CROMATOGRAFIAPrincipio Básico

Separación de mezclas por interacción diferencial de sus componentes entre una FASE ESTACIONARIA (líquido o

sólido) y una FASE MÓVIL (líquido o gás).

CROMATOGRAFIAModalidades y Clasificación

FM = Líquido

FM = Gás

CromatografíaLíquida

CromatografíaGaseosa (CG)

En CG la FEpuede ser:

Sólida

Líquida

CromatografíaGás-Sólido (CGS)

CromatografíaGás-Líquido (CGL)

CROMATOGRAFÍA GASEOSAAplicabilidad

Qué mezclas pueden ser separadas por CG ?

Mezclas cuyos constituyentes sean

VOLÁTILES (“evaporables”)

(para cualquier mezcla de sustancias que pueda ser “arrastrada” por un flujo de gas en el que

se pueda disolver - por lo menos parcialmente)

DE FORMA GENERAL:CG es aplicable para la separación y análisisde mezclas cuyos constituyentes tenganPUNTOS DE EBULLICIÓN de hasta 300oCy que sean térmicamente estables.

O Cromatógrafo a Gás

1

2

3

4

6

5

1 - Balón de Gás y Controles de Presión.2 - Inyector (Vaporizador) de la muestra.3 - Columna Cromatográfica y Horno de la Columna.4 - Detector.5 - Electrónica de Tratamiento (Amplificación) de Señal.6 - Registro de la Señal (Integrador o Computador).

Observación: en rojo: temperatura controlada

INSTRUMENTACIÓNGas de Arraste

Fase Móvil en CG: NO interacciona con la muestra - apenas la transporta a través de la

columna. Usualmente nos referimos a ella como GAS DE ARRASTEGAS DE ARRASTE

Requisitos:

INERTE No debe reaccionar con la muestra, la fase estacionaria u otras superfícies del

instrumento.

PURO Debe ser libre de impurezas que puedan degradar la fase estacionaria.

Impurezas típicas en gases y sus efectos:

oxida / hidroliza algunas FE

incompatibles con ECDH2O, O2

hidrocarburos ruido a la señal de FID

INSTRUMENTACIÓNInyector Convencional

Los dispositivos de inyección (INYECTORES o VAPORIZADORES) deben proveer medios de introducción INSTANTÁNEA de la muestra en

la columna cromatográfica

1

2

3

45

6

1 - Septa;2 - Entrada de gas de arrastre;3 - “Liner” (mezclador);4 - Columna5 - Purga del gas de arrastre;6 - Válvula de control de purga.

INSTRUMENTAÇÃOMicrojeringas para Injección

LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L

êmbolo

cuerpo (pirex)

aguja (inox 316)

Microjeringa de 10 L:

Microjeringa de 1 L (sección ampliada):

cuerpo

guia

êmbolo

aguja

INSTRUMENTACIÓNParámetros de Inyección

TEMPERATURA DEL INYECTOR Debe ser lo suficientemente elevada para que la muestra se vaporize inmediatamente, sin descomposición

Regla General : Tinj = 50oC por encima de la temperatura de ebulição del componente

menos volátil

VOLUMEN INYECTADO Depende del tipo de columna y del estado físico de la muestra

COLUMNAMuestrasGaseosas

MuestrasLíquidas

empacada = 3,2 mm (1/4”)

0,1 ml ... 50 mL0,2 L ... 20 L

capilar = 0,25 mm 0,001 ml ... 0,1 mL0,01 L ... 3 L

Sólidos: convencionalmente se disuelven en un solvente adecuado y se inyectan en solução

INSTRUMENTACIÓNColumnas: Definiciones Básicas

EMPACADA = 3 a 6 mm

L = 0,5 m a 5 mRellena con un sólido pul-verizado (FE sólida o FE líquida depositada sobre las partículas del relleno)

CAPILAR = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m

Paredes internas recubier-tas con una película fina (en m) de FE líquida o

sólida

COLUMNAS CAPILARESDefiniciones Básicas

Tubo fino de material inerte con FE líquida o sólida depositada sobre las paredes internas.

