Crecimiento de Biomasa en Suero de Quesoi

Agronoma MesoamericanaUniversidad de Costa [email protected] ISSN (Versin impresa): 1021-7444COSTA RICA

2006 Wendy Zumbado Rivera / Patricia Esquivel Rodrguez / Eric Wong GonzlezSELECCIN DE UNA LEVADURA PARA LA PRODUCCIN DE BIOMASA:

CRECIMIENTO EN SUERO DE QUESO Agronoma Mesoamericana, julio-diciembre, ao/vol. 17, nmero 002

Universidad de Costa Rica Alajuela, Costa Rica

pp. 151-160

Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina y el Caribe, Espaa y Portugal

Universidad Autnoma del Estado de Mxico

http://redalyc.uaemex.mx

AGRONOMA MESOAMERICANA 17(2): 151-160. 2006ISSN: 1021-7444

SELECCIN DE UNA LEVADURA PARA LA PRODUCCIN DEBIOMASA: CRECIMIENTO EN SUERO DE QUESO1

RESUMEN

Seleccin de una levadura para la produccin debiomasa: crecimiento en suero de queso. El presente pro-yecto se realiz con el objetivo de recomendar una especiede levadura para la produccin de biomasa, utilizando comosustrato el suero de leche del proceso de elaboracin de que-so blanco tipo Turrialba. Se compararon las especies Kluy-veromyces marxianus, Candida kefyr y Saccharomyces ce-revisiae por medio de su crecimiento en un sistema defermentacin por lotes. Se determin el tiempo de fermenta-cin, la productividad total y el contenido de protena de labiomasa. Al comparar la variacin en el tiempo segn la le-vadura utilizada, se obtuvo diferencias significativas (p 0,05). Las levaduras K. marxianus y C. kefyr presentaron untiempo de 19 y 18 horas, respectivamente y S. cerevisiae, untiempo de 24 horas. Con respecto a la productividad total debiomasa, la especie K. marxianus present un valor de 0,22g/lxh, resultando significativamente diferente (p 0,05) alas especies C. kefyr y S. cerevisiae, para las cuales se obtu-vieron productividades de 0,14 y 0,13 g/lxh. La variacin enel contenido de protena de acuerdo con la levadura utiliza-da no result significativo (p 0,05). Para la especie K.marxianus se obtuvo un contenido de protena de 32%, 34%para C. kefyr y 35% para S. cerevisiae. Se seleccion la es-pecie de levadura Kluyveromyces marxianus para la produc-cin de protena unicelular, por presentar un menor tiempode fermentacin, mayor productividad e igual contenidoproteico de la biomasa que las otras levaduras, adems defacilidades de utilizacin.

Palabras clave: Protena unicelular, lactosa,Saccharomyces cerevisiae, Candida kefyr, Kluyveromycesmarxianus.

1 Recibido: 7 de setiembre, 2005. Aceptado: 17 de julio, 2006. Proyecto de graduacin para optar por el grado de Licenciatura en Tecnologade Alimentos. Universidad de Costa Rica.

2 Escuela de Tecnologa de Alimentos, Universidad de Costa Rica. San Pedro, San Jos, Costa Rica. Correo electrnico:[email protected].

ABSTRACT

Selection of yeast for biomass production based onthe cultivation results on whey. The objective of thisresearch was to recommend a yeast species useful forbiomass production in the form of single cell protein, usingwhey obtained form Turrialba cheese manufacturers assubstrate. Three yeasts (Kluyveromyces marxianus,Candida kefyr and Saccharomyces cerevisiae) were grownseparately in a batch fermentation system, and thefermentation time, total productivity and protein content ofthe biomass were determined. Significant differences(p

INTRODUCCIN

El suero de leche es el principal subproducto en lafabricacin de quesos. Segn datos reportados, en el2001 se generaron aproximadamente 332 millones delitros de suero de leche (CNP 2001). En Costa Rica, lautilizacin del suero de leche no se ha industrializado,su aprovechamiento est limitado por la dificultad detransporte y porque al igual que el resto de productoslcteos, es perecedero, lo que hace imposible almace-narlo, sin ningn tratamiento, por ms de dos das (Ba-rroquio et al. 1981). Si el suero es desechado en losros se convierte en una grave contaminacin, puespresenta una demanda biolgica de oxgeno(DBO5,20) muy alta, que se encuentra entre los 40.000y los 50.000 mg O2/l (Salazar 1999).

