Cromberg, Lucas Defelipe, Lucas Mercogliano, Florencia Vazquez, Natalia

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Cromberg, Lucas Defelipe, Lucas Mercogliano, Florencia Vazquez, Natalia. El pasaje de secuencia de DNA a proteína involucra 2 procesos: la transcripción y la traducción. Co-transcripcionalmente se produce el procesamiento del mRNA para evitar su degradación y lograr una traducción eficiente. - PowerPoint PPT Presentation

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Cromberg, LucasCromberg, Lucas

Defelipe, LucasDefelipe, Lucas

Mercogliano, FlorenciaMercogliano, Florencia

Vazquez, NataliaVazquez, Natalia

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El pasaje de secuencia de DNA a proteína involucra 2 procesos: la transcripción y la traducción.

Co-transcripcionalmente se produce el procesamiento del mRNA para evitar su degradación y lograr una traducción eficiente.

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Splicing Alternativo (SA)

Es un proceso de edición sobre el mRNA inmaduro.Permite que a partir de un mismo gen se codifiquen distintas proteínas.Cerca de un 50% de los productos de los genes humanos son susceptibles de SA.

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Elementos cis conservados => GU y AG

Branchpoint => A

Sitio rico en pirimidinas.

Ataque nucleofílico del OH de la ribosa de la A al sitio de splicing 5’.

El OH del extremo del exón 1 realiza ataque nucleofílico al sitio de splicing 3’.

Se libera el intron.

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RNA polimersa II - CTD

Mamíferos 52 repeticiones en tándem

Levaduras 26 repeticiones en tándem (YSPTSPS)nDrosophila 40 repeticiones en tándem

Ser5 inicio de la transcripción

Residuos suceptibles a fosforilación

por kinasa

Ser2 elongación de la transcripción

CTD mutado o truncado genera defectos en el capping, clivaje/poliadenilación y splicing del pre-

ARNm

CTD compuesto por una secuencia aminoacídica altamente conservada YSPTSPS

Sujeto a Sujeto a modificaciones modificaciones como como isomerización y isomerización y glicosilaciones. glicosilaciones.

Funciona Funciona como como plataforma para plataforma para unir al mRNA unir al mRNA los factores de los factores de procesamiento.procesamiento.

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Marco TeóricoMarco Teórico

Modelo cinético: Las reacciones de SA dependen de la procesividad de la Pol II.

Menor procesividad mayor tasa de SA.

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Marco Teórico

Modelo de Reclutamiento: El SA depende de la interacción de la Pol II con diversos factores.

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Hipótesis Hipótesis

La presencia de CTD en RNA pol II inhibe la inclusión de un exón (EDI) en conjunción con la actividad negativa de la proteína SRp20.

Hipótesis suplementaria: La cinética es más influyente sobre la inclusión de EDI que la interacción con los factores.

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Resultados

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Un primer Un primer acercamiento a acercamiento a ∆CTD∆CTD

Minigen “EDI” bajo el Minigen “EDI” bajo el control de distintos control de distintos promotores.promotores.

Vector con RNA pol II Vector con RNA pol II resistente a resistente a αα-amanitina -amanitina y el dominio CTD y el dominio CTD deleteado. deleteado.

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¿Cuál es el efecto de ∆CTD?

El promotor no afecta al splicing alternativo.

∆CTD afecta al splicing alternativo aumentando la inclusión de EDI.

Pero ¿porqué?

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Sistema Tet-OffSistema Tet-Off

La dLa doxiciclina pertenece a la familia de las oxiciclina pertenece a la familia de las tetraciclinas.tetraciclinas.

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Estrategia ExperimentalEstrategia Experimental

La tetraciclina se agrega desde el principio para evitar la expresión de

los minigenes.

La α-amanitina inhibe la maquinaria transcripcional endógena.

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Sistema Tet-off “normal”Sistema Tet-off “normal”

La proteína quimérica La proteína quimérica formada por el formada por el plásmido tTA-VP16 no plásmido tTA-VP16 no puede activar la puede activar la transcripción en transcripción en presencia de RNA Pol presencia de RNA Pol II II ΔΔCTD.CTD.

Entonces ¿Qué se Entonces ¿Qué se utilizó?utilizó?

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Sistema Tet-off ModificadoSistema Tet-off Modificado

La proteína surgida del La proteína surgida del plásmido tTA-Sp1 puede plásmido tTA-Sp1 puede activar la transcripción de activar la transcripción de la luciferasa al utilizar la la luciferasa al utilizar la RNA Pol II RNA Pol II ΔΔCTD.CTD.

