CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
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CROMATOGRAFÍA
DE
LÍQUIDOS
Fase móvil: líquida
Fase
estacionaria Método Interacción
Sólida
Adsorción
Fuerzas de Van der Waals,
puente hidrógeno
Líquida convencional
y fase ligada
Reparto
Solubilidad
(ver fuerzas en fase
normal/reversa)
Resina
intercambiadora
Intercambio
iónico Fuerzas electrostáticas
Gel poroso Exclusión
molecular Tamizado
Soporte con ligando
unido Afinidad Reacción específica
Cromatografía de adsorción
Fase estacionaria sólida
Fundamento de separación
el analito interacciona con sitios activos de
la superficie de la FE. Intervienen fuerzas
de van der Waals y enlaces de hidrógeno
Fases estacionarias
silicagel (SiO2)*
alúmina (Al2O3)*
C*
CaCO3
MgCO3
Fases móviles
solventes orgánicos puros
mezclas de solventes orgánicos
mezclas de solventes orgánicos con agua
mezclas de solventes orgánicos con buffers
Cromatografía de adsorción
Cromatografía de adsorción
analito desorbido
solvente
flujo
FE
analito adsorbido
En capa delgada En columna
placa
soporte
de
aluminio
o plástico
sílica grupo
silanol molécula
de solvente
analito
Solvente débil Solvente fuerte
Gel de sílice
O
H
Si Si
O H
O O
H
analito solvente
O
H
Si Si
O H
O O
H
analito
Cromatografía de adsorción
Microscopía electrónica de barrido de soportes sílica
Partículas irregulares Partículas esféricas
Monolito a base de sílice
Alúmina
Cromatografía de adsorción
O O
Al d+
d
O
O O
Al d+
d
O
d d O O
Al d+
d
O
O O
Al d+
d
O
d d
Fuerza del solvente: energía de adsorción
del solvente por unidad de área del
adsorbente.
Se mide con el parámetro de Snyder (e°).
Cromatografía de adsorción
Cromatografía de adsorción
Fluoroalcanos 0.00 -0.25
Ciclohexano 0.01 -0.2
Tolueno 0.22 0.29
Cloroformo 0.26 0.40
Acetato de etilo 0.48 0.58
Etanol 0.70 0.88
Metanol 0.75 0.95
Etilenglicol 0.90 1.11
Agua grande grande
SOLVENTE e (SiO2) e(Al2O3)
Ejemplo: agua > metanol > acetona > cloroformo >
tolueno > etc
Fase estacionaria líquida
Fundamento de separación
diferente solubilidad del analito en
FM y FE
Cromatografía de reparto
(partición líquido-líquido)
Cromatografía de reparto
Fase normal: FE polar (FM no polar) Fuerzas polares (van der Waals) que surgen de
dipolos permanentes o inducidos en moléculas sin
carga neta, y enlaces de hidrógeno (fuerzas polares
muy fuertes)
Fase reversa: FE no polar (FM polar) Interacciones no polares de naturaleza dispersiva.
Ocurre atracción molecular entre dipolos
instantáneos. Resultan de fluctuaciones de carga
(fuerzas de dispersión de London)
Fuerzas que intervienen en la separación
CL convencional Fase ligada
El líquido (FE) está
adsorbido sobre un
soporte sólido inerte
Las cadenas
carbonadas (FE)
están unidas
covalentemente al
soporte sólido inerte
Cromatografía de reparto
Cromatografía L-L convencional
Se puede llevar a cabo en columna y en
disposición planar (capa delgada y papel)
columna capa fina papel
Cromatografía de reparto
Soporte inerte:
sílicagel, celulosa,
tierra de diatomeas,
esferas de vidrio
FE (líquida): agua, solventes
inmiscibles con FM
Cromatografía L-L convencional
Cromatografía de reparto
La mayoría de las fases ligadas se
forman a partir de partículas de sílicagel,
a las que se les une covalentemente
cadenas carbonadas que actúan como
FE
Fase unida o fase ligada
OH
OH OH
Si O
Si
O
Si
HO
O
Si O Si
O
OH
OH OH
OH
Representación esquemática
grupo silanol
Partícula de silicagel
grupo silanol reactivo
unión
siloxano
- HCl +
Si
H
Si O H
O Si
O
C 3
C H 3
R
unión siloxano
alquil clorosilano
Si O H
O H Si
O Si
C H 3
R Cl
C H 3
C8H17
C18H37
C4H6N
C8H9SO… etc
Las fases ligadas más frecuentes (cepillo, oligomérica
y voluminosa) se producen a partir de monocloro,
dicloro y triclorosilanos, respectivamente.