MATERIALDEL

TUBO

ø = 0,1 mma 0,5 mm

L = 5 ma 100 m

sílica fundidavidro pirexAcero inox.

NylonSilcosteel

Las columnas de sílica son revestidas externamente con una capa de polimero (poliimida) para aumentar su resistencia mecánica y

química

Columnas Capilares x Empacadas:

CA

PIL

AR

ES L = N Columnas mas eficientes

FC = 1 ... 10 mL.min-1 Control más difícil

Vi Dispositivos especiales de inyección

Famílias de Colunas Capilares :

PLOT (Porous layer open tube) Camada de FE sólida presa às paredes internas

SCOT (Support coated open tube) Predes internas revestidas com material de recheio similar ao das colunas empacotadas

WCOT (Wall coated open tube) FE liquida deposida (ligada // entrecruzada) sobre las paredes internas.

COLUMNAS CAPILARESColumnas Capilares: Inyección

1

2

3

45

6

1 - Septa;2 - Entrada de gas de arraste;3 - “Liner” (mezclador)4 - Columna Capilar5 - Purga de gas de arraste;6 - Válvula de control de purga.

Baja capacidad de procesamiento de muestra (sub-microlitros)

Inyección directa con microjeringa muy difícil !!!

Inyectores con división (“splitters”) Sistema neumático que elimina una fracción de la muestra

inyectada

- Menor sensibilidad (gran parte de la muestra es eliminada)

- División de la muestra raramente es uniforme (fracción purgada de los constituyentes menos volátiles es siempre

menor)

- Ajuste de la razón de división es más una fuente de error

INSTRUMENTACCIÓNHorno De la Columna

Características Deseables de un Horno:

AMPLIO RANGO DE TEMPERATURA DE USO Por lo menos de Tambiente hasta

400oC. Sistemas criogênicos (T < Tambiente)

pueden ser necesarios en casos especiales.

TEMPERATURA INDEPENDIENTE DE LOS DEMAS MÓDULOS No debe ser afectado por la temperatura del inyector y detector.

TEMPERATURA UNIFORME EN SU INTERIOR Sistemas de ventilación interna muy eficientes para mantener la temperatura homogénea en todo el horno.

INSTRUMENTACIÓNHorno de la Columna

Características Deseables de un Horno:

FÁCIL ACCESO A LA COLUMNA La operación de cambiar de coluna puede ser frecuente.

CALENTAMIENTO Y ENFRIAMIENTO RÁPIDO Importante tanto en los análisis de rutina y durante el desarrollo de metodologias analíticas nuevas.

TEMPERATURA ESTABLE Y REPRODUCIBLE La temperatura debe mantenerse con exactitud y precisión de ± 0,1°C.

En los cromatógrafos modernos (después de 1980), el control de la temperatura del horno es totalmente controlado por microprocesadores.

INSTRUMENTACIÓNProgramación Lineal de Temperatura

Mezclas complejas (constituyentes con volatilidades muy diferentes) separados

ISOTÉRMICAMENTE:

TCOL BAJA:

- Componentes mas volátiles son separados

- Componentes menos volá-tiles demoran en eluir,

saliendo como picos mal definidos

TCOL ALTA:

- Componentes mas volá-tiles no son separados

- Componentes menos volá-tiles eluyen mas

rápidamente

FASES ESTACIONARIASConceptos Generales

LÍQUIDOS Depositados sobre la superficie de: só-lidos porosos inertes (columnas empacadas) o de

tubos finos de materiales inertes (columnas capilares)

FElíquida

SOPORTESólido inerte

poroso

Tubo capilar de material inerte

SÓLIDOS Columnas rellenas con material finamente granulado (empacadas) o depositado sobre la

superficie interna del tubo (capilar)

Para minimizar la perdida de FE líquida por volatilización, normalmente es:

Entrecruzada: las cadenas

poliméricas son químicamente unidas entre si

Químicamente ligadas: las cadenas poliméricas son fijadas “presas” al

soporte por uniones químicas

FASES ESTACIONARIASCaracterísticas de una FE ideal

SELECTIVA Debe interactuar diferencialmente con los componentes de la muestra.

