^4°^ ,-M^ ^. SEMILLAS • TECNICAS DE CULTIVO

Por. M. Morán Martín*, M. Caho Herrero*.

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cult►v do lanes►s natura^„reproducien

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Cultivo de células, tejidosy órganos vegetales "In Vitro"

INTRODUCCIÓN

Durante millares de años el hombre haobservado y explotado la capacidad rege-nerativa que poseen las plantas superio-res. Sin embargo, las técnicas de laborato-rio para el cultivo estéril de órganos y teji-dos vegetales no fueron establecidas has-ta el siglo XX, cuando Haberlandt en 1902comenzó los primeros experimentos queverdaderamente pueden ser descritoscomo tales.

(') Dpto. Biología VegetalUniversidad de Salamanca

A partir de este momento se planteó lanecesidad de utilizar tejidos meristemáti-cos pero no fue posible lograr un cultivoindefinido hasta el descubrimiento de lasauxinas, sustancias reguladoras del creci-miento vegetal.

Los primeros cultivos de tejidos vege-tales, entendiendo como "cultivo de teji-dos" "...aquel cultivo multicelular en unmedio sólido y nutrido con un medio líqui-do en el que las células están en continui-dad protoplasmática" (Street,1977), fueronobtenidos por Gautheret, Nobecourt yWhite en 1939 y los medios nutritivos enlos que crecían estaban perfectamente for-mulados. En 1948, Skoog y Tsui, sugirieronque en cultivos de callos podía provocarsela aparición de estructuras morfológica-

mente diferenciadas (tallos y/o raíces),regulando la composición química delmedio nutritivo. Estos autores, buscandoun factor que estimulase la división celularlo encontraron en preparaciones degrada-das de DNA. Este, fue identificado como 6-furFurilaminopurina y recibió el nombre dekinetina. Posteriormente se sintetizó unanálogo de este compuesto, la 6-bencila-minopurina, también con propiedadesestimuladoras de la división celular. Atodos estos compuestos se les dio el nom-bre genérico de citoquininas.

Skoog y Miller en 1957, propusieron lahipótesis de que la formación de tallos yraíces en cultivos de callos podía ser regu-lada por auxinas y citoquininas en concen-traciones adecuadas.

804-AGRICULTURA

Así pues y con las observacioneshechas por estos autores, en cualquier cul-tivo de tejidos se puede reproducir la mor-fogénesis natural y de esta manera conse-guir la regeneración de una planta, bien porvia organogénica o bien por vía embriogé-nica. Sin embargo se hacen necesariosuna serie de requisitos como son, a) elmantenimiento de condiciones estériles,esenciales para el sucesivo crecimiento, yaque de otra forma podrían desarrollarsemicroorganismos que ocasionarían lamuerte celular; y b) la formulación de unmedio nutritivo adecuado que sustituya losaportes que el resto de la planta da a unfragmento vegetal cuando el vegetal estáintacto.

NECESIDADES NUTRICIONALES YFACTORES (,1UE INFLUYEN EN ELESTABLECIMIENTO DE LOSCULTIVOS "IN VITRO" DE TEJIDOS YCÉLULAS VEGETALES

Cualquier vegetal necesita un aportehídrico, junto con nutrientes minerales; unafuente de carbono en forma oxidada y laenergía suficiente para convertirlo en losdiferentes compuestos que constituyen laplanta. En el caso de los cultivos "in vitro",

los explantos presentan una nutriciónheterótrofa durante algún tiempo, no tie-nen pues, en principio, la posibilidad desintetizar carbohidratos, compuestosnitrogenados, vitaminas y sustancias regu-ladoras del crecimiento, por lo que se lesha de suministrar exógenamente sustan-cias que aporten alimentos y algunosesqueletos carbonados y que por diferen-tes rutas proporcionen la energía que sonincapaces de tomar del sol. Teniendo encuenta este hecho, se pueden explicar lasenormes variaciones que se realizan en lacomposición del medio nutritivo utilizadopara el cultivo y que dependen de la espe-cie utilizada, la parte del vegetal que nossirva como explanto y del estado fisiológi-co del mismo (George E. F. 1996).

