CUESTIONARIO

1.- Menciona la importancia de los hongos en la naturaleza.Existen entre 200 mil a 2 millones de especies de hongos, y slo de 150 a 200 son parsitos de plantas, animales y humanos; son parte de los degradadores primarios de la materia, est a su cargo la transformacin de la materia muerta que se convierte en nitrgeno que se fija al suelo fertilizndolo, funcin a la que se unen priones, virus, bacterias y parsitos; adems, su presencia entre los seres vivos induce relaciones simbiticas, mutuantes, parasitarias, de enorme trascendencia en lo vida terrestre, los hace contribuir en la industria alimentaria; en la medicina; gracias a ellos disfrutamos de vino, cerveza, quesos, antibiticos; su parasitismo en vegetales ha determinado hechos histricos y migratorios de la poblacin humana trascendentes.2.- Menciona cuatro medios de cultivo para hongos.Para el aislamiento primario de los hongos, se utilizan diversos medios de cultivo. Estos medios hay que seleccionarlos en funcin del hongo que se sospeche y del tipo de muestra.Los medios de cultivo se pueden utilizar en tubos cerrados con tapn de rosca o en placas de petri. La gran superficie de estas ltimas facilita el aislamiento y la dilucin de sustancias inhibitorias en las muestras. Es importante que el medio no se deseque por lo que el espesor de las mismas debe ser por lo menos de 25 mm, aproximadamente 35-40 mL de medio. Las placas se contaminan con facilidad durante la incubacin por lo que es aconsejable sellarlas con cinta adhesiva. Los medios en tubo tienen la ventaja de que no se deshidratan y se contaminan menos, pero en cambio tienen menos superficie.Si la muestra es de una zona contaminada se deben incluir medios que contengan Cloranfenicol y Cicloheximida. El primero inhibe los contaminantes bacterianos y el segundo inhibe el crecimiento de hongos saprofitos. Hay algunas especies patgenas que pueden ser inhibidas por ambos, por esta razn es importante usar medios con y sin agentes inhibidores. Las muestras de zonas estriles pueden inocularse en medios sin sustancias inhibitorias.La temperatura de incubacin debe ser seleccionada teniendo en cuenta el tipo de hongo, en general, los medios deben incubarse a 25C y a 37C durante 4 semanas antes de considerarse como negativos. Si se emplean tubos con tapn de rosca deben estar flojos para permitir la entrada de aire.Medios ms utilizados1. Agar Dextrosado de Saboureaud con Cicloheximida y Cloranfenicol: se utiliza para el aislamiento e identificacin de dermatfitos y Cndidas.1. Agar Dextrosado con Cloranfenicol sin Cicloheximida: se utiliza para el aislamiento e identificacin de patgenos ambientales y oportunistas.1. Agar de harina de maz (Corn Meal Agar):2. Suplementado con Tween 80: para diferenciar distintas especies de Cndida y para realizar subcultivos ya que estimula la esporulacin de hongos miceliales.2. Suplementado con 10 gramos de Glucosa: para diferenciar Trichophyton1. Agar de Urea: se utiliza para diferenciar entre levaduras e identificar diferentes especies de Trichophyton3.- Qu es un microcultivo? El microcultivo es el procedimiento idneo para la identificacin de estructuras fngicas, pues te permite visualizar al microscopio el micelio en su conjunto no solo una parte del mismo, como ocurre con el mtodo de disociacin. Permite la observacin de las estructuras microscpicas de hongos filamentosos que se distinguen con facilidad sin distorsin, alteracin o rompimiento de las mismas. Esto pasa cuando el hongo se desarrolla directamente bajo el portaobjetos. Forma parte de las pruebas para identificar el gnero y la especie de los hongos. Los microcultivos permiten hacer el seguimiento del desarrollo de hongos en estudio.4.- Describe cuatro tcnicas de tincin para hongos.Tinciones simples Tincin Lactofenol azul de algodnMtodo utilizado rutinariamente para la realizacin de preparaciones microscpicas de hongos filamentosos.Cada uno de los constituyentes del colorantes lactofenol azul de algodn cumple una funcin determinada.-El fenol utilizado sirve como funguicida-la glicerina permite tener una preparacin semipermanente.-El azul de algodn tie el exterior de la pared de los hongos.-El cido alcohol lctico acta como agente aclarante.Hongos filamentosos; Aspergillux, Microsporum, Mucor , Pelicilium.

Tincin Con Naranja De Acridina Transferir una gota del cultivo a un portaobjetos limpio y desengrasado, dejar secar al aire. Fijar con etanol al 100%, cubriendo el frotis durante 5 min. Eliminar el etanol y colocar 100 ml de naranja de acridina durante 3min.Eliminar el exceso del colorante con etanol al 70%. Observar en un microscopio de epifluorescencia con un filtro azul, emisin a 490 nm. Tinciones DiferencialesTincin De Ziehl-Neelsen (cido alcohol resistente) es utilizado para colorear aquellos microorganismos difciles de colorear con colorantes bsicos porque se muestran impermeables a la coloracin. Algunas bacterias poseen, en su pared celular, ciertos cidos grasos de cadena larga que les confiere la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol cido, tras haber sido teidas con colorantes bsicos. Esta tincin requiere un calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene la capa cerosa formada por cido miclico.

Tincin de Gram Colocar una gotita de cristal violeta sobre el frotis, dejar interactuar 1 min. Enjuagar con agua. Colocar una gotita de lugol durante 1 min. Enjuagar con agua. Colocar dos gotitas de etanol-acetona y enjuagar con agua. Colocar una gotita de safranina, 30 seg., y enjuagar con agua. dejar secar y observar a 10X, 40X y 100X a inmersin. Dibujar y colorear.