Regla general: la FE debe tener características similares a la de los solutos a ser separados (polar,

apolar, aromático ...)

FE Selectiva: separación

adecuada de los constituyentes de la muestra

FE poco Selectiva: mala resolución

AMPLIA RANGO DE TEMPERATURAS DE USO Mayor flexibilidad en la optimización de la separación.

BUENA ESTABILIDAD QUÍMICA Y TÉRMICA Mayor durabilidad de la columna, no reaccione con los componentes de la muestra

POCO VISCOSA Columnas mas eficientes (menor resistencia a la transferencia del analito entre las fases)

DISPONIBLE EN ELEVADO GRADO DE PUREZA Columnas reproducibles; ausencia de picos “fantasmas” en los cromatogramas.

FASES ESTACIONARIASCaracterísticas de una FE ideal

FASES ESTACIONARIASFamilias de FE Líquidas

SILICONAS (polisiloxanos) Es la FE más empleada en CG. Cubre amplio rango de pola-ridades y propiedades químicas diversas.

Si

CH3

H3C

CH3

O Si

R1

R2

O Si

CH3

CH3

CH3n

R1, R2 = qualquier

radical orgánico

- La Unión Si-O es extremadamente estable = elevada estabilidad térmica y química de las FE.

- Las Siliconas son fabricadas en gran escala para diversas aplicaciones = minimización del costo del producto + tecnología de producción y purificación

ampliamente estudiada y conocida.

- Practicamente cualquier radical orgánico o inorgánico puede ser unido a la cadena polimérica =

FE “ajustables” a separaciones específicas + facilidad de inmobilización por entrecruzamiento y unión

química a el soporte

Separación de pesticidas - FE = 100 % PDMS

1 - TCNB2 - Dichloram3 - Lindano4 - PCNB5 - Pentacloroanilina6 - Ronilano7 - Antor8 - pp’-DDE9 - Rovral10 - Cypermetrin11 - Decametrin

Columna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 m)

TCOL:195oC (6,5 min) / 195oC a 275oC (10oC.min-1)

Gas de Arraste: He @ 35 cm.min-1 Detector: FID

Muestra: 2L de solución de los pesticidas.

17 min

FASES ESTACIONARIASFamilias de FE Líquidas

Separación de piridinas-FE = 100 % CNpropilsilicone

1 - piridina2 - 2-metilpiridina3 - 2,6-dimetilpiridina4 - 2-etilpiridina5 - 3-metilpiridina6 - 4-metilpiridina

3 minColumna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 m)

TCOL:110oC (isoterma)

Gas de Arraste: N2 @ 16 cm.min-1 Detector: FID

Muestra: 0,1L de solución 1-2% de las piridinas en 3-metilpiridina

FASES ESTACIONARIASFamilias de FE Líquidas

INSTRUMENTACIÓNDetectores

Dispositivos que examinan continuamente el material eluido, generando una señal cuando se da el paso de una sustancia que no es el gas de

arrastre

Gráfico Señal x Tiempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada sustancia separada aparece

como un PICO en el cromatograma.

DETECTORESClassificação

UNIVERSALES:Generan señal para cualquier

sustancia eluida.

SELECTIVOS:Detectan sólo sustancias

con determinada propriedadfísico-química.

ESPECÍFICOS:Detectan sustancias que

tengan determinado elementoo grupo funcional en sus

estructuras

DETECTORESDefiniciones Generales

Dispositivos que generan una señal eléctrica proporcional a la cantidad eluida de un analito

~ 60 detectores ya usados em CG

~ 15 equipan a cromatógrafos comerciales

4 responden a la mayor parte de las aplicaciones

TCDDetector de

CondutividadTérmica

FIDDetector porIonización de

Llama

ECDDetector porCaptura deEletrones

MSDetector

Espectrométrico de Masas

INSTRUMENTACIÓDetectores

Más Importantes:

DETECTOR DE CAPTURA DE ELECTRONES

(ECD) Supresión de corriente causada por la absorción de electrones por los eluidos altamente eletrofílicos.