Nutrientes inorgánicosLos mismos elementos inorgánicos

que son esenciales para el crecimiento deplantas completas, son necesarios para elcrecimiento y desarrollo de tejidos vegeta-les cultivados "in vitro""y en éstos, sus defi-ciencias son más acusadas e incluso leta-les. Clarkson y Hanson en 1980 clasifica-ron estos nutrientes inorgánicos en dosgrandes grupos: 1) Aquellos elementos(N,P,S) unidos covalentemente a com-

puestos carbonados y que son constitu-yentes vitales de las macromoléculas DNA,RNA y proteínas y 2) otros elementos (K,Na, Mg, Ca, Mn, Fe, Cu, Zn, Mo, B, CI) queparticipan en varias funciones, a menudosolapadas, como pueden ser la regulaciónde los gradientes eléctricos y osmóticos,conformación de las proteínas y reaccio-nes redox de metaloproteínas.

George y colaboradores en su libro"Plant Culture Media" (1987), recogen losmedios más utilizados para el cultivo decélulas y tejidos vegetales "in vitro", des-cribiendo su formulación y usos. Por logeneral los medios están basados en for-mulaciones ya establecidas, definidas porHeller (1953), Murashige y Skoog (1962),Linsmaier y Skoog (1965), Gamborg (1968),Schenck y Hildebrandt (1972) entre otros yque se muestan en las tablas 1 y 2.

Nutrientes orgánicosExisten tres tipos de nutrientes orgáni-

cos requeridos prácticamente por todaslas especies de vegetales cultivadas "invitro", como son carbohidratos, sustanciasreguladoras de crecimiento y vitaminas.Además, también se añaden numerososcomplejos de extractos naturales y líqui-dos endospérmicos.

Tabla 1. Solución nutritiva según el medio de Murashige y Tabla 2. Composición de otros medios usados en el cultivo deShoog células y tejidos vegetales

Constituyentes Molandad en elmedio

Concentración dela solucibn

Volurnen dela solución

conservación dela solución stock Constituyentes Concentraaón en_ el medro de cultivo (rngl litros) _

stock(mg/lrtro) stock porlitro de _ _-,

White^s Schenk y

Hddebrank

B^ Heller^s Lismaer y Skooy

medio(ml)NH,N03

_

- - - - 1650

Macronutrientes 50 +4°C NH,H_PO< - 300 - - -inorgánicos (NH,)_SO° - - 134 - -

KNO, 81 2500 3000 - 1900

NH°N0, 2 06 x 10' 3300 CaC1,2H,0 200 150 75 440

KNO, 1 88 x 10' 38000 MgS0,.7Hz0 74 400 500 250 370

CaC1, 2HZ0 3 00 x 10' 8800 KHzPO, 12 - - - 170

MgSO, 7H,0 1 50 x 10' 7400 Ca(N03)z 142 -KHzPO, 1 25 x 10' 3400 NaNO, - - - 600 -

KCI 65 - - 750 -

Oligoelementos 5 +4°C NaHzPO,.H,O - - 150 125 -

KI 5.00 x 10^ 166 MnS0,.2H,0 - 10 10 - ^^

H^BO^ 1.00 x 10-° 1240 MnS0,.4H-0 - - - 0.1 22.3MnS0,.4H,0 9.99 x 105 4460 KI ^ 1 0 75 0.01 0.83ZnSD,7Hz0 2.99 x 10' 1720 H,BO., - 5 3 1 6 2Na,MoO° 2Hz0 1.00 x tOfi 50 LnS0,.7H^0 - 1 2 1 8 6CuSO°.SH70 1.00 x 10-' S CuSO, - 0.2 0 025 - -CoC1; 6Hr0 1.00 x 10' S CuSO,.SH,O - - - 0.03 0025