5.- Esquematiza las diferentes estructuras de un micelio en la reproduccin sexual y asexual.El esquema taxonmico tradicional empleado para la clasificacin de los hongos los ubica en cuatro divisiones, basndose fundamentalmente en variaciones en la reproduccin sexual.DIVISINESPORAS ASEXUALESESPORAS SEXUALES MICELIOEJEMPLOS

Zygomycota (Zigomicetos)Endgenas (en sacos) Oosporas ZigosporasCenocticoRhizopus, Mucor

Ascomycota (Ascomicetos)

Exgenas (en las puntas o lados de las hifas) AscosporasSeptadoPenicillum, Aspergillus, Levaduras

Basidiomycota (Bbasidiomicetos)

Exgenas (en las puntas o lados de las hifas)BasidiosporasSeptadoSetasRoyasTizones

Deuteromycota (Deuteromicetos) (Hongos inperfectos)Exgenas (en las puntas o lados de las hifas)-SeptadoLa mayora de los patgenos de humanos y animales

6.- Plantea una actividad biotecnolgica donde apliques esta prctica.Las tinciones de hongos son de gran importancia ya que sirve para realizar diagnosticos microscpicos de pacientes con infecciones fngicas como:HistopatologaLa demostracin de hongos en un tejido es confirmatorio de infeccin fngica. En 2008, las definiciones de la EORTC/MSG para las infecciones fngicas incluan este hecho para las infecciones probadas.Hongos filamentosos: examen microscpico directo, histopatolgico o citopatolgico de una muestra obtenida mediante aspiracin con aguja o biopsia en la que se visualicen hifas o formas levaduriformes melanizadas acompaadas de evidencia de dao tisular.Levaduras: examen microscpico directo, histopatolgico o citopatolgico de una muestra obtenida mediante aspiracin con aguja o biopsia de una zona estril (excluidas las membranas mucosas) en la que se visualicen levaduras- ej. Levaduras encapsuladas que sugierenCryptococcusspp o hifas y seudohifas que sugierenCandida.Manipulacin de las muestras para minimizar retrasos en el diagnsticoEl BSMM Standards of Care [ii] establece dos estndares para la histopatologa. El primero es: Todos los tejidos obtenidos de pacientes inmunocomprometidos (incluyendo los tratados con corticosteroides) y de otros pacientes con sospecha de infeccin fngica, deben ser analizados mediante tinciones especficas para hongos como el cido perydico de Schiff, tincin de plata o fluorescentes, en paralelo con las tinciones habituales. La biopsia y la reseccin quirrgica de tejidos afectados son maniobras definitivas en el diagnstico de la infeccin fngica. La rapidez de la manipulacin de la muestra es crtica para establecer un diagnstico temprano, y por tanto, la utilizacin de la tincin de hematoxilina-eosina (H&E) sin un juicio previo de la necesidad de emplear tinciones especficas para hongos puede significar un retraso inaceptable para el paciente. Es muy importante que exista una identificacin clara en todos los volantes de peticin, de que el paciente es inmunodeprimido.Tinciones estndarLas tinciones habituales para hongos son la plata metenamina de Grocott (GMS) el cido peridico de Schiff (PAS). La tincin GMS es ms sensible que el PAS pero tiene el inconveniente de que tie las clulas inflamatorias (lisososmas) y la reticulina del tejido adems de los hongos lo que puede causar problemas de identificacin de estructuras. La tincin de PAS tiene la ventaja de que el tejido adyacente al hongo se observa mejor, aunque esto tambin se puede conseguir haciendo una tincin GMS y una contra tincin con H&E. Hay que incluir buenas secciones control ya que algunos hongos, como los Mucorales, pueden requerir ms tiempo de tincin y otros, por el contrario, estar sobre teidos.En la H&E, los hongos tiene el citoplasma rosa, el ncleo azul y la pared incolora. Las tinciones de Gram puede teir aCandidaspp. De azul, consistentemente como un microorganismo Gram positivo. Con una tincin cido alcohol resistente,BlastomyceseHistoplasmapueden teirse de rojo.Sospechando una infeccin fngica histolgicamenteEn ocasiones una infeccin fngica no se sospecha clnicamente, y el patlogo pasa a ser la persona encargada de hacerlo. A veces, las hifas u otras estructuras, como las esfrulas, son fcilmente visibles, pero si las hifas son escasas y las levaduras pequeas se pueden pasar por alto con facilidad. La respuesta del husped a la infeccin fngica es muy variable, y depende, en parte, de si el paciente es inmunocomprometido o no. No se suele ver reaccin celular en caso de inmunocompromiso, especialmente en la neumona porPneumocystiso en la criptococosis diseminada.Los puntos clave para el diagnstico de una infeccin fngica son: Reacciones granulomatosas mixtas, que se ven en las infecciones causadas por levaduras y hongos filamentosos; En la histoplasmosis y la coccidioidomicosis se ven granulomas con necrosis caseosa mimetizando infecciones por micobacterias; En la aspergilosis y la mucormicosis se ve invasin vascular, trombosis, infarto y hemorragia secundaria especialmente en pacientes neutropnicos; En las infecciones cutneas se ve hiperplasia epitelial con inflamacin mixta y abscesos dentro de la epidermis.

REFERENCIAS Laboratory Exercices in Microbiology, R. A. Pollack. 2002 John Wiley & sons, Inc.

J.G. y N. Sherman.1992. Microbiology a Laboratory Manual 3ra edicin Cappuccino Benjamin/Cummings Inc.

A.E. Greenberg, L.S. Clesceri y A. D. Eaton 1992. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater 18th edicin.