DETECTOR DE CONDUTIVIDAD TÉRMICA

(TCD) Variación de la condutividad térmica del gas de arrastre.

DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA (FID) Variación del voltaje por los iones generados durante la combustión de los eluidos en una llama de H2 + ar.

REGISTRODE

SEÑAL

ANALÓGICORegistradores XY

DIGITALIntegradores

Computadores

DETECTORESDetector de Conductividad Térmica

PRINCIPIO Variaciónde la conductividad térmica de un gas cuando ocurre la elución de un analito.

Celda de Detección del TCD:

12

35

4

i

1 Bloque metálico

2 Entrada de gas de arraste

3 Salida del gas de arraste

4 Filamento metálico

5 Alimentación de corriente eléctrica

La razón de transferencia de calor entre un cuerpo caliente y un cuerpo frio depende de la

conductividad térmica del gas en el espacio que separa los cuerpos

Si la conductividad térmica de un gas disminuye, la cantidad de calor transferido

también disminuye

DETECTORESTCD: Aplicaciones

1 Separación y cuantificación de compuestos que no generan señal en otros detectores (gases nobles, gases

comunes)

2 Por ser un detector no-destructivo, puede ser usado en CG preparativa o detección secuencial con dos detectores

en “tandem”

Columna: CP Sil 5CB(50 m x 0.32 mm x 5 µm)

Gás de Arraste: He @ 3 ml.min-1

TCOL: 40°C Detector: TCD

1 N2 2 CH4

3 CO2 4 n-C2

5 NH3 6 n-C3

7 i-C4 8 n-C4

Separación de Gases Comunes y Hidrocarbonos:

DETECTORESDetector por Ionización de Llama (FID)

PRINCIPIO Formación de iones cuando un compuesto es quemado en una Llama de hidrogeno y oxigeno

El efluente de la columna es mezclado con H2 y O2, y es

quemado. Como en una Llama de H2 + O2 no existen

iones, ella no conduce la corriente eléctrica.

Cuando un compuesto orgânico eluye, tambiém es quemado. Con una suave

combustión se forman iones, la Llama pasa a conducir la

corriente eléctrica

DETECTORESDetector por Ionizacíon de Llama

COLETOR

FLAME TIP

BLOCO

AR

H2

COLUNA

El aire y el H2 se difunden para el interior del colector, donde se

mezclan con el efluente de la columna y se combustionan:

Una diferencia de potencial eléctrico se aplica entre el tip de la llama y el coletor - cuando se forman iones en la Llama, fluye

una corriente eléctrica:

DETECTORESCaracterísticas Operacionales del FID

SELEcTIVIDAD Selectivo para sustancias que contienen enlaces C-H en su estructura química.

(como virtualmente todas las sustancias analizables por CG son

orgánicas, la práctica del FID es UNIVERSAL)

Compuestos que NO producen respuesta al FID:

Gases nobles

H2, O2, N2

CO, CO2, CS2

CCl4, peralogenados

NH3, NxOy

SiX4 (X = halogenos)

H2O

HCOOH, HCHO *

SENSIBILIDAD / LINEALIDAD QMD típicas = 10 pg a

100 pg con linealidad entre 107 e 108 (pg a mg)

DIC

DCT N2

CH4

CO2

O2

DETECTORESDetector de Captura de Electrones - ECD

PRINCIPIO Supresión de um flujo de electrones causado por su absorción por especies electrofílicas

Un flujo contínuo de electrones lentos es

estabelecido entre un ánodo (fuente radiactiva -emisora) y un catodo.

Al paso de una sustancia electrofílica algunos

electrones son absorvidos, resultando en

una supresión de corriente eléctrica.