NazMo0,.2H,0 - 0 1 0 25 - 0 25Fuente de Hierro 5 +4°c CoCI, 6H_,0

^- 0.1 0 025 - 0 025

nicl, - oD3 -FeSO, 7H,0 1 00 x 10 ° 5560 NiCI-6H^0 - 003Na^EDTA.2Hz0 1.00 x 10° 7460

FeCI,6H^0 1

Compuestos FeSO°JHzO 15 27 86Orgánicos 5 20 °C (en Fe^( SO,), 2 46

alicuotas de 5 Sequestrena 330 Fe - - 28 - -Myo-Inositol 4 90 x 10 ° 20000 ml) Na^EDTA - 20

_ -- 37 26

--- -Ácido Nicotínico 4.66 x 10-e 100 Myo-Inositol 1000 100 100Pindoxina-HCI 2.40 x 10^s 100 Acido Nicotínico - 5 110 - D 4Tiamina-HCI 3.00 x 10"' 100 Piridozina-HCI - 5 1 - -

Glicma 300x10` 400 Tiamina-HCI - 0.5 1 - -Extracto de levadura 100

Fuente de carbono Sacarosa 20000 30000 20000 30000

Añadida pH 59 55 SB

CarbohidratosTodos los cultivos "in vitro" de células

vegetales necesitan la presencia de unazúcar como fuente de carbono y energía.Generalmente se emplea la sacarosa auna concentración que varia entre 20 y 45g/I. Este compuesto participa en la fuerzaosmótica del medio además de proporcio-nar glucosa y fructosa para las diferentesrutas metabólicas (Brown et al., 1976).

Sustancias reguladoras de crecimientoLa mayoría de los cultivos requieren un

aporte exógeno de auxinas y citoquininasnaturales o sintéticas, aunque algunos teji-dos son capaces de mantener el creci-miento en ausencia de fitohormonas, yaque sus niveles endogénos son suficientespara satisfacer sus propias necesidades.

La auxina natural que más se utiliza esel ácido indolacético (AIA). Dentro de lasauxinas sintéticas las más empleadas sonel ácido naftalenacético (ANA) y el 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Su acciónprincipal es la estimulación de la diferen-ciación de raíces y la elongación de tallos.EI 2,4-D a dosis muy elevadas actúa comoherbicida debido probablemente al poten-cial genotóxico de esta auxina, no obstan-

"La replicación óclonación deplantas permiteobtener unmaterial vegetalde igualescaracterísticas ylibre deenfermedades"

te, suele ser un buen promotor de la forma-ción de callos si se añade al medio en con-centración inferior a 1 mg/I, siendo muyefectivo en la inducción de embriogénesissomática, particularmente en gramíneas,aunque el desarrollo posterior de estosembrioides puede ser inhibido por estecompuesto. Otras auxinas sintéticas utili-

zadas en cultivos celulares son el ácido2,4,5,-triclorofenoxiacético (2,4,5,-T) y elácido 2-metil-4-clorofenoxiacético (MCPA)etc.

Las citoquininas regulan la divisióncelular y en los cultivos celulares suelenfavorecer la diferenciación de tallos. Seemplean normalmente las citoquininas sin-téticas kinetina (Kin) y la 6-bencil-aminopu-rina (BA) y la natural zeatina. Estas sustan-cias que se añaden exogénamente, no sonesenciales, ya que algunos tejidos crecenindefinidamente sólo con auxinas.

Además de los compuestos menciona-dos existen otras sustancias reguladorasde crecimiento que pueden ejercer algúncontrol en la morfogénesis como son, lasgiberelinas, el ácido abscísico (ABA) y eletileno. Así el ABA generalmente es un inhi-bidor natural del crecimiento y a menudotiene una influencia positiva en la madura-ción de embrioides somáticos, reduciendolas anormalidades frecuentemente obser-vadas en su desarrollo. La acción más nor-mal de las giberelinas es la estimulación dela elongación de los tallos. EI etileno al tra-tarse de un gas, ha sido ignorado durantemucho tiempo en cultivos de tejidos vege-tales, sin embargo existen estudios sobrela influencia de este compuesto en la orga-

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^^r SEMILLAS • TECNICAS DE CULTIVO: ,; r

nogénesis y la citodiferenciación Huxter etal. (1981), y se ha comprobado que enalgunas especies inhibe el desarrollo delos embrioides.

