CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

DE ALTA RESOLUCIÓN

HPLC High Performance Liquid

Chromatograpy

Comparación HPLC y CG

Volatilidad de la muestra

HPLC

oLa volatilidad no es necesaria

oLa muestras deben ser solubles en la fase

móvil

CG

oLa muestra debe ser volátil

oBajo PM

C.L.S. adsorción

C:L:L: Reparto

Cromatografía líquida

Fase Normal

•Fase Estacionaria polar

•Fase Móvil no polar a lo polar

incremento de la fuerza

eluotrópica

Fase Reversa

FE no polar

FM polar a lo no polar incremento

de la fuerza eluotrópica

Hidrófilo

Hidrófobo

Ácidos

carboxílicos

volátiles

Sulfonamidas

Cetonas de

aldehídos

Glifosatos

Aminoácidos Iones inorgánicos

Colorantes

alimentarios

sintéticos

Azúcares Alcoholes de

azúcares

Enzimas

PG, OG, DG

fenoles Glicoles

Nitrilos

Nitrosamina

BHT (butilhidroxitolueno),

BHA (butilhidroxianisol),

THBO antioxidantes

Ácidos grasos

Aflatoxinas

Antibióticos

Flavonoides

Colorantes alim. naturales

Vitaminas solubles en grasas

Anabólicos PAHs

Aminas aromáticas

Alcohol Pesticidas

organofósforos TMS derivado

de azúcares

Epóxidos Aceites esenciales

PCB

Monómeros de polímero Triglicéridos Fosfolípidos

C2/C5 hidrocarburos Metiléster

ácidos grasos Ésteres aromáticos

Volátil No volátil Volatilidad

Polaridad

6

HPLC Isocrático

Bomba

Inyector

Columna

Registrador

Electrometro

Detector

Solvente

Solventes

• Pureza – Grado HPLC

• Filtración – Poro de 0.45 micras

– Nylon

– Teflón

• Desgacificación

Bombas

Se requiere de una bomba que de

una presión alta para forzar al

líquido a pasar por la columna a

una velocidad satisfactoria.

Debe mantener el flujo constante

durante períodos relativamente

largos.

Las Bombas de Pistón dual

INJECTORES

Columnas

acero inoxidable (soportan presiones

hasta 5000 psi)

Diámetro de 1 a 6 mm

Longitud de 10 a 30 cm

El soportes para la fase líquida

tierra de diatomeas, zipax o corasil

Columnas de HPLC

Columna

analítica

Fase móvil

desde la bomba

Precolumna Muestreador

Al detector

Actúa sobre la muestra para

atrapar partículas y

componentes de muestras

retenidos con fuerza.

Las columnas varían en los siguientes aspectos:

• Longitud

• Diámetro interno

• Material de la fase estacionaria

• Tamaño de partícula de la fase estacionaria

La columna

analítica lleva

a cabo la

separación.

17

Columna - Acero inoxidable

estándar

Capilar

Frita de filtro de

acero inoxidable

Tamaño de poro de 2

um

Relleno de

columna

18

Materiales de relleno de columnas -

Sílice

Soles de sílice Xerogeles

Esférico

Irregular Las partículas tienen un diámetro de

3 a 10 μm en las columnas estándar.

19

Materiales de relleno de columnas -

Fases enlazadas

Si R1

R2

Si CH3 H3C

O

O

Si

O O

OH

Poros

Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl

R1

R2

Fase enlazada monomérica

Cadena de carbono

con forma de cepillo

20

Materiales de relleno de columnas - Fases

enlazadas extensamente utilizadas

CH3

|

-0-Si- R

|

CH3

HPLC de fase inversa •C18

•C8

•C4

•C1

•Fenilo

Las columnas de HPLC más utilizadas

Separaciones de proteínas

Dipolo débil - dipolo inducido

Interacciones con analitos polares

HPLC de fase normal o inversa • CN

• NH2

HPLC de fase normal • Diol Separaciones de compuestos con

polaridades muy diferentes

Polaridad intermedia

Intercambio iónico

DEAE (dietilaminoetanol)

QAE (aminoetilo cuaternario)

Carboximetilo

Exclusión de tamaño

Glicerilpropilo

21

Número aproximado de platos (N) y volumen

vacío (Vm) para columnas de 5 mm y 3,5 mm Si se reducen simultáneamente la longitud de la columna

(N ) y el tamaño de partícula (N ), se podrá:

◦ Mantener la resolución

◦ Reducir el tiempo de análisis

◦ Reducir el uso de disolventes

Tamaño de la

columna Tamaño de partícula

Número de platos

(N)

Volumen vacío

(V m )

4,6 x 250 mm 5- m m 20.000 2,5 ml

4,6 x 150 mm 5- m m 12.000 1,5 ml

4,6 x 150 mm 3.5- m m Resolución rápida 20.000 1,5 ml

4,6 x 75 mm 3.5- m m Resolución rápida 10.000 0,75 ml

4,6 x 50 mm 3.5- m m Resolución rápida 6.000 0,5 ml

4,6 x 30 mm 3.5- m m Resolución rápida 3.600 0,3 ml

4,6 x 15 mm 3.5- m m Resolución rápida 2.000 0,15 ml

22

Conseguir todo el potencial con

mayor velocidad de flujo mAU

0 100 200 300

mAU

0 100 200 300

min 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0.6 0.7 0.8 0,9

mAU

0 100 200 300

0

Flujo

3 ml/min

2 ml/min

4 ml/min

Zorbax SB-C18, 3,5 µm, 4,6 x 30 mm

90 bar

133 bar

181 bar

Presión

30 seg

Rs2,1 = 2,1

Rs2,1 = 2,2

Rs7,6 = 2,2

Rs7,6 = 2,2

23

Velocidades de flujo típicas d.i. de columna

partículas de 5 mm )