Empaques
de siloxanos
-2 HCl + 2 C l Si R 2
alquil
diclorosilano Si O H
O H Si
O
O Si
O Si R 2
O Si
Ejemplo de reacción con un diclorosilano
Fase ligada
La FE es más polar que la muestra y la FM
R-Polar: ciano, diol, amino, dimetilamino
FM de baja polaridad: etil éter, cloroformo,
hexano
Solutos poco polares eluyen primero
Fase normal
Fase ligada
H H N
NO2
---
---
Ejemplo de interacción con “fase normal”
enlace de
hidrógeno
entre el
analito y la
ciano-
superficie
Fase ligada
La FE es menos polar que la muestra y la FM
Las fuerzas interactivas entre FE-soluto-
solvente son de naturaleza dispersiva: fuerzas
de dispersión de London (interacciones no
polares, no iónicas).
R comunes: C8 (n-octil) y C18 (n-octildecil)
FM: metanol, acetonitrilo, mezclas de ellos
con agua o buffers
Solutos de alta polaridad eluyen primero
Fase reversa Fase ligada
Ejemplos
de fase
reversa
Hexil, C6
Octil, C8
Octadecil, C18
fenil
Fase ligada
Índice de polaridad: describe cuantitativamente
la polaridad del solvente en el reparto
Fluoroalcanos < -2
Ciclohexano 0.04
Tolueno 2.4
Cloroformo 4.1
Etanol 4.3
Acetato de etilo 4.4
Metanol 5.1
Nitrometano 6.0
Etilenglicol 6.9
Agua 10.2
SOLVENTE ÍNDICE DE POLARIDAD (P’)
Series eluotrópica de solventes
Fase normal Fase reversa
Hexano
Benceno
Cloroformo
Acetato de etilo
Metanol
Agua
Agua
Metanol
Acetonitrilo
+
- F
U
E
R
Z
A
+
-
P
O
L
A
R
I
D
A
D
+
- P
O
L
A
R
I
D
A
D
Orden de elución
Polaridades de los solutos: A > B > C
Elección de fases en
cromatografía de reparto
Se elige la polaridad de FE bastante
similar a la de los analitos y para eluir se
usa FM de polaridad considerablemente
distinta
Ventajas de fase ligada respecto a
fase líquida adsorbida
Disminuye la pérdida de FE por
sangrado
Es más eficiente (el término C de la
ecuación de Van Deemter es menor a
expensas de un menor df)
Es más versátil
Cromatografía de intercambio iónico
FE
cargada
Fundamento de la separación
se produce intercambio reversible
entre iones de la muestra
y la FE
Intervienen fuerzas electrostáticas
Fases estacionarias
Resinas de intercambio iónico
Se usan para moléculas pequeñas (PM<500).