Así pues, aunque una de las hipótesismás aceptada sea que la organogénesisestá regulada por cambios cuantitativos enel balance entre ciertos constituyentes delmedio nutritivo (Sánchez-Grás M.C. andCalvo M.C.1996) y del balance auxina/cito-quinina. Dependiendo del nivel endogénode ambos compuestos en el tejido, la adi-ción de sustancias reguladoras del creci-miento provocan resultados contradicto-rios en muchas especies cultivadas "invitro".

VitaminasLas vitaminas ejercen funciones catalí-

ticas en los sistemas enzimáticos y serequieren unicamente en cantidades míni-mas. Aunque el mioinositol es un carbohi-drato, normalmente se considera junto alas vitaminas, pues no es adecuado comofuente de carbono. Este compuesto raravez es esencial aunque su efecto benefi-cioso ha sido probado en numerososcasos.

Algunos autores piensan que la únicavitamina requerida en cultivos celulares es

"Esta técnica seestá aplicandotanto a plantas deporte herbáceocomo leñosoobteniendoseventajososresultados"

la tiamina (vitamina B1), mientras que elácido nicotínico (niacina) y la piridoxina(vitamina B6) pueden estimular el creci-miento. En casos determinados otras vita-minas pueden ejercer un efecto estimulan-te como por ejemplo el ácido fólico y labiotina. Kao y Michayluk en 1975, incluye-ron numerosas vitaminas adicionales encultivos de Vicia hajastana pero no ha sido

posible demostrar los requerimientosespecíficos de la mayoría de las sustanciasincluidas.

Aminoácidos y suplementos orgánicoscompl%os

Generalmente los aminoácidos no seincluyen en los medios de cultivo a excep-ción de la glicina. Ahora bien, en algunoscasos es necesario suplementar el medionutritivo con compuestos orgánicos quesirvan como fuente de nitrogéno reducido,para ello se añade una gran variedad deextractos complejos naturales como pue-den ser, leche de coco, hidrolizado decaseína o extracto de malta. No obstante, ysiempre que sea posible, es convenienteeliminar de los medios nutritivos el empleode extractos naturales complejos debido aldesconocimiento que existe normalmentede su composición química y de su modode acción a nivel molecular.

FACTORES FISICOS

Las condiciones físicas en las que se man-tienen los cultivos de tejidos vegetales "invitro" pueden afectar el crecimiento ydesarrollo de los mismos, entre estos fac-tores pueden destacarse :

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EI método de esterilizaciónEI medio de cultivo de tejidos vegeta-

les puede ser esterilizado mediante auto-clave o bien por filtración, siendo más uti-lizado el primer procedimiento, aunquenumerosos componentes del medio pue-den descomponerse, alterarse o bienreaccionar con otros sustancias al serexpuestos a altas temperatura. Así porejemplo la sacarosa en combinación conotros compuestos puede caramelizarsepudiendo ser tóxica para los cultivos celu-lares.

Un gran número de aminoácidos ysustancias reguladoras de crecimientoson lábiles a altas temperaturas, por ejem-plo la glutamina, el ácido indolacético, elácido giberélico y la 6-bencil-aminopurina.También la tiamina puede ser degradadaen parte, al ser sometida a altas tempera-turas, poniéndose de manifiesto sobretodo cuando los niveles de este aminoáci-do son limitantes (Linsmaier y Skoog,1965). En estos casos se hace necesaria laesterilización por fíltración.

