CRECIMIENTO MICROBIANO

5/22/2018 CRECIMIENTO MICROBIANO

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CRECIMIENTO MICROBIANO

1. CICLO CELULAR Y CRECIMIENTO POBLACIONAL

Crecimiento se define como el incremento de componentes celulares, es decir elaumento de masa y volumen. Desde el punto de vista poblacional el crecimiento es el

aumento del nmero de clulas.

El ciclo celular es la secuencia de sucesos que ocurren desde la formacin de una

nueva clula hasta la siguiente divisin. En la mayora de los procariotas esta secuencia

se le conoce como fisin binaria, algunos lo hacen por otros procesos. La fisin binaria

como su nombre lo indica es la divisin de la clula en dos y se trata de un proceso

relativamente simple: la clula se alarga, replica su cromosoma, estas molculas de

ADN migran hacia las futuras clulas hijas (los polos), se forma un septo transversal yfinalmente se separan las dos clulas hijas.

Figura 1. Fisin binaria


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El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes

perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del

crecimiento mediante diversas metodologas.

Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las clulasindividuales, esto es iniciar y completar una divisin celular. De esta forma, se

considera a los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es

entendido como un aumento en el nmero total de partculas bacterianas.

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de

formar colonias debido a que slo se tiene en cuenta el nmero de microorganismos

viables, esto es capaces de crecer indefinidamente.

Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida del

crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la sntesis macromolecular y un

incremento en la capacidad para la sntesis de los componentes celulares es una

medida del crecimiento.

Para este grupo la divisin celular es un proceso esencial pero menor que rara vez

limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema

enzimtico para utilizar los recursos del medio y formar biomasa.

2. CURVA DE CRECIMIENTO

La curva de crecimiento es la representacin grfica que se usa para estudiar el

crecimiento poblacional en un cultivo discontinuo. Se diferencian cuatro fases.

Figura 2. Grfica de la curva de crecimiento


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2.1. Fase de latencia:

A este periodo se le conoce tambin como Fase lag y sucede cuando se han

introducido microorganismos en un medio de cultivo fresco, no se produce un

aumento de clulas. A pesar de no haber un aumento del nmero de clulas, si existe

un aumento de la biomasa debido a que los microorganismos estn sintetizando

nuevos componentes. La duracin de esta fase depende del estado de los

microorganismos y de la naturaleza del medio, esto se refiere si las clulas son viejas o

no, tambin a la composicin qumica del medio al que se han transferido.

2.2. Fase exponencial:

Conocida tambin como fase logartmica (log), sucede cuando los microorganismos se

multiplican a la velocidad mxima que les permite sus caractersticas propias (potencial

gentico, metabolismo, etc.) y las del medio (naturaleza del medio, condiciones decultivo, etc.).

La velocidad de crecimiento es constante, los intervalos de divisin celular son

regulares. En la grfica se presenta como una elevacin progresiva. Esta fase es ideal

para los estudios bioqumicos, debido a su uniformidad en sus caractersticas

poblacionales.

Esta fase se produce un crecimiento equilibrado, en donde los componentes celulares

son fabricados a tasas constantes. El traspaso de un cultivo de un medio pobre en

nutrientes a uno ms rico (shift up) o de modo contrario, de un rico en nutrientes auno pobre (shiftdown), se produce un crecimiento desequilibrado debido a que los

microorganismos necesitan adaptarse a las nuevas condiciones (sntesis de ribosomas,

de protenas y/o enzimas), por lo tanto en estos casos se produce una fase de latencia

ms larga antes de comenzar la fase exponencial.

Cuando el crecimiento microbiano se ve limitado por la baja concentracin de un

nutriente esencial, el crecimiento neto final es proporcional a la concentracin inicial

del nutriente limitante.


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Figura 3. Efecto de las variaciones de la concentracin de un nutriente limitante sobre el

crecimiento y su efecto sobre la velocidad de crecimiento.

2.3. Fase estacionaria:

Esta fase se manifiesta en la grfica como una lnea horizontal. Se alcanza cuando la

poblacin tiene unas 109clulas por mililitro. El tamao real de la poblacin depende

de la disponibilidad de nutrientes y de otros factores del medio. Esta fase se da

porque la divisin celular y la muerte celular se encuentran en equilibrio, otra

posibilidad es que la poblacin sigue siendo metablicamente activa, pero ya no se

multiplica.

2.4. Fase de Senescencia y Muerte

Desde un punto de vista clsico se deca que se alcanzaba esta fase cuando haba

cambios ambientales perjudiciales como la privacin de nutrientes y la acumulacin de

desechos txicos que causaban daos irreparables los cuales hacan que se perdiese la

viabilidad. Adems las clulas no se lisaban (su nmero permanecan constante), solo

moran.

Actualmente existen dos posiciones que ponen en duda esta visin clsica de esta fase.Algunos expertos piensan que las clulas no han perdido su capacidad de reproducirse,

sino que son las condiciones de laboratorio las que no las permite crecer. A estas

clulas se les denomina clulas viables pero no cultivables (VBNC) y se piensa que

llegan a este estado producto de la activacin una clase de protenas conocidas como

protenas del hambre las cuales producen cambios fisiolgicos que permite la

supervivencia de los microorganismos en condiciones desfavorables. Las clulas VBNC

pueden reanudar la divisin cuando las condiciones les son ms favorables.


