1,2% muy difíciles; mientrasque en el grupo de ET ecoguiadas el 96,9% de los ca-sos han sido fáciles, sólo el 2,7% de dificultad mediay el 0,4% difíciles, no habiendo ningún transfer muydifícil (ß2 = 34,2, p < 0,001).

Hemos conseguido buena visualización transabdo-minal del recorrido del catéter en el 85% de los casos.

Cuando se ha analizado la tasa de embarazo segúnla dificultad del transfer, se ha objetivado una tenden-cia a mayores tasa de embarazo en el grupo ecoguia-do que en el grupo clásico (26,3% vs 18,6%; ß2 =3,44, p = 0,06: OR 0 1,6, IC 95% = 0,98-2,5).

Dentro del grupo ecoguiado, cuando la ET se harealizado sin la vaina externa del catéter, la tasa deembarazo ha sido de 27,0% comparado con 24,7%,que es la tasa de embarazo alcanzada cuando se hautilizado la vaina externa (p > 0,05).

DISCUSIÓN

La posible utilidad del uso de la ecografía para fa-cilitar la ET fue primeramente descrita por Strickleret al. (1985) y poco después por Leong et al. (1985).En estos últimos años una serie de trabajos han estu-diado la transferencia ecoguiada, siendo sus resulta-dos controvertidos, tanto en trabajos randomizadoscomo no randomizados. Algunos estudios no rando-mizados han descrito mejores resultados con la ET


Tabla 1Principales características de la población en el grupo eco-guiado y en el grupo de transferencia clásica. Los valores se

expresan en la media ±desviación estándar, salvo en los casosque se especifica.

Diferencias no estadísticamente significativas

Transferencia Transferenciaecoguiada (n=255) clásica (n=260)

Edad mujer (años) 33,98 ± 3,12 34,21 ± 2,98Duración infertilidad (años) 4,78 ± 2,48 5,10 ± 2,81Primer ciclo FIV 71,0 72,3Infertilidad primaria (%) 82,4 77,3Factor tubárico (%) 29,0 32,7Endometriosis (%) 7,8 5,7Fracaso IAC (%) 14,1 19,2FIV pre-IAC (%) 17,20 35,32Infertilidad idiopática (%) 18,0 21,5Factor masculinomoderado (%) 25,9 31,1Estradiol en día de HCG (pg/ml) 1891 ± 751 1869 ± 843Ovocitos obtenidos 10,15 ± 6,00 10,49 ± 5,76Ovocitos inseminados 8,99 ± 5,06 9,48 ± 5,14Ovocitos fertilizados 6,12 ± 3,89 5,59 ± 3,56Embriones transferidos 3,54 ± 1,07 3,40 ± 1,20Embriones tipo I 2,01 ± 1,10 2,10±1,08Embriones tipo II 1,93 ± 1,02 1,74 ± 0,86Transfer en día 2 ó 3 (%) 85,9 87,7

Tabla 2Resultados de FIV con transferencia ecoguiada vs transferencia

clásica

Transferencia Transferencia Valor de pecogiada clásica

Tasa de embarazo 26,3 (67/255) 18,1 (47/260) 0,03Tasa de embarazo múltiple (*)(**) 32,8 (22/67) 29,8 (14/47) NSTasa de gestaciones triples (*) 16,4 (11/67) 10,6 (5/47) NSTasa de im-plantación 11,1 (100/93) 7,5 (66/884) 0,01Tasa de aborto 14,9 (10,67) 21,3 (10,47) NSTasa de embarazo evolutivo 22,4 (57/255) 14,2 (37/260) 0,02Tasa de embarazo ectópico 3,0 (2/67) 2,1 (1/47) NS

*: calculado sobre el número total de embarazos.**: incluyendo embarazos gemelares y triples.

bajo control ecográfico (Lindheim et al, 1999; Woodet al, 2000). En cuanto a los ensayos randomizados,se han hallado mejores resultados significativos en laET ecoguiada (Coroleu et al, 2000; Prapas et al,1995; Prapas et al, 2001), mientras que en otros ar-tículos no se han obtenido diferencias (Hurley et al,1991; Al-Shawaf et al, 1993; Kan et al, 1999; Tang etal, 2001). Algunas de estas discrepancias podrían de-berse a la diferente metodología empleada (selecciónde pacientes, método del transfer) y al tamaño reduci-do de algunas muestras estudiadas. Recientemente seha publicado que la ET ecoguiada mejora la tasa deembarazo si se realiza en los días 3 y 4, pero no si esen el día 5 (Prapas et al, 2001). De hecho, en un estu-dio reciente randomizado, aunque no han encontradodiferencias significativas en la tasa de embarazo, sílas han hallado en la tasa de implantación (Tang et al,2001). Por otra parte, muchos de los llamados “estu-dios randomizados” no lo son realmente, ya que elcriterio para realizar la ET bajo control ecográfico hasido la disponibilidad del ecógrafo o de determinadosginecólogos (Hurley et al, 1991; Al-Shawaf et al,1993; Prapas et al, 2001).

Nuestros datos evidencian que la transferenciaecoguiada mejora la tasa de embarazo significativa-mente (26,3% vs 18,1%) y la tasa de implantación(11,15 vs 7,5%). Si la tasa de embarazo de nuestrosdatos se analiza junto con los resultados de los traba-jos previos randomizados, el meta-análisis arroja di-ferencias estadísticamente significativas, tanto si seanalizan sólo los estudios realmente randomizadoscomo si también se incluyen en al análisis los traba-jos pseudo-randomizados. Como se puede observaren la tabla 4, en ambos análisis los resultados que seobtienen son similares y la OR se sitúa cerca de 1,5siendo estadísticamente significativa.

Hemos obtenido una tasa de embarazos ectópicosde 3,0% en el grupo ecoguiado, similar al grupo detransferencia clásica. En otros estudios previos tam-poco se ha observado que los embarazos ectópicosdisminuyeran al realizar las ET bajo control ecográfi-co (Hurley et al, 1991; Sieck et al, 1997; Coroleu etal, 2000).

En nuestra serie ha habido un importante descensode los tránsferes difíciles. Mientras que en las transfe-rencias clásicas el 6% de éstas han sido difíciles, sóloel 0,4% han sido difíciles cuando se ha utilizado laecografía. Además, incluso entre las transferenciasfáciles, ha habido una tendencia a tasas de embarazomayores cuando se ha realizado la ET bajo controlecográfico. La mayoría de las ET ecoguiadas se hanrealizado sin utilizar la vaina externa del catéter deFrydman, lo que sugiere menor trauma de inserciónen estos casos.

Un problema que existe al analizar la dificultad dela ET es su propia subjetividad. De hecho, dependede varios factores como pueden ser: la selección delpaciente, la técnica de la transferencia, el tipo de ca-téter o la experiencia del clínico. Por esto, los tránsfe-res referidos como difíciles varían ampliamente. Enuna serie de 876 transferencias, el 1,3% fueron impo-sibles de llevar a cabo, el 3,2% fueron muy difíciles yel 5,6% difíciles (Wood et al, 1985). En artículos másrecientes, algunos autores refieren el 2-3% de transfe-rencias difíciles (Coroleu et al, 2000), mientras queotros alcanzan el 14% (Tur-Kaspa et al, 1998) o el19% (Lindheim et al, 1999).

Coroleu et al. (2000) no observaron diferencias enla dificultad del transfer entre el grupo ecoguiado y elde las transferencias clásicas, aunque la frecuencia detránsferes no-fáciles fue baja en ambos grupos (2-3%). Kan et al. (1999) tampoco hallaron diferencias


Tabla 3Dificultad de la transferencia y tasa de embarazo. Transferencia ecoguiada vs transferencia clásica

Transferencia ecoguiada Transferencia clásica

Frecuencia (*) Tasa Frecuencia(*) Tasa embarazo(**) embarazo(**)

Fácil 96,9 (247/255) 26,3 (65/247) 80,8 (210/260) 18,6 (32/210)

Media 2,7 (7/255) 28,6 (2/7) 12,3 (32/260) 25 (8/32)

Difícil 0,4 (1/255) 0 (0/1) 5,8 (15/260) 0 (0/15)

Muy difícil 0 _ 1,2 (3/260) 0 (0/3)

*: p < 0.001 (( 2 = 34.2)**: p = 0.06 (( 2 = 3.44)


en la dificultad de la ET, pero excluyeron de su estu-dio a aquellas mujeres en las que se anticipaba untransfer difícil. Por otra parte, obtuvieron una fre-cuencia relativamente alta en ambos grupos (10-11%). En un estudio retrospectivo, aunque no se en-contraron diferencias significativas en la dificultad dela ET, sí se apuntó que cuando el útero estaba en mar-cada anteflexión, la sensación subjetiva era que eltransfer resultaba más fácil si se realizaba con controlecográfico (Wood et al, 2000).

Se ha demostrado que una transferencia fácil yatraumática es esencial para lograr la implantación(Wood et al, 1985; Diedrich et al, 1989; Goudas et al,1998; Ghazzawi et al, 1999), aunque también existentrabajos controvertidos (Tur-Kaspa et al, 1998).Posiblemente minimizando el trauma endometrial, sepodrían disminuir las contracciones miometriales, loque facilitaría la implantación (Fanchin et al, 1998;Lesny et al, 1998).

Según nuestra experiencia, creemos que un meca-nismo importante por el que hemos obtenido una tasade embarazo mayor en el grupo ecoguiado, es la dis-minución del trauma producido al introducir el caté-ter. Presumiblemente, el factor más importante es lavisualización de la cavidad endometrial y con fre-cuencia del canal cervical, facilitando la penetraciónatraumática en el útero. Siguiendo el paso del catétercon la ecografía, se disminuirían las posibilidades de

que el clínico contacte con el fondo, como han suge-rido Wood et al. (2000).

También se podría especular que el llenado de lavejiga necesario para realizar la ecografía abdominal,podr ía horizontalizar la unión ú tero-cervical(Sundstrom et al, 1984; Wood et al, 2000). Quizás lapresión del transductor ecográfico en el hipogastriojuegue también un papel. Otro factor a considerar esque la mayoría de las ET realizadas bajo control eco-gráfico, se llevaron a cabo con el catéter blando, sinla vaina externa. Existen una serie de artículos querefieren que el uso de catéteres blandos se asocia amayores tasas de embarazo que con los rígidos(Wood et al, 2000).

Aunque no lo hemos analizado en nuestro estudio,probablemente otro factor sería el adecuado emplaza-miento de los embriones dentro de la cavidad uterina,como ha sido comunicado recientemente (Coroleu etal, 2002). Por último, la transferencia ecoguiada pro-porciona confianza y seguridad tanto al clínico como ala paciente (Hurley et al, 1991; Al-Shawaf et al, 1993).

CONCLUSIÓN

De los datos de nuestro estudio, se concluye queel apoyo ecográfico en la transferencia se asocia auna mayor tasa de embarazo y que la transferenciaecoguiada disminuye la dificultad del embriotransfer.

Tabla 4Meta-análisis de la tasa de embarazo en ensayos randomizados. Transferencia ecoguiada vs transferencia clásica

Primer autor Año Transferencia Transferencia Valor de pecoguiada (tasa clásica (tasa dede embarazo) embarazo)

Hurley* 1991 20.2 (19/94) 17.5 (43/246) NSAl-Shawaf* 1993 28.9 (44/152) 30.3 (27.89) NSPrapas* 1995 36.1 (22/61) 22.5 (16.71) < 0.05Kan* 1999 37.8 (37/98) 29.8 (28/97) NSCoroleu 2000 50 (91/182) 33.7 (61/180) < 0.05Prapas* 2001 47.6 (206/433) 36.0 (229/636) < 0.05Tang 2001 26.0 (115/441) 22.5 (81/359) NSTrabajo actual 2002 26.3 (67/255) 18.07 (47/260) < 0.05META-ANÁLISIS GLOBAL 2002 35.0 (601/1716) 27.5 (532/1938) < 0.001 (a)META-ANÁLISIS (sólo los realmente randomizados) 2002 31.4 (273/870) 23.7 (189/799) < 0.001 (b)

a: ß2= 20 ; OR = 1.4 , 95% IC = 1.23-1.64b : ß2 = 12 ; OR = 1.5 , 95% IC = 1.18-1.85

Por lo tanto, parece inferirse que la facilitación delembriotransfer, puede jugar un papel en el aumentode la tasa de embarazo asociada a la transferenciaecoguiada.

No obstante, probablemente también desempeñeun papel la mejor ubicación de los embriones, comoha sido demostrado por otros autores, si bien, este he-cho no ha sido analizado en nuestra serie.

Por lo tanto, recomendamos la realización siste-mática de la trasferencia embrionaria bajo controlecográfico.

BIBLIOGRAFÍA

1. Al-Shawaf T, Dave R, Harper J, Linehan D, RileyP, Craft I.: Transfers of embryos into the uterus: howmuch do technical factors affect pregnancy rates? JAssist Reprod Genetic, 1993; 10:31-36.

2. Coroleu B, Carreras O, Veiga A et al.: Embryo transferunder ultrasound guidance improves pregnancy rates afterin-vitro fertilization. Hum Reprod, 2001; 15:616-20.

3. Coroleu B, Barri PN, Carreras O et al.: The influenceof the depth of embryo replacement into the uterine ca-vity on implantation rates after IVF: a controlled, ultra-sound-guided study. Hum Reprod, 2002; 17:341-6.

4. Diedrich K, Van der Ven H, Al-Hasani S, Krebs D.:Establishment of pregnancy related to embryo transfertechniques after in-vitro fertilization. Hum Reprod,1989; 4:111-4.

5. Fanchin R, Righini C, Olivennes F, Taylor S, deZiegler D, Frydman R.: Uterine contractions at thetime of embryo transfer alter pregnancy rates after in-vitro fertilization. Hum Reprod, 1998; 13:1968-74.

6. Ghazzawi IM, Al-Hasani S, Karaki R, Souso S.:Transfer technique and catheter choice influence theincidence of transcervical embryo expulsion and theoutcome of IVF. Hum Reprod, 1999; 14:677-82.

7. Goudas VT, Hammitt DG, Damario MA, SessionDR, Singh AP, Dumesic DA.: Blood on the embryotransfer catheter is associated with decreased rates ofembryo implantation and clinical pregnancy with theuse of in vitro fertilization-embryo transfer. FertilSteril, 1998; 70:878-82.

8. Hurley VA, Osborn JC, Leoni MA, Leeton J.:Ultrasound-guided embryo transfer: a controlled trial.Fertil Steril, 1991; 55:559-62.

9. Kan AKS, Abdadlla HI, Gafar AH et al.: Embryotransfer: ultrasound-guided versus clinical touch. HumReprod, 1999; 14:1259-61.

10. Kovacs GT.: What factors are important for successfulembryo transfer after in-vitro fertilization?. HumReprod, 1999; 14:590-2.

11. Leeton J, Trounson A, Jessup D, Wood C.: The tech-

nique for human embryo transfer. Fertil Steril, 1982;38:156-61.

12. Lesny P, Kill ick SR, Robinson J, Raven G,Maguiness SD.: Junctional zone contractions andembryo transfer: is it safe to use a tentaculum? HumReprod, 1999; 14:2367-70.