EI pH del medioPor lo general el pH de los medios de

cultivo se ajusta entre 5 y 6 antes de este-rilizar y añadir el agar. Algunos investiga-dores han variado sígnificativamenteestos valores del pH, obteniendo resulta-dos interesantes.

La mayoría de los medios de cultivoestán pobremente tamponados y las fluc-tuaciones de pH que ocurren pueden serperjudiciales para la supervivencia y creci-miento de las células, en estos casos sehace necesario añadir al medio sustanciastamponadoras, por ejemplo MES, paraque el crecimiento celular sea posible.

L.a luzLos cultivos de tejidos vegetales no

son fotosintéticamente eficientes e inclu-so, por lo general, no son autotróficos. Noobstante, al igual que las caracteristicasde la radiación influyen en el desarrollo dela planta también afectará a los procesosmorfogenéticos de los cultivos. EI tiempode exposición (fotoperíodo), la calidad dela luz e intensidad de la misma influye enel comportamiento y metabolismo de loscultivos, afectando a las actividades enzi-máticas que participan en la biosíntesis dediferentes compuestos (Hahlbrock et al.,1980).

La temperaturaExiste poca información sobre la tem-

peratura óptima para el crecimiento ymucho menos para la producción demetabolitos secundarios. Por lo general,los cultivos "in vitro" se mantienen a unatemperatura entre 25-27°C de forma ruti-naria, pero la óptima para el crecimientode cada cultívo debería ser investigadaindividualmente para cada especie.

. «^a ^micropropagaciónpermite obtenercosechas con unaltísimo grado dehomogeneidad,sin pérdida de

. calidad" .

PRINCIPALES METODOS DEMICROPROPAGACIÓN

La obtencion de plantas es el pilar indis-cutible de la metodología del cultivo decélulas y tejidos "in vitro". Sin ella, la hibri-dación de protoplastos, los estudios de cre-cimiento y diferenciación, la generación degenotipos variantes, el cultivo de anteras, elclonaje, la eliminación de enfermedadesmediante el cultivo de meristemos ymuchos estudios sobre reguladores delcrecimiento serían imposibles.

Etapa 0 Etapa I

porpagacronparyemas axilares

Fropape4ón pLANTA MADREpor

v3slaáos o embrlonestlventicbs

` Culbvo de nudoa^,^

^ ^ ..^^^ AyAy//^^^^ ^ Cultlv deApl eccaullnarec,

O f ^,r^ y ^ _y ^ ^

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^ ^^U^^ Awna ^aw^narRammoao^en a.^iar Raminoaclen a.uar mon^aa ^

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La propagación asexual utilizando lastécnicas del cultivo de células y tejidosvegetales "in vitro" puede realizarse siguien-do el esquema que se muestra en la figura 1.En ella se observa que la obtención de plan-tas puede realizarse por morfogénesisdirecta o indirecta a partir de un explanto 0bien mediante el cultivo de meristemos y/ode ápices caulinares.

Regeneración de plantas "in vitro" pormorfogénesis

Las células vegetales en cultivo puedenexpresar en un momento dado, y en condi-ciones adecuadas su totipotencia, siguien-do una ruta organogénica que conduce aldesarrollo de meristemos caulinares y/oradiculares, o una ruta embriogénica queimplica la formación de embriones somáti-cos o zigóticos.

Cualquier especie vegetal puede serregenerada "in vitro" utilizando métodosdiversos. La eficiencia depende de la espe-cie, del tejido u órgano cultivado y del pro-cedimiento elegido. La regeneración deplantas puede Ilevarse a cabo mediante tresmétodos: cultivo de embriones, embriogé-nesis somática y organogénesis.

EI cultivo de embriones se realiza culti-vando asépticamente un embrión zigótico.EI embrión se aisla de la semilla o del óvuloy se emplaza en un medio nutritivo que sus-tituya al endospermo; el desarrollo subsi-guiente y la germinación tiene lugar como sise tratase de una semilla.