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La otra postura hace referencia a la muerte celular programada. Propones que algunas

clulas estn genticamente programadas para activar su muerte celular y as

suicidarse para liberar sus nutrientes en beneficio de otras clulas.

Figura 4. Posturas sobre la Fase de muerte

3. MEDIDAS DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

3.1. Medida del nmero de clulas

3.1.1. Mtodos Directos

3.1.1.1. Cmaras de recuento: Petroff-Hausser

Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksleyy la de Petroff-Hausser. La primera tiene la

ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los

recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento

microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos

contados.

Para los recuentos microscpicos directos se usa un portaobjetos especialmente diseado

llamado Cmara de Petroff-Hausser. Una cavidad de volumen conocido esta excavada en la

superficie del portaobjetos y se cubre con un vidrio fino marcado con cuadros de un rea

conocida. La cavidad se llena con la suspensin bacteriana. Se calcula la medida del nmero


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de bacteria de cada una de las series de cuadrados y se multiplica por un factor que

proporciona el recuento por milmetro.

Las bacterias mviles son difciles de contar por este mtodo y como pasa con otros mtodos

microscpicos, las clulas muertas son demasiado similares a las vivas que se quieren contar.

Adems se requiere una concentracin bastante alta de bacterias, de unos 10 millones debacterias por mL. La principal ventaja es que no se necesita ningn tiempo de incubacin. Su

uso se reserva en situaciones en que el tiempo es el factor principal.

Figura 5. Cmara de recuento de Petroff-Hausser.

3.1.1.2. Contadores electrnicos de partculas

A. Contador de Coulter:

Un contador Coulter tpico posee uno o ms microcanales que conectan dos cmarasconteniendo una solucin electroltica sobre las cuales hay aplicada una diferencia depotencial. La solucin es forzada a fluir de una cmara a otra, arrastrando consigo laspartculas en suspensin que al atravesar el microcanal producen un breve cambio en

la resistencia del lquido. El contador detecta estos cambios en la resistencia elctrica.


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Las clulas, al tratarse de partculas muy poco conductoras, alteran la seccinconductiva del microcanal, causando que la resistencia entre los extremos delmicrocanal aumente y por lo tanto provocando que la corriente elctrica que atraviesael canal disminuya por un breve perodo de tiempo.

Al llevar un registro de los pulsos que ocurren en la corriente elctrica, se puede contarel nmero de partculas presentes en un determinado volumen de fluido. La amplituddel cambio en la corriente que atraviesa el microcanal se encuentra directamenterelacionado al volumen de la partcula, permitiendo medir la distribucin del tamaode las partculas contadas.

Figura 6. Contador de Coulter

B. Citometra de flujo

La citometra de flujo es una tecnologa biofsica basada en la utilizacin de luzlser,empleadaen el recuento y clasificacin de clulas segn sus caractersticas morfolgicas, presencia debiomarcadores, y en la ingeniera de protenas. En los citmetros de flujo, las clulassuspendidas en un fluido atraviesan un finsimo tubo transparente sobre el que incide undelgado rayo de luz lser, la luz transmitida y dispersada por el pasaje de las clulas a travsdel tubo se recoge por medio de unos dispositivos de deteccin, permitiendo hacer inferenciasen cuanto a tamao y complejidad de las clulas. Tambin permite el anlisis multiparamtrico

simultneo de otras caractersticas fsicas y qumicas, evaluando en promedio ms de dos milpartculas por segundo.
http://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%A1serhttp://es.wikipedia.org/wiki/Biomarcadorhttp://es.wikipedia.org/wiki/Biomarcadorhttp://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%A1ser


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Figura 7. Esquema del sistema de deteccin de un citmetro de flujo.

3.1.2. Mtodos indirectos:

3.1.2.1. Recuento de viables en placa

Es un mtodo de recuento de clulas viables (Clula viable es aquella capaz de dividirse

y originar descendencia). Se cuentan las clulas de una muestra que son capaces de

formar colonias cuando se inoculan en un medio de cultivo solido adecuado. Unas vez

inoculadas las placas se incuben a la temperatura adecuada y cuando aparecen, se

cuentan las colonias. Normalmente, una celula origina una colonia, pero con el fin de

evitar errores a la hora de dar el resultado se suele hablar de Unidades Formadoras de

Colonias (UFC), en lugar de clulas, el resultado se expresa como UFC/ml.

Existen dos formas de sembrar en placa:

Mtodo de extensin en placa

- Un cierto volumen de cultivo diluido, que no suele ser superior a 0.1 ml, se

extiende sobre la superficie de una placa con medio slido utilizando una

asa estril de extensin.

- La placa se incuba despus hasta que aparecen las colonias y se cuenta su

nmero.


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- Para esto es importante que la superficie del medio este seca, de modo

que el lquido de la muestra se pueda absorber.

- No se suelen usar volmenes mayores de 0,1 ml porque el exceso de

lquido no es absorbido, y puede ser la causa de que las colonias se unan al

formarse, dificultando su recuento.