13. Lindheim SR, Cohen MA, Sauer MV.: Ultrasoundguided embryo transfer significantly improves preg-nancy rates in women undergoing oocyte donation. IntJ Gyn Obstet, 1999; 66:281-4.

14. Prapas Y. Prapas N, Hatziparasidou A et al.: Theechoguide embryo transfer maximizes the IVF results.Acta Eur Fertil, 1995; 26:113-5.

15. Prapas Y. Prapas N, Hatziparasidou A et al.:Ultrasound-guided embryo transfer maximizes the IVFresults on day 3 and 4 embryo transfer but has no im-pact on day 5. Hum Reprod, 2001; 16:1904-8.

16. Rijnders RJP, Mol BWJ, Broekmans FJ.: Use of ul-trasound guidance during embryo transfer. HumReprod, 2000; 15:2449.

17. Salha OH, Lamb VK, Balen AH.: A postal survey ofembryo transfer practice in the UK. Hum Reprod,2001; 16:686-90.

18. Schoolcraft WB, Surrey ES, Gardner DK.: Embryotransfer techniques and variables affecting success.Fertil Steril, 2001; 76:263-70.

19. Sieck UV, Jaroudi KA, Hollanders JM, HamiltonCJ.: Ultrasound guided embryo transfer does not pre-vent ectopic pregnancies after in-vitro fertilization.Hum Reprod, 1997; 12:2081-2.

20. Strickler RC, Christianson C, Crane JP, Curato A,Knight AB, Yang V.: Ultrasound guidance for humanembryo transfer. Fertil Steril, 1985; 43:54-61.

21. Sundstrom P, Wramsby H, Persson PH, LiedholmP.: Filled bladder simplifies human embryo transfer.Br J Obstet Gynaecol, 1984; 91:506-7.

22. Tang OS, Ng EHY, So WWK, Ho PC.: Ultrasound-guided embryo transfer: a prospective randomizedcontrolled trial. Hum Reprod, 2001; 16: 2310-5.

23. Taranissi M, Yang D, Al-Shawaf T.: Techniques ofembryo transfer. Hum Reprod, 1996; 11:458-9.

24. Tur-Kaspa I, Yuval Y, Bider D, Levron J, ShulmanA, Dor J.: Difficult or repeated sequential embryotransfer do not adversely affect in-vitro fertilizationpregnancy rates or outcome. Hum Reprod, 1998;13:2452-5.

25. Wood C, McMaster R, Rennie G, Trounson A,Leeton J.: Factors influencing pregnancy rates follo-wing in vitro fertilization and embryo transfer. FertilSteril, 1985; 43:245-50.

26. Wood EG, Batzer FR, Go KJ, Gutmann JN, CorsonSL.: Ultrasound-guided soft catheter embryo transferswill improve pregnancy rates in in-vitro fertilization.Hum Reprod, 2000; 15:107-12.


Inhibina y desarrollo folicular en el trasplante heterotópico de ovario sinpedículo vascular en ratas lewis singénicas

Callejo J, Vilaseca S, Medina M, Salvador C, Gómez Valencia E, Valls C, Prats P, Lailla JM.

Hospital Sant Joan de Déu. Barcelona. Universitat de Barcelona.




INTRODUCCIÓN

Los resultados decepcionantes obtenidos con lapreservación de oocitos en metafase II, junto con elaumento de la supervivencia a largo plazo en pacien-tes sometidas a altas dosis de quimioterapia, estándando impulso a los bancos de tejido ovárico paraaquellas mujeres que deseen conservar su fertilidad(1, 2). A partir de aquí, uno de los puntos que másatención está requiriendo por parte de los investiga-dores es el tratamiento que se deberá dar a este teji-do, tras el proceso de descongelación, para obteneruna adecuada maduración folicular y por ende unabuena tasa de gestaciones.

La recuperación funcional, tras el proceso de crio-preservación y posterior trasplante heterotópico deovárico sin pedículo vascular ya se ha constatado,tanto en el animal de experimentación como en hu-manos (3-5). Recientemente, nuestro grupo ha publi-cado un análisis morfológico de las características deeste tejido implantado, cuando es funcionante, desta-cando en el mismo una tasa significativamente infe-rior de folículos reclutados con respecto a la del teji-do normoinserto, junto con una hiperplasia de lagranulosa que, de algún modo, compensaba y en oca-siones superaba el área de tejido ovárico funcionante.Al mismo tiempo, de forma paradójica, aún siendo latasa de estradiol igual o superior en el grupo tras-plantado, los niveles de FSH de este grupo, eran sig-nificativamente superiores a los del grupo que teníael ovario normoinserto (6). Nos planteamos entoncesque, probablemente, esto era lo que determinaba lahiperplasia de la granulosa de los folículos en proce-so de maduración del grupo trasplantado.

El objetivo del presente estudio es comprobar siestos niveles de FSH elevados pueden estar relacio-nados con una secreción insuficiente de inhibina enlos implantes de tejido ovárico aún cuando este seaya funcionante.

MATERIAL Y MÉTODOS

Animales. Para la realización de este estudio secontó con la aprobación de la Comisión deInvestigación del Hospital Universitari Sant Joan deDéu y el Comité de Ética de experimentación animalde la Universitat de Barcelona. Se utilizaron ratasLewis singénicas de sexo hembra (Harlan Lewis,Bicester, UK) de 16 semanas de vida, en régimen decomida y agua ad libitum y se mantuvieron en unascondiciones controladas de temperatura y humedad ycon ciclos de luz-oscuridad de 12 horas. Se midieronniveles en sangre de E2 y FSH los días 0 (día de lacirugía), 4, 7, 14, 21 y 28 del estudio. Para la realiza-ción del estudio fueron randomizados en dos gruposdistintos: grupo A (grupo sham), grupo control de ra-tas con ovario normoinserto (n= 5); y grupo B, ova-riectomía y posterior implante autólogo heterotópicoSC (n= 5) y fueron sacrificados a los 28 días del im-plante, una vez comprobado el restablecimiento de lafunción hormonal mediante la determinación de losniveles hormonales en sangre, para realizar el estudiohistológico del tejido ovárico (normoinserto e im-plantado), análisis morfométrico y la demostraciónde la inhibina en el mismo mediante técnicas de in-munohistoquímica.

Proceso quirúrgico. Para anestesiar a los animalesse utilizó hidroclorido de ketamina (Ketolar; Parke-Davis, Morris Plains, NJ) a dosis de 0,1 mgr por gra-mo de peso. La mitad de la dosis anestésica se les ad-ministraba de forma IM al principio, a modo deinducción anestésica, y la otra mitad se les adminis-traba vía intraperitoneal a los 10 minutos. Después deuna laparotomía media se procedía a cerrar la incisióny aquí acababa la intervención para las ratas del gru-po A. A los animales del grupo B, tras la laparotomía,se les practicó una anexectomía bilateral y sección deambos ovarios en dos partes, inmediatamente se im-plantaron todos los fragmentos sobre el plexo ingui-nal izquierdo que había sido previamente disecado. Elmaterial de sutura que se utilizó para fijar los implan-tes y el plano muscular del abdomen del animal fuepolyglactin 000 (Vicryl; Ethicon, Edinburgh, UK). Lapiel se cerró con Seda 000 (Aragó Laboratories,Barcelona, Spain).

Medidas hormonales. Las concentraciones de E2y FSH en sangre de las ratas se midieron utilizandokits de laboratorio específicos. Las muestras fueronprocesadas por duplicado siguiendo las instruccionesdel proveedor. Para la medición de E2 utilizamos unmétodo de RIA directo en fase sólida (DiagnosticProducts Corporation, Los Angeles, CA). La sensibi-lidad del ensayo, definida como la concentración a95% de ligado, es de 30 pmol/L. La precisión intra einterensayo, obtenida por medidas repetidas en dosmuestras a distintas a distintas concentracionespmol/l, viene dada por los siguientes valores (me-dia±Sd, coeficiente de variación (CV)): intraensayo,36±5,9, CV=16,5%; 349±5,5, CV=7%; interensayo,131±18, CV=13,8%; 391±41, CV=10,6%. Para elanálisis de la FSH utilizamos un kit de RIA altamentesensible (Amersham Life Science, Amersham, LittleChalfont, UK). El límite de detección del ensayo esde 0,10ng/100(L, y la precisión intra e interensayo esde: intraensayo, 0,72±0,03, CV=4,.2%; interensayo,0,27±0,03, CV=10,7%; 1,81±0,11, CV=6,1%.

Estudio histológico, morfométrico y análisis in-munohistoquímico de Inhibina. La muestras quirúrgi-cas fueron fijadas en formol al 10%. Cada ovario fuemacroscópicamente seccionado siguiendo su eje ma-yor y los cortes se prepararon en medio de parafinasiguiendo la técnica habitual. Secciones de cuatro mi-cras, obtenidas mediante un microtomo Reichert-JungAutocut 2040 (Heidelberg, Germany) y fueron teñi-das con trichromo de Masson (7).

Para la digitalización de las muestras se utilizó unscanner AGFA DUOSCAN T2000 XL (Mortsel,Belgium) con el software FotoLook 32 V3.00 . La re-

solución óptica que se empleó fue de 2000 dpi. El tra-tamiento posterior de la imagen digital se llevó a ca-bo utilizando el programa IMAT (Desarrollado en losServeis Cientificotècnics de la Universitat deBarcelona). En el análisis morfométrico sólo se valo-raron los folículos en los cuales se evidenció una ca-vidad (folículos antrales). Sobre las imágenes digita-lizadas se dibujó el contorno interno y externo decada folículo (el contorno interno corresponde la ca-vidad antral del folículo). Las diferencias entre estosdos contornos permiten calcular el área de células dela granulosa que contiene dicho folículo (en µ/m2),área que se considera la parte funcional del folículo.

La demostración de la Inhibina en material fijadoen formol se realizó mediante inmunohistoquímica yutilizando un anticuerpo primario monoclonal,Inhibina alfa, clon R1, “Cell Marque” (MenariniDiagnósticos). El proceso técnico ha sido llevado acabo en un inmunoteñ idor de los laboratoriosMenarini Diagnósticos (1-6000), totalmente informa-tizado. Tras el proceso de digitalización, se procede ala objetivación del grado de impregnación deInhibina en cada preparación. Esta se realiza mirando“pixel a pixel” del objeto seleccionado y cuantifican-do los componentes del color: H (Hue) color, S(Saturation) saturación e V (Value) intensidad.Posteriormente se compara estadísticamente los valo-res hallados.

Análisis estadístico. El análisis estadístico fue rea-lizado con el programa SPSS-PC program (SPSS Inc.Chicago, IL). El estudio descriptivo contiene mediasy rangos. Se utilizaron los análisis estadísticos deltest de ANOVA y de Pearson. Se consiguió un nivelde significación estadística de P<0.05.

RESULTADOS

Los niveles hormonales en suero de E2 y FSH enlos dos grupos de animales estudiados se recogen enla Tabla 1 y están representados en las Figuras 1 y 2.La media de E2 y FSH basales de los tres grupos fue-ron similares. Se apreció un descenso de los nivelesde E2 asociado a un aumento de FSH después de lamanipulación ovárica en el grupo B. La reanudaciónde la función ovárica calculada mediante la determi-nación de los niveles de E2 en suero y objetivada apartir del día 21 en algún animal y a los 28 días des-pués del trasplante, en todos los animales del grupo.Los niveles de FSH basales fueron significativamentesuperiores en el grupo B, en todos los días investiga-dos a partir del día del trasplante.

El análisis histológico tanto de los ovarios del gru-



po control como de los autoimplantes puso de mani-fiesto la presencia en ambos de folículos primordiales.El análisis morfométrico evidenció, tal como ya he-mos comunicado anteriormente (6), un número mediosignificativamente superior de folículos antrales en elgrupo A frente al observado en los autoimplantes ex-traídos de los animales del grupo B. Por contra, la me-dia del área ocupada por células de la granulosa fuesignificativamente mayor en este último grupo que laocupada por los folículos del grupo A (Tabla 2).

Las diferencias de apetencia para la tinción deInhibina por inmunohistoquímica se observan a sim-ple vista en las preparaciones de ambos grupos a dife-rentes aumentos (Figuras 3, 4 y 5). Sin embargo, paraobjetivar el grado de impregnación, se ha procedido ala valoración “pixel a pixel” de la Intensidad de la co-loración para esta tinción del objeto seleccionado. Seconstatan diferencias significativas en la intensidad(Value V: mayor intensidad más proximidad a 0)(Tabla 3)

Tabla 1Niveles de FSH y E2. En la serie se muestra una recuperación de la secreción de E2 a los 28 días en el grupo trasplantado versus al

ovario normoinserto, incluso con una tendencia superior aunque no significativa. Paradójicamente los niveles de FSH persisten signi-ficativamente superiores a los del grupo control

Día 0 4 7 14 21 28

FSH (A) 0,6 (0,4-0,7) 0,6 (0,5-0,8) 0,8 (0,6-0,9) 0,7 (0,5-0,9) 0,8 (0,6-0,9)0,6 (0,4-0,9) 0,6(0,4-0,9)

FSH (B) 0,6 (0,4-0,8) 3,8 (2,5-5,2) 4,3 (3,4-4,8) 3,8 (2,6-4,7) 2,6 (1,4-3,7) 1,5 (1,1-2,1)

N.S. p<0,005 p<0,005 p<0,005 p<0,005 p<0,005

E2 (A) 250 (221-264) 279 (240-293) 300 (257-339) 279 (254-298) 270 (247-287) 294 (234-348)

E2 (B) 261 (235-273) 94 (43-140) 86 (67-125) 166 (143-213) 208 (164-270) 307 (275-343)

N.S. p<0,00005 p<0,000005 p<0,0005 p<0,05 N.S.

Figura 1Evolución de la los niveles de estradiol de los grupos A y B

durante la experiencia.

Figura 2Evolución de la los niveles de FSH de los grupos A y B du-

rante la experiencia.

DISCUSIÓN

Hoy en día existe acuerdo en que la principal indi-cación de la criopreservación de tejido ovárico radicaen la posibilidad de conservar la fertilidad en pacien-tes jóvenes que han de ser sometidas a tratamientosque ponen en peligro la supervivencia de su pobla-ción folicular. Al mismo tiempo, también está sobra-damente consensuado que los ovocitos inmaduros pa-recen ser mas fáciles de criopreservar que losmaduros, probablemente por ser mas pequeños y masindiferenciados. Como la acción de los diferentesagentes crioprotectores no va mas allá de 1-2 mm, elproceso de criopreservación ha de prescindir de laidea de un implante con pedículo vascular y recurrir ala fragmentación o laminación del tejido a conservar.Naturalmente, el tejido así tratado pagará el tributo dela manipulación y de la isquemia hasta que, tras elreimplante, la neoangiogénesis vuelva a nutrirlo. Eneste punto, podemos convenir que, los índices de su-

pervivencia de folículos primordiales están, aproxi-madamente, alrededor del 50% (2, 8) en experienciascon ratas. La recuperación de la función endocrina deestos folículos se ha constatado y persiste mas allá delos seis meses en este modelo experimental (9), mien-tras que en el humano disponemos de referencias demas de dos años (10, 11).