La embriogénesis somática o asexual esla producción de estructuras embriogénicas

Emb.^ones somar^cos

^xplanle ^,MORFOGENESIS

INDIRECTA CreclmientoCecalloa partn delaxplanro

+ PRINCIPALES MÉTODOS DE MICROPROPAGACION

(de George, 1996)

Fig.i. Diferentes métodos de obtención de plantas mediante el cultivos "in vitro" detejidos vegetales.

C

Etapa II

Form+cian mr«laEe vAste9os

VaAstagosMORFOOENE515 ^ ^• a'vanNClos

Expianlo ^ ^^ Embrfogéneslsdireaa

Etapa III Etapa IV-^^--.

AGRICULTURA-809

i:^^J SEMILLAS • TECNICAS DE CULTIVO

^^^

originadas en células somáticas. Unembrión somático es una estructura bípolarindependiente que no está físicamente uni-do al tejido que la origina. Estos embrioides,término que generalmente se utiliza paradiferenciarlo de los embriones zigóticos,pueden desarrollarse y germinar dandolugar a plántulas a través de la misma seriede acontecimientos correspondientes a lagerminación de embriones zigóticos.

La organogénesís puede iniciarse a par-tir del explanto, morfogénesis directa o apartir de callos, morfogénesis indirecta. Laregeneración de vastagos se inicia con laformación de zonas de células meristemáti-cas (meristemoides) capaces de respondera determinados factores, dentro del tejido, yoriginar así un primordio. Dependiendo de lanaturaleza de estos factores internos, elestímulo podría iniciar la formación de unaraíz, un tallo o un embrioíde, no obstante sedesconocen los factores que regulan el ori-gen de estas zonas meristemáticas. La ini-ciación del proceso es asincróníco y, enocasiones, impredecible, pero en cualquiercaso sólo unas cuantas células están impli-cadas, originandose el crecimiento de tallosa partir de callos o a partir de yemas axilaresgeneradas en cultivos de ápices y la subse-cuente formación de raíces. Los tallos y raí-ces así forrnados son estructuras unipola-res y conectados físicamente al tejido que laorigina.

En resumen la regeneración de plantaspor organogénesis puede Ilevarse a cabode tres forrnas:

a) Mediante la producción de órganosadventicios a partir de callos derivados deun explanto.

b) Por la formación de órganos adventi-cios originados directamente en el explanto,sin que intervenga la fase de callo.

Por la formación de plántulas a partir deyemas.

EI estudio de los factores que regulan laorganogénesis es difícil, aunque se piensaque el control del proceso esta determinadopor.

1) Genotipo del material cultivado.2) Estado fisiológico de la planta dona-

dora3) Composición química del medio4) Factores ambientales del cultivo5) Reguladores del crecimiento.La acción de estos factores no se pue-

de generalizar existiendo varias hipótesissobre su modo de acción. La más aceptadaes que la organogénesis está regulada porel balance cuantitativo de todos los consti-tuyentes que componen el medio. Así la adi-ción o no de diferentes compuestos orgáni-cos puede influir en la intensidad de la res-puesta y también en el modelo de diferen-ciación.

CULTIVO DE MERISTEMOS Y APICESCAULINARES

Durante los últimos años se está utili-zando la técnica de cultivo "in vitro" comouna medida altemativa de la propagaciónasexual para plantas con interés económi-co. Se trata de un sistema de propagaciónvegetativa a partir de cultivos de tejidosmeristemáticos. Se utilizan como explantostanto meristemos de tallos, como ápices detallos o bien yemas apicales, tomando lazona dei meristemo apical, o con más fre-cuencia la región meristemática subapical.Cuando la eliminación viral no es parte delobjetivo, es preferible partir de ápices detallos y de yemas apicales que de cultivo demeristemos.

Para el cultivo de ápices caulinares o

meristemos por micropopagación denumerosas especies vegetales se necesitala contribución de tres medios diferentes:uno para el establecimiento del cultivo delápice caulinar, otro para la multiplicación detallos y un tercero para el enraizamiento(Hiraoka y Oyanagi,1988).

