Cultivo de m.o.

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Universidad Nacional Agraria la Molina Laboratorio de Microbiología 01/06/15 1. Introducción En la naturaleza, diversos tipos de microorganismos comparten su hábitat con gran variedad de otras especies; sin embargo, para su estudio se hace necesario que cada especie pueda ser obtenida en forma aislada, lo que se conoce como un cultivo puro o axénico. Por ejemplo en muestras clínicas usualmente las bacterias patógenas se encuentran junto con las de la flora indígena, por lo que es necesario aislar las primeras; además, en muchos procesos industriales es necesario recuperar solo el agente de interés, dentro de una flora mixta (Rodríguez, 2005). Por estas y otras razones es que se aplicarán técnicas de aislamiento que involucran procesos de varias transferencias y la utilización de medios tanto comunes como especiales, mayormente sólidos, seleccionados en función a la naturaleza del microorganismo. El uso de medios de cultivo adecuados debe dar como resultado el rápido crecimiento de microorganismos viables que, directamente o mediante posteriores resiembras formarán colonias aisladas disponibles para su estudio. (García, 1994). Además se deberá otorgarle las condiciones adecuadas para que se desarrollen óptimamente. Existen dos métodos de aislamiento tradicionalmente empleados, el primero se realiza por estrías, que consiste en diseminar los microorganismos en la superficie de un medio sólido dispuesto en placa Petri; si el inóculo inicial se encuentra sólido o en polvo, es recomendable llevarlo a suspensión. Esta técnica requiere entrenamiento constante para obtener una determinada cantidad de colonias separadas por placa. La otra técnica de aislamiento viene a ser la de diluciones sucesivas, que consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del inóculo inicial y disponer estas soluciones en placas Petri con medio. Las colonias de varios microorganismos difieren morfológicamente, por ello su apariencia en cultivo es importante para propósitos de identificación. Si el procedimiento se realiza con un asa calibrada o con una pipeta que permita medir el volumen que se traspasa a cada tubo, es posible llegar a determinar el 1

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Universidad Nacional Agraria la MolinaLaboratorio de Microbiologa 01/06/151. IntroduccinEn la naturaleza, diversos tipos de microorganismos comparten su hbitat con gran variedad de otras especies; sin embargo, para su estudio se hace necesario que cada especie pueda ser obtenida en forma aislada, lo que se conoce como un cultivo puro o axnico. Por ejemplo en muestras clnicas usualmente las bacterias patgenas se encuentran junto con las de la flora indgena, por lo que es necesario aislar las primeras; adems, en muchos procesos industriales es necesario recuperar solo el agente de inters, dentro de una flora mixta (Rodrguez, 2005). Por estas y otras razones es que se aplicarn tcnicas de aislamiento que involucran procesos de varias transferencias y la utilizacin de medios tanto comunes como especiales, mayormente slidos, seleccionados en funcin a la naturaleza del microorganismo. El uso de medios de cultivo adecuados debe dar como resultado el rpido crecimiento de microorganismos viables que, directamente o mediante posteriores resiembras formarn colonias aisladas disponibles para su estudio. (Garca, 1994). Adems se deber otorgarle las condiciones adecuadas para que se desarrollen ptimamente. Existen dos mtodos de aislamiento tradicionalmente empleados, el primero se realiza por estras, que consiste en diseminar los microorganismos en la superficie de un medio slido dispuesto en placa Petri; si el inculo inicial se encuentra slido o en polvo, es recomendable llevarlo a suspensin. Esta tcnica requiere entrenamiento constante para obtener una determinada cantidad de colonias separadas por placa.La otra tcnica de aislamiento viene a ser la de diluciones sucesivas, que consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del inculo inicial y disponer estas soluciones en placas Petri con medio. Las colonias de varios microorganismos difieren morfolgicamente, por ello su apariencia en cultivo es importante para propsitos de identificacin. Si el procedimiento se realiza con un asa calibrada o con una pipeta que permita medir el volumen que se traspasa a cada tubo, es posible llegar a determinar el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) que haba en el cultivo original. (Rodrguez, 2005)Por otra parte, si se tiene aislado un microorganismo y se quiere mantenerlo en estado activo deben utilizarse tcnicas de trasplante que son transferencias constantes de un microorganismo que se asume puro, ya que de lo contrario podra verse afectado su crecimiento debido a competitividad, antagonismo, sinergismo, etc., desde un medio carente de nutrientes hacia un medio fresco (Garca, 1994). Esta tcnica usualmente se realiza en medios lquidos o slidos, siendo la prctica ms comn de conservacin de cepas, el realizar estras en tubos de agar inclinado.Los objetivos de la presenta prctica son: observar las caractersticas de crecimiento de los microorganismos al transplante en medios de cultivo lquido y slido, as como separa colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos utilizando tcnicas de aislamiento.