En nuestra experiencia con humanos (5), un im-plante de aproximadamente un centímetro cúbico decortical ovárica de una mujer de 47 años (FSH basal:4,5 UI/L), tras el proceso de congelación/descongela-ción y reimplante, mantuvo la función endocrina du-rante seis meses en presencia de unos niveles altos de


Tabla 2Estudio morfométrico. Existen un número significativamente

mayor de folículos antrales en el grupo A. Por el contra el áreade la granulosa es significativamente mayor en el ovarios

trasplantado

Nº Folic. antr. Area granulosa (µµm2 )Grupo A: 33,00 (DS: 20,04) 12599,91 (DS: 4223,75) Grupo B: 15,50 (DS: 8,20) 18572,47 (DS: 3683,71)P < 0,05 < 0,05

Figura 3Tinción tricrómica e inmunohistoquímica para inhibina

(x 1) de un caso grupo A y del grupo B. El recuadro inferior muestra la intensidad

media para la impregnación Inhibina de cada preparación.


(x 2) de un caso grupo A y del grupo B.


(x 10) de un caso grupo A y del grupo B

FSH (20-30 UI/L). Durante este tiempo las determi-naciones de Inhibinas A y B eran inferiores a la sen-sibilidad del mé todo. El reciente trabajo deMuttukrishna y cols (12) investiga las variaciones delos dímeros de inhibina durante el ciclo en 1) mujeresjóvenes, 2) mujeres de 40 a 50 años con FSH normaly 3) mujeres de 40 - 50 años con FSH elevada. Losautores concluyen que las pautas cíclicas de inhibinaseran similares en las mujeres jóvenes y en las mayo-res con FSH normal, mientras que en las mujeres ma-yores con FSH elevada se evidenció un descenso delos niveles de inhibina A antes del pico de LH y du-rante toda la segunda fase del ciclo y una disminu-ción de la inhibina B en la fase folicular precoz.Resulta sugestivo pensar que, los procesos de conge-lación/descongelación y la consiguiente isquemia deun implante sin pedículo vascular, condicionen unadeplección determinante en una población folicularque por razones de edad ya estaría suficientementemermada. En el presente estudio, aunque con un mo-delo experimental, también cuando se ha recuperadola función endocrina en el grupo B (ovario trasplanta-do), vemos que existe una FSH significativamentemas elevada que la de los animales con el ovario nor-moinserto. Por último, la evidencia de una poblaciónfolicular disminuida en el grupo trasplantado, nos su-gieren que, en tanto el descenso de los dímeros de lainhibina son considerados como un marcador precozdel agotamiento de la población folicular, los cam-bios inducidos por la congelación y la isquemia deltejido ovárico post implante pueden ser similares alos que se observan en pacientes de edad avanzada.

Pero además, nuestra propuesta, es que estos nive-les mas altos de FSH van a ser los probables respon-sables de las alteraciones morfométricas constatadasy que ya describíamos en nuestro anterior trabajo (6).La menor población de folículos antrales en el grupoB, va acompañada de un incremento significativo enel área de la granulosa una (una hiperplasia de la gra-nulosa), del grupo B frente al grupo del ovario nor-moinserto, funcionalmente compensadora como que-da evidenciado en los niveles de E2 (Figura 6).

Llegados a este punto, parece lógico que intentá-ramos constatar cual era la participación de la inhibi-na en los cambios que se operaban en el tejido ovári-co trasplantado sin pedículo vascular en nuestromodelo experimental. Recurrimos a los estudios in-munohistoquímicos en un intento de identificar ade-más las estructuras que mas participan en la secrecióndel dímero. Las figuras 3, 4 y 5 nos muestran comoen el grupo B la disminución de la impregnación dela tinción inhibina es debido al menor número de folí-culos en el grupo B y a la casi nula tinción del estro-

ma de las preparaciones de este grupo. Este resultadonos lleva al trabajo de Gook y cols (13) cuando exa-minan los efectos de la criopreservación en tejidoovárico humano y observan que la mayoría de las cé-lulas estromales que rodean los folículos se muerensin poder precisar si es por el proceso de criopreser-vación o por acción enzimática. Estas experiencias seunen a las que, cada vez más, confieren un importan-te papel al estroma en la maduración folicular.Abundando en esta línea, hacemos referencia al tra-bajo de Hovatta y cols (14), quienes realizan cultivoscelulares de tejido ovárico y folículos primordialesasilados de humanos y concluyen que el cultivo aisla-do de folículos no mejora la supervivencia ni el desa-rrollo folicular, por lo que hasta la actualidad la víaóptima de cultivar folículos primordiales es mediantepequeñas muestras de tejido ovárico.

El mecanismo de inicio del crecimiento folicular ydel consumo de folículos primordiales de la reservaovárica es aún bastante desconocido. Cada vez másse está revisando la idea de que los folículos restan-tes, en la mujer mayor, sean “per se” más resistentes(o menos sensibles) al estímulo de la FSH, para resal-tar el papel que juegan los elementos extrafolicularesdel ovario. Un estroma envejecido (o dañado por elproceso de congelación o isquemia) puede no partici-par de forma adecuada en la función paracrina que deél se espera. La doctora Abel y cols (15) nos presentaun trabajo con ratas hembras con una alteración en elgen que codifica para el receptor de FSH, con lo queobtiene unas hembras infértiles con unos ovarios detamaño reducido y constata un crecimiento folicularparado en el estadio preantral pero con una gran hi-pertrofia del estroma. También el grupo de Oktay ycols (16) en un excelente trabajo, donde muestran laexistencia de mecanismos de interacción entre la ma-triz celular y la activina de la matriz extracelular queregula el inicio del crecimiento folicular. Las célulasfoliculares crean y destruyen constantemente adhe-siones (receptores de adhesión) a la matriz extracelu-lar. Además, la granulosa ovárica secreta varios com-ponentes de esta matriz extracelular y esta secreciónsi está influida por los niveles de gonadotrofinas. Eldescenso de FSH y el aumento de GnRH aumenta lasecreción de fibronectina por parte de la granulosa.Unos niveles de FSH que no descendieran adecuada-mente influirían negativamente en este mecanismo.

Así pues, después de nuestros resultados y delanálisis de estas reflexiones, parece lógico que la pro-puesta para la óptima maduración de los folículos delos implantes de tejido ovárico vengan de la mano deprotocolos que contemplen una frenación de la secre-ción de FSH endógena para iniciar un estímulo con-



trolado de aquellos folículos que, seguro en forma es-casa o dificultosa, han sido reclutados. En esta líneaya existe trabajos que muestran que la maduraciónnuclear y citoplasmática es mejor ante la presencia degonadotrofinas, EGF, células foliculares, hormona delcrecimiento, etc. (17, 18).

BIBLIOGRAFÍA

1. Rutherford AJ, Gosden RG.: Ovarian tissue cryopre-servation: a practical option?. Acta Paediatr Suppl1999; 88(433):13-8.

2. Oktay K, Newton H, Aubard Y, Salha O, GosdenRG.: Cryopreservation of immature human oocytesand ovarian tissue: an emerging technology?. FertilSteril 1998; 69(1):1-7.

3. Salle B, Lornage J, Demirci B, Vaudoyer F, PoirelMT, Franck M, Rudigoz RC, Guerin JF.: Resto-ration of ovarian steroid secretion and histologic as-sessment after freezing, thawing and autograft of a he-mi ovary in sheep. Fertil Steril 1999; 72(2):366-70.

4. Oktay K, Karlikaya G.: Ovarian function after trans-plantation of frozen, banked autologous ovarian tis-sue. N Engl J Med [letter] 2000;342:1919.

5. Callejo J, Salvador C, Miralles A, Vilaseca S, LaillaJM, Balasch J.: Long-term ovarian function evalua-tion after autografting by implantation with fresh andfrozen-thawed human ovarian t issue. J ClinEndocrinol Metab 2001; 86:4489-94.

6. Callejo J, Vilaseca S, Ordi J, Cabré S, Lailla JM,Balasch J.: Heterotopic ovarian transplantation wit-hout vascular pedicle in syngeneic lewis rats: long-

term evaluation of effects on ovarian structure andfunction. Fertil Steril (En prensa: Feb-2002).

7. Luna LG.: Manual of histologic staining methods ofthe Armed Forces Institute of Pathology, 3rd ed,McGraw-Hill, New York, 1968.

8. Nugent D, Meirow D, Brook PF, Aubard Y, GosdenRG.: Transplantation in reproductive medicine: pre-vious experience, present knowledge and future pros-pects. Hum Reprod Update 1997; 3:267-80.

9. Callejo J, Jáuregui MT, Valls C, Fernández ME,Cabré S, Lailla JMª.: Heterotopic ovarian transplan-tation without vascular pedicle in syngeneic Lewisrats: six-mont control of estradiol and follicle-stimula-ting hormone concentrations after intraperitoneal andsubcutaneous implants. Fertil Steril 1999;72:513-7.

10. Oktay K, Aydin BA, Economos K, Rucinski J, KanMT, Veeck L, Rosenwaks Z.: Restoration of ovarianfunction after autologous transplantation of ovarian tis-sue in the forearm. Fertil Steril 74 (Suppl 3) 2000; S79.

11. Oktay K, Economos K, Kan M, Rucinski J, VeeckL, Rosenwaks Z.: Endocrine function and oocyte re-trieval after autologous transplantation of ovarian cor-tical strips to the forearm. JAMA 2001;26;286(12):1490-3.

12. Muttukrishna S, Child T, Lockwood GM, GroomeNP, Barlow DH, Ledger WL.: Serum concentrationsof dimeric inhibins, activin A, gonadotrophins andovarian steroids during the menstrual cycle in olderwomen. Hum Reprod 2000 Mar; 15(3):549-56.

13. Gook DA, Edgar DH, Stern C.: Effect of cooling rateand dehydration regimen on the histological apperean-ce of human ovarian cortex following cryopreservationin 1,2-propanediol. Hum Reprod 1999; 14(8):2061-8.

Isquemia

Congelación/descongelación

Población folicular

Daño estroma

Hiperplasia granulosa

Inhibina

FSH


14. Hovatta O, Wright C, Krausz T.: Human primordial,primary and secondary ovarian follicles in long-termculture: effect of partial isolation. Hum Reprod 1999;14:2519-2524.

15. Abel MH, Wootton AN, Wilkins V, Huhtaniemi I,Knight PG, Charlton HM.: The effect of a null muta-tion in the follicle-stimulating hormone receptor geneon mouse reproduction. Endocrinology 2000May;141(5):1795-803.

16. Oktay K, Karlikaya G, Akman O, Ojakian GK,Oktay M.: Interaction of extracellular matrix and acti-

vin-A in the initiation of follicle growth in the mouseovary. Biol Reprod 2000 Aug; 63(2):457-61.

17. Cooper A, Paynter SJ, Fuller BJ, Shaw RW.:Differential effects of cryopreservation on nuclear or cy-toplasmic maturation in vitro in immature mouse oocytesfrom stimulated ovaries. Hum Reprod 1998; 13(4):971.

18. Liu X, Andoh K, Yokota H, Kobayashi J, Abe Y,Yamada K, Mizunuma H, Ibuki Y.: Effects ofgrowth hormone, activin, and follistatin on the deve-lopment of preantral follicle from immature femalemice. Endocrinology 1998 May; 139(5):2342-7.




Estrategia ante el fallo repetido de implantación

Pellicer A

Equipo IVI (IVI-Almería, IVI-Castellón, IVI-Madrid, IVI-Murcia, IVI-Sevilla, IVI-Valencia)

Uno de los desafíos con los que nos encontramosa menudo los grupos con amplia experiencia en téc-nicas de reproducción asistida (TRA) es solucionarel problema de esterilidad en parejas con fallo repeti-do de implantación (FRI). Bien porque acuden a no-sotros después de haber fracasado en otros centros,bien por ser nuestras propias pacientes que fracasande forma repetida, la verdad es que a diario se plan-tea un caso de FRI que precisa establecer una estrate-gia adecuada para intentar solucionarlo. En la era dela Medicina Basada en la Evidencia, lamentablemen-te en este campo de la Medicina Reproductiva toda-vía quedan muchas preguntas por contestar, por loque nuestra propuesta de estrategia está basada en al-gunas evidencias aportadas en la literatura y en nues-tra propia experiencia, con la consistencia que pue-den otorgar más de 5000 ciclos anuales de TRA,pero en ocasiones sin el rigor científico que debeacompañar nuestra conducta.

La primera cuestión a considerar es cuándo en elEquipo IVI consideramos que nos encontramos anteun FRI. Un análisis de nuestros datos muestra que enmujeres <37 años se mantiene bastante constante latasa de implantación embrionaria (26%) y la proba-bilidad de embarazo (50%) a lo largo de los 3 prime-ros ciclos de transferencia embrionaria en día 3 (RuizA, sin publicar). Sin embargo, ambas caen despuésdel cuarto. Con las mujeres >37 no ocurre lo mismo,pues durante dos ciclos estos porcentajes se mantie-nen (17 y 40%, respectivamente), pero en el tercerose observa un descenso. Así pues, estamos ante unFRI, desde un punto de vista práctico, cuando lasmujeres son <37 y han tenido 3 transferencias negati-vas o cuando son >37 y han experimentado 2 fraca-sos. También por pragmatismo, se consideran tantotransferencias de embriones en fresco o tras descon-

gelación, así como si esos casos han sido tratados ono en un Centro IVI.

La segunda cuestión a ser planteada es cuándoocurren estos FRI, pues debemos distinguir entre FRIy abortos del primer trimestre, pues ambos podríanser considerados por igual. Sin embargo, la defini-ción de FRI se reserva para los embarazos ocultos ylos bioquímicos. Simón y cols (1) demostraron quetanto en fecundación in vitro (FIV) como en dona-ción de ovocitos (DO), la tasa real esperable de ges-tación se aproxima al 70% cuando se analiza la pro-ducción de hCG durante la segunda fase del cicloestimulado o artificial, pero hasta un 40% de ellos sepierden. Los embarazos bioquímicos son incluidostambién como FRI y no como abortos, dentro denuestra actividad diaria.

Una vez establecidas las definiciones, la siguientecuestión a plantearnos es cuáles son las causas conoci-das de fallo de implantación para seguir un razona-miento lógico a la hora de definir una estrategia (Tabla1). La extirpación de los hidrosálpinx evidenciados enun control ecográfico ha demostrado multiplicar x3 lasposibilidades de lograr un embarazo en distintas publi-caciones (2, 3). De la misma manera, los miomas in-tramurales (no digamos los submucosos) de incluso<5 cm, se asocian a una menor implantación en TRAy deben ser extirpados (4). Algo semejante ocurre conlos septos uterinos, que se asocian en un 25% con pér-didas gestacionales precoces (5).

La existencia de una ventana de implantación fuedemostrada por Navot y cols (6), por lo que es acep-table que los FRI sean debidos a una receptividad en-dometrial alterada. Aunque existen muchos marcado-res bioquímicos y morfológicos que han pretendidoacotarla (7) esto no es hoy posible con certeza desdeun punto de vista asistencial, pero obtener una valo-

ración adecuada del endometrio de acuerdo a nuestrosconocimientos actuales se antoja necesario.