12

3

4

5

1 Anôdo (fonte radioativa - emissora)

2 Saída de gases 3 Catodo

4 Cavidade 5 Coluna cromatográfica

DETECTORESDetector de Captura de Electrones - ECD

DETECTORESECD: Aplicações

Contaminantes en aire atmosférico - detección paralela FID + ECD

FID

ECD

1, 2, 3 - Hidrocarburos aromáticos

4, 5, 6 - Hidrocarburos clorados

ANÁLISIS CUALITATIVOConceptos Generales

Fuentes de Informaciones Cualitativas

RETENCIÓN Uso de datos de Tr de un analito para su identificación

DETECCIÓN Detectores que brindan informacion estructural de las sustancias eluídas

Identificación individual de las especies contenidas en una

muestra

Determinación de la identidad de la muestra adecuadamente

hecha

Aplicaciones Cualitativas

de la CG

Para análisis cualitativo confiable por CG es recomendable la combinación de datos provenientes de por lo menos dos fuentes

ANÁLISIS CUALITATIVOTiempos de Retención

t’R = fInteracciones analito / FE

Presión de vapor del analitoCondiciones operacionales (TCOL, FC ...)

Fijas las condiciones operacionales, el tiempo de retención de un analito es una constante

MUESTRA

PATRÓN

Comparação de cromatogramas

da amostra e de uma

solução padrão do analito suspeito

Comparación del t’R usando dopage (“spiking”)

de la muestra con un analito sospchoso: aumento de la confiabilidad de la identificación.

Muestra compleja: incertidumbre de los t’r medidos pueden llevar

a una identificación errónea

La comparación con un cromatograma de la

muestra dopada permite una

identificación más confiable del compuesto

desconocido

ANÁLISIS CUALITATIVOTiempos de Retención

ANÁLISIS CUALITATIVOMétodos de Detección Cualitativos

Métodos de detección que brindan información cualitativa sobre los analitos eluídos:

Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Absorção no Infra-Vermelho (CG-EIV)

Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica de Massas (CG-EM)

Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA)

Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de identificação baseadas em retenção

ANÁLISE QUALITATIVAEspectro de Massas

m/Z = 118

m/Z = 80

m/Z = 79

- CO

- (CO + H)

m/Z = 90

20 40 60 80100

120

0

m / Z

ANÁLISE QUALITATIVAAcoplamento CG - EM

Sistema de Controle e Aquisição de Dados:

É MANDATÓRIO que sistemas CG-EM sejam totalmente controlados por microcomputador.

Sistema de Controle e Aquisição de Dados:

1 Gerencia e monitora o funcionamento dos módulos de CG e EM.

2 Coleta e arquiva espectros de massa em intervalos regulares de tempo e constroi o cromatograma.

3 Após a corrida, compara espectros coletados com bases de dados para identificação dos eluatos.

COMPUTADORES RÁPIDOS E COM GRANDE CAPACIDADE DE ESTOCAGEM DE DADOS

ANÁLISE QUALITATIVACG-EM: Geração do Cromatograma

Espectros de massas completos coletados e arquivados em intervalos regulares de tempo

Geração do cromatograma a partir dos espectros:

CROMATOGRAMA DE ÍONS TOTAIS (TIC = To-tal Ion Chromatogram)

Para cada espectro o número total de íons detectados na faixa de massas varrida é somado e plotado em

função do tempo, gerando o cromatograma.

MONITORAMENTO DO ÍON SELECIONADO (SIM = Single Ion Monitoring)

Seleciona-se um fragmento resultante da fragmentação da espécie de interesse. Gera-se o cromatograma

plotando-se o número de íond detectados com a massa desse fragmento em função do tempo.

TICUniversal

Similar a DIC

SIMSeletivo

Maior Sensibilidade

ANÁLISE QUALITATIVACG-EM: TIC x SIM

Aroma de polpa industrializada de cajá após extração por SPME

TICAparecem os picos correspondentes a todas substâncias

eluídas

SIM (m/z = 149)Cromatograma

construido a partir dos mesmos dados acima, mas apenas usando

fragementos com massa = 149 (ftalatos:

plastificante)