• Recuento en tubo.

- Distribuir y marcar los tubos con caldo lauril sulfato triptosa, tres tubos para cada dilución.

-Preparar las diluciones de la muestra.

1.-Prueba presuntiva:

-Inocular 1 ml por dilución a cada uno de los tres tubos con calco lauril sulfato triptosa.

-Incubar los tubos a 35°C por 48 horas.

- Transcurrido el tiempo de incubación, observar la presencia de gas, en cualquier cantidad, en los tubos incubados.

2.-Prueba confirmatoria:

-Agitar suavemente los tubos con producción de gas y transferir 3 asadas de cada tubo con gas a un tubo con caldo lactosa bilis verde brillante.

-Incubas los tubos con caldo lactosa bilis brillante a 35°C por 48 horas

-Transcurrido el tiempo de incubación, observar la presencia de gas en los tubos.

-Consultar la tabla I para la emisión del resultado con base al numero de tubos positivos y su disolución

Nota: Si las diluciones probadas fueron 1, 2 y 3 informar directamente de la tabla I. Si las diluciones probadas fueron 2, 3 y 4 ó 3, 4 y 5 multiplicar la cifra de la tabla por 10 ó 100 respectivamente.

-Informar NMP de coliformes totales por gramo ó mililitro de muestra.

• Cuenta en placa.

-Distribuir y marcar las cajas estériles en la mesa de trabajo.

- Preparar las diluciones de la muestra, según sea el caso.

-Transferir en condiciones de esterilidad, un mililitro de cada una de las diluciones a las cajas de Petri, realizando cada dilución por duplicado. Si se sospecha que la muestra posee un numero muy bajo de coliformes, inocular la muestra directa, sin diluir (si es lo suficientemente fluida para incorporarla al medio de cultivo) ó distribuir 10 ml de la primera dilución en 3 cajas de Petri, lo que permitirá analizar 1 g ó 1 ml de la muestra.

- Agregar de 15 a 20 ml aproximadamente de agar bilis rojo violeta fundido(45+-1°C) e incorporar la muestra al medio de cultivo(recordar que el numero de movimientos debe ser igual para todas las cajas).

-Preparar al mismo tiempo testigos de medio de cultivo y ambiente.

-Dejar solidificar el agar.

-Agregar una sobrecapa de 4 ml de agar bilis rojo violeta fundido sobre el medio solidificado, extendiéndolo para que cubra toda la superficie.

-Dejar solidificar el agar.

-Invertir las cajas e introducirlas a la estufa de incubación a 35°C durante 24 horas.

-Corroborar transcurrido el tiempo de incubación, que existe proporcionalidad entre el número de colonias desarrolladas y la dilución correspondiente. Si es posible, seleccionar las cajas que hayan desarrollado entre 20 y 200 unidades formadoras de colonias (UFC) típicas para la lectura. En el caso de haber inoculado 10 ml de la primera dilución en 3 cajas, contar todas las UFC típicas desarrolladas en las 3 cajas con ayuda del cuenta colonias y el contador manual.

Las UFC típicas son de color rojo obscuro con halo de precipitación rojo ó rosa alrededor y un diámetro de 0.5mm ó mayor.

Confirmar un número representativo de UFC (de 5 a 15), particularmente cuando las muestras analizadas no sean productos lácteos transfiriéndolas individualmente a un tubo de Fermentacion con caldo lactosa bilis verde brillante.

-Promediar los dos recuentos (duplicados) y multiplicar por la inversa de la dilución para obtener el numero de UFC por gramo ó mililitro de muestra.

Redondear la cifra obtenida en el recuento a dos dígitos significativos.

Cuando se halla realizado el conteo en 3 cajas donde se distribuyeron 10 ml de la primera dilución. Considerar el total de colonias contadas que están presentes en un gramo ó un mililitro de muestra.

-Informar UFC de organismos coliformes en agar bilis rojo violeta incubado 24 horas a 35°C