Algo semejante ocurre con la estimulación ovári-ca. Nosotros hemos seguido una linea de investiga-ción durante años que nos lleva claramente a estable-cer que un FRI puede ser debido estimulacionesováricas agresivas que eleven los niveles séricos deE2 de forma exagerada (8-10), que esto puede afectartanto a la receptividad uterina como al desarrollo em-brionario (11).

Igualmente existen numerosas evidencias en la li-teratura que muestran la pobre capacidad de implan-tación de los embriones morfológicamente anormalesy cómo estas alteraciones se corresponden directa-mente con una mayor incidencia de anomalías cromo-sómicas en los mismos (12, 13) que, en la mayoría decasos, impiden su desarrollo en épocas tempranas(13). Del mismo modo, parece hoy indiscutible queuna transferencia embrionaria cuidadosa, inclusoguiada por ultrasonidos, es capaz de mejorar la im-plantación de los embriones humanos (14, 15).

Con todas estas reflexiones en la mente y teniendoen cuenta que la implantación consiste en un estrechodiálogo entre embrión y endometrio (7), desde elpunto de vista práctico en la primera visita de un FRIdebe descartarse la existencia de patología tubáricaque pueda dar lugar a hidrosálpinx o presencia de lí-quido endocavitario, debe descartarse también por ul-trasonidos la existencia de miomas o patología mülle-riana que en cualquier caso pueden exigir medidasdiagnósticas complementarias y debemos asegurarnosde que pasa fácilmente a través del cérvix un catéterde inseminación artificial blando. Los primeros casosrequieren cirugía previa a un nuevo intento, la difi-cultad de paso de un catéter obliga a una evaluacióncuidadosa del mismo.

A continuación, debemos analizar rigurosamentelos ciclos anteriores de esa mujer, poniendo especialénfasis en dos cuestiones: las estimulaciones y la ca-lidad embrionaria. Unas estimulaciones exageradaspueden ser corregidas con estrategias más suaves

(16), mientras que una calidad embrionaria defectuo-sa obliga a un estudio más estricto, también, de la ca-lidad de los gametos.

Si las estimulaciones no parecen excesivas y si lacalidad embrionaria es aceptable, quizás debemosprofundizar más en el estudio de endometrio. Aunqueni la histeroscopia ni la ecografía han sido capaces demostrar un patrón morfológico incompatible con laimplantación embrionaria, la existencia de endome-trios con aspecto inflamatorio, la falta de desarrolloendometrial adecuado por ultrasonidos o la patologíavascular uterina y endometrial (17, 18) pueden ser tanevidentes que obliguen a implementar tratamientospara paliar estos defectos, como puede ser la adminis-tración de antibióticos, la superimposición de E2 exó-geno a la propia estimulación del ovario (19) o la ad-ministración de vasorelajantes que puedanincrementar la vascularización uterina (17). Si se rea-lizara una histeroscopia, debería ponerse especial cui-dado también en evaluar el cérvix, para facilitar laposterior transferencia embrionaria.

Habiendo descartado, pues, patología orgánica yun problema evidente en el endometrio, el siguientepaso es intentar una transferencia embrionaria cuida-dosa con embriones teóricamente mejores que los an-teriormente transferidos, aunque estamos ante el su-puesto de que aparentemente eran normales. Paraello, existen dos estrategias, cultivar los embrioneshasta blastocisto y/o realizar en ellos un análisispreimplantatorio de una serie de cromosomas. Co-cultivando los embriones en células endometrialesepiteliales, Simón y cols (20) demostraron que sepuede mejorar la implantación en mujeres con FRIsometidas a DO, pero no a FIV, lo que sugiere que es-tas últimas adolecen también de problemas adiciona-les en su capacidad receptiva que no se corrige sólocon el co-cultivo embrionario. Además, Gianaroli ycols (21) mostraron que la implantación mejora enmujeres con FRI porque pueden ser seleccionados losembriones cromosómicamente normales.

Ambos métodos son complementarios en nuestrasmanos en la actualidad, pues los embriones biopsia-dos son dejados en co-cultivo hasta blastocisto. Conesta práctica, hemos aprendido que los embrionesanormales pueden crecer hasta blastocisto aunque conproporciones menores a los normales (40 vs 65%aproximadamente), pero hay algunas anomalías, co-mo las monosomías X o los mosaicismos no muy ex-tensos que pueden desarrollarse igual que los norma-les (22). Por todo ello, nuestra recomendación actuales biopsiar los embriones y dejarlos crecer hasta blas-tocisto. Con ello, conseguimos tasas de implantaciónpor embrión transferido del 18% en casos de FRI y,


Tabla 1Causas científicamente demostradas de fallo de implantación

- Hidrosalpinx

- Alteraciones de la anatomía uterina (miomas, septos)

- Estimulación ovárica excesiva

- Receptividad endometrial alterada (morfológica y genética)

- Mala calidad embrionaria (morfológica y genética)

- Transferencia embrionaria dificultosa


Cult Alternativo

Figura 6Algoritmo de actuación clínica ante un FRI

lo que es aún más importante, hemos identificado pa-rejas que sistemáticamente >90%, incluso el 100%,de sus embriones son anormales.

Esto último obliga a buscar alternativas que nece-sariamente pasan por la DO pues sabemos que el se-men debe ser responsable de tan sólo un pequeñoporcentaje de aneuploidías (23). La DO es, en cual-quier caso, una alternativa a contemplar desde elprincipio, pues nos encontramos ante casos en queexiste un fuerte agotamiento anímico y muchas vecesprefiere la pareja confiar en métodos que proporcio-nan posibilidades reales de tener un niño en casa pró-ximas al 90% (24).

Se podría discutir con la pareja como alternativarealizar ciclos sin estimulación ovárica para su trans-ferencia. Nosotros no hemos acumulado suficienteexperiencia en este aspecto, pero detrás de este con-cepto está el razonamiento de que las estimulacionesováricas pueden inducir anomalías embrionarias enlos animales de experimentación (25) y que las esti-mulaciones sucesivas incrementan los abortos (26).Así pues, quizás un ciclo sin estimulación algunapuede proporcionar embriones normales que de otramanera no tendríamos. Hay que contar en estos casoscon menores probabilidades de embarazo que con laDO, pero es deber de la pareja poner en ambos ladosde la balanza las ventajas e inconvenientes de ambasalternativas.

Si descubrimos en sus ciclos anteriores la existen-cia de estimulaciones exageradas que pudieran justifi-car los fracasos, una estrategia interesante es congelarlos cigotos y posteriormente dejarlos crecer en otrociclo, biopsiarlos y obtener blastocistos normales pa-ra la transferencia en el útero. Hemos realizado esteproceder en algunos casos con buenos resultados.

Si por algunos de los métodos diagnósticos antesexpuestos, nos encontramos ante un caso en que losembriones son cromosómicamente normales, crecenbien en cultivo y no se consigue la implantación, en-tonces podemos incluso considerar el útero de alqui-ler como una alternativa, pues una de sus indicacio-nes es esta, sobre todo si se añadiera una causauterina documentada e intratable (27).

La demostración de que existen embriones anor-males morfológicamente en ciclos anteriores planteaun enfoque distinto. Inicialmente, se pueden plantearestrategias que ayudan a mejorar su morfología en ellaboratorio, entre ellas la eliminación de fragmentosy la eclosión asistida, combinados con el uso de me-dios de cultivo distintos (28, 29). La eclosión asistidase ha mostrado eficiente en estas pacientes (30-32),pero no hay evidencia clara de su eficiencia y parecenmás indicadas en mujeres de edad avanzada. Sin em-

bargo, es lo único que se puede hacer en estas cir-cunstancias. Simultáneamente hay que analizar la ca-lidad de los gametos, pues si existiese un defecto im-portante en alguno de los gametos quizás la estrategiaa seguir sería cambiarlo, sobre todo si el “make-up”embrionario no ha servido y considerando siempre elestado anímico de la pareja.

Cuando ninguno de los dos gametos son clara-mente defectuosos y las medidas de manipulaciónembrionaria no mejoran el aspecto de los mismos,DO se presenta como la alternativa más válida, basa-dos en los supuestos anteriormente citados (23). Latransferencia citoplasmática de ovocitos de donantepuede ser otra alternativa no suficientemente contras-tada todavía (33), pero las dudas sobre manipulacióngenética que acarrea hacen que esta deba ser restrin-gida a ensayos clínicos muy bien controlados.

Con los razonamientos anteriormente expuestos,un algoritmo lógico a seguir en los casos de FRI es elexpuesto en la Figura 1, que desarrollaremos adecua-damente en nuestra ponencia, exponiendo la expe-riencia del Equipo IVI y las evidencias científicas dela literatura.

BIBLIOGRAFÍA

1. Simón C, Landeras J, Zuzuarregui JL, y cols.:Early pregnancy losses in in vitro fertilization andoocyte donation. Fertil Steril 1999; 72: 1061-5

2. Vandromme J, Chasse E, Lejeune B, y cols.:Hydrosalpinges in in vitro fertilization: an unfavora-ble prognostic feature. Hum Reprod 1995; 10:576-9

3. Katz E, Akman MA, Damewood MD, García JE.:Deleterious effect of the presence of hydrosalpinx onimplantation and pregnancy rates with in vitro fertili-zation. Fertil Steril 1996; 66: 122-5

4. Hart R, Khalaf Y, Yeong Ch y cols.: A prospectivecontrolled study of the effect of intramural uterine fi-broids on the outcome of assisted conception. HumReprod 2001; 16:2411-17

5. Raga F, Bauset C, Remohí J, y cols.: Reproductiveimpact of congenital müllerian anomalies. HumReprod 1997; 12: 2277-81

6. Navot D, Bergh P, Williams M, y cols.: An insightinto early reproductive processes through the in vivomodel of ovum donation. J Clin Endocrinol Metab.1991; 72:408-414.

7. Simón C, Martín J, Gimeno MJ y cols.: Cytokineadhesión molecules invasive proteinases. The missingparacrine/autocrine link in embryonic implantation?.Mol Hum Reprod 1996; 6: 405-24

8. Pellicer A, Ruiz A, Castellví RM, y cols.: Is the re-trieval of high numbers of oocytes desirable in pa-


tients treated with gonadotrophin-releasing hormoneanalogues (GnRHa) and gonadotrophins ?. HumReprod 1989; 4:536-40

9. Simón C, Cano F, Valbuena D, y cols.: Clinical evi-dence for a detrimental effect on uterine receptivity onhigh serum oestradiol concentrations in high and nor-mal responder patients. Hum Reprod 1995; 10: 2432-5

10. Pellicer, A., Valbuena, D., Cano, F., y cols.: Lowerimplantation rates in high responders: evidence for analtered endocrine milieu during the preimplantationperiod. Fertil. Steril. 1996; 65: 1190-95.

11. Valbuena D, Martín J, De Pablo JL, y cols.: In-creasing levels of estradiol are deletereous to embryo-nic implantation because they directly affect the embr-yo. Fertil Steril 2001; 76: 962-8

12. Magli MC, Jones GM, Gras L, y cols.: Chromosomemosaicism in day 3 aneuploid embryos that developedto morphologically normal blastocyst in vitro. HumReprod, 2000; 15 : 1781-6.

13. Sandalinas M, Sadowy, S, Alikani, M, y cols.:Developmental ability of chromosomally abnormal hu-man embryos to develop to the blastocyst stage. Hum.Reprod., 2001; 16: 1954-8.

14. Coroleu B, Carreras O, Veiga A, y cols.: Embryotransfer under ultrasound guidance improves preg-nancy rates after in vitro fertilization. Hum Reprod2000; 15: 616-20.

15. Wood EG, Batzer FR, Go KJ, y cols.: Ultrasound-guided soft catheter embryo transfers will improvepregnancy rates in in vitro fertilization. Hum Reprod,2000; 15: 107-12.

16. Simón C, García-Velasco JA, Valbuena D, y cols.:Increased uterine receptivity by decreasing estradiollevels during the preimplantation period in HighResponder Patients by Using an FSH Step-DownRegimen . Fertil Steril 1998; 70: 234-9.

17. Rubinstein M, Marazzi A, Polak de Fried E.: Low-dose aspirin treatment improves ovarian responsive-ness, uterine and ovarianblood flow velocity, implan-tation, and pregnancy rates in patients undergoinginvitro fertilization: a prospective, randomized, dou-ble-blind placebo-controlledassay: Fertil Steril 1999;71:825-9

18. Merce LT, Barco MJ, Bau S.: Color Doppler sono-graphic assessment of placental circulation in the first-trimester of normal pregnancy. J Ultrasound Med1996;15:135-42

19. Pellicer A, De los Santos MJ, Remohi J.: Simul-taneous induction of multiple follicular developmentwith gonadotrophins and steroid replacement for in vi-tro fertilisation. Hum Reprod 1992; 7: 606-7.

20. Simón C, Mercader A, García-Velasco J y cols.:

Cocultured of human embryos with autologous humanendometrial epithelial cells in patients with implanta-tion failure. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1999; 84:2638-46.

21. Gianaroli L, Magli MC, Ferraretti AP, y cols.:Preimplantation diagnosis for aneuploidies in patientsundergoing in vitro fertilization with a poor prognosis:identification of the categories for which it should beproposed. Fertil Steril, 1999; 72: 837- 844

22. Rubio C, Vidal F, y cols.: Influencia de las anomalíascromosómicas en el desarrollo preimplantatorio deembriones humanos. Rev Iber Fertil 2000; 17: 17-22

23. Plachot M.: Chromosome analysis of spontaneousabortions after IVF. A European survey. Hum Reprod1989; 4: 425-42

24. Remohí,J., Gartner,B., Gallardo,E. y cols.: Preg-nancy and birth rates after oocyte donation. Fertil.Steril. 1997; 67: 717-23.

25. Viuff D, Hendriksen PJM, Vos PLAM, y cols.:Chromosomal abnormalities and developmental kine-tics in in vivo-developed cattle embryos at days 2 to 5after ovulation. Biol Reprod 2001; 65: 204-8

26. Van Blerkom J, Davis P.: Differential effects of repe-ated ovarian stimulation on cytoplasmic and spindleorganization in metaphase II mouse oocytes maturedin vivo and in vitro. Hum Reprod 2001; 16: 757-64

27. Goldfarb JM, Austin C, Peskin B, y cols.: Fifteenyears experience with an in-vitro fertilization surroga-te gestational pregnancy programme. Hum Reprod2000; 15: 1075-8.

28. Cohen J, Elsner C, Kort H., y cols.: Impairment ofthe hatching process following IVF in the human andimprovement of implantation by assisted hatchingusing micromanipulation. Hum. Reprod. 1990; 5: 7-13

29. Alikani M, Cohen J, Tomkin G, y cols.: Humanembryo fragmentation in-vitro and its implications forpregnancy and implantation. Ferti l . Steril .1999;71:836-42.

30. Obruca A, Strohmer H, Sakkas D y cols.: Use of la-sers in assisted fertilization and hatching. Hum.Reprod. 1994; 9: 1723-1726.