Al generarse elevados volmenes de suero de le-che, y con niveles de contaminacin superiores a lacantidad mxima permitida para el vertido de aguas re-siduales en ros o alcantarillado pblico (300 mg O2/l)(Ministerio de Salud 1997), resulta necesario buscarmtodos para su aprovechamiento. Una alternativa esutilizar el suero como medio para el crecimiento de mi-croorganismos para la produccin de biomasa. La ma-sa de microorganismos obtenida (levaduras, mohos,bacterias, algas) posee un alto contenido proteico, porlo que recibe el nombre de protena unicelular. En di-versas investigaciones se ha indicado la posibilidad deobtener protena unicelular mediante el crecimiento demicroorganismos que hacen uso de la lactosa presenteen el suero (BuLock y Kristiansen 1991; Hernndez etal. 1980; Grba et al. 2002). Especies de levadura comoKluyveromyces marxiaus y Candida kefyr son capacesde fermentar la lactosa, al ser productoras de la enzima-D-Galactosidasa (EC 3.2.1.23), la cual hidroliza lalactosa en sus componentes bsicos (Rajoka et al.2003; Inchaurrondo et al. 1994). Ambas levaduras hansido empleadas en investigaciones para la generacinde biomasa, etanol y para la produccin de la enzima(Belem et al. 1997).

Para la generacin de biomasa a partir de la lacto-sa del suero tambin es posible el empleo de levadurasde la especie Saccharomyces cerevisiae, cuyo creci-miento se logra si la lactosa es hidrolizada previamen-te en glucosa y galactosa, por medio de preparados en-zimticos (Mittal 1992). Esta especie de levadurapresenta una amplia utilizacin y aceptacin en laindustria para la alimentacin animal y humana, lo que

podra resultar en una ventaja para su utilizacin (Litiet al. 2001).

El proceso de produccin de protena unicelulares una va biotecnolgica adecuada para el aprovecha-miento de desechos industriales ricos en carbohidra-tos. De hecho, el principal factor limitante en la gene-racin de protena unicelular es el alto costo de lasfuentes de carbono, por lo que el uso de subproductoses ideal (Durn 1989). El emplear el suero en este pro-ceso permitira darle valor agregado, al obtenerse pro-tena de calidad para la alimentacin animal, y a la vezdisminuir su DBO para su posterior descarga (Ghaly yKamal 2004). Esta disminucin, segn datos reporta-dos para levaduras, se encuentra entre 70-80% delDBO inicial del suero, lo que convierte este procesoen una opcin adecuada para su tratamiento (Capoor ySingh 1985; Chinappi y Sanchez 2000).

El inters por producir protena unicelular fue es-timulado por agencias internacionales relacionadascon la salud, alimentacin y agricultura ante la eviden-cia de una escasez de protena a nivel mundial (Bu-Lock y Kristiansen 1991), es por esto que la bsque-da de fuentes proteicas es vital (Chacn 2004).

La biomasa de origen unicelular tiene aplicacionescomo suplemento proteico en alimentacin animal, ade-ms, se ha investigado su utilizacin en la fabricacinde ingredientes funcionales, suplementos proteicos, pa-ra resaltar el sabor de alimentos procesados, entre otros(Lee 1996). Para su aplicacin en la alimentacin hu-mana, requiere el empleo de mtodos para la reduccindel nivel de cidos nucleicos, ya que si son consumidosen altas proporciones podran causar la formacin declculos renales u otras enfermedades. A diferencia delos humanos, el ganado tolera altos niveles de cidosnucleicos, por lo que la protena unicelular podra utili-zarse inicialmente en alimentacin animal sin requerirningn tratamiento (Lee 1996).

Los componentes del suero que tienen mayor im-portancia para ser utilizados como sustrato son lactosa,protena y minerales (Quintero et al. 2001). Con el finde lograr una utilizacin eficiente de estas sustancias,es importante elegir una levadura con adecuadas carac-tersticas fisiolgicas (Grba et al. 2002). Por lo ante-rior, considerando la evidencia cientfica de las carac-tersticas de las levaduras Kluyveromyces marxianus,Candida kefyr y Saccharomyces cerevisiae para su

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ISSN: 1021-7444 AGRONOMA MESOAMERICANA 17(2): 151-160. 2006

desarrollo en el suero de queso, as como su utilizacinen procesos biotecnolgicos (Inchaurrondo et al. 1994;Quintero et al. 2001; Rose 1979; Moo-Young et al.1985), el objetivo de este proyecto es evaluar el creci-miento de tres especies de levaduras en el proceso deproduccin de protena unicelular, con el fin de selec-cionar y recomendar una de ellas para ser utilizada enel suero de queso. Uno de los criterios de seleccin delmicroorganismo a emplear en el proceso es la produc-tividad de biomasa, unido a otros resultados como sonel tiempo de fermentacin, el contenido de protena dela biomasa y aspectos econmicos, los cuales se deri-varan de caractersticas propias de la utilizacin de ca-da levadura, como pretratamientos del sustrato.