Mtodo del vertido en placa o mtodo de vaciado en placa

- Se pipetea un volumen conocido (normalmente 0,1-1,0 ml) de cultivo en

una placa petri estril

- Sobre la que se aade el medio con agar fundido y se mezcla bien

mediante un suave movimiento giratorio de la placa sobre la superficie de

la mesa, antes de dejar que se solidifique.

- Como la muestra se mezcla con el medio fundido, se pueden usar

volmenes de inoculo mayores que en el mtodo de recuento por

extensin.

- Sin embargo, para poder hacer uso de este mtodo, el organismo que se

cuenta debe ser capaz de resistir brevemente la temperatura del agar

fundido a 45C, sin perder su viabilidad.

Figura 8. Mtodos de siembra para el recuento en placa.

En la mayora de los casos antes de realizar la siembra las muestras tienen que diluirse

(diluciones seriadas):

Es importante que el numero de colonias que aparezcan en las placas no sea

demasiado grande, ya que en placas muy atestadas algunas colonias se podran

fusionar, provocando clculos errneos. Tambin es importante que el numero de


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colonias no sea demasiado bajo para que el clculo sea estadsticamente significativo.

En la prctica, el nmero de colonias por placa oscila entre 30 y 300.

- Para obtener el nmero apropiado de colonias casi siempre se diluye la

muestra.

- Como raramente se sabe de antemano el nmero de clulas viables,

normalmente se hace ms de una dilucin. Es comn usar varias diluciones

decimales de la muestra.

- Para hacer una dilucin de 10-1 se mezclan 0,5 ml de la muestra con 4,5 ml de

diluyente o 1 ml de la muestra con 9 ml del diluyente. Si se necesita una

dilucin de 10-2, se puede mezclar 0,05 ml de la muestra con 4,95 ml del

diluyente o 0,1 ml con 9,9 ml.

- Por otra parte, una dilucin 10-2 se puede hacer de modo seriado haciendo

sucesivamente dos diluciones de tipo 10-1.- En la mayora de casos se realizan dichas diluciones seriadas para alcanzar la

dilucin final que se desea, por ejemplo si se requiere una dilucin 10-6, se

puede lograr haciendo tres diluciones sucesivas de 10-2 o seis sucesivas de 10-

1.

- El lquido usado para hacer las diluciones es importante y lo mejor es que sea

idntico al lquido utilizado para preparar el medio solidificado, aunque por

economa, es posible usar soluciones estriles de sales inorgnicas o un

amortiguador de fosfatos.

- Cuando se hacen diluciones es importante que se utilice una pipeta diferente

para cada dilucin, aun cuando sea de la misma muestra.

Figura 9. Diluciones seriadas.

Fuentes de error en el Recuento en Placa

El nmero de colonias que se obtiene en una determinacin de viables no solodepende del tamao del inculo, sino tambin:


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- De lo adecuado que sea el medio de cultivo

- De las condiciones de incubacin,

- De la duracin de la incubacin.

o Las clulas depositadas en la placa no se desarrollaran todas en colonias a lamisma velocidad, y si se emplea un corto tiempo de incubacin, se

obtendrn menos colonias de las posibles.

o El tamao de las colonias no siempre es el mismo, y si se desarrollan

colonias muy pequeas pueden pasar desapercibidas en el recuento.

o Es habitual establecer las condiciones de incubacin (medio, temperatura y

tiempo) que permitan obtener el mayor numero de colonias para un

determinado organismo y usar luego estas mismas condiciones.

o La determinacin de viables puede estar sujeta a grandes errores, y si se

desean recuentos precisos, se deben hacer con cuidado, y hacer las placas

de las diluciones por duplicado.

o Una agrupacin de dos o ms clulas solo producir una colonia, de modo

que el recuento de viables ser errneamente menor.

o El recuento de viables se expresa a menudo como unidades formadoras de

colonias obtenidas, ms que como nmero de clulas viables (ya que una

unidad formadora de colonias pudo originarse a partir de una o ms clulas

inciales).

Pese a estas dificultades el recuento de viables suministra buena informacin

sobre el nmero de clulas viables y este procedimiento se usa ampliamente.

Anomala del Recuento en Placa

o A pesar de ser una tcnica muy sensible, el recuento en placa puede ser

irrealizable cuando se trata del recuento de muestras naturales, tales como

suelo, o agua.

o El recuento directo en muestras naturales suele dar un nmero mucho

mayor de organismos que los que se obtienen en cultivo en placas de

cualquier tipo de medio de cultivo, algunos microbilogos se refieren a

este hecho como la gran anomala del recuento en placa, pero por qu


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los recuentos en placa dan menores nmeros de clulas que los recuentos

directos al microscopio? Esto se debe a una combinacin de factores:

- El hecho de que los mtodos microscpicos cuentan clulas

muertas, mientras que los mtodos de viables no.- El hecho de que diferentes organismos, incluso en una muestra muy

pequea, tienen ciertos requerimientos nutricionales y de cultivo

muy diversos.

o Por lo tanto, aunque los recuentos en placa especficos con medios

altamente selectivos, como el anlisis microbiano de aguas residuales o de

alimentos, puede dar resultados fiables, los recuentos del nmero total de

clulas, pueden ser subestimados en varios rdenes de magnitud.