Penetran en los poros pequeños de la resina
Geles de intercambio iónico
Se usan para moléculas más grandes (proteínas y
ácidos nucleicos)
Intercambiadores iónicos inorgánicos (óxidos
hidratados de Zr, Ti, Sn y W)
Separaciones que exigen condiciones químicas
fuertes (alta temperatura, agentes oxidantes fuertes,
radiación)
ácidos y bases inorgánicos/orgánicos (KOH,
NaOH, HClO4, HCl, ácido tartárico)
sales (Na2CO3, NaHCO3, NaClO4) con o sin
solventes orgánicos
Detector conductímetro
Fase móvil
Resina Grupo Nombre
comercial Catiónica ácido fuerte ácido
sulfónico Dowex 50, Amberlite IR120, Ionac CGC-240
ácido débil ácido carboxílico
Amberlite IRC 50, Ionac CGC-270
Aniónica base fuerte ión amonio
cuaternario Dowex 1, Amberlite IRA 400, Ionac AGA-542
base débil grupo amina Dowex 3, Amberlite IR-45 Ionac AGA-316
Resinas de intercambio iónico
Resinas de intercambio catiónico: ácido fuerte
Resinas de intercambio catiónico: ácido debil
Resinas de intercambio aniónico: base fuerte
Resinas de intercambio aniónico: base debil
Diferentes empaques en intercambio iónico
vidrio o
polímero
intercambiador iónico
Resina pelicular
Resina
macroreticular
macroporos
x RSO3 H+ + Mx+ (RSO3
)xMx+ + x H+
sólido solución sólido solución
El intercambio de cationes se ilustra con el equilibrio
El intercambio de aniones se ilustra con el equilibrio
x RN(CH3)3+ OH- + Ax- [RN(CH3)3
+]x Ax- + x OH-
sólido solución sólido solución
Se aplica elución en gradiente con fuerza iónica creciente o
mediante cambios de pH
Un gradiente de fuerza iónica es semejante a gradiente de
solvente o de temperatura
Cromatografía Iónica
La cromatografía iónica es una variante de la
cromatografía líquida de alta presión (HPLC) para la
separación y determinación de iones, basado en el
uso de resinas de intercambio iónico.
Se utilizan columnas de intercambio iónico
especialmente diseñadas para este tipo de
cromatografía.
Los conectores del cromatógrafo iónico son
poliméricos (en vez de ser de acero inoxidable). El
más común es el PEEK (polyether ether ketone).
Se utilizan detectores conductimétricos,
amperométricos, UV, etc, aunque el más común es
el conductímetro.
El resultado es un cromatograma donde la
posición de los máximos nos indica el ión presente
(carácter cualitativo) y su área nos indica que
cantidad existente de dicho ión (carácter
cuantitativo).
Cromatografía Iónica
Cromatografía de exclusión molecular
Fundamento de separación Separación en base a forma y tamaño del analito
Geles porosos hidrofílicos Geles porosos hidrofóbicos
Filtración en gel Permeación en gel
Fase estacionaria
Cromatografía de exclusión molecular
FE: Geles porosos hidrofílicos (Sephadex), geles
de poliacrilamida (biogeles), geles rígidos de sílica
o vidrio con determinados tamaños de poro
FM: no interactiva. Transporta la muestra
Exclusión molecular
K = 0.2 K = 0.5 Rta
Volumen
VS VM
Exclusión total
Permeación
selectiva
Permeación total
102
104
106
Volumen
PM
VR - VM
VS
K =
K = 0 K = 1
Exclusión molecular
Utiliza la alta especificidad de las reacciones biológicas
del tipo antígeno-anticuerpo, hormona-receptor.
Un ligando se une al soporte de la FE. Cuando la
muestra atraviesa la columna solo se retiene la
sustancia capaz de reaccionar con dicho ligando.
Concluida la separación, se provoca la salida de la
sustancia que dio la reacción específica.
Cromatografía de afinidad
ligando unido
covalentemente
empaque
muestra
analito
etapa de lavado
etapa de elución
columna
regenerada
solución con
analito puro
+
etapa de
interacción
Cromatografía de afinidad
102
103
104
105
106
PM
no polar iónico polar no iónico
Aumento de la polaridad
adsorción intercambio
iónico
partición
fase
reversa fase
normal
exclusión
permeación en
gel filtración en
gel
Elección del sistema cromatográfico
Elección de la fase móvil
FM interactiva FM no-interactiva
reparto, adsorción,
intercambio iónico gas portador en CG y
exclusión molecular
tiempos de retención
fuertemente influenciados
por el tipo de FM utilizada
participación activa
en la separación
tiempos de retención
independientes de la FM
utilizada
la FM solo transporta la
muestra a través de la FE
Buscar y describir ejemplos de aplicación
de separación y/o cuantificación utilizando:
Cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de exclusión molecular