Nótese que Sp1 es un Nótese que Sp1 es un activador débil de la activador débil de la transcripción mientras que transcripción mientras que VP16 es un activador VP16 es un activador fuerte.fuerte.

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¿Que se cotransfectó?¿Que se cotransfectó?

Células Hep3B.Células Hep3B.El par de plásmidos Tet-Off, uno El par de plásmidos Tet-Off, uno expresando la proteína quimérica (tTA-expresando la proteína quimérica (tTA-Sp1) y otro con el minigen inducible por Sp1) y otro con el minigen inducible por tetraciclina.tetraciclina.Otro plásmido expresando las distintas Otro plásmido expresando las distintas variantes de la subunidad mayor de la variantes de la subunidad mayor de la RNA Pol II: WTRNA Pol II: WTSS, WT, WTResRes o o ΔΔCTD.CTD.Las células se analizaron luego de 48hs.Las células se analizaron luego de 48hs.

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¿Afecta el CTD a la inclusión de ¿Afecta el CTD a la inclusión de EDI?EDI?

Con ΔCTD la inclusión de EDI aumenta varias veces. (Ver calle 6).En las Calles 1, 3 y 5 se observa el conjunto de los efectos de la pol endógena y la agregada con el plásmido.Únicamente en las calles 2, 4 y 6 se observa el efecto provocado por la pol agregada.

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El efecto de la El efecto de la α-amanitina

La α-amanitina reduce el nivel de trascripción de pUHC-EDA en un 90% cuando se utiliza Pol WTS.

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¿Afecta la falta de CTD al proceso ¿Afecta la falta de CTD al proceso de splicing en general?de splicing en general?

La eficiencia del La eficiencia del proceso general proceso general de splicing no es de splicing no es afectada por la afectada por la falta de CTD en falta de CTD en la RNA Pol II.la RNA Pol II.

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¿Las modificaciones del transcripto ¿Las modificaciones del transcripto primario influyen en el splicing primario influyen en el splicing

alternativo?alternativo?

El efecto de la El efecto de la falta de CTD en la falta de CTD en la RNA Pol II es RNA Pol II es independiente del independiente del procesamiento de procesamiento de mRNA (Capping y mRNA (Capping y 3’ end processing).3’ end processing).

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Estructura del CTDEstructura del CTDARN pol II composición del CTD = (YSPTSPS)nARN pol II composición del CTD = (YSPTSPS)n

n= 26 en levadurasn= 26 en levaduras

n= 40 en Drosophilan= 40 en Drosophila

n= 52 en mamíferosn= 52 en mamíferos

Sonda anticuerpo específico contra el CTD se pueden Sonda anticuerpo específico contra el CTD se pueden imnuprecipitar 3 formasimnuprecipitar 3 formas

II0= fosforilada en residuos serinaII0= fosforilada en residuos serina

IIA= sin fosforilarIIA= sin fosforilar

IIB= sin cola por remoción proteolíticaIIB= sin cola por remoción proteolítica

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Composición del CTDComposición del CTD

N-terminal N-terminal heptadas 1-25, repeticiones heptadas 1-25, repeticiones consensoconsenso

C-terminal C-terminal heptadas 26-52, degeneradasheptadas 26-52, degeneradas

Motivo C-Terminal (C-ter) de 10 residuos Motivo C-Terminal (C-ter) de 10 residuos (ISPDDSDEEN)(ISPDDSDEEN) estabilidad CTD y factor de estabilidad CTD y factor de procesamiento eficiente del ARNmprocesamiento eficiente del ARNm

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Células Hep3BCélulas Hep3B

Minigen inducible (pUHC-EDA) + Vectores para la expresión de Minigen inducible (pUHC-EDA) + Vectores para la expresión de la subunidad larga del RNA pol II (WT res o la subunidad larga del RNA pol II (WT res o ∆∆CTD)CTD) + N ó C-+ N ó C-

terminal (+/- C-ter)terminal (+/- C-ter)

Western Blot Sonda: anticuerpo contra el epitope B10 del Western Blot Sonda: anticuerpo contra el epitope B10 del CTDCTD

¿Cómo influye su composición en la la estabilidad del CTD?¿Cómo influye su composición en la la estabilidad del CTD?