El producto obtenido se podra destinar a la ali-mentacin animal y en el futuro continuar las investi-gaciones para utilizarlo en la alimentacin humana.

MATERIALES Y MTODOS

La presente investigacin se llev a cabo de abrildel 2004 a marzo del 2005 en las instalaciones de laUniversidad de Costa Rica, en San Pedro de Montesde Oca, San Jos, Costa Rica.

Suero de queso utilizado

Se utiliz el suero residual de la elaboracin dequeso blanco tipo Turrialba de una empresa producto-ra de Cartago. Este tipo de queso corresponde la cate-gora de quesos frescos que se elaboran de cuajada sinmaduracin. La tradicin latinoamericana se basa enquesos blancos elaborados a partir de leche de vaca. Elproceso de elaboracin parte de leche parcialmentedescremada o leche entera. Se procede a sucoagulacin utilizando cultivo, cuajo y cido, y el pro-ducto obtenido luego del desuerado es salado, moldea-do, posteriormente prensado y es consumido en su es-tado fresco (Revilla 1985).

El queso blanco tipo Turrialba es de color blancoamarillento, de sabor simple, no cido, de textura sua-ve y de corte limpio y no grasoso. Presenta un eleva-do contenido de humedad, mayor del 50%, un conte-nido de grasa que vara entre 10-26% y un contenidode sal que vara entre 1-3% (CNP 1999).

Las muestras se tomaron directamente de la tinade desuerado y fueron transportados en recipientes hi-gienizados de aluminio con tapa, los cuales fueronpreviamente lavados y desinfectados.

Levaduras y condiciones de mantenimiento

a. Kluyveromyces marxianus sp. marxianusLAF-4, liofilizado. Almacenado a una temperatura de-40 C. Casa comercial Chr. Hansen. Levadura lactosapositivo.

b. Candida kefyr ATCC (2004) 66028, liofiliza-do, lactosa positivo. Esta fue mantenida en el medioSaborou glucosado (Difco, Becton, Dickinson andCompany) a temperatura ambiente.

c. Saccharomyces cerevisiae, levadura seca ins-tantnea de la casa comercial Fleishmann.Almacenado a una temperatura de 4C. Levadura lac-tosa negativo y glucosa positivo.

Equipo de fermentacin

Se utiliz un fermentador diseado para el estudio(Figura 1), consta de un frasco de fermentacin(capacidad de 2 l), unidades de toma de muestra, ino-culacin y salida de gases. El mantenimiento de la tem-peratura se realiz empleando una incubadora que seajust a la temperatura del proceso. Para la aireacin seutiliz una bomba pequea de 2,5 l/min de capacidad,conectada a un rotmetro, por medio del cual se regulel flujo de aire. El aire fue esterilizado hacindolo pa-sar previamente a travs de un filtro de 0,22 m.

Para la agitacin del medio se utiliz una pastillade agitacin magntica colocada dentro del frasco defermentacin.

Proceso de fermentacin

a. Preparacin del suero de leche

Se llev a cabo la preparacin de la totalidad delsuero de queso a emplearse para el crecimiento de lastres levaduras.

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Se separaron las protenas coagulables del suero deleche por medio de un tratamiento termocido, en el quese ajust el pH a 4,5 (HCl 1N) seguido de un calenta-miento a 115 C por 20 minutos en autoclave (Yamato,Scientific America Inc, Orangeburg). El suero se enfriy se separaron las protenas por decantacin y filtradocon papel Whatman N41. El contenido de protena finaldel suero empleado en las fermentaciones fue de 0,38 %.