Figura 10. Tcnica del Recuento en placa.


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3.1.2.2. Recuento sobre filtros de membrana:

Los mtodos que dependen de la formacin de colonias (recuento en placa) o del

desarrollo de turbidez (nmero ms probable) pueden detectar una nica clula

microbiana viable, pero debido a razones prcticas, slo se utiliza alrededor de un

mililitro de la muestra como inculo para la placa o para el tubo. Por lo tanto, no se

detectan las poblaciones con menos de una clula por mililitro. Supongamos que

queremos determinar las bacterias que existen en una piscina. La muestra debe

concentrarse antes de proceder al recuento.

Son utilizados cuando el nmero de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45

mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una

placa del medio de cultivo apropiado.

En este mtodo el recuento se realiza por filtracin de un volumen de la muestra a

travs de un filtro de membrana de tamao adecuado para retener a las bacterias

(0.22-0.45 m). Una vez filtrada la muestra, el filtro se coloca sobre un medio de

cultivo slido y se incuba. El recuento del nmero de colonias formadas sobre el filtro

determina el nmero total de bacterias en la muestra filtrada. Generalmente, los

resultados se expresan como organismos presentes por litro. Se utiliza con frecuencia

para determinar el nmero de bacterias en agua.

Figura 11. Tcnica de filtracin en membrana.


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3.1.2.3. Nmero Ms Probable:

El mtodo del nmero ms probable (NMP), al igual que el mtodo de recuento en

placa, nos proporciona un recuento de viables. Se basa en el principio de que una

nica clula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio.

El NMP requiere la realizacin una serie de diluciones seriadas al dcimo de la muestra

de cultivo, en un medio lquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo.

Posteriormente, se incuban las muestras de dichos tubos problema.

Una vez que ha pasado suficiente tiempo como para que crezca el microorganismo, se

examinan los tubos. Aquellos tubos que fueron inoculados con una o ms clulas

microbianas a partir de la muestra, se pondrn turbios, mientras que los tubos que no

recibieron ninguna clula permanecern transparentes.

A medida que se aumenta el factor de dilucin, se alcanzar un punto en el cual

algunos tubos contendrn tan slo un organismo y otros, ninguno. Al determinar la

probabilidad de que los tubos no recibieran ninguna clula, se puede determinar el

nmero ms probable de microorganismos presentes en la muestra original, utilizando

para ello una tabla estadstica.

La precisin del nmero ms probable aumenta con el nmero de tubos que se usan,

aunque cinco tubos por dilucin se consideran como una relacin apropiada entre la

precisin y la economa.

El mtodo del NMP se utiliza para contar microorganismos que son difciles de cultivar

en medio slido. Tambin se usa para determinar el nmero de clulas de un cultivo

mixto que pueden crecer en un medio lquido determinado.


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Figura 11. Diluciones para la tcnica NMP

3.1.2.4. Contadores de colonias:

Un contador de colonias es un instrumento utilizado paracontar colonias de bacterias

o de otrosmicroorganismos que crecen en unaplaca de agar.Los primeros contadoresslo eran superficies iluminadas sobre las que se colocaba la placa, con las colonias

marcadas con un rotulador en la superficie externa de la placa mientras el operador

realizaba el recuento manual. Los contadores ms recientes intentan contar las

colonias por va electrnica, mediante la identificacin de reas individuales de

oscuridad y luz, de acuerdo a los umbrales definidos por el usuario, contando los

puntos en los que se aprecia contraste, o de modo automtico mediante registro

electrnico tras presionar con cualquier tipo de marcador.

Estos contadores se utilizan para estimar la densidad de microorganismos en uncultivolquido.Unadilucin adecuada, o variasdiluciones en serie dentro del rango estimado

apropiado, se propaga utilizando unatcnica estril en la placa de agar, que seincuba

en las condiciones adecuadas para el crecimiento hasta que aparecen las colonias

individuales. Cada colonia marca el lugar donde se coloc un solo organismo

originalmente, con lo que el nmero de colonias en la placa es igual al nmero de

organismos en el volumen de lquido existente en la placa. Esta concentracin se

extrapola a partir de la dilucin practicada sobre el cultivo original, para estimar la

concentracin de organismos existentes en ese cultivo inicial.

Figura 12. Contador de colonias.

3.2. Medida de la masa celular:

La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es utilizadafrecuentemente como base para la medida de una actividad metablica, o de un

constituyente metablico o qumico.
http://es.wikipedia.org/wiki/Conteo_bacterianohttp://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismohttp://es.wikipedia.org/wiki/Placa_de_agarhttp://es.wikipedia.org/wiki/Rotuladorhttp://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_%28microbiolog%C3%ADa%29http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_%28microbiolog%C3%ADa%29http://es.wikipedia.org/wiki/Diluci%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Diluci%C3%B3n_en_seriehttp://es.wikipedia.org/w/index.php?title=T%C3%A9cnica_est%C3%A9ril&action=edit&redlink=1http://es.wikipedia.org/wiki/Incubaci%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Incubaci%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/w/index.php?title=T%C3%A9cnica_est%C3%A9ril&action=edit&redlink=1http://es.wikipedia.org/wiki/Diluci%C3%B3n_en_seriehttp://es.wikipedia.org/wiki/Diluci%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_%28microbiolog%C3%ADa%29http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_%28microbiolog%C3%ADa%29http://es.wikipedia.org/wiki/Rotuladorhttp://es.wikipedia.org/wiki/Placa_de_agarhttp://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismohttp://es.wikipedia.org/wiki/Conteo_bacteriano


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Algunos de los mtodos para cuantificar la biomasa son obvios y confiables, pero

pueden volverse complicados si se busca la exactitud.