31. Antinori S, Selman HA, Caffa B y cols.: Zona ope-ning of human embryos using a non-contact UV laserfor assisted hatching in patients with poor prognosis ofpregnancy. Hum. Reprod. 1996; 1: 2488-92.

32. Magli MC, Gianaroli L, Ferraretti AP y cols.:Rescue of implantation potential in embryos with poorprognosis by assisted zona hatching. Hum. Reprod.1998; 13: 1331-35.

33. Barritt JA, Brenner CA, Malter HE, Cohen J.:Mitochondria in human offspring derived from ooplas-mic transplantation. Hum Reprod 2001; 16:513-6.


condiciones ideales para la obtención de blastocistos,por ejemplo). Por que desconocemos casi todo sobre lacronobiología del embrión (tanto desde el punto de ne-cesidades metabólicas como de activación génica) loque nos conduce, todo ello, a no poder determinar cuáles el “embrión” con potencial para implantarse.Segundo, por lo que una restricción de este tipo supon-dría para el avance investigador en el cultivo de blasto-cistos y en él diagnóstico pre-implantacional. Tercero,por que en mujeres pobres respondedoras, a veces esnecesario transferir más de dos embriones.

Por todo este conjunto de desconocimientos y limi-taciones, es por lo que yo defiendo la segunda opción.Reducir voluntariamente él numero de embriones atransferir. En mi opinión creo que es la opción más re-alista y la actitud que menos puede perjudicar a uncierto número de parejas (>38 años). En Madrid-FIV,con el fin de reducir el número de gestaciones múlti-ples transferimos habitualmente dos embriones y si esnecesario aumentamos en función de cada caso.

La decisión de autolimitarse a transferir no más dedos embriones, en los casos que se puede, se basa en:una buena selección de los embriones y una buenapolítica de congelación embrionaria.

Los objetivos de mi conferencia son:

1. Concienciar a la audiencia de la necesidad de li-mitar el número de embriones a transferir (máximo dos)con el fin de reducir él numero de gestaciones múltiples

2. Evaluar los parámetros de selección embrionariaactuales (morfológicos: del cuerpo polar, alineamientode los pronucleos, cronología mitótica, etc.) y futuros(molecular: cromosómico, a nivel génico y proteómico.)

3. Presentar nuestra política de criopreservación.

En un futuro no muy lejano, el aspecto mas valo-rado de una clínica de reproducción asistida será notanto sus tasas de embarazos, sino el número de ges-taciones múltiples. Cuanto mayor sea este último, pe-or el grado de consideración; ya que el tanto porciento de gestaciones múltiples será un referente di-recto de la calidad del equipo.

Es de dominio público, que la mayor parte de lasgestaciones múltiples se derivan de la tendencia a trans-ferir varios embriones (>2) con el fin de aumentar las ta-sas de embazo. Esta es una práctica habitual que actual-mente esta muy cuestionada, ya que las gestacionesmúltiples conllevan serios y graves efectos secundariossobre el bienestar materno- fetal que son de difícil justi-ficación en aras a un aumento de los embarazos.

Según una de las últimas encuestas de la ESHRE, alas clínicas de Reproducción Asistida (RA) españolas,nos cabe el honor de estar a la cabeza de los países eu-ropeos en cuanto al número de gestaciones. A costa, sinembargo, del dudoso privilegio de ser el país con el ma-yor número de embarazos múltiples. Según el registrode la SEF, el 74% de las transferencias se realizan con3-4 embriones, lo que da lugar a un 34% de gestacionesmúltiples de las que un 7% son de triples o más

Dadas las serias consecuencias materno-fetales de lagestación múltiple, entre los profesionales de la RA se hagenerado un movimiento de concienciación que ha desem-bocado en la estrategia de limitar el número de embrionesa transferir, bien por ley o bien por voluntad propia.

Respecto a la primera opción, limitar por decretogubernamental el numero de embriones a transferir(uno-dos), simplemente no estoy de acuerdo. Primero,por que las condiciones de cultivo embrionario tal co-mo hoy la realizamos son subóptimas para el manteni-miento de un embrión in vitro (no conocemos aun las

Prevención del embarazo múltiple en reproducción asistida.

Hernández de Miguel E

Clínica de Medicina de la Reproducción y Ginecología “Madrid-FIV”




Congelación de ovocitos y tejido ovárico: situación actual y perspectivasfuturas

Veiga A, Boiso I.

Servei de Medicina de la Reproducció Institut Universitari Dexeus. Barcelona. España




CONGELACIÓN DE OVOCITOS

La criopreservación rutinaria de ovocitos es unade las herramientas de las que carece el laboratorio dereproducción asistida. Un protocolo de congelaciónfiable, reproducible y eficiente contribuiría a resolverdiversas situaciones clínicas y evitaría los problemaséticos y legales que conlleva la criopreservación deembriones.

La criopreservación de ovocitos humanos fue em-prendida con entusiasmo a comienzos de los años‘80. El reducido número de embarazos procedentesde ovocitos previamente congelados (Chen 1986; vanUem y col., 1987; Al Hasani y col., 1987), llevaron alabandono relativo del tema. La evaluación de losefectos de los diversos pasos involucrados en un pro-tocolo de congelación-descongelación sobre las es-tructuras del ovocito, crearon una visión pesimistaacerca de las posibilidades de aplicación de la técni-ca. En particular el efecto de la criopreservación so-bre la integridad del huso meiótico y la placa metafá-sica, que llevó a plantear el riesgo que supone lafecundación de ovocitos previamente congelados enlo que se refiere a inducción de aneuploidías en losembriones resultantes (Trounson, 1986). La presenciade un huso meiótico estructuralmente organizado esun requisito necesario para que se produzca la segre-gación normal de cromátides hermanas al completar-se la segunda meiosis y es esencial para la formaciónde embriones euploides tras la fecundación. En nues-tra propia experiencia, la criopreservación de ovoci-tos humanos resultó en unas tasas de supervivenciarelativamente altas acompañadas de un índice de ano-malías del huso meiótico muy elevado (Boiso y col.,2002). La alta frecuencia de ausencia o de anomalíasdel huso detectadas podría explicar las bajas tasas defecundación observadas en ovocitos criopreservados,

así como el pobre desarrollo in vitro e in vivo de losembriones procedentes de estos ovocitos.

Las tasas de supervivencia de los ovocitos huma-nos a la congelación son relativamente bajas si secomparan con las tasas de supervivencia de embrio-nes congelados (que oscilan entre un 35 y un 93%,dependiendo del estadío embrionario en el momentode la congelación) (Veeck, 1993). En un trabajo re-ciente Fabbri y col. (2001) informan de un notableincremento en las tasas de supervivencia tras la reali-zación de algunas modificaciones técnicas en el pro-tocolo de congelación. Queda por demostrar si esteincremento en la tasa de supervivencia va acompaña-do de un incremento en el adecuado desarrollo in vi-tro e in vivo de los embriones resultantes.

Los ovocitos que sobreviven presentan tasas defecundación relativamente bajas, si bien se ha obser-vado un incremento notable en las tasas de fecunda-ción normal gracias a la introducción de la microin-yección espermática (ICSI) (Palermo, 1992) comotécnica de inseminación (Gook y col., 1995; Kazem ycol., 1995; Porcu y col., 1997a). Este hecho ha reavi-vado recientemente el interés en lo referente a la con-gelación de ovocitos. En los últimos años se han pro-ducido nuevos embarazos y el nacimiento de niñossanos (aproximadamente unos 30 en todo el mundo),todos ellos gracias a la aplicación de la ICSI (Porcu ycol., 1997a; Porcu y col., 1997b; Fabbri y col., 1998;Tucker y col., 1998; Polak de Fried y col., 1998;Young y col., 1998; Borini y col, 1998; Antinori ycol., 1998; Kuleshova y col., 1999; Yang y col.,1999; Porcu y col., 1999a,b) en ovocitos criopreser-vados, a partir de un número indeterminado pero pre-sumiblemente grande de intentos.

Sin embargo la eficiencia del procedimiento con-tinúa siendo muy baja. De acuerdo a Mandelbaum ycol. (1998) el porcentaje calculado de implantación

por ovocito descongelado es del 1%. Si bien gracias ala aplicación de la ICSI han mejorado los porcentajesde fecundación, persisten las altas tasas de bloqueode los embriones en cultivo y de pérdidas embriona-rias post implantación. Ludwig y col. (1999) analizanen una revisión reciente la evolución de los embara-zos publicados en la literatura entre 1986 y 1998.Señalan que el 45% de los embarazos obtenidos conovocitos criopreservados concluyó en un aborto. Estaelevada tasa de abortos indica que existía algún tipode anomalía en estos embriones, que demostraron te-ner capacidad de implantación pero se abortaron tem-pranamente. Por lo que se ha señalado que hoy porhoy sería éticamente dudoso ofrecer a los pacientes lacriopreservación rutinaria de ovocitos como opción(Oktay y col., 1998).

Es necesario seguir investigando y desarrollandoprotocolos de congelación más adecuados o técnicasalternativas. Una vía a investigar la constituye la con-gelación ultrarápida en etilén glicol, que ha sido em-pleada en humanos recientemente con relativo éxitoen un número reducido de ovocitos (Kuleshova ycol., 1999; Chung y col., 2000). No existen aún estu-dios acerca del efecto que tiene este protocolo decongelación sobre la estructura del huso meiótico.

La aplicación clínica del procedimiento estáprohibida en algunos países entre los que se cuentaEspaña, ya que la inocuidad de la técnica en lo querespecta a la inducción de aneuploidías queda todavíapor establecer. La única forma de responder a la in-cógnita que se plantea respecto a la normalidad cro-mosómica de los embriones obtenidos por FIV deovocitos previamente congelados es el análisis gené-tico preimplantacional para detectar posibles aneu-ploidías. Cobo y col. (2001) analizaron cromosómica-mente 15 embriones procedentes de ovocitoscriopreservados encontrando que no había un incre-mento en la tasa de aneuploidías respecto del grupocontrol. Sería necesario un estudio controlado y conun elevado número de casos para determinar en estesentido la inocuidad de la técnica.

El número creciente de niños sanos nacidos a par-tir de ovocitos criopreservados indica que la técnicapuede ser aplicable en situaciones clínicas bien selec-cionadas, siempre que se informe a la paciente de laslimitaciones, riesgos e incertidumbres que plantea.

CONGELACIÓN DE TEJIDO OVÁRICO

En la mujer, la dotación de células germinales esun número finito representado por los folículos pri-mordiales. Este número alcanza su pico durante el de-

sarrollo fetal y va disminuyendo a partir de la puber-tad a lo largo de la vida, a través de los procesos demaduración, ovulación y atresia. Cuando la reservafolicular declina por debajo de cierto nivel (alrededorde los 35 años de edad), la fecundidad se pierde(Faddy y Gosden, 1995).

El tratamiento del cáncer mediante quimio y radio-terapia, tiene un efecto esterilizante sobre el ovario,implicando por tanto una disminución notable de la re-serva folicular. La disminución de la reserva foliculares proporcional a la agresividad del tratamiento y laedad de la paciente, y puede conducir eventualmente ala esterilidad total (Apperley y Reddy , 1995).

Estudios recientes demuestran que el tejido ovári-co humano resiste el proceso de congelación y des-congelación (Hovatta y col., 1996). La viabilidad deltejido ovárico humano congelado ha sido comproba-da injertando los fragmentos de tejido descongeladoen la cápsula renal de ratones inmunodeficientes y re-cuperando los injertos para el análisis histológicodespués (Newton y col., 1996), demostrando la capa-cidad de integración y el potencial de desarrollo in vi-vo del tejido ovárico descongelado.

Los alentadores resultados obtenidos en lo refe-rente a la supervivencia a la criopreservación de teji-do ovárico, plantean la disyuntiva respecto a comoutilizar el tejido una vez descongelado de la formamás eficaz posible con fines reproductivos. Se pre-sentan dos opciones, ambas con problemas técnicospor resolver: por una parte existe la posibilidad de in-jertar el tejido una vez que la paciente alcance la re-misión de la enfermedad y alternativamente los folí-culos podrían aislarse y madurarse in vitro. Si eltejido pudiera ser criopreservado antes de que la pa-ciente recibiera tratamiento, y fuese devuelto en for-ma de injerto cuando la paciente alcanzase la remi-sión, podría restaurarse el ciclo ovulatorio natural,siendo entonces posible la concepción in vivo con suspropias células germinales. Alternativamente, en loscasos en que el injerto estuviese contraindicado, el te-jido podría ser madurado y fecundado in vitro, y losembriones resultantes transferidos a la paciente.

La posibilidad de llevar a cabo autotransplantes detejido ovárico criopreservado ha sido probada ya enespecies tales como el ratón (Harp y col., 1994) y laoveja (Gosden y col., 1994). Las experiencias detransplantes de tejido ovárico congelado en humanosson escasas y muy recientes. El primer transplante or-totópico de tejido ovárico congelado-descongelado sellevó a cabo en 1999 (Oktay y col.). Tras el transplan-te, se observó revascularización del tejido tres sema-nas después y respuesta ovulatoria (verificada porecografía y analítica hormonal) a la estimulación con


gonadotrofinas exógenas tres meses más tarde. Un se-gundo transplante de estas características se publicórecientemente (Radford y col., 2001). En este caso serealizó un seguimiento durante 9 meses; tras 7 mesespost-transplante se detectó estradiol circulante y des-censo de las hormonas FSH y LH, así como un ciclomenstrual en una paciente que había quedado meno-pausia a consecuencia de la quimioterapia. Sin em-bargo a los 9 meses post-transplante la paciente vol-vió a presentar signos de menopausia. De manera queaunque la viabilidad fisiológica del tejido ovárico hu-mano ha sido demostrada, la longevidad de eventua-les transplantes aún está por determinar (Moomjy yRosenwaks, 1998). Se han descrito experiencias reali-zando transplantes heterotópicos: cuatro meses des-pués del transplante de tejido en el antebrazo, la pa-ciente presentaba desarrollo de folículos antrales yproducción de estradiol (Oktay y col., 2000). El se-guimiento de esta paciente durante 18 meses demos-tró el crecimiento mensual espontáneo de un folículodominante; tras someter a la paciente a estimulaciónhormonal, la aspiración percutánea de 4 folículos per-mitió recuperar un ovocito en metafase I, que tras sercultivado in vitro alcanzó el estadío de metafase II(Oktay y col., 2001). El seguimiento durante un añode cuatro pacientes perimenopaúsicas que recibierontransplantes heterotópicos de tejido ovárico demostróque en tres de ellas se restablecía la secreción hormo-nal 3-4 meses después del transplante. Sin embargo,la duración de la funcionalidad del transplante fuecorta ya que aproximadamente seis meses después lasecreción hormonal retornó a los valores basales(Callejo y col., 2001).

