Técnicas de formulación y estabilización de biomateriales

CUESTIONARIO Y PROBLEMAS- Problema 1 En la Figura 1 se observan los termogramas de embriones vegetales almacenados a distintas humedades relativas (R.H.), obtenidos por calentamiento (10ºC/min) en el rango -120ºC a 90ºC, antes y después de realizar una extracción lipídica con solvente. Además, se incluye el termograma del extracto lipídico obtenido luego de la evaporación del solvente. a) Analice los termogramas b) ¿Qué conclusiones obtiene?

° C - 120 - 100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80

^exo

Defatted embryos

RH = 75 %

RH= 11%

Extracted lipids

mW 5

Figura 1

Matiacevich y col, 2006 Problema 2 La transición endotérmica observada en la Figura 1 (flecha, a 80ºC a 75%HR), desaparece con el re-scan de la muestra. Se analizó esta transición térmica (entalpía y temperatura) a distintas HR para embriones de quinoa y los datos se muestran en la Figura 2. a) ¿A qué evento se podría atribuir la transición observada? ¿Cómo lo confirmaría? b) Discuta los resultados encontrados para entalpía y contenido acuoso.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

0 10 20 30 40 50Water content (%db)

Ent

halp

y (J

/g e

mbr

yos

db)

50

55

60

65

70

75

80

85

90

Tem

pera

ture

(ºC

)

EnthalpyTemperature

R2=0,952R2=0,948

Figura 2 Matiacevich y col, 2006

1

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Problema 3Disponiendo del diagrama de Tg vs contenido de agua de la Figura 3 para los componentes de un sistema: a) Si el producto final tuviera un contenido de agua de 5 % b.s., cuál sería la máxima

temperatura a la cual podría almacenarse para conservar la estabilidad física? b) Si sólo se dispone de una cámara a 25°C, a qué contenido de agua habría que ajustar el

producto? c) Discuta la validez de analizar un sistema con varios componentes a través de los valores

de los componentes individuales. Caso A) material particulado Caso B) material homogeneizado antes de deshidratar

d) ¿Qué variables se pueden modificar para almacenar el producto a temperaturas más elevadas para el caso A) y B)?

0 5 10 15 20 25 30-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80componente 1

componente 2

Contenido de agua, %b.s.

T g, °

C

Figura 3 Problema 4 a) Interprete los termogramas de la Figura 4a, obtenidos por DSC. El termograma superior corresponde una mezcla de manitol y sorbitol y el inferior al “re-scan” de dicha mezcla.

Fig.4a

2

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Luego de procesar mezclas de maltitol y sorbitol en distintas proporciones se obtuvieron los valores de temperatura de transición vítrea que se muestran en la Figura 4b

Fig. 4b

b) Interprete los datos obtenidos. b1. ¿Qué ecuación conoce para describir la Tg de una mezcla a partir de su composición? b2. Calcule las constantes características para el sistema maltitol/sorbitol. b3. ¿Cuál es el objeto de estudiar el comportamiento de mezclas de polioles? Problema 5El azúcar rafinosa es un trisacárido que cristaliza con 5 moléculas de agua.

a) Analice y explique los siguientes termogramas obtenidos por DSC considerando que corresponden al almacenamiento de muestras liofilizadas de rafinosa expuestas a 62,5% H.R. a 37°C durante distintos tiempos.

b) Analice los cambios en el ΔCp en función del tiempo. c) Considerando que el ΔH de fusión de la rafinosa cristalina= 146.9 J/g calcule el % de

cristalización para los distintos tiempos y grafique la evolución de la temperatura de transición vítrea y del % de cristalización en función del tiempo (ambas variables en un solo gráfico).

3

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-20 0 20 40 60 80 100 °C

Tg: 11.2 °C

Tg: 6 °C

Tg: 5.1 °C

22.5 h

70.5 h

147 h 1.8 J/g

10.4 J/g

20.

