cuestionario de bacterias
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7/23/2019 cuestionario de bacterias
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Inhibicin de la Actividad de la Ureasa y el Succinato DeshidrogenasaBioqumica
PRCTICA DE LABORATORIO N 03
INHIBICIN DE LA ACTIVIDAD DE LA UREASA ( E.C. 3.5.1.5) YDEL SUCCINATO DESHIDROGENASA (E.C. 1.3.99.1)
I. INTRODUCCIN.En la presente experiencia de prctica investigaremos la inhibicinde la actividad en!imtica por productos qumicos espec"cos# losllamados Inhibidores$ El inhibidor espec"co usado ser bisul%atode sodio y el malonato$ Se conoce que el bisul"to se combina conla ureasa inhibiendo la actividad en!imtica de modo reversible$
Una mol&cula inhibidora a%ecta la actividad en!imtica de dosmodos' por Inhibicin competitiva e inhibicin no competitiva$ (ainhibicin competitiva tiene lugar cuando una mol&cula que es
estructuralmente similar al sustrato para una reaccin particular#compite por una posicin en el sitio activo de la en!ima$ Esto haceque la en!ima no est& disponible al sustrato$ (a inhibicincompetitiva puede invertirse si se eleva la concentracin delsustrato a niveles su"cientemente altos mientras la concentracindel inhibidor se mantiene constante$
En la inhibicin no competitiva# el inhibidor se une a la en!ima enun sitio que no es el sitio activo$ Siendo as# cambia la naturale!ade la en!ima para que pierda sus propiedades catali!adoras$ Estosucede de dos maneras$ El inhibidor no competitivo bloquea%sicamente el acceso al sitio activo# o causa un cambiocon%ormacional en la protena# inactivndola$ )orque las mol&culasdel sustrato no pueden invertir la posicin de un inhibidor nocompetitivo y aumentar la concentracin del sustrato no invertirla inhibicin$
El ob*etivo de la presente experiencia es demostrar el e%ectoinhibidor de algunas sustancias sobre la velocidad de reaccin
en!imtica# utili!ando para ello bisul"to de sodio y malonato#como inhibidores de la ureasa y succionato deshidrogenasa#respectivamente$
II. MATERIALES. +radillas$ Ba,o -ara a ./01$ 2ubos de ensayo 34x 354 mm$
Ingeniera Agroindustrial )gina 3
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Inhibicin de la Actividad de la Ureasa y el Succinato DeshidrogenasaBioqumica
2ubos de ensayo 3. x 366 mm$ 7uego de pipetas 36# 4# 5 y 3 ml$
Espectro%otmetro$ 8otocolormetro$ Bu9er %os%ato de
sodio 6$3- p: /$ 5$;
dicloro%enolindo%enol6$65
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III. PROCEDIMIENTO.
)repare el siguiente esquema de tubos y siga las indicaciones quese muestra a continuacin'
A. INHIBICIN DE UREASA.1. SISTEMA DE INCUBACIN.
COMPONENTES (L)
Y PROCESO
T
T
T
T
Bu9er 2ris
6$64 - ):/$6
5
3
>>
3
=rea 6$3 -en bu9er2ris 6$64 -p: /$6
5
5
.
5
Bisul"to deSodio 6$3 -
>>
3
3
3
)re Incubar a ./01 por 4 minutos$ Ureasa 6$3<
6
6
6
>>
Incubar a ./01 por 34 minutos$
A,adir dos gotas de :g1l5 a cada tubo paradetener la reaccin$
Ureasa 6$3< >>
>>
>>
6
-e!clar# preparar y seguir con el siguientesistema$
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5$ Evaluacin del e%ecto inhibidor del bisul"to de sodio'1uanti"cacin del producto %ormado por colorimetra
?@eaccin de essler$ 2rans%erir 6$3 m( de cada uno de los tubos de ensayode la parte 3 a sus correspondientes en la parte 5$
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COMPONENTE
S
B
I
II
II
IV
2UBC3?)arte3
>
6
>>>
>>
>>>>
2UBC5?)arte5
>
>>
6$
>>
>>>>
2UBC
.?)arte
.
>
>>
>>>
6
>>>>
2UBC?)arte
>
>>
>>>
>>
6$
Aguadestilada
.