Se debe tener en cuenta el riesgo de criopreservartejido con células cancerosas, que al ser re-injertadoen una paciente en remisión, reinicie la enfermedad.Un estudio realizado en ratones, demuestra que es po-sible transferir un linfoma a ratones sanos, receptoresde transplantes de tejido ovárico de un ratón afecto dela misma cepa (Shaw y col., 1996). Sin embargo, enun estudio reciente en el que se transplantó tejidoovárico previamente congelado de pacientes con lin-foma ninguno de los animales huésped desarrolló laenfermedad (Kim y col., 2001). La selección de laspacientes debe hacerse en función del tipo de malig-nidad y su actividad (Meirow y col., 1998). Una me-dida de precaución a considerar es el uso de marcado-res moleculares y citogenéticos para determinar si eltejido criopreservado conserva alguna célula maligna(Gosden y col., 1997).

Para eliminar toda posibilidad de reintroducir cé-lulas malignas, sería deseable cultivar los folículos yposteriormente los ovocitos in vitro, de manera que

embriones libres de contaminación pudiesen ser trans-feridos a la paciente. La tecnología para el cultivo defolículos primordiales aislados está aún en una fase ex-perimental temprana. Recientemente se ha logrado elcultivo in vitro de folículos primordiales de ratón(Eppig y O´Brien (1996) y es posible que la aplicaciónde estos métodos en humanos no sea realidad hastadentro de algunos años. Sin embargo, para entonces laspacientes jóvenes que actualmente congelan tejido, po-drán beneficiarse de los avances técnicos cuando con-sideren la posibilidad de un embarazo.

En conclusión, la técnica de criopreservación detejido ovárico está a punto para su aplicación clínicaen casos seleccionados, si bien queda por resolver eldestino que se dará al tejido ovárico almacenado unavez descongelado.

BIBLIOGRAFÍA

1. Al-Hasani S, Diedrich K, vans der Ven H, ReineckeA, Hartje M, Krebs D.: Cryopreservation of humanoocytes. Hum Reprod 1987; 2:695-700.

2. Antinori S, Dani G, Selaman HA, Vidali A.,Antinori M, Cerusico C, Versaci C.: Pregnancies af-ter sperm injection into cryopreserved human oocytes.Hum Reprod 1998, 13 (Abst Book 1):P-055.

3. Apperley JF, Reddy N.: Mechanisms and manage-ment of treatment related gonadal failure in recipientsof high dose chemo-radiotherapy. Blood Rev 1995; 9:93-116

4. Boiso I, Martí M, Santaló J, Ponsá M, Barri PN,Veiga A.: A confocal microscopy analysis of thespindle and chromosome configurations of humanoocytes cryopreserved at the GV and MII stage. HumReprod, 2002; en prensa.

5. Borini A, Bafaro MG, Bonu MA, Di Stratis V,Sereni E, Sciajno R, Serrao L.: Pregnancies afteroocyte freezing and thawing. Preliminary data.HumReprod 1998; 13 (Abst book 1):O-241.

6. Callejo J, Salvador C, Miralles A, Vilaseca S, LaillaJM, Balasch J.: Long-term ovarian function evalua-tion after autografting by implantation with fresh andfrozen-thawed human ovarian t issue. J ClinEndocrinol Metab 2001; 86:4489-94.

7. Chen C.: Pregnancy after human oocyte cryopreserva-tion. Lancet 1986; i:884-886.

8. Chung HM, Hong SW, Lim JM, Lee SH, Cha WT,Ko JJ, Han SY, Choi DH, Cha KY.: In vitro blas-tocyst formation of human oocytes obtained from uns-timulated and stimulated cycles after vitrification atvarious maturational stages. Ferti l Steril 2000;73:545-51.

9. Cobo A, Rubio C, Gerli S, Ruiz A, Pellicer A.


Remohi J.: Use of fluorescence in situ hybridizationto assess the chromosomal status of embryos obatinedfrom cryopreserved oocytes. Fertil Steril 2001; 75:354-360.

10. Eppig JJ, O´Brien MJ.: Development in vitro ofmouse oocytes from primordial follicles. Biol Reprod1996; 54:197-207

11. Fabbri R, Porcu E, Marsella T, Primavera MR,Seracchioli R, Ciotti PM, Magrini O, Venturoli S,Flamigni C.: Oocyte cryopreservation. Hum Reprod1998; 13 (Suppl 4):98-108.

12. Fabbri R, Porcu E, Marsella T, Rocchetta G,Venturoli S, Flamigni C.: Human oocyte cryopreser-vation: new perspectives regarding oocyte survival.Hum Reprod, 16: 411-416.

13. Faddy MJ, Gosden RG.: A mathematical model offollicle dynamics in the human ovary. Hum Reprod1995; 10:770-5.

14. Gook DA, Schiewe MC, Osborn SM, Asch RH,Jansen RPS, Johnston WIH.: Intracytoplasmicsperm injection and embryo development of humanoocytes cryopreserved using 1,2-propanediol. HumReprod 1995; 10:2637-2641.

15. Gosden RG, Baird DT, Wade JC, Webb R.: Resto-ration of fertility to oophorectomized sheep by ovarianautografts stored at - 196ºC. Hum Reprod 1994;9:597-603.

16. Gosden R, Rutherford A, Norfolk DR.: Ovarian ban-king for cancer patients. Transmission of malignantcells in ovarian grafts. Hum Reprod 1997, 12:403-405.

17. Harp R, Leibach J, Black J, Keldalhl C, Karow A.:Cryopreservation of murine ovarian t issue.Cryobiology 1994; 31:336-3432.

18. Hovatta O, Silye R, Krausz T, Abir R, Margara R,Trew G, Lass A, Winston RML.: Cryopreservationof human ovarian tissue using dymethylsulphoxideand propanediol-sucrose as cryoprotectants. HumReprod 1996; 11: 1268-1272.

19. Kazem R, Thompson LA, Srikantharajah A, LaingMA, Hamilton MPR, Templeton A.: Cryopreser-vation of human oocytes and fertilization by two tch-niques: in vitro fertilization and intracytoplasmicsperm injection. Hum Reprod 1995; 10:2650-2654.

20. Kim SS, Radford J, Harris M, Varley J, RutherfordAJ, Lieberman B, Shalet S, Gosden R.: Ovarian tis-sue harvested from lymphoma patients to preserve fer-tility may be safe for autotransplantation. Hum Reprod2001; 16:2056-60.

21. Kuleshova L, Gianaroli L, Magli C, Ferraretti A,Trounson A.: Birth following vitrification of a smallnumber of human oocytes. Hum Reprod 1999; 14:3077-3079.

22. Ludwig M, Al-Hasani S, Felberbaum R, DiedrichK.: New aspects of cryopreservation of oocytes and

embryos in assisted reproduction and future perspecti-ves. Hum Reprod 1999; 14 (Suppl 1):162-85.

23. Mandelbaum J, Belaïsch-Allart J, Junca AM,Antoine JM, Plachot M, Alvarez S, Alnot MO,Salat-Baroux J.: Cryopreservation in human assistedreproduction is now routine for embryos but remains aresearch procedure for oocytes. Hum Reprod 1998; 13(Suppl 3):161-174.

24. Meirow D, Ben Yehuda D, Prus D, Poliack A,Schenker JG, Rachmilewitz EA, Lewin A.: Ovariantissue banking in patients with Hodgkin’s disease:is itsafe? Fertil Steril 1998; 69:996-998.

25. Moomjy M, Rosenwaks Z.: Ovarian tissue cryoprese-vation: the time is now . Transplantation or in vitromaturation: the time awaits. Fertil Steril 1998; 69:999-1000.

26. Newton H, Aubard Y, Rutherford A, Sharma V,Gosden R.: Low temperature storage and grafting ofhuman ovarian tissue. Hum Reprod 1996; 11:1487-1491.

27. Oktay K, Newton H, Aubard Y, Salha O, GosdenRG.: Cryopreservation of immature human oocytesand ovarian tissue: an emerging technology? FertilSteril 1998; 69:1-

28. Oktay K, Karlikaya G, Gosden R, Schwarz R.:Ovarian function after autologous transplantation offrozen-banked human ovarian tissue. Fertil Steril1999; 72 (Suppl 1): S-21

29. Oktay K, Karlikaya GG, Aydin BA.: Ovarian cryo-preservation and transplantation: basic aspects. MolCell Endocrinol 2000, 169:105-8.

30. Oktay K, Economos K, Kan M, Rucinski J, VeeckL, Rosenwaks Z.: Endocrine function and oocyte re-trieval after autologous transplantation of ovarian cor-tical strips to the forearm. JAMA 2001; 286:1490-3.

31. Palermo G, Joris H, Devroey P, Van Seirteghem AC.:Pregnancies after intracytoplasmic injection of a singlespermatozoon into an oocyte. Lancet 1992; 340: 17-18.

32. Polak de Fried E, Notrica J, Rubinstein M, MarazziA, Gómez Gonzalez M.: Pregnanacy after human do-nor oocyte cryopreservation and thawing in associa-tion with intracytoplasmic sperm injection in a patientwith ovarian failure. Fertil Steril 1998; 69:555-557.

33. Porcu E, Fabbri R, Seracchioli R, Ciotti PM,Magrini O, Savelli L, Ghi T, Flamigni C.: Intracyto-plasmic sperm injection of cryopreserved human oocy-tes. Proceedings of the 10th World Congress on InVitro Ferti l ization and Assisted Reproduction,Vancouver, Canada, 24-28 May, 1997. MonduzziEditore, Bologna, pp 1153-1157.

34. Porcu E, Fabbri R, Seracchioli R, Ciotti P, MagriniO, Flamigni C.: Birth of a healthy female after in-tracytoplasmic sperm injection of cryopreserved hu-man oocytes. Fertil Steril 1997b; 68:724-726.


35. Porcu E, Fabbri R, Ciotti PM, Petracchi S,Seracchioli R, Flamigni C.: Ongoing pregnancy afterintracytoplasmic sperm injection of epididymal sper-matozoa into cryopreserved human oocytes. J AssistReprod Genet 1999a; 16: 283-285.

36. Porcu E, Fabbri R, Ciotti PM, Marsella T,Balicchia B, Damiano G, Caracciolo S, Giunchi S,De Cesare R, Flamigni C.: Cycles of human oocytecryopreservation and intarcytoplasmic sperm injec-tion: results of 122 cycles. Fertil Steril 1999b; 72(Suppl 1):O-004.

37. Radford JA, Lieberman BA, Brison DR, Smith AR,Critchlow JD, Russell SA, Watson AJ, Clayton JA,Harris M, Gosden RG, Shalet S.: Orthotopic reim-plantation of cryopreserved ovarian cortical strips af-ter high-dose chemotherapy for Hodgkin’s lymphoma.Lancet 2001; 357:1172-1175.

38. Shaw JM, Bowles J, Koopman P, Wood EC,Trounson AO.: Fresh and cryopreserved ovarian tissuesamples from donors with lymphoma transmit the cancerto graft recipients. Hum Reprod 1996; 11:1668-1673.

39. Trounson A.: Preservation of human eggs and embr-yos. Fertil Steril 1986; 46: 1-12.

40. Tucker MJ, Wright G, Morton PC, Massey JB.:Birth after cryopreservation of immature oocytes withsubsequent in vitro maturation. Fertil Steril 1998b;70:578-579.

41. Van Uem JF, Siebzehnrübl E, Schuh B, Koch R,Trotnow S, Lang N.: Birth after cryopreservation ofunfertilised oocytes. Lancet 1987; ii:752-753.

42. Veeck LL.: Freezing of Preembryos: Early vs LateStages. J Assist Reprod Genet 1993; 10:181-185.

43. Yang DS, Blohm PL, Cramer L, Nguyen K, ZhaoYL, Winslow KL.: A successful human oocyte cryo-preservation regime: survival, implantation and preg-nancy rates are comparable to that of cryopreservedembryos generated from sibling oocytes. Fertil Steril1999; 72 (Suppl 1):O-224.

44. Young E, Kenny A, Puigdomenech E, Van Thillo G,Tiverón M, Piazza A.: Triplet pregnancy after in-tracytoplasmic sperm injection of cryopreserved oocy-tes: case report. Fertil Steril 1998; 70:360-361.





Diagnóstico genético preimplantacional

Velilla E, Sandalinas M, Escudero T, Munné S.

Institute for Reproductive Medicine and Science, Saint Barnabas Medical Center. NewJersey. USA.

Las causas de la disminución de la implantacióncon el aumento de la edad materna estan aun por de-terminar. Los resultados obtenidos en programas dedonación ovocitaria en mujeres de avanzada edad re-productiva sugieren que la calidad ovocitaria se verealmente comprometida. La incidencia en las ano-malías cromosómicas en embriones es considerable-mente superior que en las encontradas en abortos es-pontáneos sugiriendo que un determinado porcentajede embriones cromosómicamente anormales son eli-minados antes del diagnóstico prenatal. Esta pérdidaafecta a la disminución de la implantación en estegrupo de pacientes. Debido a la correlación existenteentre el porcentaje de aneuploidías y la disminuciónde la implantación, se cree que la selección de losembriones cromosómicamente normales podría re-vertir esta tendencia.

Así pues, el estudio de aneuploidías presenta tresobjetivos principales: (1) Aumentar las tasas de implan-tación, (2) reducir el riesgo de abortos espontáneos, (3)evitar la descendencia cromosómicamente anormal, (4)reducir el número de embarazos múltiples.

Se ha observado que las tasas de implantación nose ven aumentadas con el estudio de 5 cromosomas yque es necesario analizar hasta 8 cromosomas paraconseguir un aumento significativo de la tasa de im-plantación. En cuanto a la disminución de la inciden-cia de los abortos espontáneos, se ha observado ennuestro centro una disminución desde el 23% al 11%después de la técnica de PGD. En St Barnabas se ob-serva un 0,8% de gestaciones cromosómicamenteanormales después del PGD respecto a un 3,2% ob-servado en el grupo control. El aumento del porcen-taje de gestación en parejas mayores de 37 anos au-menta considerablemente con el estudio de 8 a 9cromosomas.

El PGD para aneuploidías reduce el número de

gestaciones múltiples. En los dos últimos estudios setransfirieron significativamente menos embriones enlos grupos de PGD que en los grupos controles(Munné et al., 1999; Gianaroli et al., 1999).

Para el diagnóstico genético preimplantacional yasea para la selección de sexo (Griffin et al., 1992,Munné 1993a), aneuploidía (Munné et al., 1993b,1995, 1999; Verlinsky et al., 1995: Gianaroli et al.,1999), y anomalías estructurales (Munné et al. 1996,1998; Verlinsky y Evsikov 1999) es necesario labiopsia de uno o los dos corpúsculos polares o labiopsia de uno o dos blastómeros, su fijación en unportaobjetos, la posterior hibridación in situ fluores-cente (FISH) y su análisis. Uno de los pasos críticosen todo el proceso es la fijación. Es imprescindibleasegurar la fijación de cada blastómero y la correctahibridación de las sondas.

Gran porcentaje del volumen de casos de PGDque se realizan en nuestro centro (75%) provienen dediferentes centros por todo EE.UU. Parte de ellos en-vían las muestras fijadas y deshidratadas preparadaspara el PGD y su análisis. Para ello es necesario uni-formizar las técnicas de fijación.