Para la preparacin del suero de queso para el cre-cimiento de Saccharomyces cerevisiae se tom el suerodesproteinizado y posteriormente se llev a cabo la hi-drlisis de la lactosa empleando un preparado enzimti-co de lactasa Maxilact 2000, con lo que se obtuvo sue-ro hidrolizado con un contenido de glucosa de 20 g/l.

b. Preparacin del inculo

Cada una de las levaduras estudiadas se inoculen un Erlenmeyer con 100 ml de caldo Saborou gluco-sado (Difco, Becton, Dickinson and Company) y seincub a una temperatura de 30C. Kluyveromycesmarxianus y Candida kefyr, se incubaron durante 24horas y Saccharomyces cerevisiae durante cincohoras, previas a la fermentacin. La concentracin ce-lular se midi por medio de una cmara de Neubauer(Counting Chamber, Hausser Scientific Company) yse estableci en 107 clulas/ml para las tres levaduras.

c. Esterilizacin del equipo e inoculacin

Se esteriliz un volumen de 900 ml de suero deleche en el frasco de fermentacin, junto con las man-gueras y filtros acoplados. Se aplic una temperaturade 115 C durante 20 minutos, empleando una autocla-ve (Yamato Scientific America Inc, Orangeburg). Elequipo se enfri a la temperatura de fermentacin y serealiz la inoculacin de la levadura.

Los parmetros que se mantuvieron constantesdurante el proceso de fermentacin con las tres leva-duras, fueron temperatura de 30 C, flujo de aireacin0,6 VVM y agitacin 300 rpm.

Determinacin de la composicin del suero

Se analizaron muestras de suero de queso de 10lotes distintos escogidos aleatoriamente. A cada mues-tra se le determin la cantidad de lactosa, protena, yhumedad utilizando el equipo Milkoscan (Foss Instru-ments). Adems, se realiz la medicin del pH por elmtodo 981.12 de la AOAC (1999) y la determinacindel contenido de cenizas, por el mtodo 930.30 de laAOAC (1999). Para cada uno de los componentes sereport el promedio y su correspondiente intervalo deconfianza al 95%.



Figura 1. Esquema del equipo de fermentacin utilizado para la seleccin del microorganismo autilizar en la produccin de protena unicelular. Costa Rica, abril 2004-marzo 2005.

Salida de gases

Frasco defermentacin

Unidad deinoculacin

Toma de muestra

Aireacin

Determinacin del tiempo de fermentacin

Para cada levadura se llevaron a cabo tres repeti-ciones del proceso de fermentacin descrito anterior-mente, para cada repeticin se construy una curva decrecimiento, en la que se represent la variacin de ab-sorbancia en el tiempo (Scragg 2000). La medicin dela absorbancia se realiz en un espectrofotmetro a 620nm, a muestras de 10 ml del medio que fueron extradasdel biorreactor durante perodos de tiempo establecidos.

El tiempo de fermentacin se obtuvo grficamen-te en la curva de crecimiento, mediante el trazo de unacurva de mejor ajuste del tipo media mvil utilizandoel programa Microsoft ExcelTM. En el primer punto enel que la curva de mejor ajuste se volva constante serealiz la interpolacin del tiempo de fermentacincorrespondiente.

Determinacin de la productividad de biomasa delas levaduras

Para cada una de las levaduras se realizaron tresrepeticiones del proceso de fermentacin. Una vez al-canzada la fase estacionaria se tomaron muestras de25 ml de la biomasa para la determinacin del peso se-co. La muestra se centrifug a una velocidad de 3000rpm por 30 min, se resuspendi en agua y se sometia secado a 100C en placas de Petri prepesadas hastallegar a peso constante. Posteriormente, se calcul laproductividad expresada como la relacin entre el pe-so seco de biomasa y el tiempo de fermentacin.

Determinacin del contenido de protena de la bio-masa obtenida

La biomasa seca se someti a un anlisis de lacantidad de protena por el mtodo de Kjeldahl 930.29de la AOAC (2000). La medicin se llev a cabo paracada una de las repeticiones del experimento y con ca-da una de las levaduras.

Diseo experimental y anlisis estadstico

Para el anlisis del tiempo de fermentacin, laproductividad y el contenido de protena obtenido concada una de las levaduras se utiliz un diseo

irrestricto al azar con tres tratamientos, representadospor las tres levaduras. Este se llev a cabo para las tresvariables por separado.

Se realiz un anlisis de varianza para evaluar lasdiferencias en los resultados de cada una de uno de losparmetros segn la levadura utilizada. En los casosque se obtuvo diferencia significativa entre los trata-mientos (p 0,05), se llev a cabo una prueba de Tu-key, de comparacin mltiple de promedios, para deter-minar con cul levadura se obtuvo un efecto distinto.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Composicin del suero de queso

En el Cuadro 1 se presenta la caracterizacin delsuero empleado en la investigacin.