.$
.
.$
@eactivodeessler
6
6
6$
6
6$
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De*ar en reposo por 4 minutos$ (eer en %otocolormetro con"ltro verde o bien en espectro%otmetro a 46 nn$ @estar lalectura del tubo de las lecturas de los otros tubos$ Determinarla actividad en!imtica en cada uno de los tubos de incubacin$)ara lo cual deber multiplicar la lectura de cada tubo por un%actor'
!R ./ mg :.F ml# para espectro%otmetro y 6$66; mg :. F ml# para %otocolormetro$
B. INHIBICIN DE SUCCINATO DESHIDROGENASA.1. SISTEMAS DE INCUBACIN Y EVALUACIN DEL E!ECTO
INHIBIDOR DEL MALONATO.
COMPONENTES (")
TUBO1
TUBO#
TUBO 3
TUBO $
TUBO 5
Bu9er %os%ato deSodio 6$3 - p: /$
3$4
3$5
3$6
6$G
6$.
5$;dicloro%enolindo%enol
3$6
3$6
3$6
3$6
3$6
Succinato 6$4 - >>>>
>>>>
>>>>
>>>>
6$/
-alonato 6$3 - >>>>
>>>>
:omogeni!adoheptico
>>>>
6$4
6$4
6$4
6$4
-e!clar y de*ar en reposo a temperatura ambiente$ Cbservary anotar los resultados segHn el color de cada un de los tubos$
IV. CUESTIONARIO.
1. %&' * *+,-*+* / -24* * "4 4,--4*+6-7,-48
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MODI!ICADORES DE LA ACTIVIDAD ENIMTICA
T-/:
4) T*/*4,'4' (as en!imas son inactivadas por e calor a
temperaturas de 461>;61 inactivan rpidamente la mayorparte de las en!imas$ Esta inactivaron es irreversible# pues alen%riar no se obtiene actividad otra ve!$ Esto explica que casitodos los organismos resulten muertos a una exposicin atemperatura elevada' Sus en!imas se inactivan y resultanincapaces de reanudar su metabolismo$
(as En!imas no son inactivadas por la congelacinJ lasreacciones que producen tienen a lugar muy lentamente atemperaturas ba*as# o se detienen# pero la actividad cataltica
reaparece si la temperatura vuelve a su estado normal
;) A-*6:(as en!imas son sensibles a los cambios de ): o seade acide! o alcalinidad en el medio$
(a mayor parte de en!imas intracelulares tienen ): ptimoscerca de la neutralidad# por lo que no actHan en medioscidosni alcalinos# los cidos y bases en&rgicos las inactivanirreversiblemente$
) C+*+,4-
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&l por acceder al centro activo# pero que no posee ningHnenlace susceptible de ser atacado por el en!ima$
.@ %&' *?*, ,-*+* *" 4'*+, * "4 +*+,4-
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comple*o en!ima>sustrato ?ES$ En la catlisis# este comple*o serompe para liberar el producto ?) y la en!ima ?E$ El inhibidor?I puede unirse tanto a ?E como a ?ES con las constantes dedisociacinKio KiN# respectivamente
.@ E-,* -*+,**+,* 4"+ ,-/ * *"4-
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Este tipo de inhibicin es el de la inhibicin de la succinatodeshidrogenasa# en!ima que tiene por sustrato el cidosuccnico# por otras sustancias estructuralmente parecidas alcido succnico# como el cido malnico# el cido oxlico# y elcido glutrico
10.@ %D* F'* ?4,* */*+* *" 4 * -+-;--
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11. %E+ F'* -'+,4+-4 /'** *" ',4, * '+4*+6-4 4,'4 -+-;- /*,-,- * "4 -4*+6-48
El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la mismaen!ima al mismo tiempo# como se muestra en la "gura de laderecha$ Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tienea"nidad por el sitio activo de una en!ima en el que tambi&n seune el sustratoJ el sustrato y el inhibidor compitenpara el acceso al sitio activo de la en!ima$ Este tipode inhibicin se puede superar con concentracionessu"cientemente altas del sustrato# es decir# de*ando%uera de competicin al inhibidor$ (os inhibidorescompetitivos son a menudo similares en estructura
al sustrato$
1#.@ %&' ,-/ * -+-;- * *";-'"2, * - 0.1M8
Es un inhibidor no competitivo
13.@ %&' ,-/ * -+-;- * *" 4"+4, 0.1M8
Es un inhibidor competitivo
1$. %&'* * *+,-*+* / -+-;- +/*,-,-8
I+-;--
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2ienen a"nidades id&nticas por ?E y ?ES ?Ki KiN$ (ainhibicin no competitiva no cambia la Km?es decir# no a%ecta ala unin del sustrato pero disminuye la Vmax?es decir# la unindel inhibidor obstaculi!a la catlisis$
15. %&' *?*, ,-*+* *" 4'*+, * "4 +*+,4-
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1.@P&'* /4 *- */*, 4 "4 */*-2-4 *
" -+-;-* + /*,-,-.