Los métodos de fijación tradicionales, desarrolla-dos en un principio por Tarkowski et al., (1966) ymodificados posteriormente por diferentes autores,implica el uso de solución de carnoid (metanol: ácidoacético, 3:1 v:v) a una pequeña gota de solución dehipotónico que contiene el blastómero a fijar. Se handesarrollado otros métodos de fijación usando Tween20 (Coonen et al., 1994) y otro, mediante la combi-nación de la solución de Tween 20 y Carnoid(Dozortev and McGinnis 2001). Estos dos últimosmétodos no requieren tanta habilidad ya que se evitala posible pérdida de blastómeros durante el procesode fijación (Xu et al., 1998, Dorzotev and McGinnis2001). Por otra parte, estos dos nuevos métodos se


basan en el secado parcial o total de los blastómerospor lo que es difícil obtener un diámetro adecuado(Hliscs et al., 1997). El porcentaje de señales super-puestas, situadas en la misma posición u overlaps, au-menta en núcleos de tamaño reducido produciendo unaumento en el número de errores de diagnóstico(Munné et al., 1996).

Existen diferentes factores que pueden afectar lacalidad de la FISH, como son:

Pérdida nuclear . La técnica de fijación conCarnoid implica la mezcla de fijador (solución alco-hólica) con una gota de hipotónico conteniendo elblastómero a fijar. Este proceso produce turbulenciasen el cual es posible la pérdida del material, este ries-go es del 3% en manos expertas.

Presencia de citoplasma. La presencia de citoplas-ma interfiere en la unión de la sonda con el núcleo,especialmente en las sondas locus especificas. Estassondas son de tamaño mayor que las repetitivas y seunen con facilidad a los restos de citoplasma y partí-culas de polvo aumentando el ruido de fondo o back-ground. Además, el citoplasma es refringente por simismo y enmascara las señales. Así pues la presenciade citoplasma puede incrementar el número de erro-res de diagnóstico o bien, hacer que el núcleo sea noinformativo. La técnica de Tween 20 se combina conun tratamiento de los núcleos con pepsina para degra-dar el máximo posible la presencia de citoplasma, apesar de ello, la cantidad de citoplasma remanente esaun considerable. Además, una exposición demasiadolarga con pepsina podría dar una degradación delDNA (Xu et al., 1998, Dozortev and McGinnis 2001)

Otra de las posibles fuentes de background obser-vada con el método de Tween 20 es la Poli-L-lisina.Esta técnica requiere el pretratamiento de los porta-objetos con solución de poly-L-lisina para evitar así

la pérdida del núcleo. Esta sustancia produce una ca-pa en todo el portaobjetos que puede interferir en elanálisis de las señales.

Diámetro nuclear. Los núcleos de pequeño tamañoconservan su estructura tridimensional con lo que lasseñales quedan a diferentes planos de foco siendomas fácil un falso diagnóstico. Dos señales cercanaso sobrepuestas pueden ser diagnosticadas como unasola señal, dando error de diagnóstico. Con el uso defijador de Carnoid los núcleos quedan fijados en unsolo plano, reduciéndose así las señales superpuestas.El tamaño ideal de núcleo es de aproximadamente60µ m (Tabla 1). Núcleos de diámetro superior a80µm presentan una cromatina excesivamente des-condensada mostrando unas señales mas laxas, dis-persas y débiles que en los núcleos de tamaño normalproduciendo así falsas nulisomías, monosomías o di-somías. El tamaño nuclear no depende solamente delproceso de fijación sino que también depende de latemperatura y la humedad (Spurbeck et al., 1996,Hliscs et al., 1997).

En un estudio reciente en nuestro laboratorio se hacomparado las diferentes técnicas de fijación [método(1) Carnoid (Tarkowky AK. 1966); método (2) Tween20 (Coonen et al., 1994); método (3) Tween 20 yCarnoid (Dozortsev and McGinnis (2001)] en funcióndel porcentaje de pérdida nuclear, diámetro nuclear yerrores de diagnóstico mediante el uso de sondas paralos cromosomas 13,15, 16, 17, 18, 21, 22, XY (Velillaet al., 2002). El método (2) se ha utilizado anteriormen-te para determinación del sexo (Harper et al. 1994,1995, Coonen et al. 1996, Soussis et al. 1996) mediantela sondas para uno o dos pares de cromosomas. Estassondas son de tamaño pequeño y se unen a secuenciasrepetitivas de regiones satélites (centrómero X y 18, ola mayor parte del brazo q del cromosoma Y), produ-ciendo una señal de gran tamaño, incluso bajo las peo-

Diámetro analizables diámetro Núcleos con total # Erroresmedio señales sup. señales sup. FISH

<30 55 21,63 28 (50,9%)a 62 14 (25,5%)c

30-60 139 42,97 45 (32,4%) 71 29 (20,9%)

>60 58 78.72 16(27.6%)b 16 3 (5.2%)d

a vs b: p<0.025, c vs d: p<0.005

Tabla 1Diámetro nuclear en relación a las señales superpuestas y errores de FISH


res condiciones de fijación. Este método puede ser útilpara determinación de sexo donde se utilizan un bajonúmero de sondas, pero no se recomienda para el estu-dio de aneuploidías donde se utilizan gran numero desondas, gran parte de ellas locus específicas.

Los errores de FISH observados para el método(1), 10%, fue comparable a los hallados en estudiosprevios usando el mismo método de fijación (Munnéet al., 1996). Para el método (3) el error de FISH sehallo en un 17% y para el método (2) el error de

FISH fue del 30% siendo este último un método norecomendable para PGD de aneuploidías (Tabla 2).Así pues se observo que el método de fijación conCarnoid todo y ser el método mas complicado deaprender es el que produce mejor calidad nuclear y deFISH y que la combinación del método de Tween 20con Carnoid, debido a su fácil aprendizaje, a la bajapérdida nuclear y considerable calidad nuclear, podríaser un método alternativo de fijación para aquelloscentros donde este no se realiza de forma rutinaria.

Tabla 2Número de señales superpuestas y errores de FISH

Método analizables Diámetro Núcleos con # total Errores de± Desv St señales superp. señales superp. FISH

1 89 58,5±20,7 12(13,5%)a 16d 9 (10,1%)g2 71 30,8±12,9 41(57,7%)b 88e 21(29,6%)h3 92 46,0±18,7 36(39,1%)c 45f 16 (17,4%)

a vs b, a vs c, d vs e, d vs f: p <0.001. g vs h: p<0.005

BIBLIOGRAFÍA

1. Coonen E, Dumoulin JCM, Ramackers FCS,Hopman AHN.: Optimal preparation of preimplanta-tion embryo interphase nuclei for analysis by fluores-cence in-situ hybridization. Human Reprod. 1994; 9,3: 533-537.

2. Coone E, Dumolin JCM, Dreesen JCFM, Bras M,Evers JHL, Geraedts JPM.: Clinical application ofFISH for sex determination of embryos in preimplan-tation diagnosis of X-linked diseases. JARG. 1996;13: 133-136.

3. Dozortsev DI And McGinnis KT.: An improved fixa-tion technique for fluorescence in-situ hybridizationfor preimplantation genetic diagnosis Fertility andSterility. 2001; 76: 186-188.

4. Griffin DK, Wilton LJ, Handyside AH, WistonRML, Delhanty JDA.: Dual fluorescent in-situ hybri-dization for simultaneous detection of X and Y chro-mosome-specific probes for the sexing of humanpreimplantation embryonic nuclei Hum.Genet.1992;89:18-22.

5. Gianaroli L, Magli MC, Munné S, et al .:Preimplantation diagnosis for aneuploidies in patientsundergoing in vitro fertilization with a poor prognosis.Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 1999;16, 170-175.

6. Harper JC, Drawson K, Delhanty JDA, WinstonRML.: The use of fluorescent in-situ hybridization(FISH) for the analysis of in-vitro fertilization embr-

yos: a diagnostic tool for the infertile couple HumanReprod. 1995; 10: 3255-3258.

7. Harper JC, Coonen E, Ramaekers FCS, DelhantyJDA, Handyside AH, Winston RML, HopmanAHN.: Identification of the sex of human preimplan-tation embryos in two hours using an improved sprea-ding method and fluorescence in-situ hybridization(FISH) using directly labeled probes. HumanReproduction. 1994; 9: 721-724.

8. Hliscs R, Muhlig P, claussen U.: The spreading ofmetaphases is a slow process, which leads to a stret-ching of chromosomes Cytogenet Cell genet. 1997;76: 167-171.

9. Munné S, Weier HUG, Stein J, Grifo J, Cohen J.: Afast and efficient method for simultaneous X and Yin-situ hybridization of human blastomeres J AssistedReprod Genet. 1993a; 10: 82-90.

10. Munné S, Lee A, Rosenwaks Z, Grifo J, Cohen J.:Diagnosis of major chromosome aneuploidies in hu-man preimplantation embryos Hum Reprod. 1993b; 8:2185-2191.

11. Munné S, Alikani M, Tomkin G, Grifo J, Cohen J.:Embryo morphology, developmental rates and mater-nal age are correlated with chromosome abnormalities.Fertil Steril. 1995; 64: 382-391.

12. Munné S, Dailey T, Finkelstein M, Weier HUG.:Reduction in signal overlap results in increased fish effi-ciency: implications for preimplantation genetic diagno-sis J Assisted Reprod Genet. 1996; 13: 149-156.

13. Munné S, Cohen J.: Chromosome abnormalities in

human embryos. Human Reprod update. 1998; 4: 842-855.

14. Munné S, Magli C, Cohen J, Morton P, Sadowy S,Gianaroli L, Tucker M, Márquez C, Sable D,Ferraretti AP, Massey JB, Scott R.: Positive outco-me after preimplantation diagnosis of aneuploidy inhuman embryos Human Reprod. 1999; 14: 2191-2199.

15. Soussis I, Harper JC, Kontogianni E, Paraschos T,Packham D, Handyside AH, Winston RML.:Pregnancies resulting from embryo biopsied for preim-plantation diagnosis of genetic disease: biochemical andultrasonic studies in the first trimester of pregnancy. JAssisted Reprod Genet. 1996; 13: 254-258.

16. Spurbeck JL, Zinsmeister AR, Meyer KJ, JalalSM.: Dynamics of chromosome spreading. Am. J.Med Genet. 1996; 61: 387-393.

17. Tarkowski AK.: An air-drying method for chromoso-

me preparation mouse eggs. Cytogenetics. 1966; 5:394-400.

18. Verlinsky Y, Evsikov S.: Karyotyping of human oocy-tes by chromosomal analysis of the second polar bodyMolec Human Reprod. 1999; 5: 89-95.

19. Verlinsky Y, Cieslak J, Frieidine M, et al .:Pregnancies following pre-conception diagnosis ofcommon aneuploidies by fluorescence in-situ hybridi-zation. Human Reproduction. 1995; 10, 1923-1927.

20. Velilla E, Escudero T, Munne S.: Blastomere fixationtechniques and risk of misdiagnosis for PGD of aneu-ploidy. RBMOn line, in press, 2002.

21. Xu K, Huang T,Tiezheng L, Zhongmig S andRosenwaks Z.: Improve the fixation method forpreimplantation Genetic Diagnosis for Fluorescent In-Situ Hydridization Journal of assisted reproductionand genetics. 1998; 13, 9: 570-574.


cribió la clonación de más de 50 ratones hembras apartir de células del cúmulo de animales adultos. Apartir de entonces, diversos grupos de investigaciónde todo el mundo han utilizado una serie de diferen-tes tipos de células para clonar ovejas, vacas, rato-nes, vacas, ratones, cabras, cerdos y, más reciente-mente, conejos y un gatito.

En la página web del Instituto Roslin (www.ros-lin.ac.uk/public/cloning.html) puede verse un resu-men de todos los artículos sobre clonación publica-dos hasta agosto de 2001. El porcentaje global deéxito es reducido, dado que sólo una media del 1 al2% de los embriones clonados producen nacimientosvivos. Dado que no se publican muchos de los expe-rimentos que fracasan, el porcentaje real de éxito se-rá muy inferior. Los fracasos pueden presentarse entodas las etapas del desarrollo. Una proporción ele-vada de embriones clonados simplemente no se con-vierten en blastocitos y otros, al parecer, no consi-guen implantarse. Lo más importante es que, una vezque se establecen los embarazos, una proporciónmuy superior a lo normal terminan en abortos espon-táneos. Un elevado número de clones mueren igual-mente en el plazo de pocas horas después del naci-miento.

En los animales clonados se han podido encontraruna gran variedad de problemas. En el ganado ovinoy vacuno, los clones tienen a menudo un tamaño ex-cesivo. En los ratones, la placenta puede ser de tres acuatro veces mayor que la normal, y se considera queel funcionamiento defectuoso de la placenta es unade las causas principales de muerte fetal en los clo-nes de todas las especies. Los análisis post-mortemde clones que mueren poco después del nacimientopermiten observar a menudo un desarrollo anormalde los pulmones o de otros órganos. en Roslin, por

La oveja Dolly fue el primer mamífero clonado apartir de una célula adulta. Nacida el 5 de julio de1996 en el Instituto Roslin, cerca de Edimburgo, elanuncio de su nacimiento, 7 meses después, puso enmarcha lo que ha resultado ser una fascinación dura-dera de los medios de comunicación en relación concualquier cosa clonada. Este trabajo estudia el alcan-ce que ha tenido la clonación durante los 5 últimosaños, e intenta separar los probables beneficios prác-ticos de lo que es simplemente “novedoso”.

El clon no es más que una copia genética. Los jardi-neros clonan cuando toman esquejes de plantas, y la na-turaleza clona cuando crea gemelos idénticos. En el va-cuno, la disección de células individuales de embrionesde 4 u 8 células y su implantación en diferentes madres“adoptivas” puede producir terneros clonados.

Dolly fue creada siguiendo una técnica muy dife-rente: la transferencia nuclear. Suponía retirar el nú-cleo de un óvulo no fecundado y sustituirlo por unacélula diploide de la ubre de una oveja de 6 años deedad. Este “embrión reconstruido” se expuso a unapequeña corriente eléctrica que fusionó entre sí am-bas células y - por imitación al cambio de polariza-ción que ocurre normalmente cuando un esperma fer-tiliza un óvulo - inició el proceso de división ymultiplicación celular. Los embriones clonados fue-ron entonces incubados en el útero de ovejas reci-pientes temporales y los que se desarrollaron normal-mente fueron implantados en madres sustitutas. De277 embriones creados de este modo, sólo 29 se con-virtieron en blastocitos y, cuando fueron implantadosen 13 madres sustitutas, sólo una quedó preñada.

Los avances desde Dolly

Al principio, Dolly fue un “clon único” pero, enjunio de 1998, un grupo investigador de Hawaii des-

La Clonación: la actualidad y el futuro

Griffin H. BSc,MBA,PhD

Assistant Director (Science)

Roslin Institute. Edinburhg. Scotland. U.K.




ejemplo, tuvimos que sacrificar un cordero clonado alos 12 días de edad porque presentaba hiperventila-ción. El examen posterior demostró que el músculoliso que rodeaba las arteriolas de los pulmones eramucho más grueso de lo normal y esto había estadolimitando probablemente la eficiencia del intercam-bio gaseoso entre los alvéolos y la alimentación desangre a los pulmones. En Francia, un ternero clona-do murió repentinamente a los 51 días de edad. Unanálisis retrospectivo de muestras de sangre tomadasdel animal mostró un fallo catastrófico en la forma-ción de hematíes y leucocitos en los pocos días queprecedieron a la muerte. Los ratones clonados tiendena la obesidad, y existe un informe de ratones clonadosque murieron antes de lo previsto (Ogonuki et al,2002). Dolly sufre de artritis, pero no se sabe con se-guridad si este hecho es una consecuencia de ser unclon o bien una oveja célebre.