El suero utilizado present diferencias significati-vas entre lotes en cuanto al contenido de sus compo-nentes ms importantes. Esto podra generar resulta-dos de fermentacin distintos y el requerir laestandarizacin del sustrato para la aplicacin del pro-ceso a nivel industrial.

Con el fin de reducir el efecto del sustrato, se reali-z la preparacin de la totalidad del suero de queso a em-plearse para el crecimiento de las levaduras en estudio.

El suero analizado present como componentemayoritario el agua, seguido por la lactosa, protena ycenizas. Un contenido de 4,77% de lactosa representa



Cuadro 1. Composicin promedio del suero de queso utilizadopara la produccin de protena unicelular. CostaRica, abril 2004-marzo 2005.

Componente Contenido Intervalo de (% m/m) confianza ()

Lactosa 4,77* 0,08Protena 0,96* 0,02Cenizas 0,52* 0,01Humedad 93,10* 0,20pH 6,54 0,03

* Existieron diferencias significativas entre datos que origi-naron los valores promedio (p 0,05).

una concentracin adecuada para el crecimiento de le-vaduras, segn resultados de diversas investigacionesen las que se han utilizado concentraciones similares(Chinappi y Snchez 2000; Quintero et al. 2001;Ghaly y Kamal 2004). El nivel de azcar presente esuna de las razones que convierte al suero en un sustra-to ptimo para la generacin de biomasa (BuLock yKristiansen 1991; Lee 1996; Ward 1991).

El porcentaje de protena en el suero es similar alpresentado en investigaciones realizadas con distintostipos de suero (Chinappi y Snchez 2000; Quintero etal. 2001). Se ha observado que el utilizar suero sin laadicin de otras fuentes de nitrgeno permite obtenerbiomasa microbiana con contenidos de protena mayo-res al 40% (Rose 1979). En el presente estudio se uti-liz el suero sin suplementar con el fin de evaluar elcrecimiento de las levaduras en un medio simple.

El contenido de cenizas concuerda con la compo-sicin promedio reportada para el suero de leche(Alais 1996). Segn Chinnapi y Snchez (2000) yMoo-Young et al. (1985), el contenido de mineralesdel suero permite el crecimiento adecuado de levadu-ras (Rose 1979).

De acuerdo con el pH del suero, ste se clasificacomo suero dulce, al presentar un valor mayor a 5,9,que es el esperado a partir de elaboracin de quesosblancos (Revilla 1985). Dado que su pH es alto y quepresenta un alto contenido de humedad, el pH del sue-ro se debe ajustar a un valor de 4,5 al inicio de la fer-mentacin, con el fin de reducir la posibilidad de con-taminacin con bacterias (Moo-Young et al. 1985).

Comparacin del tiempo de fermentacin

En la Figura 2, donde se presentan las curvas decrecimiento promedio de las levaduras, se puede dis-tinguir la fase lag o de adaptacin de los microorganis-mos al medio. Tambin se observa el momento en elque se llega a la fase estacionaria, donde no se obser-van cambios aparentes en la absorbancia con respectoal tiempo, lo que indica que no se est generando msmasa celular (Chan 2001).

A partir de las curvas de crecimiento, es posibleobservar que la fase de adaptacin fue ms extensa pa-ra las levaduras K. marxianus y C. kefyr, que a

diferencia de S. cerevisiae, deban producir la enzimalactasa para hacer uso de la lactosa del medio (Liti etal. 2001). La modificacin del sistema enzimtico pa-ra iniciar la sntesis de enzimas (Shuler y Kargi 1992)pudo causar que se observara ms prolongada.

En el Cuadro 2 se observa que S. cerevisiae pre-sent un tiempo ms prolongado para alcanzar la faseestacionaria (p 0,05) que el de K. marxianus y C.kefyr, las cuales requirieron cinco y seis horas menos,respectivamente.

En el caso de S. cerevisiae, el requerir un tiempo defermentacin mayor puede deberse a caractersticaspropias de este microorganismo y/o a que su crecimien-to en el suero se dio de forma ms lenta. En un sistemade produccin por lote, un tiempo de fermentacin ms



Cuadro 2. Tiempo para alcanzar la fase estacionaria en la cur-va de crecimiento en suero de queso, para Kluyve-romyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae yCandida Kefyr. Costa Rica, abril 2004-marzo 2005.

Levadura Tiempo Intervalo de (horas) confianza al

95% ()

Kluyveromyces marxianus 19 a 0Saccharomyces cerevisiae 24 b 2Candida Kefyr 18 a 1

a, b Letras iguales indican que no se encontraron diferencias sig-nificativas (p 0,05).