Esquema de Trabajo

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Western BlotWestern Blot

** Mutantes C-ter - se degradan a la forma IIB (180 kDa) Mutantes C-ter - se degradan a la forma IIB (180 kDa)

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RT-PCR radioactiva

La composición del CTD no es crucial para la normal inclusión de EDI

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Longitud de CTD en el splicingLongitud de CTD en el splicing

Células Hep3BCélulas Hep3B

Minigen inducible (pUHC-EDA) + Vectores para la expresión de Minigen inducible (pUHC-EDA) + Vectores para la expresión de la subunidad larga del RNA pol II (WT res o la subunidad larga del RNA pol II (WT res o ∆∆CTD)CTD) + CTD + CTD

sintéticos de distinta longitudsintéticos de distinta longitud

Western Blot Sonda: anticuerpo contra el epitope B10 Western Blot Sonda: anticuerpo contra el epitope B10 del CTDdel CTD

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Splicing de EDISplicing de EDI

CTD n=9 => aumento en la CTD n=9 => aumento en la inclusión de EDI (menor que pol II inclusión de EDI (menor que pol II ∆CTD)∆CTD)

CTD n=12 => efecto intermedio CTD n=12 => efecto intermedio en la inclusión de EDIen la inclusión de EDI

CTD n=19 => reestablece la CTD n=19 => reestablece la normal inclusión de EDInormal inclusión de EDI

Se necesita al menos, un tamaño de 19 repeticiones

para el normal splicing de EDI

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SRp20 y SF2/ASF son miembros de la familia de proteínas SR . Son factores de splicing.

SRp20 es la única proteína SR que inhibe la inclusión de EDI.

SF2/ASF provoca un aumento de la taza de inclusión de EDI

¿Cuál es la relación de CTD con los factores de splicing?

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Knock Down

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Knock Down de SF2/ASF y de SRp20.

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Knock Down de SF2/ASF reduce la inclusión de EDI, independientemente de CTD.

Knock Down de SRp20 aumenta la inclusión de EDI dependiente de CTD.

CTD es necesario para el funcionamiento de los factores de splicing.

¿Qué pasó con EDI?

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Existen sitios fuertes y débiles de splicing.

Dependiendo de la tasa de transcripción de la RNA pol II estos sitios pueden ser leídos o no.

En el splicing alternativo uno de los sitios es débil y no es leído por una RNA pol II con alta tasa de transcripción.

Una RNA pol II mutante (C4), con baja tasa de transcripción, ve el sitio débil de splicing y por lo tanto incluye a EDI en el mRNA maduro.

Volviendo al Marco Teórico

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Utilización de C4 para observar la inclusión/exclusión de EDI.

C4 y DRB tienen un efecto en la inclusión de EDI mucho menor que siRNA de SRp20.

Esto puede deberse a que es necesario CTD para el funcionamiento de los factores de splicing.

¿Que pasa si transcribo EDI con C4?

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El reclutamiento de SRp20 no determina completamente el efecto inhibitorio de CTD en la inclusión de EDI.

96 hs. después de la transfección, los valores de SRp20 van a estar más reducidos.

Luego de 96 horas ∆CTD pol II y siSRp20 aumentaron la inclusión de EDI a niveles comparables.

El efecto de ∆CTD pol II sobre el splicing de EDI puede atribuirse a la imposibilidad de mediar la inhibición de SRp20.

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El knockdown de SRp20 El knockdown de SRp20 en en CTD pol II CTD pol II NONO afecta afecta los niveles de inclusión los niveles de inclusión de EDI.de EDI.

SRp20 es independiente SRp20 es independiente del promotor.del promotor.

Células Hep3B cotransfectadas con EDI bajo el control de distintos promotores y con vectores expresando distintas variantes de pol II.

La inclusión de EDI es independiente del promotor, pero es dependiente del CTD de la pol II.

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Se utilizó un minigen con Se utilizó un minigen con una deleción de 9 una deleción de 9 nucleótidos en el Exon nucleótidos en el Exon Splicing Enhancer (ESE). Al Splicing Enhancer (ESE). Al estar mutado este sitio estar mutado este sitio SF2/ASF se une con mucha SF2/ASF se une con mucha menos afinidad al exón menos afinidad al exón disminuyendo su nivel de disminuyendo su nivel de inclusión.inclusión.Se cotransfectaron Hep3B Se cotransfectaron Hep3B con pUHC-EDA con pUHC-EDA ESE y ESE y vectores conteniendo vectores conteniendo variantes para la variantes para la subunidad grande de la pol subunidad grande de la pol II. Se agregaron siRNAs II. Se agregaron siRNAs contra proteínas SR o contra proteínas SR o contra luciferasa (control contra luciferasa (control negativo).negativo).Estos experimentos se Estos experimentos se realizaron en ausencia o realizaron en ausencia o presencia de SF2/ASF. presencia de SF2/ASF.

