CULTIVO CELULAR APLICACIONES EN MEDICINA Centro Comunitario de Sangre y Tejidos del Principado de...
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CULTIVO CELULAR APLICACIONES EN MEDICINA
Centro Comunitario de Sangre y Tejidos del Principado de
Asturias.
Unidad de Ingeniería Tisular
Sara Llames
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CULTIVO CELULARCULTIVO CELULAR: mantenimiento, proliferación y/o diferenciación de células in vitro en un medio artificial.
REQUERIMIENTOS MÍNIMOS DE UN LABORATORIO REQUERIMIENTOS MÍNIMOS DE UN LABORATORIO DE CULTIVO:DE CULTIVO:
Asepsia: cabina de flujo, esterilizador
Incubador
Nevera/congelador
Baño agitador
Centrifuga
Microscopio Invertido
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MEDIO DE CULTIVOMEDIO DE CULTIVO:
proporciona a las células los nutrientes necesarios.
BASAL: medio definido, adecuado al tipo celular.
SUERO: fuente de proteínas, minerales, lípidos, hormonas, mitógenos.
ANTIBIÓTICOS
ADITIVOS: hormonas, factores de crecimiento, etc.
MEDIO DEFINIDO: sin suero, componentes conocidos, reproducible.
MEDIO INDEFINIDO: con suero, variación entre lotes.
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CONDICIONES DE CULTIVOCONDICIONES DE CULTIVO:
pH: 7.4, tamponamiento 5% CO2
temperatura: 37ºC humedad: 90-95%
INCUBADORINCUBADOR
CONTAMINACIÓN BIOLÓGICA:CONTAMINACIÓN BIOLÓGICA:
Bacteriana Fúngica MICOPLASMA
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CULTIVO DE CONDROCITOSCULTIVO DE CONDROCITOS
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Britterg y colaboradores 1994, condrocitos humanos autólogos cultivados para el tratamiento
de lesiones completas de cartílago articular.
Desde 1997 condrocitos comerciales. Elevado coste.
Unidades hospitalarias de cultivo celular.
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PROCESAMIENTO Y CULTIVO:PROCESAMIENTO Y CULTIVO:
Fragmentación mecánica (bisturí)
Digestión enzimática (colagenasa)
Cultivo en presencia de suero autólogo
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CONTROLES:CONTROLES:
Bacteriológicos
Micoplasma: ELISA, PCR, Fluorocromo
Cultivo infectado por micoplasma
Cultivo negativo
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Producción de matriz cartilaginosaProducción de matriz cartilaginosa
Tinción Safranina
Tinción Azul Alcián Inmunodetección de Colágeno II
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Estudio de normalidad celularEstudio de normalidad celular
Cariotipo Bandas G Hibridación Genómica Comparada.
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Viabilidad CelularViabilidad Celular
Azul Tripán
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TRANSPLANTE Y/O CONGELACIÓNTRANSPLANTE Y/O CONGELACIÓN
Transplante: suspensión celular en DMEM sin rojo fenol.
Congelación para uso posterior.
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CULTIVO DE QUERATINOCITOSCULTIVO DE QUERATINOCITOS
PIEL ARTIFICIALPIEL ARTIFICIAL
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CULTIVO DE EPITELIO AISLADOCULTIVO DE EPITELIO AISLADO
Digestión enzimática
Biopsia del paciente Fragmentación
mecánica
Células aisladas de piel + 3T3
radiados
Cultivo primario de queratinocitos
Células del cultivo primario + 3T3
radiados
Cultivo secundario de queratinocitosTransporte y trasplante
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LIMITACIONES DEL EPITELIO CULTIVADO:LIMITACIONES DEL EPITELIO CULTIVADO:
Fragilidad
Dispasa daña la membrana basal
Formación de ampollas
Infección
Antisépticos
Resultados clínicos pobres
Escasa disponibilidad
Coste elevado
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Modelo de piel artificial completacompleta destinado al tratamiento definitivo de grandes lesiones
epiteliales
Epidermis
Dermis
INGENIERÍA TISULARINGENIERÍA TISULAR
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Biopsia de piel
Fragmentación mecánica
1ª Digestión T/E
Células aisladas de piel + 3T3 radiados
Cultivo de Cultivo de queratinocitosqueratinocitos
2ª Digestión colagenasa
Cultivo de Cultivo de fibroblastosfibroblastos
Cultivos PrimariosCultivos Primarios
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Cultivo de fibroblastos
Cultivo de queratinocitos
Plasma humano
Dermis artificial basada en plasma humano Piel cultivada
Cultivo SecundarioCultivo Secundario
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PREPARACIÓN DE LA PIEL ARTIFICIAL PARA PREPARACIÓN DE LA PIEL ARTIFICIAL PARA TRASPLANTETRASPLANTE
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Biopsias procesadas Biopsias procesadas (patologías)(patologías)
0
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4
6
8
10
12
Nº
de
pa
cien
tes
Año 2000 Año 2001 Año 2002 Año 2003 Año 2004(agosto)
Quemados Nevus Úlceras CutáneasEICH Neurofibromatosis EpidermolisisTx familiar Retracción Fascitis Necrot.Mucosa oral