Flujo

ml/mi

n 4,6 1 –2

3,0 0,4 - 0,8

2,1 0,2 – 0,4

1,0 0,05 – 0,09

24

Longitud de columna - Adaptar la

longitud a la resolución deseada DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0035.D)

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0032.D)

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0037.D)

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0027.D)

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0038.D)

min0 1 2 3 4 5 6 7 8

Ad

sorb

ance

4,6 x 15 mm

4,6 x 30 mm

4,6 x 50 mm

4,6 x 75 mm

4,6 x 150 mm

Ab

sorb

an

cia

SB-C18

Condiciones: LC: Hewlett-Packard HP1100

Columnas: Zorbax SB-C18, 3,5 µm

Fase móvil: 1 mM octano ácido sulfónico, Na sal, pH 2,5: ACN (80:20)

UV: 275 nm; flujo: 2,0 ml / min.; 70 °C

Vol. de inyección: 1 µl

Muestra:

1. Acetoaminofeno (4-acetoamidofenol)

2. Cafeína

3. 2-Ac2-Acetoamidofenol

4. Acetanilida

5. Aspirina (ácido acetilsalicílico)

6. Ácido salicílico

7. Fenacetina (acetofenetidina)

1 2 3 4

5 6 7

los 7 componentes se descomponen en menos de 1 min

25

Operación de un gradiente en

HPLC

El cambio de composición en la

fase móvil durante una corrida

cromatográfica

Definición de Gradiente

. El principal motivo de un

gradiente de elución es el de

mover los compuestos retenidos

fuertemente de una manera

rápida, pero tomando en cuenta

que el último compuesto debe ser

resuelto debidamente

Tipico gradiente

Estrategias para desarrollar

un gradiente

• Lograr la máxima separación

– Decrecer el tiempo de reequilibrio

– Reducir el ciclo de inyección

• Uso de gradientes cortos

• Uso de flujos altos

• Uso de columnas cortas o rocket

• Uso de tamaño pequeño de partícula

• Incremento de la temperatura

'k

'kx

)(xN)/(R

1

141

Eficiencia Selectividad Capacidad

Ecuación de Resolución

El tipo de elución es

mantenido durante toda la

corrida, haciendo los ciclos

mas cortos

• La composición de la FM

• La composición de la FE

• pH

• Temperatura de la columna

• Aditivos en la FM

Cambios en

Cambios en k’

• Cambiar la composición de la FM

• Incrementando la Fza de la FM decrece

la k’

• En una C18, el incremento de la

polaridad en la FM hace que los solutos

sean retenidos más fuertemente

• Bajando la polaridad de la FM

disminuyendo la cantidad de agua

causa que las moléculas de la

muestra eluyan más rápidamente

Cambios en k’

Detectores

Visible UV

Arreglo de diodos

Índice de refracción

Fluorescencia

Electroquímico

Características del detector ideal

•Bajo nivel de ruido

•Alta sensibilidad

•Respuesta rápida

•Respuesta lineal alta

•Bajo volumen muerto

•Insensible al cambio del tipo de solvente

•Operación simple y reproducible

•De preferencia no destructivo

Fracción del espectro

electromagnético

infrared (IR) 2,500 - 50,000 nm

near infrared 800 - 2,500 nm

visible 400 - 800 nm

ultraviolet (UV) 190 - 400 nm

Ley de Lamber Beer

UV variable

• Muchos solutos absorben

• Lecturas entre 0.001 a 3 ua

• Lineraridad de 5 ordenes de magnitud

• Eluciones por gradiente con solventes

que no absorben

UV variable

Arreglo de Diodos

• Registra el espectro de cada soluto conforme eluye de la columna

• Permite seleccionar mejor la longitud de onda, importante cuando no hay información disponible sobre las absortividades molares

• Pureza. La forma del pico, la absorbancia a varias longitudes de onda es particularmente útil decidiendo si la cresta representa un solo compuesto o, es una cresta compuesta.

.

Arreglo de Diodos

• Único detector universal en HPLC

• La detección es la medida en el cambio

del índice de refracción del eluyente

pasando a través de la celda.

• No permite eluciones por gradiente

Índice de Refracción

Índice de Refracción

Detector de Fluorescencia

• 15 % de los compuestos

• Alifaticos ciclicos, con grupos carbonilo,

dobles enlaces conjugados

• Compuestos aromáticos no sustituidos,

entre mas anillos mas F.

Detector de Fluorescencia

Detector Electroquímico

• Selectivo, solo ciertos analitos se

oxidan o se reducen con facilidad

• Oxidación: fenoles, aminas aromáticas,

peróxidos y mercaptanos

• Reducción: cetonas, aldehídos, nitrilos

conjugados, halógenos aromáticos y

comp. nitro aromáticos

Detector Electroquímico

Ruido