2. Resumen de la metodologa2.1 Cultivo en tubosA continuacin se mostrar los pasos a seguir para los cultivos de microorganismo en tubos de ensayo con diferentes medios:

2.2Tcnicas de aislamiento 2.2.1 Aislamiento por estras

2.2.2Aislamiento por diluciones

3. Resultados1. Cultivo en tubosTabla IBacteriasCrecimiento en caldo de cultivoCrecimiento en agar vertical por picadura profundaCrecimiento en estras sobre agar inclinado

Staphylococus aureusTurbioEn superficie y limitado a la lnea de inoculacinGranulado

Bacillus cereusTurbioFuera de la lnea de inoculacinEquinulado

Escherichia coli

BacteriasCaldo de cultivoAgar verticalAgar inclinado

Staphylococcus aureus

Bacillus cereus

Escherichia coli

a. Staphylococcus aureusLos resultados obtenidos tras la siembra fueron turbio en caldo de cultivo, limitado a la lnea de inoculacin y en superficie, en agar vertical y granulado, en agar inclinado; lo cual est relacionado con sus requerimientos de oxgeno y tambin con la movilidad que presenta. Con respecto a su relacin con el oxgeno son aerobios y anaerobios facultativos (Prieto y Gomez-Lus, 1996), lo que indica que pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de oxgeno por lo que el crecimiento en agar vertical se manifest en la lnea de inoculacin (alta concentracin de O2) y en la superficie ya que al introducir la Aguja de Kolle la mayor parte del inoculo quedo adherido en el extremo superior. Se sabe que Staphylococcus aureus no presenta movilidad porque carece de flagelos y por ello no aparece fuera de la picadura o en profundidad. El crecimiento en agar inclinado involucra caractersticas de ambos tipos (anaerobios facultativos y no mviles); ya que dicho crecimiento fue a los largo de la lnea de siembra y sin ramificaciones, lo que indica que crece en superficies arobicas (el agar al encontrarse inclinado presenta mayor superficie con oxgeno) y no ramificado pues es una bacteria no mvil.b. Bacillus cereusLos resultados obtenidos tras la siembra fueron turbio en caldo de cultivo, fuera de la lnea de inoculacin, en agar vertical y equinulado, en agar inclinado. En relacin a sus requerimientos de oxgeno Bacillus cereus es una bacteria ubiquitaria, de metabolismo aerbico facultativo, por lo que el crecimiento en caldo nutritivo ser del tipo turbio ya que no necesitan cantidades altas de oxgeno para su crecimiento. En cuanto al agar vertical, se observ el crecimiento fuera de la lnea de inoculacin, lo cual indica que se trata de una bacteria con motilidad, pues presenta flagelos distribuidos en toda la superficie celular (Manzo, 2005).El crecimiento en agar inclinado incluye las caractersticas de motilidad y requerimiento de oxgeno. Se observ que el crecimiento fue equinulado, lo cual indica que puede crecer en superficies aerbicas y son mviles, pues presenta un borde espinoso a los lados de la lnea de siembra.c. Escherichia coli

2. Aislamiento y recuento en placas:A. Aislamiento por estras

Debido a que el Agar Manitol-Salado es un medio de cultivo selectivo diferencial, se observ el crecimiento de Staphilococcus aureus, despus de 48 horas de incubacin.Las colonias tenan una coloracin halo amarillo cremoso de forma circular, con bordes uniformes; ligeramente elevadas.Discusin:Se pudo realizar una buena distribucin de las bacterias con el asa de kolle, logrndose apreciar las colonias que crecen en un medio salino con un alto concentracin de Cloruro de Sodio. Cuando hay produccin de cido se fermenta el manitol produciendo colonias con un halo amarillo, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo pH (8.4) al amarillo pH (6.8) (Chapman, 1945).

