CRIOPROTECCION

Métodos de elección o de conservación a largo plazo. Son los mejores porque en ellos se paraliza el

crecimiento de las células microbianas, pero éstas no han muerto. Así se garantiza al máximo la

estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones sucesivas. Aun así no se puede

descartar algún cambio originado por el método preparatorio en sí mismo. Los métodos de

conservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización.

Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a

temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al

no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con

las células así conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de

conservación desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos

especiales, y además existe el peligro de que algún fallo del sistema produzca una subida no

deseada de la temperatura durante el almacenamiento. También resulta ser el método más molesto

para realizar el envío de las cepas. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de

las células conservadas por este método son los siguientes:

Edad de las células

Velocidad en la congelación y descongelación.

Temperatura de almacenamiento

Empleo de agentes crioprotectores.

Estas sustancias protegen del daño que se pueda producir en las células microbianas en el momento

de la congelación. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como

crioprotectores, pero el que se utiliza con más frecuencia es el glicerol, a una concentración del 15

al 20%. También se pueden utilizar el dimetilsulfóxido etc. En su elección influye el tipo de

microorganismo que se quiera conservar.

CONTAMINACION:

¿Cómo se introduce una contaminación en nuestro cultivo?

• Operador

• La manipulación

• La atmósfera

• Las superficies

• Los utensilios

• Los medios y soluciones

Tipos de contaminación

• BIOLÓGICA

Bacterias:

Fácil de detectar a microscopía:

• Formas motiles (cocos, bacilos..)

• Origina cambios en el pH del medio

• Origina turbidez en el medio

• Control: penicilina/estreptomicina, gentamicina

• No utilizar antibióticos, al menos durante algún tiempo, para su control

• Eliminar los cultivos contaminados

▫ Levaduras:

Fáciles de detectar a microscopía.

• Partículas redondeadas u ovoides formando cadenas

• No causan cambios rápidos en el pH del medio

• El medio se vuelve turbio

• Pueden causar alcalinización del medio

• Olor típico a “pan”

▫ Hongos:

Fácilmente observables a microscopía o incluso a simple vista.

• No provocan cambios inmediatos en el pH del medio

• Generalmente no son citotóxicos

• Esporas difíciles de detectar

• Blanquecinos, amarillentos o negros

• Control: AnfotericinaB (Fungizone) o Nistatina

▫ Virus:

Difíciles de detectar por su tamaño

• Requerimientos muy específicos (hospedero)

• Peligro potencial para el operador al manipular cultivos infectados

• El riesgo de manifestación de virus ‘latentes’ se incrementa con las modificaciones genéticas y los

cambios en las condiciones de cultivo.

Para prevenir este tipo de contaminantes se recomienda:

Antes de utilizar la cabina: Apagar la lámpara UV, encender la luz, desinfectar las superficies con

el desinfectante apropiado, desinfectar y colocar el material necesario dentro de la cabina.

Manipular cada línea celular por separado: No compartir medios de cultivo entre diferentes

líneas, manipular las líneas celulares con mayor capacidad de proliferación las últimas, verificar

periódicamente las propiedades del cultivo.

CURVA DE CONGELACION

AS: Se enfría por debajo de su punto de congelación es inferior a 0º C.

SB: La temperatura aumenta rápidamente hasta alcanzar el punto de congelación.

BC: El calor se elimina a la misma velocidad que en las fases anteriores.

CD: Uno de los solutos alcanza la sobre saturación y cristaliza.

DE: La cristalización del agua y los solutos continúa.

EF: La temperatura de la mezcla de agua y hielo desciende.

CONTEO CELULAR:

Cuantificación celular es necesario para: la caracterización de líneas celulares, establecer

condiciones reproducibles de cultivo, consistencia de cultivos primarios.

Conteo celular: El numero células por ml = promedio del numero de células de los cuadros de

las esquinas x104. Si el conteo es muy alto se debe diluir la suspensión para evitar errores de

muestreo.