Tg: 15.5 °C

Tg: 13.0 °C

No Tg

197 h

239 h

1368 h

104.4 J/g

146.9 J/g

-20 0 20 40 60 80 100 °C

66.0 J/g

80 100

ΔCp= 0.66 J/g ºC

ΔCp= 0.58 J/g ºC

ΔCp= 0.44 J/g ºC

ΔCp= 0.35 J/g ºC

ΔCp= 0.11 J/g ºC

Problema 6 1) Se almacenaron embriones vegetales durante 20 días a distintas humedades relativas. A partir de los termogramas obtenidos a través de un calentamiento dinámico (10ºC/min) en el rango de -120ºC a 60ºC, se obtuvo la temperatura de transición vítrea a las distintas HR (indicadas por flechas en la Figura 6). a) Analice qué sucede con la Tg a medida que aumenta la humedad. b) ¿A partir de que HR se obtiene agua libre o congelable? ¿Que tipo de transición se observa? c) ¿A qué temperatura se observa y por qué?

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Matiacevich y col, 2006 Figura 6: Termogramas obtenidos por DSC normalizados por el peso de la muestra. La humedad relativa se indica a la derecha de cada curva. Las flechas indican Tg. Problema 7 Para un estudio de conservación en bancos de germoplasma se embebieron embriones somáticos de cacao con distinto grado de hidratación en soluciones de sacarosa de molaridad entre 0,08 y 1,25M. Las muestras (control y embebidas con sacarosa) se deshidrataron hasta alcanzar diferentes contenidos de agua. Se realizaron barridos por DSC desde -50°C a 25°C, a 10°C/min. Luego se analizaron los termogramas obtenidos y se graficó la entalpía de una transición, que ocurrió entre -5 y -10 ºC. Los gráficos obtenidos son los que se muestran en la Figura 7.

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Figura 7. Entalpía de la transición observada en los embriones de cacao entre -5 y -10ºC, durante el calentamiento de las muestras desde -50°C a 25°C. a) ¿Qué transición ocurrió y cómo se determinó su entalpía? b) Justifique los gráficos obtenidos c) ¿Qué datos obtiene a partir de los gráficos de la Figura 7? d) Justifique los resultados encontrados teniendo en cuenta la concentración de sacarosa de cada sistema. e) ¿Cómo espera que influya la imbibición con sacarosa sobre la conservación de los embriones congelados y por qué? d) ¿Cómo influiría sobre la conservación de embriones deshidratados y por qué? Problema 8. a) Interprete el efecto del NaCl, observado en los termogramas de la Figura 8 que corresponden a soluciones congeladas de PEG con distintas proporciones de NaCl.

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Figura 8

b) Discuta las implicancias que puede tener la presencia de electrolitos como el NaCl sobre la crioconservación de material biológico. Problema 9

a) Discuta la importancia de conocer Tg', Tm’ y Cg' para la formulación de un producto congelado (Figura 9).

b) ¿Cómo podría, por ejemplo variar Tm’ y Tg' para evitar congelación de hielo o el crecimiento de los cristales?

Tesis Asa Schoug Uppsala University, 2009

Figura 9

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Problema 10Explique las variaciones de la temperatura de producto y del estante del liofilizador, obtenidas durante la liofilización de un cultivo de lactobacilos mostradas en la Figura 10.

a) ¿De qué depende el contenido de agua del material cuando termina el ciclo de secado primario?

b) ¿De qué depende la supervivencia de las células durante la congelación? c) ¿Cómo evita el colapso durante el ciclo primario? d) ¿Cómo evita el colapso durante el almacenamiento?

Responda considerando las principales variables involucradas, las condiciones de tratamiento y formulación que tendría en cuenta para óptimos resultados.

Figura 10

Tesis Asa Schoug Uppsala University, 2009 Problema 11Se liofilizó un cultivo de lactobacilos variando: a) el contenido de sacarosa empleada como excipiente; b) la velocidad de enfriamiento y c) la concentración de microorganismos. Interprete el efecto de estos factores sobre la actividad de agua del producto obtenido.

Figura 11. Actividad de agua de cultivos de lactobacilos liofilizados en función del contenido de sacarosa, la velocidad de enfriamiento y la concentración de microorganismos. Tesis Asa Schoug Uppsala University, 2009

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Problema 12 El punto A marca la condición de una formulación enzimática liofilizada envasada herméticamente. Indicar con flechas la evolución del sistema frente a las siguientes situaciones: a) Se aumenta la temperatura y la humedad relativa (HR) de la atmósfera externa a 45ºC y

40% respectivamente. b) A continuación, con la muestra a 45ºC y 40% HR se perfora el recipiente en varios

lugares. c) El recipiente perforado se traslada a una cámara con donde la HR del aire es 30% y la

temperatura 5ºC. d) Se desea deshidratar la formulación exponiéndola a una corriente de aire de HR 20%, en

un caso a 20ºC y en otro a 45ºC. ¿Cuál será la mínima humedad que puede obtenerse en cada caso?