3.2.1. Mtodos directos:

3.2.1.1. Determinacin del peso hmedo:

Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego

de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin.

Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra.

La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio

intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquidoretenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas

bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular

que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y

deformacin celular.

Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que

queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin,

para ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el

Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no puedenatravesar las paredes bacterianas.

3.2.1.2. Determinacin del peso seco:

El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se

encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un

horno a 105C hasta peso constante.

Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que

diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran nmero

de bacterias.

La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula

pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la

muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el

ambiente tiene una humedad relativa alta.
http://www.monografias.com/trabajos11/metods/metods.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos15/medio-ambiente-venezuela/medio-ambiente-venezuela.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos15/medio-ambiente-venezuela/medio-ambiente-venezuela.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos11/metods/metods.shtml


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3.2.2. Mtodos Indirectos

3.2.2.1. Actividad metablica:

La magnitud de una actividad metablica concreta del cultivo es funcin de la masa

celular y por tanto es un mtodo indirecto de la estimacin de la masa del cultivo que

desarrolla dicha actividad.

La actividad metablica puede utilizarse, mediante varios procedimientos, para medir

indirectamente la cantidad de clulas microbianas. La tasa de formacin de productos

metablicos, tales como gases o cidos, que produce un cultivo, refleja la masa de

clulas presente en el mismo, Asimismo, la tasa de utilizacin de un substrato, como el

oxgeno o la glucosa, refleja la masa celular.

Finalmente, la tasa de reduccin de determinados colorantes, es otra forma de estimar

la masa microbiana. Por ejemplo, el azul de metileno se vuelve incoloro cuando es

reducido por los componentes de la cadena de transporte de electrones de los

microorganismos. Consecuentemente, en ausencia de oxgeno, que oxida el azul de

metileno, la tasa de decoloracin de este compuesto mide la masa microbiana. La tasa

de reduccin del colorante es una medida muy indirecta y, por lo tanto, no es una

medida precisa de la masa microbiana. Sin embargo, la tcnica puede utilizarse con

materiales complejos, como el suelo o la leche, sin necesidad de usar instrumentos.

3.2.2.2. Mtodo turbidomtrico:

La base comn de este mtodo consiste en la medicin de la cantidad de luz

dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano.

Las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea

suspendida en agua (efecto Tyndall).

La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo.

Cuantas ms clulas estn presentes, mayor ser la luz dispersada, y por lo tantomayor ser la turbidez.

A. Espectrofotmetro:

Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiologa o

Bioqumica.

Mide la densidad ptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz

transmitida a travs de la suspensin).


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Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para relacionar los valores de

absorbancia con la masa bacteriana en una muestra problema; la sensibilidad de la

tcnica aumenta pues a longitudes de onda () cortas.

Es una tcnica exacta y precisa, ya que se basa de aspectos fsicos y qumicos de las

bacterias. Es un mtodo de recuento automatizado que da resultado con clculos

matemticos.

Sin embargo, presenta desventajas como:

La presencia de precipitado u otras sustancias producidas por las bacterias,

puede aumentar la turbidez.

Este mtodo no puede medir bacterias mviles.

No distingue clulas vivas de muertas.

Es impreciso si el nmero de microorganismos es escaso.

Figura 13. Espectrofotmetro.

B. Nefelmetro:

Es un instrumento para medir partculas suspendidas en un lquido, es un aparato

similar al anterior, pero el dispositivo sensor est situado en ngulo recto respecto de

la direccin de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada

directamente por la preparacin. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro.


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Figura 14. Nefelmetro.

3.2.2.3.

Escala de MacFarland:

La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un

patrn. La finalidad, es establecer una relacin entre una precipitacin qumica y una

suspensin bacteriana.

Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados, 10 estndares.

Consiste en varios tubos de vidrio hermticamente cerrados que contienen 1% de

Cl2Ba + cantidades crecientes de SO4H2 al 1%, por lo tanto en cada tubo se origina un

precipitado de SO4Ba, el que da origen a la turbidez, esto servir para crear un recta

patrn, de tal forma que se pueda detectar la concentracin de las diluciones

bacterianas de manera aproximada, ya que depende de factores como el tamao de la

bacteria.

Figura 15. Mtodo de MacFarland.


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Tabla 1. Tabla usada para la escala de MacFarland.

4. PARMETROS DE CRECIMIENTO

Durante la fase exponencial, cada microorganismo se divide a intervalos constantes.