Existen tres posibles rutas para la multi-plicación de propágulos "in vitro": a)aumentando la relación de yemas axilares;b) producción de yemas adventícias pormedio de una ruta organogénica; c) porembriogénesis somática. Todos ellas pre-sentan una serie de ventajas e inconvenien-tes. Así, en la regeneración "in vitro" pororganogénesis y embriogénesis somática,se producen más variaciones en el desarro-Ilo pues por lo general es necesario un pasoprevio de inducción de callos, con la subsi-guiente reorganización dentro de las plántu-las para obtener la planta completa. Sinembargo, utilizando el método de prolifera-ción de yemas axilares a partir de cultivosde meristemos, ápices de tallos o yemasapicales solamente se requiere la elonga-ción del tallo y la diferenciación de raícespara originar la nueva planta aunque estehecho no ha podido ser demostrado enmuchas especies vegetales.

Cuando se da una formación previa decallo se origina un incremento en la frecuen-cia de cambios genéticos, especialmente sise produce una poliploidia o una aneuploi-dia, resultantes de anormalidades mitóticas,mientras que las plantas derivadas de culti-vos de meristemos, ápices de tallos yyemas apicales son prácticamente establesgenéticamente, lo que produciría materialuniforme para experimentación o para pro-ducción de protoplastos.

A pesar de que el nivel de multiplicaciónde plántulas por vía organogénica o por vía

810-AGRICULTURA

embriogénica es muy alto, este disminuyerápidamente después de varios subcultivosy en algunos casos se Ilega a perder supotencial morfogénico. Sin embargo, elporcentaje de multiplicación por prolifera-ción de yemas axilares, que en un principioes relativamente bajo, va aumentando enprogresión geométríca durante los prime-ros subcultivos, hasta Ilegar a un punto enque la producción alcanza una estabilidad.Todo esto hace que económicamente laregeneración por este método sea benefi-ciosa, pues, un único explanto, en un año,es capaz de producir millones de plantas,que pueden servir como fuente continua depropágulos, aunque hubiera que renovarperiódicamente dicha resenra con cultivosde explantos frescos. Así mismo, no sepuede olvidar que esta técnica se puedeutilizar cuando los métodos organogénicosy embriogénicos fallan como alternativa

REFERENCIAS BIBLIOGRAFlCAS

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para la producción comercial de algunasespecies (George 1993 y1996)

CONCLUSION

La micropropagación de plantas a partirdel cultivo de células y tejidos "in vitro", es unmétodo de regeneración ut1, ya que propor-ciona un sistema simple con el que se pue-den efectuar múltiples estudios fisiológicos,como el del control del crecimiento, la dor-mición de yemas, ciclos reproductivos yotros procesos fisiológicos de las yemas,tales como explicar el papel de los regulado-res de crecimiento en su desarrollo. Ademásesta técnica presenta, para muchas espe-cies, múltiples ventajas sobre otros métodosconvencionales de propagación asexual eninvemaderos, entre ellas podemos citar :

1) Solo es necesaria una pequeña canti-dad de tejido vegetal como explanto inicial

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para obtener la regeneración de millones declones vegetales en un año, mientras que pormétodos convencionales se necesitaríanaños para obtener una cantidad igual de clo-nes.

2) Es un método altemativo que puederesultar uútil sobre todo para aquellas espe-cies que no pueden propagarse por otrosprocedimientos.

3) Es una técnica que proporciona unmétodo adecuado para el intercambio dematerial vegetal, y si se émplean bien losconceptos de esterilidad, se puede eliminarel peligro de introducción de enfermedades,con lo cual el periodo de cuarentena puedereducirse o suprimirse.

4) Se elimina la dependencia estacionalcomo ocurre con la práctica convencional ypor lo tanto las reservas "in vitro", puedenproliferar rápidamente después del embar-que o almacenamiento.

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