Figura 2. Curva de crecimiento de Kluyveromyces marxia-nus, Saccharomyces. cerevisiae y Candida kefyr ensuero de queso, utilizada en la determinacin deltiempo en que se alcanza la fase estacionaria. CostaRica, abril 2004-marzo 2005.

prolongado implica un proceso de produccin ms ex-tenso y como consecuencia, con mayores costos de ope-racin que las otras dos levaduras (Stanbury y Whitaker1987).

K. marxianus y C. kefyr no presentaron diferenciassignificativas (p 0,05) en cuanto al tiempo de fermen-tacin. El presentar un ciclo de crecimiento de igualduracin, implica que los costos de proceso seran muysimilares para ambas levaduras, considerando nica-mente el tiempo que tardara cada ciclo de produccin,sin embargo, se deben tomar en cuenta otros parme-tros como la utilizacin de lactosa del medio, el conte-nido de protena y productividad de cada una de las le-vaduras, para obtener conclusiones al respecto.

Al comparar el consumo de lactosa al final delproceso, tal como se presenta en el Cuadro 3, se obser-va que no hubo diferencias significativas en la canti-dad de lactosa empleada por cada una de las levadurashasta alcanzar la fase estacionaria, lo que indica que lahidrlisis de este azcar, posiblemente ocurri a unamisma velocidad con cada una ellas.

El tiempo de fermentacin y la reduccin de lac-tosa obtenidos para K. marxianus coinciden con los re-sultados de investigaciones en las que se utiliz estamisma especie. Segn Belem et al. (1997), la levadu-ra utilizada alcanz la fase estacionaria a las 20h decrecimiento y logr una reduccin de la lactosa de un80%, durante su crecimiento en suero de queso suple-mentado. Respecto a lo anterior, es importante consi-derar que en el caso del presente estudio no se suple-ment el suero y se obtuvo un resultado muy similar aestudios en los que s se llev a cabo. Esta situacin da

la posibilidad de evaluar el efecto de la suplementa-cin sobre el tiempo y cantidad de biomasa generada,lo que podra mejorar el proceso. La adicin de nu-trientes al medio, como sales de amonio y extracto delevadura, puede tener un efecto beneficioso en la pro-duccin y actividad de la enzima -galactosidasa (DeBales y Castillo 1979).

Un aspecto que podra evaluarse para disminuir eltiempo de fermentacin con K. marxianus y C. kefyr esel utilizar para la propagacin de los cultivos, un medioque contenga lactosa, o el mismo suero a utilizar en lafermentacin. Con lo anterior, se estara realizando laactivacin del microorganismo sobre un medio con elmismo azcar del que dispondr en el medio de fermen-tacin, con lo que se podra acortar la fase de adapta-cin (Fase Lag) del microorganismo (Chinappi y Sn-chez 2000), y con ello el tiempo de la fermentacin.

Comparacin de la productividad obtenida con lastres especies de levadura

De las levaduras estudiadas, K. marxianus presen-t una productividad significativamente mayor(p0,05), tal como se observa en el Cuadro 4. Esto in-dica que la velocidad de formacin de biomasa y conello el crecimiento de esta levadura fue mayor, lo cuales deseable y necesario para un proceso de produccinde protena unicelular (Chacn 2004).

La menor productividad de biomasa de C. kefyr,respecto a la de K. marxianus, concuerda con lo



Cuadro 4. Productividad de las levaduras Kluyveromyces mar-xianus, Saccharomyces cerevisiae y Candida kefyren la formacin de biomasa microbiana en suero dequeso. Costa Rica, abril 2004-marzo 2005.

Levadura Productividad Intervalo de (g/l h) confianza

al 95% ()

Kluyveromyces marxianus 0,22 a 0,02Saccharomyces cerevisiae 0,14 b 0,03Candida kefyr 0,13 b 0,01

a, b Letras iguales indican que no se encontraron diferencias sig-nificativas (p 0,05).

Cuadro 3. Utilizacin de lactosa para el crecimiento de Kluy-veromyces marxianus y Candida Kefyr en suero dequeso. Costa Rica, abril 2004-marzo 2005.