Figura 12.

Desorción

A

Adsorción

Problema 13 Se dispone de un cultivo de bacterias lácticas deshidratadas, cuya H.R. a 25°C es de 30%. El mismo se coloca en un sobre de un material impermeable. Luego el sobre se almacena a 35 °C y 70% H.R.

a) ¿Cuál será su aw y su contenido de agua en cada condición? b) ¿Cuáles serían los valores de aw y su contenido de agua si el envase se perfora?

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000

5

10

15

20

2535°C25°C

Humedad relativa, %

Con

teni

do d

e ag

ua, %

(bas

e se

ca)

Figura 13.

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Problema 14 Se dispone de tres formulaciones de una proteína recombinante liofilizada (A, B y C), cada una de ellas con un contenido de agua de 0,5 g de agua/100 g de masa seca a 20ºC. ¿Cuál será el contenido de agua final de cada formulación si se las coloca en recipientes individuales abiertos en una cámara a 20ºC y 40% HR y se las deja expuestas durante largo tiempo?

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.80

10

20

30Formulación AFormulación BFormulación C

aw

Con

teni

do d

e ag

ua, %

b.s

. 20ºC

Problema 15 Un cultivo de bacterias lácticas liofilizadas y un medio de cultivo con agar se colocaron por separado en una atmósfera de 75 %HR a 22 °C y se determinó el contenido de agua de las muestras en función del tiempo (ver figuras). Una vez alcanzado el equilibrio, se extrajeron 2 g de cada material y se colocaron en un mismo recipiente cerrado pequeño (con mínimo espacio cabeza).

0 2 4 6 8 10 12 14 160

2

4

6

8

10

12

14

75 %HR, 22°C

Cultivo estárter de yogur

Tiempo

Con

teni

do d

e ag

ua (%

b.h.

)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 160

10

20

30

40

50

60

7075 %HR, 22°C

Medio de cultivo con agar

Tiempo

Con

teni

do d

e ag

ua (%

b.h.

)

Discuta: a) por qué habrán ocurrido los cambios de contenido de agua de dichos materiales

durante su equilibración. b) ¿qué habrá sucedido con el contenido de agua de dichos materiales cuando se

pusieron en contacto luego de haberse equilibrado? Problema 16 Las isotermas de sorción de agua obtenidas para manitol con distinto grado de cristalinidad se muestran en la siguiente tabla:

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Contenido de agua, % b.s. aw 65% crist. 3% crist. 0 0 0

0,1 2 7 0,3 5 10 0,4 4 9 0,5 4 9 0,65 9 14 0,75 22 28 0,85 40 45

a) Justifique las diferencias observadas. Discuta las ventajas/desventajas que tendría un mayor grado de cristalinidad en la formulación de productos deshidratados.

b) Analice las curvas utilizando las ecuaciones de BET y GAB, obtenga a partir de ambos modelos el valor de sorción de la monocapa y compare. Discuta acerca del rango de validez de cada ecuación.

c) Calcule el área superficial específica de sorción de agua. d) ¿Qué datos aportaría conocer la isoterma de sorción de nitrógeno para este producto?

Problema 17 Se equilibraron muestras de un excipiente combinado para formulaciones enzimáticas a distintas humedades relativas con el objetivo de obtener diferentes contenidos de agua.

a) Se realizó la isoterma de sorción de las muestras y los datos experimentales se ajustaron al modelo GAB (Figura 17a). Los parámetros GAB obtenidos fueron mo= 5,1 ± 0,4; K= 0,97; C= 3,71, R2= 0,995.

b) Se determinaron los tiempos de relajación magnética espín-espín de los protones de dichas muestras mediante FID y la secuencia de Hahn para analizar el eco de espín a 25ºC (Figura 17b). Por esta última metodología se obtuvieron dos poblaciones diferentes de protones, dependiendo del contenido de agua de las muestras. A la población con mayor tiempo de relajación (protones más móviles) se la denominó T2L, y a la población con menor tiempo de relajación (protones menos móviles) de la denominó T2S.

c) Se aplicó el método de FID, equilibrando previamente las muestras durante 10 min a distintas temperaturas en el rango de 5ºC a 90ºC. (Figura 17c).

d) A partir de los termogramas obtenidos por DSC a través de un calentamiento dinámico (10ºC/min) en el rango de -50ºC a 150ºC, se obtuvo la temperatura de transición vítrea para cada contenido de agua (Figura 17d).