Por ejemplo, supongamos que se inocula un tubo de ensayo con una clula que se

divide cada 20 minutos. La poblacin ser de 2 clulas despus de 20 minutos, de 4

clulas a los 40 minutos, y as sucesivamente. Como la poblacin se duplica en cada

generacin, el aumento de poblacin ser siempre de 2n, donde n es el nmero de

generaciones. El aumento de poblacin resultante es exponencial o logartmico.

Las bacterias crecen siguiendo una progresin geomtrica en la que el nmero de

individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de

generacin (). De esta forma, podemos calcular el nmero de bacterias (N) al cabo de

un nmero de generaciones (n) usando la ecuacin siguiente:

N0= Nmero inicial de la poblacin

Nt= Nmero final de clulas en un tiempo t

n = Nmero de generaciones en un tiempo t

Podemos inferir: 4.1Nmero de generaciones (n).-

Es la cantidad de generaciones que ocurre en la fase exponencial.

Para expresar na partir de la ecuacin N = N0.2n, se necesita hacer las siguientes

transformaciones:

N =N02n

logN = log N0+ n log 2

TUBO Cl2Ba 1% SO4H2 1% u.f.c/ml

1 0,1 9,9 3,0x10

2 0,2 9,8 6,0x10

8

3 0,3 9,7 9,0x10

8

4 0,4 9,6 1,2x109

5 0,5 9,5 1,5x109

6 0,6 9,4 1,8x109

7 0,7 9,3 2,1x109

8 0,8 9,2 2,4x109

9 0,9 9,1 2.7x109

10 1,0 9,0 3,0x109


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21

l o g N l o g N 0 = n l o g 2

Expresando n en funcin de trminos fcilmente medibles como N y N0, se

pueden calcular los tiempos de generacin y la velocidad de crecimiento.

4.2Tiempo de Generacin (Tg).-

El tiempo de generacin es el tiempo requerido para que se duplique el nmero

de clulas, por lo que al tiempo de generacin se le llama tambin TIEMPO DE

DUPLICACION. Debemos tomar en cuenta que durante una sola generacin, se

han duplicado no solo la cantidad de clulas, sino tambin la masa de estas.El

tiempo de generacin g, de la poblacin celular se calcula como:

Donde tindica simplemente las horas o minutos de crecimiento exponencial.

Por lo tanto, sabiendo el nmero inicial y final de clulas en una poblacin que

est creciendo exponencialmente, es posible calcular n;y conociendo ny t, calcular

el tiempo de generacin Tg.

Como ejemplo para realizar estos clculos podemos usar los datos siguientes: N=

108, N0= 5 x 107y t= 2. Por tanto,

n = 3,3 [ log108- log (5 X 10 7)]

n = 3,3 (8 - 7,69) = 3,3(0,301)

n = 1

As, el tiempo de generacin Tg, que definimos como t/n, ser

Tg = t/n=

= 120 min.

Los tiempos de generacin varan dependiendo del organismo, citando como

ejemplo a la E. colise puede completar un ciclo en 20 minutos, pocas bacterias

crecen ms rpido, pero muchas s lo hacen ms lento; como Mycobacteriumtuberculosiscuyo tiempo de duplicacin es de 18 horas.

TIEMPO DE GENERACIN EN CONDICIONES PTIMAS

Microganismo Tiempo Generacin (min)

Bacilluscereus 28

Escherichiacoli 12.5

Staphylococcusaureus 27-30

Mycobacterium tuberculosis 792932

Treponema pallidum 1,980


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Tabla: Tiempo de generacin de diferentes microorganismos

El tiempo de generacin tambin se puede calcular a partir de la pendiente de la

recta obtenida en la representacin semilogartmica del crecimiento exponencial,

pues la pendiente tiene un valor de 0,301/g.

4.3Velocidad De Crecimiento (V).-

Cambio en el nmero de clulas o en la masa celular experimentado por unidad de

tiempo.

Las unidades de la velocidad es: generaciones/ horas.

Por ejemplo: teniendo 36 generaciones de una poblacin, con t=10 horas;podemos deducir que:

4.4Constante De La Velocidad De Crecimiento.-

Medida del nmero de generaciones que ocurren por unidad de tiempo

La constante de la velocidad de crecimiento se expresa como

m = ln2/g = 0.693/g

(expresado en h--1)

Una constante de crecimiento de 4.3 h-1, una de las ms grandes registradas,

significa que cada gramo de clulas produce 4.3 g de clulas por hora durante este

periodo del crecimiento.


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La constante de la tasa de crecimiento calculada se puede usar paa determinar la

magnitud del crecimiento que ocurrir en un periodo especifico o para calcular el

tiempo requerido para un crecimiento determinado.

5. CINTICA DE CRECIMIENTO

5.1 Cultivo Discontinuo ( Batch Culture )

Cuando una fraccin de clulas de un cultivo puro se inocula en un determinado

volumen de medio fresco, despus de una incubacin, se produce un incremento de la

biomasa hasta un valor mximo denominado crecimiento total. Este proceso comporta

crecimiento celular propiamente dicho y aumento del nmero de clulas por

autoduplicacin. La biomasa es un catalizador de una reaccin que produce ms

biomasa idntica a la de partida.