Levadura Lactosa Intervalo de utilizada (%)* confianza al

95% ()

Kluyveromyces marxianus 79 0,7Candida Kefyr 75 1,0

* No hubo diferencias significativas al 95% de confianza.

reportado por Barroquio et al. (1981) y por Capoor ySingh (1985), quienes obtuvieron productividades me-nores utilizando una levadura Candida pseudotropica-lis, en condiciones de crecimiento similares y utilizan-do suero de leche de composicin similar a la delpresente estudio. De acuerdo con la productividad ob-tenida con C. kefyr en comparacin con la K. marxia-nus, se observa que sta no se desarroll de forma ade-cuada en el medio, ya que a pesar de que no presentdiferencia en el tiempo de fermentacin respecto a K.marxianus, y la cantidad de lactosa utilizada fue muysimilar (Cuadro 3), su velocidad de formacin de bio-masa fue menor, lo que implicara costos ms altos deproduccin por la extensin del tiempo del proceso.

En el caso de S. cerevisiae, el obtener una produc-tividad de biomasa baja, puede relacionarse con laconcentracin inicial de azcares en el medio de cre-cimiento. Una vez realizada la hidrlisis, la cantidadde azcar presente en el medio era de 20 g/l de gluco-sa, este nivel de azcar, an en condiciones aerbicas,puede causar que las levaduras de la especie S. cerevi-siae se desarrollen por la va de la fermentacin msque la de la respiracin, por causa del efecto Crabtree(Shuler y Kargi 1992). El nivel de azcar crtico, apartir del cual se produce este efecto, va a depender dela especie y cepa de levadura con la que se trabaje,segn Moo-Young et al. (1985), puede ocurrir a nive-les de glucosa mayores a tres o hasta 30 g/l. El efectoCrabtree causa la disminucin drstica de la genera-cin de biomasa, debido a que la utilizacin del sustra-to (lactosa) se desva hacia la produccin de etanol, loque hace que la formacin de biomasa se vea dismi-nuida de forma considerable (Postma et al. 1989).

La generacin etanol por parte de esta especie delevadura ha llevado a investigadores a evaluar la pro-duccin de etanol con cepas genticamente modifica-das en la bsqueda de rendimientos rentables (Domin-gues et al. 2001).

Comparacin del contenido proteico de la biomasade las levaduras estudiadas

Las levaduras evaluadas no presentaron diferenciassignificativas (p = 0,0665) en cuanto al contenido deprotena de la biomasa. Tal como se presenta en el Cua-dro 5, los porcentajes de protena variaron entre un 32%y un 35%. Estos resultados son similares a los reporta-dos por Barroquio et al. (1981), quienes obtuvieron

porcentajes de 31% y 38%, durante el crecimiento ensuero de leche de las levaduras Kluyveromyces fragilis yCandida pseudotropicalis, respectivamente.

Al comparar el contenido proteico de la biomasade las levaduras evaluadas, con el valor indicado en lacomposicin general de las levaduras ste fue bajo, yaque en promedio el porcentaje de protena es de alre-dedor de 45-55% (Reed y Pepler 1983). Un menorcontenido proteico se puede relacionar con caracters-ticas propias de las levaduras bajo estudio, as como elefecto de parmetros operativos y de la composicindel medio de cultivo, como en el caso del presenteestudio que no fue suplementado (Chinappi y Snchez2000). Diversos estudios demuestran que en mediosde cultivo en los cuales se ha limitado la adicin de ni-trgeno, las levaduras presentan un contenido de pro-tena menor que las crecidas en un medio suplementa-do con este compuesto (Aiba et al. 1973). En elpresente estudio, las levaduras fueron evaluadas utili-zando un medio de crecimiento simple, con el fin dedeterminar la produccin de protena bajo las mismascondiciones y empleando un sustrato menos costoso.

Seleccin del microorganismo para produccin deprotena unicelular a partir de suero de queso

Para la eleccin de un microorganismo a utilizarseen la produccin de protena unicelular, se tomaron encuenta aspectos de ndole econmico y prctico, que po-dran dar ventajas a utilizar un microorganismo u otro.

En un proceso por lotes o batch, el ciclo de creci-miento debe ser tan corto como sea posible, para



Cuadro 5. Contenido de protena de la biomasa microbianaobtenida a partir del crecimiento en suero de quesode las levaduras Kluyveromyces marxianus, Sac-charomyces cerevisiae y Candida Kefyr. CostaRica, abril 2004-marzo 2005.

Levadura Contenido de Intervalo deprotena (%m/m)* confianza al

95% ()

Kluyveromyces marxianus 32 2Saccharomyces cerevisiae 35 2Candida Kefyr 34 1

* No hay diferencias significativas al 0,05%.

obtener el mayor rendimiento y utilizacin del equipo(Stanbury y Whitaker 1987), esto implica una reduc-cin de los costos de operacin, que incluyen la energa,gastos generales, costos de mano de obra y la capacidaddel sistema (Rojas 1995). Las levaduras K. marxianus yC. kefyr presentan esta ventaja respecto a S. cerevisiaeal presentar un menor tiempo de fermentacin.