* Analice los resultados. * ¿Qué sucede al aumentar el contenido de agua en las muestras? * ¿Cómo se relacionan los datos de la Figura 17b con la isoterma de sorción de agua? ¿Se puede determinar cuál es el tiempo de relajación de la monocapa? ¿A partir de que HR comienza a aparecer agua libre? * ¿En verano, a 40ºC y 75%HR, este excipiente mantendrá las formulaciones en estado vitreo?

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Figura 17a. Isoterma de sorción

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240.00

0.01

0.02

0.030.25

0.50

0.75

1.00

1.25

T 2 (m

s)

contenido de agua (%bs)

T2L

T2S

T2 FID

Figura 17b Tiempos de relajación transversal (T2) obtenidos por Hahn (T2L y T2S) o por FID (T2FID) a 25ºC.

-20-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 901001100.007

0.008

0.009

0.010

0.011

0.012

0.013

T 2 (m

s)

T (ºC)

aw:0,30 wc:4,1 aw:0,45 wc:6,4 aw:0,62 wc:11,0 aw:0,74 wc:16,4

Figura 17c. Tiempos de relajación obtenidos por FID a distintas Temperaturas. wc= contenido de agua

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 220

153045607590

105120135150165

contenido de agua (%bs)

T g (º

C)

Figura 17d. Temperaturas de transición vítrea obtenidas por DSC para las formulaciones con distintos contenidos de agua

Figura 17a. Isoterma de sorción

Tesis Farroni, 2010

water sorption isotherm

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

0

0

common CF

aw

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Técnicas de formulación y estabilización de biomateriales

Problema 18 Dados los siguientes datos para la supervivencia de lactobacilos almacenados por dos meses en una solución de 15% de sacarosa a distintas temperaturas (Figura 18a), y teniendo en cuenta los valores de Tg para distintas humedades relativas (Figura 18b). Establezca la humedad relativa crítica para almacenar las muestras a 4°C o a -18°C en los sistemas de esta última figura, que contienen sacarosa. Analizar cómo varían los valores indicados en el caso de que el sistema sea formulado con Sacarosa + PVP90 ó Sacarosa + Ficol 400. Tesis Asa Schoug Uppsala University, 2009

Figura 18a

Figura 18b

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Problema 19. Dada una isoterma de sorción como la mostrada en la Figura 19 para un material biológico que debe ser preservado. Indicar:

a) La zona de máxima glicosilación de proteínas. b) La zona de aparición de agua congelable c) La zona de máxima velocidad de oxidación lipídica d) La zona de aparición de actividad enzimática e) La zona de crecimiento microbiano f) Los valores aproximados de los t de relajación T2 en cada zona de la isoterma.

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

aw

Wat

er c

onte

nt

Figura 19 Justificar todas las respuestas. Problema 20 Explique los cambios en los espectros IR mostrados en la Figura 20 para tres preparados proteicos. ¿Qué ocurre cuando se liofilizan las soluciones? ¿Por qué? ¿Cómo lo solucionaría?

Liofilizado

Solución acuosa

Figura 20

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Técnicas de formulación y estabilización de biomateriales

Problema 21. Interprete los siguientes resultados que corresponden a determinaciones realizadas en ejes embrionarios de semillas durante su almacenamiento a 33°C. Mencione: a qué tipo de reacciones corresponden cada uno de los parámetros analizados y justifique la forma de las curvas obtenidas. Cómo repercuten estos cambios sobre la germinabilidad de los ejes? ¿Cómo espera que varíe la solubilidad de proteínas y por qué? ¿Cuál sería el efecto del contenido acuoso sobre las reacciones analizadas? J. Exp. Bot. 348 1221-1228, 2000

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