Para poder cuantificar el aumento del nmero de clulas de la poblacin, es

importante limitarnos aqu a microorganismos que se multiplican por divisin binaria,

tal y como sucede con la mayora de las bacterias. Si consideramos el crecimiento de

una nica clula en condiciones ambientales que no imponen ninguna restriccin a su

multiplicacin, el crecimiento de dicha clula, que se divide de forma binaria, sigue una

progresin geomtrica de base 2, es decir :

20 212223 2n

Si la poblacin inicial, en vez de estarformada por una clula, est formada por N 0

clulas, el nmero final de clulas que habr en un momento dado (N1) depender,

obviamente, del nmero de generaciones que hayan tenido lugar (n), y ser :

N1= N0.2n

O, tomando logaritmos:

logN1= logN0 + n. log.2

Conociendo experimentalmente N0 y N1, el nmero de generaciones n puede

determinarse por la ecuacin:

Como el log 2 es igual a 0, 301, puede escribirse tambin:

n= 3, 32 (log N1log N0)

Estos clculos permiten determinar con facilidad el nmero de generaciones que hatenido lugar en una poblacin que ha incrementado su nmero de clulas de N0a N1.


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Es importante resaltar aqu que estas frmulas son vlidas para cualquier organismo

vivo que prolifere por divisin binaria.

El factor que puede introducirse ahora hace referencia al tiempo necesario para que

N0 clulas se conviertan en N1. Este factor s que es caracterstico de cada

microorganismo y puede variar enormemente de uno a otro. La introduccin del factor

tiempo (t) implica necesariamente la aparicin del concepto de velocidad de

multiplicacin (R), o nmero de generaciones por unidad de tiempo:

Si el valor de nse obtiene de la ecuacin, tenemos:

Un concepto que suele utilizarse para caracterizar el crecimiento microbiano es el

llamado tiempo de generacin g que es el tiempo necesario para que se duplique la

poblacin:

g = 1/R = t/n

El planteamiento matemtico realizado hasta ahora es un modelo terico, que si bien

nos posibilita una aproximacin interesante para la determinacin de una serie de

parmetros que caracterizan el crecimiento microbiano, presenta algunas limitaciones.Por ejemplo, hay que tener en cuenta que no todas las clulas de un cultivo se dividen,

por lo que, en conjunto, el cultivo presentar un valor de g algo mayor que el calculado

a partir de la ecuacin.

Una aproximacin matemtica ms precisa se basa en considerar el mismo sistema

referido anteriormente, es decir, clulas creciendo en condiciones no restrictivas,

como un sistema autocataltico y analizar los cambios que se producen en la biomasa

en intervalos infinitesimales de tiempo en lugar de estudiar el promedio de cambios en

el nmero de clulas que tienen lugar a lo largo de un periodo de tiempo. En estas

condiciones, el aumento de biomasa a lo largo del tiempo es proporcional a la biomasa

existente, porlo que sigue la cintica de una reaccin de primer orden.

En trminos matemticos, esto puede expresarse como:

dN/dt=NAqu y en adelante, N puede ser cualquier parmetro que refleje la biomasa, como el

nmero de clulas, pero tambin podra ser la cantidad de protena, de cidos

nucleicos, etc. Por otro lado,

es el tiempo y

una constante de proporcionalidad que

se denomina constante de la fase de crecimiento o velocidad especfica de


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multiplicacin. Es importante mencionar que aqu que no es la velocidad decrecimiento (dn/dt), sino un valor que refleja la capacidad del microorganismo de

incrementar su biomasa en un medio determinado.

Si integramos la ecuacin entre N0y N1, tenemos :

ln (N1/ N0) = tTambin con este planteamiento matemtico puede calcularse el tiempo de

generacin, g, a partir de la ecuacin. Si ges el tiempo necesario para la duplicacin de

la poblacin, tendremos que N1=2 N0y t = g. Sustituyendo:

ln 2=.g, o 0,693 / Si comparamos las ecuaciones :

g = 1/R g = 0,693/

entonces:

= 0,693 . R

Esto significa que Res mayor que. Este hecho hay que interpretarlo pensando que

refleja la tasa de crecimiento de crecimiento instantnea, y que esta se toma como si

se mantuviese constante desde el momento en que una clula resultante de una

divisin empezase a crecer. En la prctica, al final del ciclo celular, la tasa de sntesis debiomasa es prcticamente el doble que al principio. Por ello R, que representa el

promedio de lo que ocurre durante el perodo de duplicacin, es mayor que.

Otra pregunta interesante es si vara con la concentracin del sustrato de

crecimiento ([). Si los valores de obtenidos con diferentes concentraciones desustrato se representan grficamente, se obtiene:

La curva obtenida es muy parecida a la descrita para la catlisis enzimtica. Monod

demostr que la ecuacin de esta curva es :


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[ [Donde m es la velocidad especfica mxima de crecimiento para valores de [S] no muy

alejados de aquellos para los que deja de ser limitante para el crecimiento. Kses la

constante de saturacin, igual a la concentracin de sustrato que reduce la velocidad

especfica de crecimiento am.