A pesar de que las levaduras K. marxianus y C.kefyr presentaron un tiempo similar, es importanteconsiderar que la productividad de biomasa de K. mar-xianus fue superior, tanto a la obtenida para C. kefyrcomo a la de S. cerevisiae. Una mayor velocidad deformacin de biomasa da ventajas a su utilizacin enla obtencin del producto.

Las levaduras K. marxianus y S. cerevisiae, sonconsideradas como organismos GRAS (Generalmentereconocida como segura) segn la FDA (Liti et al.2001). La cepa de C. kefyr empleada en estainvestigacin, a pesar de que es utilizada en diversas in-vestigaciones y que no se ha encontrado que sea patge-na (ATCC 2004), no ha sido aceptada como segura paraser utilizada en alimentacin animal ni humana, por loque sera necesario realizar un proceso de investigacinprevio a la utilizacin de su biomasa a nivel industrial.

El utilizar la levadura S. cerevisiae, implica untiempo de fermentacin ms prolongado y una menorproductividad. La hidrlisis enzimtica de la lactosa delsuero requiere la utilizacin de enzima libre, lo cual im-plica mayores costos econmicos, tanto por la comprade los preparados enzimticos, como por el tiempo yfuncionamiento de equipos durante la hidrlisis.

Considerando los aspectos analizados anterior-mente, la especie K. marxianus present mayores ven-tajas para ser utilizada en la produccin de protenaunicelular en suero de leche, que las levaduras C. kefyry S. cerevisiae. El comparar las tres levaduras bajo lasmismas condiciones ambientales y sin la suplementa-cin del suero, permiti determinar cmo K. marxiua-nus se desarroll de forma ms eficiente en el medio.En caso de utilizarse esta levadura para el tratamientodel suero de queso en un sistema por lotes, presentaraun tiempo de fermentacin menor, que resultara enuna ventaja econmica y prctica, y una mayor pro-ductividad, que asegurara una mayor velocidad en lageneracin del producto de inters.

Para la aplicacin de esta levadura en la industrianacional, sera recomendable simplificar las condiciones

del proceso. Para esto sera necesario, en siguientes in-vestigaciones, optimizar el proceso a escala industrialrealizando ciertas modificaciones, una de ellas sera elempleo de tanques de fermentacin a temperatura am-biente. Adems, sera necesario incorporar el proceso deforma paralela a la lnea de produccin de la planta, demanera que se utilice el producto final (biomasa) para laalimentacin del ganado, dndole valor agregado a undesecho que generan las industrias lcteas.

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a2.pdfInicioIntroduccinMateriales y MtodosResultados y DiscusinLiteratura CitadaCuadrosCuadro 1. Composicin promedio del suero de queso utilizadopara la produccin de protena unicelular. CostaRica, abril 2004-marzo 2005.Cuadro 2. Tiempo para alcanzar la fase estacionaria en la curvade crecimiento en suero de queso, para Kluyveromycesmarxianus, Saccharomyces cerevisiae yCandida Kefyr. Costa Rica, abril 2004-marzo 2005.Cuadro 3. Utilizacin de lactosa para el crecimiento de Kluyveromycesmarxianus y Candida Kefyr en suero dequeso. Costa Rica, abril 2004-marzo 2005.Cuadro 4. Productividad de las levaduras Kluyveromyces marxianus,Saccharomyces cerevisiae y Candida kefyren la formacin de biomasa microbiana en suero dequeso. Costa Rica, abril 2004-marzo 2005.Cuadro 5. Contenido de protena de la biomasa microbianaobtenida a partir del crecimiento en suero de quesode las levaduras Kluyveromyces marxianus, Saccharomycescerevisiae y Candida Kefyr. CostaRica, abril 2004-marzo 2005.

FigurasFigura 1. Esquema del equipo de fermentacin utilizado para la seleccin del microorganismo autilizar en la produccin de protena unicelular. Costa Rica, abril 2004-marzo 2005.Figura 2. Curva de crecimiento de Kluyveromyces marxianus,Saccharomyces. cerevisiae y Candida kefyr ensuero de queso, utilizada en la determinacin deltiempo en que se alcanza la fase estacionaria. CostaRica, abril 2004-marzo 2005.

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