Los frecuentes problemas asociados a los cloneshan llevado a ciertas preguntas sobre si cualquierclon es totalmente “normal”. Recientemente se hanpublicado datos sobre la normalidad aparente de unpequeño grupo de terneros clonados (Lanza et al.,2001), pero el grupo estudiado representaba supervi-vientes de un grupo mucho mayor de clones (de losque el 75% murió in utero y el 10% poco después delnacimiento). Incluso en este grupo, algunas observa-ciones se presentaban fuera de la escala normal. Esevidente que se necesitan comparaciones mucho másdetalladas, en varias especies y durante un períodomás prolongado de la vida, si queremos tener la segu-ridad de que los clones pueden ser “normales”.

¿Por qué es tan ineficiente la clonación?

Gran parte de la atención dedicada a explicar elescaso porcentaje de éxito se ha centrado en las in-fluencias epigenéticas sobre la expresión de los ge-nes. La creación del esperma y del óvulo va acompa-ñada por una remodelación del ADN, tanto entérminos de su estructura cromatínica como de su es-tado de metilación, procesos que duran meses y años,respectivamente. Después de la fecundación, el ADNdel embrión sufre inicialmente una desmetilación pe-ro, a medida que avanza el desarrollo, se establecenpautas de metilación específicas de cada tejido. El es-tado de metilación del ADN de células somáticas uti-lizadas como donantes en transferencia nuclear es,pues, muy diferente del del ADN del óvulo y el es-perma, y se han publicado ya algunos artículos quedemuestran la existencia de una metilación aberranteen embriones clonados, comparados con los normales(Kang et al 2001, Bourc’his et al 2001, Dean et al

2001). En ratones clonados adultos, las pautas de me-tilación propias de cada tejido son anormales, pero lanormalidad varía según el individuo (Ohgane et al2001). Es interesante señalar que la obesidad de losratones clonados no se transfiere a su descendencia(Tamashiro et al 2002).

Nuestros propios estudios (Young et al 2001) handemostrado que el cultivo in vitro de embriones deoveja reducían la metilación y expresión del gen re-ceptor IGF-2 y que esto podría representar, al menosen parte, la descendencia superior a la normal que seobtiene a menudo por clonación. El gen receptorIGF-2 no se imprime en los humanos, lo que ha lleva-do a afirmar que este hecho significa que la clonaciónhumana sería más fácil que la de los animales. Estosería una grave simplificación, ya que se calcula queexisten más de cien genes impresos. Además, la im-presión no es más que uno de una serie de mecanis-mos epigenéticos que intervienen en la reprograma-ción. Varios grupos están empezando ahora a realizarcomparaciones entre la expresión de genes específi-cos en fetos normales y clonados y entre el feto clo-nado y su placenta.

Las limitadas pruebas disponibles hasta la fecha es-tán, pues, de acuerdo con la hipótesis de que el escasoporcentaje de éxito de la clonación se debe a errores enla expresión genética provocados por una reprograma-ción inapropiada y esto, a su vez, es en parte conse-cuencia de una metilación aberrante del ADN (Janischy Wilmut, 2001). En un extremo, los errores generadosparecen impedir cualquier avance mientras que, en elotro, los animales clonados parecen ser normales. Unamayor experiencia podría aumentar los porcentajes deéxito, como se afirma ya en el ganado vacuno, pero lanaturaleza aparentemente estocástica del problema su-giere que aumentos importantes en la eficiencia exigi-rán cambios radicales en la técnica.

¿Cuáles serán los beneficios prácticos de laclonación?

Dada la atención que se ha prestado a la clona-ción, se tiene a veces la impresión de que esta técnicava a revolucionar la agricultura y la medicina, pro-porcionando, por ejemplo, un suministro ilimitado detejidos y órganos inmunocompatibles para trasplan-tes. Lo cierto es que las aplicaciones prácticas de laclonación son relativamente limitadas, como se expo-ne brevemente a continuación.

Modificación genética

En Roslin, el motivo principal para desarrollar la


clonación fue el de proporcionar mejores sistemas pa-ra modificar genéticamente especies de animales degranja. Hasta hace poco tiempo, el único medio decrear terneros, ovejas o cerdos genéticamente modifi-cados era por inyección directa de genes en uno delos pro-núcleos de un óvulo recién fecundado. Estatécnica es ineficiente: sólo de un 2 a un 5% de losanimales obtenidos son transgénicos y, en muchos deellos, el transgen aparece inactivo. Lo importante esque la inyección pro-nuclear sólo permite que se aña-dan genes.

En células en cultivos pueden efectuarse modifi-caciones genéticas mucho más sofisticadas, incluidasla supresión o sustitución de genes específicos. Latransferencia nuclear permite que las células se con-viertan en animales: si las células se modifican pri-mero genéticamente, entonces cabría esperar que losanimales derivados de ellas llevaran la misma modifi-cación. Este enfoque se ha utilizado ahora para añadirgenes a ovejas, y dos compañías han eliminado losgenes de la galactosil-transferasa de cerdos con la fi-nalidad de hacer que sus órganos sean más adecuadospara trasplantes a pacientes humanos.

La cría del ganado vacuno

En la actualidad, la mayor parte del avance en lamejora genética del ganado la realizan compañías es-pecializadas en los cruces y mejoras de estos anima-les, en rebaños relativamente pequeños y elegidos,pasándose los beneficios al granjero normal a travésde la venta a los mismos de semen de los mejores to-ros. El esperma sólo proporciona la mitad de los ge-nes para la siguiente generación de terneros y, comoresultado, una granja normal se encuentra aproxima-damente con 10 años de retraso respecto a lo que se-ría lo óptimo.

La clonación de unos pocos toros o vacas elegidostendría muy poco impacto en la cría de los animales.Por el contrario, si embriones clonados obtenidos deanimales elegidos pudieran implantarse de forma ruti-naria en vacas, los granjeros podrían esperar la obten-ción de terneros con un rendimiento muy similar alde los rebaños elegidos. Este escenario exigiría quese redujeran drásticamente los costes de la clonación,pero algunas compañías de Nueva Zelanda, Australiay los EE.UU. están trabajando sin descanso para con-seguirlo. Sus esfuerzos cuentan con la ayuda de ma-durar ovocitos bovinos in vitro: en los mataderos po-demos encontrar un suministro prácticamenteilimitado de óvulos, así como el éxito en el cultivo invitro de embriones de vaca para convertirlos en blas-tocitos.

Preservación de especies en peligro de extinción

La posibilidad de utilizar la clonación para preser-var especies en peligro de extinción ha despertado laimaginación del público, pero este interés no tieneprácticamente ninguna base científica. La clonaciónexige un suministro de óvulos y de madres “de alqui-ler” y, como ocurre con la reproducción normal, éstasdeben ser de especies iguales o estrechamente rela-cionadas si se quiere tener éxito en los embarazos.Existen dos casos de clonación de especies distintas:un grupo italiano ha clonado un musmón y un equipode los EE.UU. una especie similar a la de los bovi-nos: el “guar”. En ambos casos, los óvulos y las ma-dres suplentes procedían de razas domésticas con lasque pudieron cruzarse satisfactoriamente las especiessupuestamente en peligro de extinción.

La perspectiva de clonar una especie auténtica-mente en peligro, como el panda, que no tiene ningún“pariente” cercano, es bastante remota. Además - co-mo han señalado con toda razón los ecologistas - eldinero empleado en proyectos de clonación en su ma-yoría especulativos se gastaría mucho mejor para me-jorar los programas clásicos de cruce y para protegerel hábitat de las especies en peligro de extinción.

La clonación y la terapia con células-madre

Algunos grupos de investigadores de todo el mun-do están estudiando nuevos sistemas para tratar enfer-medades tales como la de Parkinson, las cardiopatíasy los ataques cerebrovasculares por implantación decélulas en lugar de utilizar drogas. Una fuente en po-tencia de células serían las células madre embriona-rias obtenidas de embriones humanos. Estas célulasse pueden multiplicar indefinidamente en el laborato-rio y, en principio, pueden dirigirse a cualquiera delos más o menos 200 tipos de células que forman elcuerpo humano. Una única línea de células madreembrionarias podría, en teoría, proporcionar trata-miento a muchos millares de pacientes que sufrieranuna serie de enfermedades diferentes.

Será necesario identificar la manera de evitar elrechazo inmunológico, y una sugerencia sería la de“clonar” las células necesarias de los mismos pacien-tes. En este escenario, una célula de la piel, por ejem-plo, del paciente se utilizaría para crear un embriónhumano por transferencia nuclear. Este embrión seríacultivado durante 6 ó 7 días en el laboratorio, utili-zándose después como fuente de células madre em-brionarias que podrían convertirse más tarde en el ti-po de cé lula deseado por cultivo en un cóctelapropiado de factores de crecimiento. Cuando se in-trodujeran de nuevo en el paciente las células produ-


cidas de este modo, no las rechazaría porque seríaninmunológicamente idénticas a todas las demás célu-las de su organismo.

Aunque esta secuencia sería posible, no será prác-tica para el tratamiento de rutina de los muchos cien-tos de miles de pacientes que podrían beneficiarse dela terapia celular: se necesitarían varios óvulos paracrear cada embrión, y los óvulos humanos son aúnmás escasos que los embriones humanos.Consideramos que el uso de la transferencia nuclearen este contexto es básicamente una herramienta de lainvestigación: un medio para conocer el proceso dereprogramación. Ese conocimiento podría permitirentonces la reprogramación de células sin el uso deóvulos humanos, ni la creación y destrucción de em-briones humanos. Como alternativa, se podría utilizarla transferencia nuclear para crear líneas madre em-brionarias de un determinado individuo, a fin de estu-diar una enfermedad genética específica.

¿Y la clonación de niños?

Los intentos para clonar niños con el uso de la tec-nología actual serían totalmente irresponsables.Cuando, en 1979, nació el primer “niño probeta”,muchos plantearon temores en cuanto a un procedi-miento que no había sido ensayado, temores que granparte resultaron no tener fundamento. Pero la actualsituación respecto a la clonación es muy diferente.Como se ha descrito antes con algún detalle, existenindicios abundantes de estudios con animales de quela clonación termine de mala manera, como así ocu-rre de hecho, y no hay justificación alguna para pen-sar que no sucederá esto en los humanos.

Las sugerencias de que sería posible identificarlos embriones anormales antes de la implantación através de un cálculo del estado de metilación de losgenes clave son peligrosamente ingenuas. Nadie sabecuántos genes son críticos para el desarrollo normaldel embrión, ni se dispone en este momento (ni sedispondrá en un futuro previsible) de tecnología algu-na para evaluar el estado epigenético global del geno-ma. Las ideas de que los fetos clonados podrían serevaluados in utero por ultrasonido, provocándose elaborto si resultaran anormales no tienen en cuenta larealidad de que muchos de los defectos de los clonesson sutiles y casi imperceptibles, pero representan sinembargo una amenaza para la vida. Los pulmones,por ejemplo, son con frecuencia los más comprometi-dos, pero por ultrasonido sería difícil detectar anor-malidades en un órgano que no se utilice hasta el mo-mento del nacimiento.

La posibilidad de la clonación de un niño plantea

cuestiones fundamentales en cuanto a la dignidad eindividualidad humanas. En el Reino Unido, la clona-ción conocida como reproductiva fue prohibida espe-cíficamente por el Parlamento en agosto de 2002, unadecisión con la que está totalmente de acuerdo el au-tor de este artículo.

Entonces ... ¿Cuál será la contribución másduradera de la clonación?

La clonación de animales a partir de células adul-tas echó por tierra un axioma generalmente manteni-do por los biólogos del desarrollo, en el sentido deque las células diferenciadas de los mamíferos tienenroles fijos, y por este logro fue por el que la creaciónde Dolly fue reconocida como “Avance Científico delAño” en 1997 por el Comité de Redacción de la re-vista de los EE.UU. “Science”. La clonación haabierto evidentemente un campo del todo nuevo paraestudio - la plasticidad evolutiva - y, en el plazo detres años, esperamos que será por este motivo por elque sea recordada, en lugar de por la actual especula-ción interminable sobre la clonación humana.

BIBLIOGRAFIA

1. Bourc’his D, Le Bourhis, D, Patin, D, Niveleau, A,Comissoli P, Renard J, Viegas-Peguignot, E.:(2001) Delayed and incomplete reprogramming of ch-romosomal methylation patterns in bovine clonedembryos. Current Biology 11, 1542-1546

2. Dean W, Santos F, Stojkovi, M, Zakhartchenko V,Walter J, Wolf E. & Reik W.: (2001) Conservationof methylation reprogramming in mammalian deve-lopment: aberrant reprogramming in cloned embryos.Proceedings of the National Academy of Sciences 98,13734-13738

3. Jaenisch R, Wilmut I.: (2001) Don’t clone humans.Science 291, 2252

4. Kang Y.K, Koo D.B, Park J.S, Choi Y.H, ChungA.S, Lee K.K, Han Y.M.: (2001) Aberrant methyla-tion of donor genome in cloned bovine embryos.Nature Genetics 28, 173-177

5. Lanza R. P, Cibelli J.B, Faber D, weeney R.W,Henderson B, Nevala W, West M.D, Wettstein P.J.:(2001) Cloned cattle can be healthy and normal.Science 288, 665-669

6. Ohgane J, Wakayama T, Kogo Y, Senda S, HattoriN, Tanaka S, Yanagimachi R, Shiota K.: (2001)DNA methylation variation in cloned mice Genesis30, 45-50

7. Ogonuki N, Inoue K, Yamamoto Y, Noguchi Y,Tanemura K, Suzuki O, Nakayama H, Doi K,


Ohtomo Y, Satoh M, Nishida A, Ogura, A.: (2002)Early death of cloned mice from somatic cells. NatureGenetics. Advance online publication.

8. Tamashiro K.L.K, Wakayama T, Akutsu H,Yamakazi Y, Lachey J.L, Wortman M.D, SeeleyR.J, DíAlessio D.A, Woods S.C, Yanagimachi R,Sakai R.R.: (2002) Cloned mice have an obese phe-notype not transmitted to their offspring. NatureMedicine 8, 262-267.

9. Young L.E, Fernandes K, McEvoy T.G, Butterwith

S.C, Gutierrez C.G, Carolan C, Broadbent P.J,Robinson J.J, Wilmut I, Sinclair K.D.: (2001)Epigenetic change in IGF2R is associated with fetalovergrowth after sheep embryo culture. NatureGenetics 27, 153- 154

For further information also see Rolsin Instituteísweb site on www.roslin.ac.uk.


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