La ecuacin se parece mucho a la ecuacin de Michaelis-Menten para la cintica de

los sistemas enzimticos. De este modo tambin puede aplicarse el mtodo de

Lineweaver-Burk para la determinacin mas precisa de Ks y m. La ecuacin puede

expresarse tambin como:

[ [

[

Llevando a una grafica los valores de 1/ como ordenadas y los de 1/[comoabscisas, puede calcularse la Ks.

A la hora de establecer una relacin entre la concentracin de sustrato y la tasa de

crecimiento bacteriana, es muy importante tener en cuenta que las bacterias

incorporan la mayora de los nutrientes por mecanismos de transporte activo o de

translocacin de grupo. Ello implica que incluso cuando un nutriente esta

notablemente diluido en el medio, su concentracin citoplasmtica es mxima . Por

ello, bajas concentraciones de sustrato proporcionan ya una m. As, Escherichiacoliya

crece con una tasa mxima de crecimiento en medios con una concentracin de

glucosa de 0.004 mM (0.72mg.1-1).

Monod tambin demostr experimentalmente que existe una relacin constante entre

el crecimiento de un cultivo y la cantidad de sustrato utilizado:

Donde Yes el llamado factor de produccin. Durante la fase exponencial.

Y= peso de biomasa formada/ peso de sustrato consumido

Cuando se conocen los valores de m, Ks e Y se tiene una descripcin cuantitativa

completa del desarrollo de un ciclo de cultivo discontinuo.

5.2 Cultivo Continuo

En la prctica, las condiciones de crecimiento no restrictivas indicadas en el apartado

anterior solamente perduran durante un tiempo limitado. Tanto el agotamiento de los

nutrientes como la produccin de metabolitos inhibidores del crecimiento por parte dela biomasa en desarrollo producen condiciones en las que el crecimiento microbiano


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cesa. Una alternativa para mantener la poblacin indefinidamente en crecimiento en

condiciones no restrictivas lo constituye el cultivo continuo. El cultivo continuo se inicia

del mismo modo que el discontinuo. Si cuando se alcanza la fase logartmica se aade

medio fresco a una velocidad adecuada para mantener la densidad de poblacin en un

valor constante e inferior al valor mximo de la fase estacionaria, el crecimiento puedecontinuar indefinidamente. Sin embargo, la velocidad de entrada y el volumen de

cultivo crecern exponencialmente con la biomasa, a no ser que se vaya eliminando un

volumen de cultivo igual al del medio fresco que va entrando. El sistema de volumen

constante tiene un intercambio energtico fijo y la biofase produce un mnimo de

entropa.

En un quimiostato los microorganismos crecen a una velocidad especfica constante

inferior a m. En el recipiente de cultivo, que tiene un volumen V, entra un flujoconstante F de medio de cultivo fresco. Este medio tiene todos los nutrientes a unaconcentracin limitante para una velocidad de crecimiento determinada. El volumen V

se mantiene constante porque simultneamente se elimina un flujo F de medio

modificado por la actividad metablica que adems lleva clulas producto del

crecimiento. El caudal de entrada F, determina la velocidad de dilucin:

D = F/V

La velocidad especfica de multiplicacin depende de la dilucin, esto es el nmerode volmenes de cultivo que pasan por el recipiente de cultivo en la unidad de tiempo.

Si la dilucin es constante, la concentracin de sustrato tambin ser constante yhabr una velocidad especfica de crecimiento = D que determina un estado

estacionario que puede mantenerse indefinidamente.

La concentracinefectiva de sustrato puede expresarse por:

[x= [S]0- [S]donde [S]0 es la concentracin de sustrato en el depsito de medio fresco y [S] la

concentracin en el recipiente de cultivo. Si [S]x = 0, el sustrato no esutilizado y no hay

crecimiento. Para que haya crecimiento, [S]x debe ser mayor que 0. Aumentando [S]0,puede conseguirse un valor de [S] que d una prxima a m.La velocidad especifica de crecimiento ser prxima a m si puede satisfacerse las

siguientes condiciones: (a) medio de cultivo perfectamente agitado, (b) cultivo

homogneo, (c) que las propiedades de cultivo sean prcticamente constantes a altas

concentraciones de sustrato (S>>Ks) y (d) que todos los dems componentes del medio

estn en exceso. Recordando la ecuacin:


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Si N es ahora compensado por la salida de biomasa del volumen de cultivo DN, el

cambio neto de concentracin de biomasa con el tiempo ser:

Incremento = CrecimientoPrdida

Si > D, dN/dt ser positivo y la concentracin de microorganismos en el cultivo

aumentar con el tiempo. Si < D, dX/dt ser negativo y la concentracin celular

disminuir, esto es, el cultivo se ir lavando fuera del recipiente de cultivo. nicamente

cuando = D ser dN/dt= 0 y la concentracin de microorganismos en el recipiente de

cultivo permanecer constante. Esta es la situacin de estado estacionario, en la que:

[ [ El estado estacionario no es difcil de conseguir, porque, al estar limitada por el

suministro del sustrato, la velocidad especfica de crecimiento cambiara con la

dilucin. Si esta ltima es constante, el sistema tiende a equilibrarse.

Cuando la velocidad de dilucin aumenta, D > y, entonces,dX/dtse hace negativo y la

biomasa decrece. Esto conduce a una menor utilizacin del sustrato, lo cual, para

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