Ya que el Agar Mac-Conkey es un medio de cultivo selectivo diferencial, se observ el crecimiento de Escherichia coli despus de 48 horas de incubacin. Las colonias tenan una coloracin roja de forma circular convexa, con bordes redondeados, lactosa positiva lo que les da coloracin rosada y sobresaliente. Discusin:Se realiz el aislamiento E.coli logrndose ver colonias de una manera muy disgregada poco repartida; por otro lado, se puede apreciar las colonias medianas. Por otro lado, se hubiese mejorado la muestra si se hubiese manipulado el asa de kolle de una manera correcta el barrido de la muestra no tuvo suficiente uniformidad; sin embargo, este cultivo no creci por falta de tiempo ya que la American Heath Association (A.P.H.A.) recomienda incubar durante 3 das y 32C en aerobiosis.

B. Aislamiento por diluciones

Se realizo la primera dilucin cualitativa del caldo cuyo contenido es la mezcla de microorganismos que se incubo en la primera placa Petri por 48 horas a 37C. Pero no se pudo identificar la colonia, mas su aparicin de bacterias. Discusin:Para no mostrar ninguna colonia debe haber surgido un problema con la temperatura del horno, ya que es un factor muy importante en el crecimiento de la colonia. Por otro lado, inicialmente la temperatura del Agar no fue la ms adecuada, ya que se debi enfriar y mantenerlo a 50C.

Una vez realizada la primera dilucin cualitativa se realizo una segunda mezcla con el asa de kolle al segundo Agar fundido para luego verter en la placa Petri que tambin se incubo por 48 horas a 37C. Los resultados finales fueron igual que el primero, se observo bacterias pero no colonias.Discusin:No se obtuvo la formacin de colonias bacterianas nuevamente. El problema es de realizarse al inicio de la extraccin de la pelcula en la asa de kolle muy poca cantidad de bacterias para que luego puedan proliferar en un medio nutritivo.

CONCLUSIONES: Se aprendi a reconocer las distintas colonias que se formaron normalmente por bacterias que crecen en Agar Mac-Conkey. Tambin se pudo identificar su forma circular convexa, color rosada sobresaliente, borde redondeado. As mismo, tambin se apreci la formacin de colonias en el Agar Manitol-Salado, mostrando la forma de circular uniforme, con un halo amarillo cremoso y ligeramente elevado. No se logr apreciar las colonias en el aislamiento por diluciones, ya que surgi factores que hayan influenciado en su crecimiento de la colonia.

Reseas bibliogrficas Prieto J y Gomez-Lus ML. 1996. Gnero Staphylococcus. Microbiologa Mdica. Garca-Rodriguez, Picazo. Pg 179-191. Ed Doyma Agencia Catalana de Seguridad Alimentaria (acsabrief). 2011. Riesgos emergentes. Bacilluscereus Manzo, Anabelle. 2005. Bacilluscereus: peligro bajo el tenedor. Digital universitaria. 6(4):2-4. American Society for Microbiology; [Internet]; [Consultado 2014 feb 09]; Disponible en: http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/2871-eosin-methylene-blue Chapman, G.H. 1945. El significado de cloruro de sodio en studios de Staphilococcus. J. Bacteriana. 50: 201:20 -Rodrguez, E. 2005. Bacteriologa general: principios y prcticas de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica. pg. 101-107. Garca, P. Paredes, F. Fernndez, M. 1994. Microbiologa clnica prctica. Servicio publicaciones UCA. Pg. 73-81

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