(as mol&culas del sustrato se unen a un sitio particular en la
super"cie de la en!ima# denominada -,- 4,-# donde tienelugar la catlisis$ (a estructura tridimensional de este sitioactivo# donde solo puede entrar un determinado sustrato ?nisiquiera sus ismeros es lo que determina la especi"cidad delas en!imas$ El acoplamiento es tal que E$ 8isher ?3GQenunci' "el sustrato se adapta al centro activo ocataltico de una enzima como una llave a una
cerradura"
1. %E-,* -*+,**+,* 4"+ ,-/ * --"-,' *+,*"4 *,','4 F'-4 *" -+-;- + /*,-,- > "4*" ',4, +4,'4" * "4 *+6-48 %J,4 * '+4+--
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1.@ %C
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2ubo
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blanco
Si hubo reaccinpor ausencia de
inhibidor
2ubo65
blanco
o hubo reaccinpor inhibidor
2ubo6.
Blanco
Si hubo reaccinpor mayor
concentracin desustrato
2ubo6
Blanco
o hubo reaccinpor inhibidor
Al anali!ar los resultados utili!ando el m&todo de colorimetra
observamos di%erencia de color en las muestras 3 y .$ En elprimer caso el color indica %ormacin de producto debido a queno hay presencia de inhibidorJ en el otro caso tambi&n seproduce reaccin pues al aumentar la cantidad de sustrato nose despla!a al inhibidor# solo se disminuye la velocidad dereaccin$
(os tubos 5 y presentan el mismo color que el tubo blancodebido a que en el segundo tubo el inhibidor bloquea lareaccin impidiendo as la %ormacin de productoJ en el tubo nohay %ormacin de producto debido a que no hay presencia deen!ima durante la reaccin$
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INHIBICION DE SUCCINATO DESHIDROGENASA
TUBO
EKPLICACIN
2ubo
63
Solo presenta el color del indicador nohay variacin
2ubo6
5
Solo observa el color del indicador nohay cambio$
2ubo6.
Este tubo presenta sustrato# en!ima yel indicador y se observa cambiode color
2ubo6
Este tubo presenta sustrato# en!ima eindicador pero el color no varia ya quese presenta un inhibidor que bloquea yhace que el color se mantenga igual alindicador
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2ubo64
Este tubo presenta sustrato en!ima eindicador pero tambi&n presenta elinhibidor pero es muy ba*o compradocon el Succinato y no existe unbloqueo por eso el color varia
)odemos observar cambio de color en las muestras . y 4' En elprimer caso la muestra no contiene malonato ?inhibidor# por lo
tanto se ha producido reaccinJ en la segunda muestra seincrement la concentracin de sustrato y se produce Ku*o de e>que son absorbidos por el indicador# el inhibidor es despla!adodebido a que es competitivo$
En los tubos 3#5 y las muestras mantienen el color a!ul delindicador lo cual indica que no se produ*o reaccin debido a que enel tubo 3 no hay sustrato# el segundo tubo no contiene en!ima yen el tubo la reaccin es bloqueada por la presencia delinhibidor$
V. ANEKOS.
A. INHIBICIN DE UREASA.
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!-. #S* ,4+2-< 0.1 L *' * " ,'; * "4/4,* 1 4 '*/+-*+,* *+ "4
!-. 1S-,*4
D* I+';4-
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!-. S* "* 44* *"H*+-64H*/7,- / * *",'; 3 > 5 4;-4+ *
!-.5S-,*4 * -+';4- *4"'4-