Cromatografía Técnica bioquímica en la que sustancias mezcladas se separan en función de su...
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CromatografíaTécnica bioquímica en la que sustancias mezcladas se separan en función de su carga, hidrofobicidad, tamaño o alguna otra propiedad, al repartirse entre una fase móvil y una fase estacionaria
Volumen de columna
Muestra aplicada
Matriz
Tapónporoso
Eluyente
Eluyente Proteínas separadas
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Matriz de la columna: (Fase estacionaria o lecho de la columna). Matriz ó sustancia empaquetada en la columna que está empapada de solvente y que se.
Fase Móvil. Solución tamponada que pasa a través de la columna.
Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna: Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad.
Volumen de la columna. (Geométrico) Volumen total de la matriz ó gel que se empaqueta en una columna cromatográfica.
Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.
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Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gel
PRINCIPIO: Separación en función del tamaño
TIPOS DE MATRIZ: Perlas de polímeros entrecruzados con poros de un tamaño determinado
Dextranos entrecruzados Agarosa Poliacrilamida
APLICACIONES Desalado de proteínas Purificación de proteínas Determinación de la masa molecular de proteínas
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Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gel
PRINCIPIO: Tamaño de partícula y masa
molecular. Mayor masa molecular eluye primero El gel retiene particuas de menor
masa molecular
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En esta práctica se utilizará el matriz-gel dextrano.
FASE ESTACIONARIA
Tipo Peso molecularLímite de
fraccionamiento (daltons)
Agua retenida(g/g gel sec)
Volumen de gel hidratado (ml/g
gel seco)
G10 Hasta 700 1.0 2
G15 Hasta 1500 1.5 3
G25 1000 - 5000 2.5 5
G50 1500 - 30 000 5.0 10
G75 3000-80 000 7.5 12-15
G100 4000 - 150000 10.0 15-20
G150 5000 – 400 000 15.0 20-30
G200 5000 – 800 000 20.0 30-40
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Desventajas: No se pueden obtener fracciones de
proteínas altamente purificadas si se parte de una mezcla compleja de proteínas
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Detección de proteína
Fraccionar extractos proteicos
0.00.20.40.60.81.0
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0.00.20.40.60.81.0
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0.00.20.40.60.81.0
Abso
rbanci
a a
280 n
m (norm
aliz
ado) Alb + 0 hrs
Alb + 12 hrs
Tiempo (minutos)
Alb + 24hrs
Cromatograma
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0.00.20.40.60.81.0
0.00.20.40.60.81.0
0 10 20 30 40 50 60 70
0.00.20.40.60.81.0
Alb + 0 hrs
AB
SO
RB
AN
CIA
A 2
80 n
m (N
OR
MA
LIZ
AD
O)
Alb + 12 hrs
NUMERO DE FRACCION
Alb + 24 hrs
Perfil de elución de extractos proteicos de 0, 12 y 24 h de germinación de maíz
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Ejemplo: Mezcla de proteínas
MW (kDa)
75
440
Mezcla de proteínas
Conalbúmina +
Feritina
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En esta práctica se utilizará el matriz-gel dextrano.
FASE ESTACIONARIA
Tipo Peso molecularLímite de
fraccionamiento (daltons)
Agua retenida(g/g gel sec)
Volumen de gel hidratado (ml/g
gel seco)
G10 Hasta 700 1.0 2
G15 Hasta 1500 1.5 3
G25 1000 - 5000 2.5 5
G50 1500 - 30 000 5.0 10
G75 3000-80 000 7.5 12-15
G100 4000 - 150000 10.0 15-20
G150 5000 – 400 000 15.0 20-30
G200 5000 – 800 000 20.0 30-40
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FerritinaConalbúmina NaCl
Proteína MW (kDa)
Conalbúmina 75
Ferritina 440
NaCl 0.058
Ejemplo:
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-25 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 32522
23
24
25
26
27
28
29
TIEMPO (Time [min.]:)CO
ND
UC
TIV
IDA
D (
Conductivity [m
S/c
m]:)
-0.005
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
A 2
80 n
m (U
V [A
.U.]:)
Ejemplo:
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MASA
TAMAÑO
Å
Å
kDa