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Con el minigen WTCon el minigen WTres res el el knockdown de SRp20 knockdown de SRp20 aumenta la inclusión de aumenta la inclusión de EDI. Con la polimerasa EDI. Con la polimerasa lenta (C4) este efecto lenta (C4) este efecto persiste.persiste.Con el CTD deletado no Con el CTD deletado no se observa diferencia se observa diferencia entre el control y la entre el control y la calle con el siSRp20. calle con el siSRp20.

SRp20 necesita la presencia de CTD para producir la exclusión de EDI.

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La cotransfección de un vector La cotransfección de un vector que expresa SF2/ASF aumenta el que expresa SF2/ASF aumenta el nivel basal de la proporción nivel basal de la proporción EDIEDI++/EDI/EDI--. .

En la WT la presencia de siSRp20 En la WT la presencia de siSRp20 aumenta la inclusión de EDI.aumenta la inclusión de EDI.

En cambio, cuando la pol II está En cambio, cuando la pol II está mutada no se observa variación.mutada no se observa variación.

siLuc

siSRp20

Estos resultados confirman que el efecto de SRp20 depende de la presencia del CTD y no del aumento del nivel basal por la utilización de una pol II mutante.

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DiscusiónDiscusión

La transcripción mediada por la La transcripción mediada por la CTD pol II aumenta la inclusión CTD pol II aumenta la inclusión de un cassette alternativo (EDI) sin afectar la eficiencia del de un cassette alternativo (EDI) sin afectar la eficiencia del splicing.splicing.

El CTD influencia el splicing alternativo y es independiente del El CTD influencia el splicing alternativo y es independiente del capping y del procesamiento 3’.capping y del procesamiento 3’.

Ambas mitades del CTD pueden restituir el efecto sobre el splicing Ambas mitades del CTD pueden restituir el efecto sobre el splicing alternativo en una alternativo en una CTD pol II.CTD pol II.

Para lograr un CTD activo y funcional se necesitan 19 repeticiones Para lograr un CTD activo y funcional se necesitan 19 repeticiones de 7 aminoácidos, siendo el factor de importancia la cantidad de de 7 aminoácidos, siendo el factor de importancia la cantidad de repeticiones y no la composición.repeticiones y no la composición.

22 repeticiones son necesarias para obtener un nivel de splicing 22 repeticiones son necesarias para obtener un nivel de splicing similar al de la polimerasa WT.similar al de la polimerasa WT.

Para un splicing efectivo debe estar presente el exón enhancer del Para un splicing efectivo debe estar presente el exón enhancer del splicing (ESE).splicing (ESE).

La proteína SF2/ASF (perteneciente a la familia SR) promueve la La proteína SF2/ASF (perteneciente a la familia SR) promueve la inclusión de EDI, pero es independiente del CTD.inclusión de EDI, pero es independiente del CTD.

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DiscusiónDiscusión

La proteína SRp20 (de la familia SR también) inhibe la inclusión de La proteína SRp20 (de la familia SR también) inhibe la inclusión de EDI, pero necesita la presencia de CTD.EDI, pero necesita la presencia de CTD.

El mecanismo de inhibición mediado por SRp20 no es conocido, El mecanismo de inhibición mediado por SRp20 no es conocido, sin embargo se proponen 2 hipótesis: puede que exista una sin embargo se proponen 2 hipótesis: puede que exista una interacción con EDI e impida su reconocimiento o puede ser que interacción con EDI e impida su reconocimiento o puede ser que produzca la exclusión interactuando con los exones vecinos.produzca la exclusión interactuando con los exones vecinos.

Se realizaron experimentos de doble híbrido y Se realizaron experimentos de doble híbrido y coinmunoprecipitación para comprender la interacción entre CTD coinmunoprecipitación para comprender la interacción entre CTD y SRp20 pero no fueron exitosos, ya que dicha interacción física y SRp20 pero no fueron exitosos, ya que dicha interacción física no se pudo establecer. Estos resultados sugieren que de existir la no se pudo establecer. Estos resultados sugieren que de existir la interacción fisíca debe ser muy débil, muy dinámica o indirecta.interacción fisíca debe ser muy débil, muy dinámica o indirecta.

Tanto el efecto de inhibición o de activación del splicing Tanto el efecto de inhibición o de activación del splicing alternativo son independientes de los promotores utilizados en las alternativo son independientes de los promotores utilizados en las construcciones. Evidencia que fortalece la teoría de que el efecto construcciones. Evidencia que fortalece la teoría de que el efecto del CTD sobre el splicing alternativo depende más del del CTD sobre el splicing alternativo depende más del reclutamiento que de los cambios en la elongación.reclutamiento que de los cambios en la elongación.